Summary
Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) üretebilir birkaç flavin bağımlı enzim içerir. ROS izleme mitokondri içinde tek tek siteleri istenmeyen yan tepkiler nedeniyle zorlu sürümüdür. Biz saf flavoenzymes ve Mikroplaka fluorometry kullanarak ROS yayımı için yerel oranları doğrudan değerlendirilmesi için bir kolay, ucuz yöntemi mevcut.
Abstract
Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) 12 enzimatik kaynakları içerebilir bildirilmiştir. Bu sitelerin çoğunluğu flavin bağlı solunum kompleksleri ve süperoksit (O2● -) ve hidrojen peroksit (H2O2) karışımı üretmek dehydrogenases içerir. ROS üreten potansiyel izole mitokondri içinde bireysel siteleri doğru miktar antioksidan savunma sistemleri ve ayrıca O2●-/ h2O2formu yan reaksiyonlar varlığı nedeniyle zor olabilir. Mitokondriyal bioenergetics bozabilir nonspesifik inhibitörleri kullanımı da ROS yayın üretim diğer sitelerden değiştirerek ölçümleri olumsuz etkileyebilir. Burada, saflaştırılmış flavin bağlı dehydrogenases tarafından eş zamanlı ölçüm H2O2 serbest bırakmak ve Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) üretim için kolay bir yöntem mevcut. Burada kastedilen, örnek olarak saflaştırılmış pyruvate dehidrogenaz kompleksi (PDHC) ve α-ketoglutarate dehidrogenaz kompleksi (KGDHC) domuz kalp kökenli kullandık. Bu yöntemi doğru bir ölçü oranlarının yerli H2O2 yayın üretim bireysel siteleri tarafından ROS ve antioksidan sistemleri diğer potansiyel kaynakları ortadan kaldırarak olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem H2O2 serbest bırakmak ve enzim aktivitesi ve etkinliği testi ile taranması ve inhibitörleri ROS üretim için selectivity ilişkisi doğrudan karşılaştırması için izin verir. Genel olarak, bu yaklaşım ROS yayın izole mitokondri veya permeabilized kas fiber ile daha sofistike deneyler önce bireysel enzimler için yerel oranları derinlemesine değerlendirilmesi için izin verebilirsiniz.
Introduction
Besin metabolizma, nihai hedefi adenozin trifosfat (ATP) yapmaktır. Memeli hücrelerinde mitokondri, ATP karbon depolanan enerji dönüştürme çift membraned organelleri içinde oluşur. Karbon iki elektron taşıyıcıları, NADH ve flavin adenin dinükleotit (FADH2)1şekillendirme mitokondri tarafından yakılarak olduğunda ATP üretimi başladı. NADH ve FADH2 o zaman okside çoklu alt birim solunum kompleksleri tarafından ı ve II, sırasıyla ve elektron alıcısı moleküler oksijen (O2) karmaşık IV1için serbest elektron Guam'dan sürekli. Thermodynamically olumlu "yokuş aşağı" transferi elektron zinciri sonundaki O2 proton verileceği intermembrane birleştirilmiştir uzay kompleksleri tarafından ı, III ve IV. Bu bir transmembran elektrokimyasal gradyan proton (proton-sebep kuvvet), ATP2yapmak için karmaşık V tarafından dinleniyor Gibbs serbest enerjisi geçici bir form oluşturur. Elektron transferi reaksiyonlar mitokondri içinde mükemmel ATP üretimi için birleştiğinde değil. Krebs döngüsü ve solunum zinciri çeşitli noktalarda, elektron zamanından önce O2 forma ROS3ile etkileşim kurabilir. Mitokondri tarafından oluşturulan en biyolojik ilgili ROS O2● - ve H2O2' dir. Şimdi ne kadar O2● - kez mitokondri tarafından kurulan proksimal ROS olarak, üretim siteleri ücretsiz ile ilişkili olduğu O2● - ve H2O2, karışımı oluşturmak belirgin flavin protez radikal kimya4,5gruplandırır. Yüksek düzeylerde ROS oksidatif stres6' kaynaklanan hücre işlevi için gerekli biyolojik bileşenlerinin zarar tehlikeli olabilir. Ancak, düşük tutarları, mitokondrial ROS hayati sinyal işlevleri yerine getirmek. Örneğin, H2O2 sürümü mitokondri T hücre aktivasyonu, stres sinyal (örneğin, indüksiyon Nrf2 sinyal yollar), hücre çoğalması ve farklılaşma indüksiyon kontrolünde karıştığı olmuştur, insülin sinyal ve serbest bırakmak ve davranış7besleme. Önemli ROS sinyal gönderme işlevini anlama konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Ancak, önemli soru hala cevap bekliyor hangi açısından enzimler mitokondri içinde en önemli kaynakları ve nasıl üretim kontrol olarak hizmet vermektedir.
