Summary
Formazione immagine del tessuto retinico può fornire informazioni di cella singola che non possono essere raccolti dai metodi biochimici tradizionali. Questo protocollo descrive la preparazione delle fette della retina dallo zebrafish per imaging confocale. Fluorescenti geneticamente codificati sensori o indicatore coloranti permettono la visualizzazione di numerosi processi biologici in tipi distinti delle cellule retiniche.
Abstract
La retina è un tessuto complesso che avvia e integra i primi passi della visione. Disfunzione delle cellule retiniche è un segno distintivo di molte malattie accecante, e terapie future cerniera su fondamentali comprensioni circa retinico come le diverse cellule di funzionano normalmente. L'acquisizione di tali informazioni con metodi biochimici ha dimostrato difficile perché i contributi di tipi delle cellule particolari sono diminuiti nell'ambiente delle cellule retiniche. Live imaging retinico può fornire una visualizzazione di numerosi processi biologici a livello subcellulare, grazie a un numero crescente di biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Tuttavia, questa tecnica è stato finora limitata a girini e larve di zebrafish, gli strati retinici esterni di retine isolate o immagine in alta risoluzione inferiore delle retine in animali vivi. Qui presentiamo un metodo per la generazione diretta ex vivo retinica fette dallo zebrafish adulto per l'imaging dal vivo tramite microscopia confocale. Questa preparazione produce in sezioni trasversali con tutti gli strati della retina e la maggior parte dei tipi di cellule visibili per l'esecuzione di esperimenti di imaging confocale mediante perfusione. Zebrafish transgenici esprimenti le proteine fluorescenti o biosensori in tipi specifici delle cellule retiniche o organelli vengono utilizzate per estrarre informazioni di cella singola da una retina intatta. Inoltre, fette della retina possono essere caricati con indicatore fluorescente tinture, aggiungendo alla versatilità del metodo. Questo protocollo è stato sviluppato per l'imaging di Ca2 + all'interno di fotorecettori cono zebrafish, ma con gli indicatori di corretta potrebbe essere adattato per misurare Ca2 + o metaboliti Müller cells, cellule bipolari e orizzontali, microglia, cellule amacrine, o retinica cellule del ganglio. L'epitelio pigmentato retinico è rimosso dalle fette quindi questo metodo non è adatto per lo studio di tale tipo di cella. Con la pratica, è possibile generare fette di serie da un animale per esperimenti multipli. Questa tecnica adattabile fornisce un potente strumento per rispondere alle tante domande sulla biologia delle cellule retiniche, Ca2 +e l'omeostasi energetica.
Introduction
Il danio zebrato (Danio rerio) diventare ampiamente utilizzato nella ricerca scientifica medica e base1, grazie alla sua piccola dimensione, rapido sviluppo e sistemi dell'organo dei vertebrati. La naturale trasparenza delle larve di zebrafish combinati con metodi stabiliti per transgenesi hanno permesso la visualizzazione dettagliata dei processi cellulari in un animale vivente. Un numero di biosensori fluorescenti geneticamente codificati è stati presi di mira alle cellule di zebrafish specifico per rilevare il Ca2 + 2, perossido di idrogeno3, apoptotico attivazione4 e ATP5.
In vivo imaging delle larve di zebrafish ha portato innovazioni nel campo delle neuroscienze, tra cui la mappatura del cervello circuito6 e7di disturbi dello sviluppo del farmaco per il sistema nervoso centrale. Zebrafish sono adatti per ricerca sulla visione, perché le loro retine presentano la struttura laminare e tipi di neurone dei vertebrati superiori, e mostrano comportamenti visual robusto8,9. Diversi tipi di degenerazioni retiniche analoghe alla malattia umana sono stati modellati con successo e ha studiati in zebrafish10,11, compreso formazione immagine diretta dei singoli fotorecettori che degenera in una retina2, 12.