ROS yayın üretim sitesi tarafından birkaç faktöre bağlıdır: 1) konsantrasyonu elektron bağış site, 2) elektron bağış sitesi, oksijen ve 4) konsantrasyon 3) erişim Redoks durumunu ve oksidasyon substrat3, türü 8 , 9. NADH ve membran potansiyel gücü konsantrasyonu da etkiler gibi ROS üretim8,10mitokondri içinde diğer faktörler. Örneğin, O2●-/ h2O2 tarafından üretimin saf PDHC veya KGDHC hızı artan NADH durumu5,11ile artar. Bu senaryoda, elektron geriye doğru PDHC ya da KGDHC,O2● // h2O2 üretim12sitesi E3 alt birim FAD Merkezi NADH akıyor. Benzer şekilde, NAD+ hükmü ROS yayın KGDHC12azalan ters etkiye sahiptir. Böylece, kontrol giriş veya çıkış elektron ROS üretim sitelerden ne kadar O2●-/ h2O2 oluşan değiştirebilirsiniz. Örneğin, PDHC veya CPI-613, analog, sonuçları bir neredeyse % 90 O2● -içinde/h2O2 üretim13azaltmak lipoic asit ile KGDHC E2 alt birim engelliyor. Kimyasal S-glutathionylation Katalizörler, diamide ve Ampisilin, hangi neredeyse O2●-/ h2O2 üretim PDHC veya KGDHC tarafından glutatyon e konjugasyon üzerinden kaldırılması ile benzer sonuçlar elde 2 alt birim14. E2 alt birim PDHC ve KGDHC ile elektron akışını engelleme için ticaret-off ROS oluşumuna elektron taşıma zinciri tarafından (örneğin, karmaşık III) azalır NADH üretim bir azalmadır. Bu da elektron taşıma zinciri tarafından ATP çıkış düşürebilir. Genel olarak, ROS üretim siteleri için elektron giriş kütük parçası O2●-/ h2O2 üretim kontrol son derece etkili bir anlamı olabilir.
Mitokondri 12'ye kadar potansiyel O2●-/ h2O2 kaynakları6içerebilir. Bu sitelerin çoğu flavin içeren O2● - ve H2O2karışımı oluşturan enzimler. Farklı yüzey ve önleyici bileşimleri kullanımı hangisitelerde oluşturan yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 solunum kompleksleri ve mitokondriyal dehydrogenases hizmet tanımlaması için izin verilen farklı dokuların3. PDHC ve KGDHC yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 kas ve karaciğer mitokondri13,15yayan siteleri hizmet gösterilmiştir. Ancak, mitokondri ve etkisi farklı substrat ve önleyici bileşimleri olan bireysel sitelerin potansiyel oluşturan O2●-/ h2O2 incelenmesi açısından bazı zorluklar kalır enzimler faaliyetleri. Bu istenmeyen yan reaksiyonlar (örneğin, O2●-/ h2O2 siteleri dışındaki faiz enzim tarafından oluşumu) varlığı nedeniyle, endojen besin (örneğin,yağ kirletici asitler) veya organelleri (örneğin, aynı zamanda O2●-/ h2O2şeklinde tanımladıkları) ve seçicilik eksikliği inhibitörleri kullanımı ve/veya tamamen ROS üretim inhibe değil bileşikler kullanımı. Belirli inhibitörleri Ayrıca mitokondriyal bioenergetics ve elektron akışı yönünü değiştirebilir ve bu üretimin diğer sitelerden ROS sürüm değiştirir ve sonuçları zihnimi karıştıran. O2●-/ h2O2 serbest bırakılması için bireysel sitelerinden mitokondri yapılan mutlak oranları da O2● - ve H2O2 yüksek konsantrasyonu nedeniyle ölçmek zordur matris ve intermembrane alanı içinde enzimler ortadan kaldırarak. Bu nedenle, O2●-/ h2O2 yayın ölçümleri ile engelleyebilir herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırılması yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 belirlerken yararlı olabilir siteleri şekillendirme.