Mentre in vivo imaging larvale zebrafish è uno strumento prezioso, diventa più difficile come pesci crescono e si sviluppano pigmentazione, e alcuni trattamenti farmacologici non possono superare un animale intero. Ulteriormente, alcuni processi cellulari cambiano con lo sviluppo e l'età, rendendo più tardi tempo punti critici per la funzione di comprensione e la progressione della malattia negli animali adulti. Metodi biochimici quali immunoblot, quantitative PCR, il consumo di O2 e analisi metabolomica possono fornire importanti indizi sulla biologia della retina nel suo complesso, ma è difficile discernere contributi singoli tipi di cellule colpiti da malattia. Tessuto retinico isolato ex vivo di imaging consente di ignorare questi problemi e mentre imaging piatto montate retine offre una vista della retina esterna13, funzionalità retinica interna più profonda sono oscurati. Le sezioni trasversali retiniche, come quelli presentati fissa le analisi di immunohistochemical, permettono una visione chiara di tutti i livelli e tipi di cellule, ma offrono solo un singolo snapshot dei processi dinamici coinvolti nella malattia e nella funzione normale.
Qui, presentiamo un metodo per la generazione ex vivo sezioni trasversali retiniche dallo zebrafish adulto per l'imaging. È simile ai metodi per la preparazione di fette retiniche anfibio e zebrafish per studi elettrofisiologici e morfologici14,15, con importanti modifiche per time lapse imaging ex vivo mediante confocale microscopia. Le risposte di fluorescenza di biosensori o coloranti a fette sono monitorate in tempo reale con un microscopio confocale offrendo agenti farmacologici mediante perfusione. Mentre il metodo è stato sviluppato per l'imaging di fotorecettori, può essere fattibile per utilizzarlo per la visualizzazione di celle Müller, cellule bipolari, cellule orizzontali, cellule amacrine o cellule retiniche del ganglio con appropriati marcatori fluorescenti. Inoltre, le fette possono essere caricati con coloranti fluorescenti cellula-permeabile di attuabilità delle cellule di relazione, trasporto vescicolare, funzione mitocondriale o stato redox. Questa preparazione versatile permette la visualizzazione di una vasta gamma di processi subcellulare in tutta la retina, tra cui Ca2 + dinamiche, trasduzione del segnale e dello stato metabolico.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università di Washington istituzionale Animal Care e Comitato di uso.
1. preparazione di animali e le attrezzature
Nota: L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un foglio scuro del tessuto che circonda la parte esterna della retina cui pigmentazione può oscurare la funzionalità retinica e danneggiare il tessuto quando confocale imaging ex vivo. Nel buio, RPE di zebrafish è retratto dalla retina; buio si adattano pesce per facilitare la futura rimozione del RPE dalla retina prima di affettare e imaging.
- Trasferire il pesce in un serbatoio di deposizione delle uova riempito con acqua di pesce e poi avvolgere il carro armato di deposizione delle uova con tessuto scuro oppure inserirlo in un armadio scuro.
- Buio si adattano zebrafish per almeno 1 h prima dell'eutanasia per consentire vicino separazione completa del RPE dalla retina. adattamento all'oscurità 30 min è sufficiente rimuovere la maggior parte delle RPE, anche se parti di esso potrebbero rimanere intercalate tra fotorecettori.
- Sciogliere ~ 15 mL di petrolio della gelatina in un becher da 50 mL su un piatto caldo e quindi disegnare 3 mL di liquido in una siringa di punta di slittamento di 3 mL. Invertire la siringa, posto in una rastrelliera per provette e consentono la gelatina di petrolio raffreddare.
- Fare un alloggiamento per affettare riutilizzabile su un vetrino da microscopio semplice 7 X 2,5 cm.
- Utilizzando smalto trasparente, vernice strette linee per creare un rettangolo di 3 X 2,5 cm al centro della diapositiva, lasciarlo asciugare e poi aggiungere un altro strato di smalto per le linee.
- Preparare scalette imaging su vetrini per tenere fette durante la formazione immagine. Le fette si formeranno i "gradini" della scala.
- Per formazione immagine statica o esperimenti di iniezione con flusso soluzione minima, fare scale di vaselina composto da due strisce piatte paralleli di vaselina sui vetrini 18mm quadrato in vetro. Usare la siringa per applicare due appiattito ~ strisci lungo 1cm di vaselina raffreddato 0,5 cm di distanza su vetrini coprioggetto.
- Pronto l'affettatrice di tessuto.