Burada, O2●-/ h2O2 üretim ve NADH oluşumu eşzamanlı incelenmesi için saflaştırılmış flavin bağımlı dehydrogenases tarafından sağlar basit bir yöntem mevcut. Arıtılmış enzimler kullanarak, istenmeyen yan reaksiyonlar oluşturan ROS ve enzimler aşağılayıcı ROS bırakmak daha doğru bir ölçü birimi yerel O2●-/ h2O2 üretim oranları için bireysel flavoenzymes için ortadan kaldırılabilir. Bu yöntem doğrudan O2●-/ h2O için kapasite farklı arıtılmış dehydrogenases veya ekran potansiyel siteye özgü inhibitörleri oluşturan O2●-/ h2O2 karşılaştırmak için kullanılabilir 2 serbest bırakmak. Son olarak, O2●-/ h2O2 ve NADH üretim aynı anda ölçme enzim aktivitesi ve ROS yayın kapasitesi arasındaki ilişkinin gerçek zamanlı bir değerlendirmesi için izin verebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kimyasal maddeler ve arıtılmış enzimler
- Aşağıdaki belgeleri temin etmek: PDHC ve KGDHC domuz kalp kökenli (veya başka bir saf mitokondriyal flavoenzyme); H2O2 (% 30 çözüm), pyruvate, α-ketoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, tiamin pirofosfat (DYP), mannitol, HEPES, sukroz, EGTA, 3-metil-2-oxo valeric asit (KMV), süperoksit dismutaz (SOD), horseradish peroksidaz (HRP), 10-asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reaktifi (AUR) ve CPI-613.
2. planlama tahlil ve reaktif hazırlık
- Tablo 1 göre tahlil bir 96-şey plaka ayarlayın.
Not: Toplam her reaksiyon için 200 µL. hisse senedi konsantrasyonları böyle reaktif 20 µL eklenir ayarlanır birimdir her şey için. Bu kofaktör ve yüzeylerde de tahlil başlamadan önce her tepki için hızlı ek sağlar. - 220 mM mannitol, 70 mM sukroz, 1 mM EGTA ve 20 mM HEPES (pH 7.4 HCl ile) içeren tepki arabellek hazırlayın.
Not: Bu farklı arıtılmış enzimler fiziksel özellikleri bağlı olarak değişebilir. - Saf KGDHC veya PDHC enzim aktivitesi deneyleri14,16,17 kullanarak kirlenme veya immunoblot incelemek veya Coomassie leke5.
- Tablo 1çalışma çözüm konsantrasyonlarda göre tepki arabellekteki tüm reaktifler hazırlayın.
- 1 mL aliquots-20 ° C'de olarak tüm reaktifler saklamak Auto-oksidasyon ve tekrarlanan donma-çözülme nedeniyle kendiliğinden yıkımı önlemek için 100 µL aliquots pyruvate ve α-ketoglutarate-80 ° C'de depolayın.
- AUR reaktif DMSO 1 mL ana stok hazırlamak ve 100 µM tepki arabelleği için oranında seyreltin. Işıktan korunan mağaza.
Not: Burada, 100 µM çalışma çözüm taze her 2-3 hafta yaptı ve ışıktan korunan.
3. Assay şablon ayarlama
- Bir tek renkli Mikroplaka okuyucu Çift ölçüm yetenekleri ile tahlil ameliyat ayarlayın.
- Okuma yordamı "Protokol" seçerek belirleyin. O zaman "Yordamı"'ı tıklatın.
- "Sıcaklık" 25 ° C (şekil 1A) ayarlayın.
- "Başlamak okuma koşulları (şekil 1A) ayarlamak için kinetik"'ı tıklatın. Okuma aralıkları/deneyler sayısı ve zamanı ayarlayın.
- Tıklayın "oku" (şekil 1B).
Not: Üst konumda örnekleri okunduğu bir kazancı 50. Süresi: okuma 5 dk, 30-s aralıklarla. Kanal 1: Resorufin floresan - uyarma/emisyon 565 nm:600 nm, 13,5 dalga boyu genişliği = nm. Kanal 2: NADH autofluorescence - uyarma/emisyon 376 nm:450 nm dalga boyu genişliği 20 = nm. - Altında "okuma", wells (örneğin, A1-A4 ve B1-B4) monitör için seçin.
- "Son kinetik" seçin.
4. standart eğrileri
- Reaktifleri çözülme ve ihtiyaç kadar buza saklayın.
-
NADH standart eğri (şekil 2A)
- Çalışma çözümleri 0,5-10 mM tepki arabelleği konsantrasyon aralığında NADH için hazırlayın.
- 20 µL aliquots çözüm konsantrasyonu 180 µL tepki arabellek içeren wells için çalışma her NADH ekleyin. NADH son konsantrasyonu her şey 0,05-1 mM.
- "Oku"'ni tıklatın ve uyarma/emisyon 376 nm:450 nm dalga boyu genişliği 20 = nm.
Not: Bu salt okunur bir son nokta - Kinetik parametrelerin gerekli değildir.
-
AUR standart eğri (şekil 2B)
- Hidrojen peroksit tepki arabelleği çalışma stokları hazırlamak; hisse senedi konsantrasyonları 200-4.000 nM arasındadır.