- Pulire la lama di un rasoio doppio bordo con etanolo e lasciare asciugare all'aria. Tagliate in quarti con le forbici, in primo luogo longitudinalmente in due parti per poi attraversare ogni lama.
- Posizionare la camera di affettare sul palco dell'affettatrice del tessuto, centrarlo orizzontalmente sul palco e segnare un bordo lungo con pennarello indelebile per l'allineamento.
- Caricare una sezione della pala sul braccio di affettatrice del tessuto, assicurarsi che la lama si trova piatto e centrato sulla diapositiva senza toccare lo smalto di chiodo, poi stringere con delicatezza l'apparato di lama. Abbassare il braccio di lama regolando la manopola ¼ girare, quindi posizionare un pezzo di carta da filtro nel centro della sezione imaging e test di tagliarlo. Se la carta non viene tagliata completamente attraverso, rimontare la lama.
- Utilizzando la siringa, posizionare un singolo puntino di vaselina raffreddato in una capsula Petri 10 cm ~ 1,5 cm a destra del centro. Premere una scaletta di imaging in esso usando il forcipe con la gelatina di petrolio rivolto verso l'alto. Fare un altro piccolo vaselina punto ~ 1 cm dal bordo di entrata della camera imaging.
- Inserire la siringa di gelatina di petrolio con un ago di 20g e stappare esso. Tenere l'ago sulla siringa e usarlo per fare due strisce di parallelo lungo e sottile di 1 cm di vaselina longitudinalmente nel centro della camera di taglio. Spazio le strisce ~ 1 cm di distanza.
- Fare uno strumento riutilizzabile cavo del ciclo di occhio avvolgendo il centro di un ~ segmento di 4 cm di filo di tungsteno 30g intorno a una coppia di pinze una volta chiusa. Regolare il diametro del loop facendo scorrere il filo verso l'alto o verso il basso la pinza fino a quando non è in genere leggermente più grande di un occhio di zebrafish, ~ 2-3 mm. le estremità del filo di torsione e fissarli all'estremità di un bastone di legno di 6 cm con del nastro di laboratorio.
- Preparare la soluzione di Ringer.
- Scongelare i 50 X integratore soluzione madre (tabella 1) e aggiungerlo fresco alla soluzione di Ringer tamponata HEPES, non-bicarbonato (tabella 2) al mattino dell'esperimento; Diluire 200 µ l di soluzione di riserva di supplemento in ogni 10 mL di soluzione di Ringer in una provetta conica per centrifuga o bottiglia di vetro sterile. Per gli esperimenti di imaging statici, preparare almeno 30 mL di soluzione di Ringer per esperimento. Il volume di soluzione di Ringer, necessarie per gli esperimenti di perfusione dipenderà la portata e l'esperimento totale ora.
- Verificare che il pH della soluzione completato utilizzando una sonda pH digitale o carta pH 7.4 e regolare di conseguenza con diluire NaOH o HCl.
- Ossigenare la soluzione di Ringer completati su ghiaccio dalla bollitura con 100% ossigeno e gas per almeno 5 min utilizzando una bombola di ossigeno medicale standard e regolatore dotato di un tubo flessibile, o il collettore della vasca di gorgogliamento di gas opzionale utilizzato per aspersione. Conservare la soluzione di Ringer ossigenato sul ghiaccio in una provetta conica per centrifuga sigillato o bottiglia di vetro sterile vicino il microscopio di dissezione; utilizzare questa soluzione per dissezione, imaging e diluire coloranti o agenti farmacologici.
- Se altre soluzioni vengono utilizzati nell'esperimento, come Na+-gratis la soluzione di Ringer (tabella 3), ripetere i passaggi 1.9.1.-1.9.3.
- Raccogliere le capsule di Petri, forcipe, micro-forbici e altri strumenti vicino il microscopio di dissezione e preparare un bagno di ghiaccio d'acqua di pesce per l'eutanasia di zebrafish.
2. preparare fette della retina (Vedi Figura 1)
- Lavorare sotto rosso luce ambiente per ridurre al minimo adattamento alla luce (che può fare il bastone di RPE più strettamente alla retina), eutanasia zebrafish per immersione in bagno di ghiaccio, fino a quando la risposta al tocco è persa, in genere 1-2 min. trasferire il pesce in una capsula di Petri e utilizzare un bisturi per dislocare le cervicale ma non decapitare il pesce.