- 120 µL tepki arabelleği her şey için ekleyin.
- HRP 20 µL eklemek (hisse senedi toplama çalışma 30 U/mL, iyi son konsantrasyonu = 3 U/mL =), 20 µL SOD (hisse senedi toplama çalışma 250 U/mL, iyi son konsantrasyonu = 25 U/mL =) ve AUR 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 100 µM = iyi son konsantrasyonu 10 µM =) de içeren her reaksiyon arabellek için.
- Her tampon ve tahlil reaktifler de içeren stok çözüm çalışma her H2O2 20 µL ekleyin. Son tepki birim 200 µL ve her iyi H2O2 son konsantrasyonu 20-400 nM.
- 1 dk içinde 25 ° C'de plaka okuyucu için tabak kuluçkaya
- "Oku"'ni tıklatın ve uyarma/emisyon 565 nm/600 nm, 13,5 dalga boyu genişliği = nm. Bu salt okunur bir son nokta olduğunu unutmayın - Kinetik parametrelerin gerekli değildir.
5. O2●- / h2 O2 yayın ve KGDHC ve PDHC tarafından NADH üretim ölçme
- Bkz. Tablo 1 farklı reaktifleri ilavesi sipariş için her çalışma çözüm ve birimin her için eklendi iyi.
- 40 µL tepki arabelleği her şey için ekleyin. KMV veya CPI-613 kullanarak deneyleri için 20 µL arabelleği her şey için ekleyin.
- PDHC veya KGDHC 20 µL ekleyin (çalışma stok 1 U/ml, son konsantrasyonu iyi başına 0.1 U/mL =) her şey için.
- PDHC ve KGDHC için 2 dk 25 ° C'de kuluçkaya.
- KMV 20 µL ekleyin (çalışma stok = 100 mM, son konsantrasyonu = 10 mM) veya CPI-613 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 1.5 mM, son konsantrasyonu = 150 µM =) (Tablo 2).
Not: Eğer inhibitörleri deneyleri için kullanılmayan bu adımı dışlanabilir. - 25 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya
Not: Eğer inhibitörleri deneyleri için kullanılmayan bu adımı dışlanabilir. - HRP 20 µL ekleyin (hisse senedi toplama çalışma 30 adet/mL, iyi son konsantrasyonu = 3 adet/mL =) ve SOD 20 µL (hisse senedi toplama çalışma 250 adet/mL, iyi son konsantrasyonu = 25 adet/mL =) her şey için.
- Koenzim a 20 µL eklemek (hisse senedi toplama çalışma = 1 mM, son konsantrasyonu = 0,1 mM), 20 µL DYP (hisse senedi toplama çalışma = 3 mM, son konsantrasyonu 0.3 mM =) ve NAD+ 20 µL (hisse senedi toplama çalışma = 10 mM, son konsantrasyonu = 1 mM) her w söyle.
- AUR reaktif koruyucu folyo kaplama kaldırın ve her şey için 20 µL ekleyin.
- Pyruvate 20 µL ekleyin (hisse senedi toplama 1-100 mM, deneyleri için son konsantrasyonu arasında değişen çalışma = 0,1-10 mM) PDHC ve α-ketoglutarate içeren wells için (hisse senedi toplama 1-100 mM, deneyleri için son konsantrasyonu arasında değişen çalışma = 0,1-10 mM) için KGDHC içeren wells.
- "Oku" Kinetik ölçüm başlatmak için tıklatın.
6. veri analizi
- Klavye 'CTRL' düğmesini basılı tutun ve kuyu Kanal 1 (şekil 3A) karşılık gelen tüm Kinetik ölçüleri içeren bir grafik oluşturmak için tıklatın.
- Farklı zaman noktalarda (3B rakam) ölçülen göreli Floresans birimleri (RFU) için "veri" görünümü simgesi ham değerleri için sağ üst köşedeki tıklatın.
- Analizi (Tablo 3) değerleri verin.
- "Grafik" damla aşağı yemek listesi (şekil 3B) sağ üst üzerinde Floresans Kanal 2 ile ilişkili RFU değerlerini erişmek için tıklatın.
- 6.1-6.3 Kanal 2 için yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3A tarafından arıtılmış KGDHC H2O2 ve NADH üretim eş zamanlı ölçüm sırasında toplanan RFU için bir temsilci izleme sağlar. Ham RFU veri her zaman aralığı için şekil 3B' tasvir edilir. Ham RFU veri daha sonra analiz için verilir. Şekil 2' de sunulan standart eğriler üzerinden extrapolating tarafından her ölçüm Aralık 5 dk süre içinde oluşan NADH ve H2O2 mutlak miktarı belirlenebilir. Bu hesaplama örneği Tablo 3' te verilmiştir. NADH ve H2O2 miktarı oluşturduğu bir kez KGDHC da PDHC, farklı aralıklarla algıladı, değerleri kopyalanan ve daha fazla çözümleme için bir grafik/istatistik yazılımı içine girdim. XY grafik türü analizi kullanarak, NADH (µmol) ve KGDHC veya PDHC tarafından kurulan H2O2 (pmol) Zaman (şekil 4A) bir fonksiyonu çizilebilir. Bu değerler kullanılarak, NADH ve H2O2 oluşumu sırasında substrat oksidasyon oranı da hesaplanabilir. Şekil 4B' de gösterildiği gibi KGDHC ve PDHC yeteneği şekillendirme NADH ve H2O2 açısından farklı özellikleri görüntüler.
Bir kez KGDHC ve PDHC enzimatik etkindir ve NADH ve H2O2 oluşumu aynı anda izlenebilir, ROS özellikleri bırakın ve enzim aktiviteleri ölçülebilir olduğunu kurulmuştur. Beri son derece temel yapısında homolog ve yüksek kapasiteli siteleri ROS üretim5için dokümante edilmiş KGDHC ve PDHC karşılaştırmak seçtik. Şekil 5 ve şekil 6 NADH ve H2O2 üretim substrat konsantrasyonu üzerinde bağımlılık göstermektedir. PDHC kolayca substrat düşük miktarda 0.1-0,5, maksimum ulaşan NADH ve H2O2 üretim hızı ile doymuş mM pyruvate. KGDHC, öte yandan, α-ketoglutarate (şekil 5) artan NADH ve H2O2 üretim artımlı artar görüntüler. Bu son derece homolog rağmen temel yapısı, KGDHC ve PDHC, ne kadar substrat maksimal ROS yayın ikna etmek için gerekli açısından farklı Kinetik özellikleri vardır gösterir. Şekil 5 da H2O2 sürümü KGDHC şiddetle NADH üretim ve substrat kullanılabilirliği ile ilişkili olan gösteriyor. Diğer PDHC aynı Kinetik özelliklere sahip değil. Ayrıca KGDHC ve PDHCne zaman NAD+ konsantrasyon çeşitli kapasite şekillendirme NADH ve O2●-/ h2O2 açısından (şekil 6) farklı.
NADH ve H2O2eşzamanlı ölçü alarak avantaj tarafından ROS üretim için potansiyel siteye özgü inhibitörleri taranması. Bu H2O2 yayın maksimal inhibisyonu ikna etmek için gerekli olan inhibitörü miktarını belirlemenize yardımcı olabilir. Buna ek olarak, aynı zamanda NADH üretim ölçerek, önleyici eylem yanı sıra ROS kaynak sitesine belirlenebilir. Önceki çalışmalar α-ketoglutarate analog, KMV, ROS yayın KGDHC (≥ % 90 inhibisyon)13,15inhibe son derece etkili olduğunu göstermiştir. Biz de CPI-613, dihydrolipoamide bir PDHC ve KGDHC, E2 alt birimi engelleyen lipoik asit analog da ROS serbest bırakmak--dan ikisinden biri kompleksi tarafından inhibe gösterdi ~ % 9013,14. Eylem KMV ve CPI-613 için sitenin Şekil 7' de gösterilir. CPI-613 molekülü içeren bir kükürt olduğunu ve bu nedenle tavsiye edilir o thiol zengini azalan bakiyeli ajanlar (dithiothreitol; DTT) ya da proteinler (albümin) yordamı13atlanmış. Şekil 7 KMV ve CPI-613 hem NADH ve H2O2 KGDHC tarafından sınırlama son derece etkili olduğunu gösterir. Aynı şekilde, CPI-613 tamamen H2O2 PDHC (Şekil 7) sürümünden kaldırıldı. Toplu olarak, bu sonuçlar KMV ve CPI-613 H2O2 serbest bırakmak için son derece etkili inhibitörleri vardır ve böylece izole mitokondri ile deneyler uygulanabilir göstermek. Etkinliğini doğrudan bir değerlendirmesine ve arıtılmış flavin içeren dehydrogenases üzerinde farklı inhibitörleri selectivity için sağlar beri böyle bir ekran diğer potansiyel ROS oluşturmayan enzimler için son derece faydalı olacaktır. NADH eşzamanlı ölçümü de ROS potansiyel kaynak bir enzim içinde ön tanımlaması karmaşık izin yararı vardır. Şekil 7 PDHC için son derece homolog KGDHC, katalitik mekanizması bir tasviri sağlar. E1 ve E2 alt birim KGDHC, blok, KMV ve CPI-613, H2O2 ve NADH üretim, neredeyse tamamen kaldırılmış gözlem onaylar E3 alt birimi, büyük olasılıkla tuhaflık, ROS kaynağıdır 18. CPI-613 sarf H2O2 serbest bırakmak için ilke sitesi E3 alt birim18olduğunu teyit PDHC benzer bir etkisi. Benzer bir yaklaşım diğer dehydrogenases için kullanılabilir. Bu karmaşık bir enzim farklı parçaları ile elektron akışı engellemek inhibitörleri tanımlaması gerekir.