- Utilizzare l'anello del filo per allentare il tessuto connettivo intorno un occhio e poi tirare l'occhio in avanti delicatamente con il ciclo in una mano. Utilizzando micro-forbici in altra mano, tagliare il nervo ottico bianco sotto l'occhio, facendo attenzione a non per tagliare la parte posteriore dell'occhio.
- Trasferire l'occhio usando il forcipe per una piastra Petri di soluzione di Ringer lattato freddo sul ghiaccio e ripetere per il secondo occhio. Tenere gli occhi nel buio o sotto la luce rossa fino a quando RPE è rimosso dalla retina.
- Sezionare le conchiglie sotto un microscopio di dissezione di bassa potenza in una goccia di soluzione di Ringer lattato freddo su un vetrino di pianura in una capsula di Petri.
- Perforare la cornea con una pinzetta, poi rimuovere delicatamente i pezzi di clear, fragile cornea e sclera argentea con pinze o forbici. Rimuovere e gettare la lente e la maggior parte della sclera (Vedi Figura 1A) e gestire l'oculare isolato minimamente.
- Pezzi di grasso, piccoli pezzetti di sclera e nero RPE possono rimanere attaccati alla conchiglia oculare e rimosso dalla retina più tardi. Se la retina si separa dal RPE al punto 2.4.1, procedere con la stessa procedura utilizzando prestare particolare attenzione di non per danneggiare la delicata retina isolata.
- Posizionare il lato aperto oculare verso il basso (RPE fino) sulla diapositiva e tagliarle a terzi o quarti con una lama di rasoio monotaglio fresco in un unico movimento (cfr. Figura 1B). Eliminare parti di tessuto che sono altamente curvi.
- Monte Piana retina su carta da filtro.
- Bagnare un pezzo di carta da filtro con soluzione di Ringer e inserirlo nella diapositiva accanto i pezzi di conchiglia oculare. Utilizzare pinze piatte quando si maneggia la carta da filtro bagnata intatta per evitare la puntura. Aggiungere la soluzione di Ringer lattato freddo per coprire sia il filtro di carta e tessuto.
- Utilizzando forcipe in ogni mano, trascinare con attenzione la carta da filtro sotto ogni pezzo oculare con la RPE e fotorecettori rivolto verso l'alto, cioè con la parte posteriore dell'occhio rivolto verso l'alto. Posizionare i pezzi di conchiglia oculare in una singola riga lungo il centro della carta da filtro (Vedi Figura 1). Manipolazione dei pezzi di conchiglia oculare delicatamente con una pinzetta solo vicino a un bordo o un angolo.
- Per aiutare le retine a rispettare la carta da filtro, inserire il filtro di carta bagnato su un tovagliolo di carta a secco per 3 s di stoppino umidità verso il basso, ma non lasciare che il tessuto diventi secco. Ripetere fino a quando i pezzi di conchiglia oculare stendersi sulla carta da filtro. Applicare aspirazione delicata alla parte inferiore della carta da filtro consente di appiattire la retina, ma questo passaggio non è indispensabile.
- Se lenzuola nere di RPE rimanga i pezzi di conchiglia oculare, utilizzare una pinzetta per staccarla delicatamente via partendo da uno angolo (Vedi Figura 1) mentre il tessuto è seduto in una goccia di soluzione di Ringer. La retina si dovrebbe sollevare fuori la carta da filtro, ripetere il passo traspirante in 2.5.3. La retina può apparire rosa a causa di pigmenti visivi non candeggiati.
- Ripetere la dissezione di retina e piatto montaggio passi in 2.4-2.6 per il secondo occhio, se lo si desidera, mantenendo la retina piatto montato prima immersa in soluzione di Ringer lattato freddo. Per semplificare la procedura per affettare, pezzi di entrambe le retine possono essere posizionati su una carta da filtro. Una volta RPE è stato rimosso, il protocollo può essere effettuato sotto la luce normale camera a meno che gli esperimenti richiedono oscurità.