Resim 1 : Temsilcisi ekran görüntüleri için tahlil Kur. (A)tasvir yordamın NADH ve resorufin floresan değişiklikleri Kinetik ölçüm için kurmak. (B) ayarı için tahlil floresan parametreleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : NADH ve resorufin floresan için temsilcisi standart eğrileri. Eğrileri NADH ve O2●-/ h2O2 üretim oranını tahmin etmek için kullanılmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Ham RFU veri temsili izlerini tahlil sırasında toplanan. (A)eğrileri tahlil sırasında okumak her şey için. Plaka görünümü eğrileri CTL düğmesini basılı tutup tıklatarak okunan her şey üzerinde oluşturulur. (B) veri vermek için veri görünümü altında temsilcisi RFU değerlerini içeren bir tablo oluşturmak için tıkladım. Elektronik tablo dışa aktar düğmesini sonra ham sonuçlar vermek için tıkladım. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Doğrudan karşılaştırma H2 O 2 ve KGDHC ve PDHC NADH şekillendirme oranları. (A)eş zamanlı ölçüm H2O2 ve KGDHC ve PDHC potansiyel oluşturan NADH. (B) KGDHC ve PDHC tarafından NADH oluşumu ve H2O2 oranı hesaplama. NADH ve ROS üretim her iki flavin içeren enzimler tarafından doğrudan karşılaştırma KGDHC daha yüksek enzimatik kapasitesi ile ilgili daha fazla H2O2 üretir gösterir. n = 4, demek ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : H eş zamanlı ölçüm 2 O 2 ve KGDHC ve PDHC tarafından oranları oluşturan NADH farklı substrat konsantrasyonu oksitleyici. Floresans değişimler final substrat konsantrasyonu 0 mM 10 mM den farklı dışında daha önce açıklandığı gibi ölçüldü. Bu yaklaşım H2O2 serbest bırakmak üstünde KGDHC ve PDHC Kinetik özelliklerinin bağımlılık tespit etmek için kullanıldı. n = 4, demek ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : KGDHC ve PDHC aynı zamanda ekran farklı H2 O 2 ve özellikleri şekillendirme NADH zaman NAD + düzeyleri değiştirilir. Floresans değişimler NAD+ son konsantrasyonu 0 mM 1 mM için çeşitli dışında daha önce açıklandığı gibi ölçüldü. Bu yaklaşım H2O2 serbest bırakmak üstünde KGDHC ve PDHC Kinetik özelliklerinin bağımlılık tespit etmek için kullanıldı. n = 4, demek ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : NADH ve H2 farklı siteye özgü inhibitörleri, eleme O 2 Üretim. (A)diyagram KGDHC ve eylem KMV ve CPI-613 siteleri için katalitik döngüsü resmeden. KMV pyruvate bağlama site için rekabet değil dışında PDHC homolog katalitik döngüsü olduğunu not alın. E1: pyruvate veya α-ketoglutarate dehidrogenaz, E2: dihydrolipoamide asiltransferaz, E3: dihydrolipoamide dehidrogenaz. (B) etkisi KMV ve CPI-613 NADH ve H2O2 üretiminde KGDHC ve PDHC. Örnekleri preincubated KMV (10 mM) veya CPI-613 (150 µM) ve NADH ve H2O2 üretimi için denetlesinler. n = 4, demek ± SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif | Çalışan hisse senedi toplama | Cilt iyi için eklendi | Iyi son konsantrasyonu |
| KGDHC veya PDHC | 1 birim/mL | 20 ΜL | 0.1 adet/mL |
| Süperoksit Dismutaz | 250 adet/mL | 20 ΜL | 25 adet/mL |
| Horseradish peroksidaz | 30 adet/mL | 20 ΜL | 3 adet/mL |
| Tiamin pirofosfat | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Koenzim A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substrat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0.1-10 mM |
Tablo 1: O ölçüm için bir temel protokol örneği kurmak 2 ●- /H 2 O 2 ve NADH üretim arıtılmış PDH veya KGDH. Her reaktif 20 µL ekleniyor her şey ve son bu yana cilt/reaksiyonu 200 µL, her reaktif son konsantrasyonu 10 kat daha az hisse senedi toplama (örneğin, NAD+ son konsantrasyonu tepki karışımı olduğunu 1 mM ). Reaktifler tabloda sunulan sırayla de eklenmesi gerektiğini unutmayın.
| İnhibitörü | Hedef |
| 3-metil-2-oxo valeric asit | KGDHC, E1 alt birimi |
| TÜFE-613 | Okso asit dehydrogenases E2 altünitesi |
Tablo 2: inhibitörleri ve hedefleri listesi. Siteleri eylem şekil 8' de tasvir edilmektedir.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Zaman | T ° 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24,4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24,4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24,4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24,4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24,4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24,4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24,4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24,4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24,4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24,4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24,4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin floresan | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Zaman | T ° 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24,4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24,4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24,4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24,4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24,4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24,4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24,4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24,4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24,4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24,4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24,4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tablo 3: sonuçları elektronik tablo görünümünü toplanan deneyler kümesinden. Deneyden üretilen ham RFU değerler daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tabloya dışa aktarılır. Deney öncesinde oluşturulan standart eğrileri kullanılarak, elektronik tabloda NADH ve H2O2 üretim oranı hesaplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı beri avantajlıdır, 1) bu aksi takdirde H2O2 algılama (örneğin, antioksidan sistemleri veya diğer kaynakları ROS), ile 2 engel olabilecek herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırır) yerel oranı doğrudan bir değerlendirmesini sağlar ROS serbest bir flavin içeren mitokondrial dehidrogenaz tarafından 3) yerli karşılaştırmasını sağlar ROS yayın oranları iki veya daha fazla saf flavin tabanlı dehydrogenases, 4) oranı ROS yayın ve enzim aktivitesi ve 5 doğrudan karşılaştırma için izin verebilirsiniz) Seçici rekabetçi inhibitörleri ROS yayımı için tarama sağlar. Bizim grup ve diğerleri bu yöntemi önceki yayınlarda ROS yönetmelik tarafından allosteric incelemek için kullandık ve Redoks yürütmek önce mekanizmaları sinyal mitokondri veya permeabilized kas14,16ile deneyler, 17,19,20.
Değişiklikler ve sorun giderme:
Bu yordamı temel ekipman mevcut hemen hemen her kurum olarak kullanır. Yaklaşım aynı zamanda düşük maliyetli ve ortak kimyasallar çeşitli tedarikçileri ile mevcut kullanır. Her ne kadar biz Sükroz, HEPES, mannitol ve EGTA oluşan bir temel tepki arabellek de çoğu uygulamada çalışır bulduk, arabellek oluşturma göre enzim özellikleri - değişebilir. Ham resorufin floresan değerleri genellikle yaklaşık 0.1 U/mL sulandırılmış enzim bırakmadan bir ROS için 50-500 RFU. Daha yüksek RFU değerleri AUR reaktif otomatik pozlama ışık veya tekrarlanan donma-çözülme nedeniyle okside olmuştur gösterebilir. Bu nedenle, AUR çalışma çözümleri (kullanım sıklığı) bağlı olarak her 2-3 hafta düzenli olarak değiştirilmesi gerekir. Enzim hazırlık veya denatürasyon kirleri normal ROS ve NADH kaynaklar alt yol açabilir. Enzim saflık Jel Elektroforez tarafından düzenli olarak izlenmelidir. Kinetik özellikleri (Km ve substrat için Vmax ve NAD+)-meli da var olmak satın almak veya enzim saflaştırılması hemen sonra değerlendirildi ve o zaman bundan sonra düzenli olarak izlenir. Assay olarak kullanılan reaktifler çoğu stabildir ve birden çok donma-çözülme çevrimleri için tabi. Pyruvate ve α-ketoglutarate Oto-oksidasyon önlemek için-80 ° C'de 100 µL aliquots içinde muhafaza edilmelidir. O2●-/ h2O2 doğrudan den radikal oluşumunda PDHC ve KGDHC (ve potansiyel olarak diğer flavoenzymes)17oluşturur beri azalan bakiyeli ajanlar DTT gibi kullanmaktan kaçının. 37 ° C'de deneyleri yapılabilir; Ancak, bizim grup bu deneyler 25 ° C'de daha tutarlı veri sağlamak için ideal olduğunu buldu.
Teknik sınırlamaları:
Bu teknik ile ilişkili bir büyük engel flavin içeren saf mitokondriyal enzimlerin erişimdir. Burada, biz piyasada bulunan KGDHC ve PDHC bu teknik doğrudan ROS yayın kapasitesi ve enzim aktivitesini flavin içeren mitokondriyal dehydrogenases karşılaştırmak için kullanılabilir göstermek için kullanılır. Ancak, çoğu ROS flavin içeren enzimler üreten ticari olarak mevcut değildir ve laboratuvarda saf olmalı. Bu Bu enzimlerin bazıları membran dikkate alınarak zor olabilir bağlı veya mitokondriyal iç membran için emmek. Yeni protokoller başarılı arıtma membran bağlı flavin içeren enzimler, ROS üretmek için artık kullanılabilir. Ben, karmaşık II ve snBu kompleks için arıtma yöntemleri içerir-gliserol-3-fosfat dehidrojenaz21,22,23. Bu nedenle, yalıtım ve arıtma için listelenen ROS jeneratörlerin en ticari olarak mevcut olmayabilir olsa bile, protokoller bulunmaktadır. Arıtılmış flavin tabanlı enzimler kullanarak toplanan sonuçları fizyolojik uygunluğunu da bir kısıtlamadır. Bu nedenle, saflaştırılmış enzimler ile toplanan bulgular izole mitokondri veya permeabilized doku kullanarak deneyleri ile takibi. Beş ayrı çalışmalar bu yaklaşım ROS yayın Yönetmeliği için mekanizmalar KGDHC ve PDHC14,16,17,19,20tarafından araştırmak için kullanılır. Ön rolü için sonuçlarını ROS yayın kontrol Redoks anahtarları başlangıçta arıtılmış KGDHC ve PDHC kullanarak test edildi ve ardından düzenleme için mekanizmalar daha fazla karaciğer ve kalp mitokondri ve kas lif14analiz edildi, 16,17,20.
Önemi ile ilgili mevcut yöntemler:
ROS ölçme yayın üretim mitokondri içinde bireysel sitelerden de aksi halde neden olabilir O2●-/ h2O2 ve antioksidan sistemleri üretmek rakip yan reaksiyonlar varlığı nedeniyle zor olabilir Yerel oranları küçümseme. Membran potansiyeli de ROS yayın oranları çeşitli sitelerden değiştirebilir ve inhibitörleri kullanımı elektron akışı, O2●-/ h2O2 oluşumu ölçümleri semptomlarıdır değiştirebilirsiniz. Burada sunulan yöntem aynı anda O2●-/ h2O2 ve enzim aktivitesi yerli oranları arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi sırasında ROS yayın kapasitenin dışında bireysel enzimler doğrudan değerlendirilmesi sağlar. Bu ucuz yöntem yerel ROS yayın oranları mitokondri, hücreleri veya doku ile daha sofistike deneyler önce bireysel flavin içeren mitokondriyal enzimlerin için karşılaştırma için bir araç olarak hizmet verebilir. Ayrıca, burada sunulan yöntem etkinliği ve inhibitörleri ile izole mitokondri deneyleri yürütmek önce ROS sürülmesi seçicilik ön ekran için yararlı olabilir.
Gelecekteki uygulamalar:
Burada sunulan yöntem beş ayrı çalışmalarda ROS serbest bırakmak--dan PDHC ve KGDHC14,16,17,19,20üzerinde kontrol araştıran amaçlı kullanılmıştır. Bu çalışmalarda inhibitörleri gösterildi ve ROS yayın ve arıtılmış enzimler kullanarak üreten NADH oranları değerlendirildi. Arıtılmış enzimler ile toplanan sonuçları daha sonra izole mitokondri kullanılarak doğrulanan ve kas lifleri14,16,17,20permeabilized. Bu nedenle, gelecekteki çalışmaları yerel ROS yayın oranları mitokondri, hücreleri ve kas lifleri okuyan amaçlı bir dizi bu yöntem uygulanabilir.
Kritik adımlar iletişim kuralı:
Enzim saflık ve Kinetik özellikleri düzenli olarak izlenmelidir. Hisse senedi reaktif çalışma AUR da sık sık değiştirilmesi. Bu toplanan sonuçları tutarlı sağlayacaktır. Reaktifler ilavesi sırasını başarılı deneme (Tablo 1) çalıştırmak için hayati önem taşımaktadır. İnhibitörleri ROS yayın maksimum inhibisyonu temin için gerekli konsantrasyonu belirlemek için titre. Bu çalışmada, 10 mM KMV seçtik ve 150 µM CPI-613 beri biz daha önce bu konsantrasyonları KGDHC ve PDHC13tarafından ROS yayın maksimal inhibisyonu neden tespit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İfşa etmek bir şey yoktur.
Acknowledgments
Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) tarafından finanse edildi. Video üretim merkezi için yenilik öğretim ve öğrenme (CITL), Newfoundland Memorial Üniversitesi ile işbirliği içinde gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