- Inserire la carta da filtro in una diapositiva e tagliarla in un rettangolo con una lama di rasoio singolo bordo, lasciando ~ 0,5 cm di carta da filtro su entrambi i lati della linea di retine. Spostare la carta da filtro alla camera preparata per affettare, spingere i bordi della carta da filtro lungo le linee di sottile vaselina usando il forcipe e immergere le retine in 3-4 gocce di soluzione di Ringer lattato freddo.
Nota: Alcuni coloranti, quali coloranti lipofilici, meglio vengono caricati nella piana monta in questa fase prima di affettare. Possono essere caricati, wicked distanza con un fazzoletto e lavati in aula per affettare. Per esempio, C12 558/568 BODIPY intensamente macchie retinica delle cellule membrane e segmenti esterni del fotoricettore (Vedi Figura 4A) quando caricato a ~ 5 µ g/mL per 15 min a temperatura ambiente (in genere 23-27 ° C), seguita da un lavaggio in soluzione di Ringer lattato in eccesso . - Trasferire la camera di taglio per la fase di sezionamento del tessuto, posizionare il lato lungo lungo la linea segnata e fissare le estremità di alloggiamento sul palco con nastro di laboratorio. A partire da un'estremità, tagliare la retina e la carta da filtro con pressione costante, dolce sul braccio per affettare. Verificare che la prima fetta è stata tagliata completamente, quindi utilizzare il micrometro per tagliare ~ 400 µm fette.
- Montare la scala imaging.
- Posto la camera di taglio con affettato in sezioni retinica di Petri dal passaggio 1.7 adiacente per l'imaging della scala (Vedi Figura 1E). Riempire il piatto con soluzione di Ringer lattato freddo per sommergere il suo contenuto.
- Usando il forcipe e mantenendo fette sommersi, delicatamente trasferimento strisce di carta da filtro e retina per la scala facendo scorrere la piastra di Petri da sinistra a destra. Fare attenzione a non per toccare direttamente le retine. Ruotare le sezioni 90° e seppellire i bordi della carta da filtro in gelatina di petrolio.
- Finemente Posizionare fette retiniche nella scala con una pinza in modo che strati retinici sono chiaramente visibili sotto il microscopio di dissezione (Vedi Figura 1). Per le fette su ciascuna estremità della scala, assicurarsi che il tessuto sia rivolta verso l'interno verso le altre fette per minimizzare il movimento del tessuto durante l'iniezione o flusso. Scartare le sezioni della retina che non sono bene rispettati la carta da filtro (Vedi Figura 2A).
- Se lo si desidera, caricare coloranti fettine retinica in questa fase e lavare in soluzione di Ringer lattato in eccesso prima di formazione immagine.
Nota: Ioduro di propidio (PI) e Hoechst 33342 robustamente macchia i nuclei di morti e di tutte le cellule, rispettivamente (Vedi Figura 2B), quando incubati con fette retiniche a 5 µ g/mL per 20 min a temperatura ambiente. Tetrametilrodamina (TMRM) si accumula mitocondri attivamente uccida in tutto la retina quando incubati a 1 nM per 30 min a temperatura ambiente. - Mentre le fette sono macchiatura, preparare l'apparato di iniezione e camera di imaging. Usare la siringa per sciacquare il tubo con soluzione di Ringer e bolle di spurgo, collegare l'estremità aperta del tubo all'ingresso camera imaging e chiudere il rubinetto. Rimuovere la siringa e riempirla con contenuti nel reagente per iniezione, quindi ricollegare il tubo.
- Utilizzare pinze per trasferire il coprioggetto con fette retiniche alla camera di formazione immagine, premendo il coprioggetto nel puntino della gelatina di petrolio vicino al bordo di entrata della camera imaging (vedere la Figura 1 H). Riempire la camera imaging con soluzione di Ringer per coprire le fette.
3. imaging retinici fette
- Posizionare la camera riempita di imaging con l'apparato di iniezione collegato sul palco di un microscopio confocale verticale dotato di un acqua X 20 o 40 immersione lente. Fissare la camera imaging con clip di fase.
- Abbassare la lente tuffantesi sopra la scaletta e concentrarsi su una fetta a un'estremità della scala sotto la luce fioca di trans-illuminato. Esaminare ogni fetta per orientamento trasversale, la presenza di segmenti esterni del fotoricettore e sicura adesione per la carta da filtro.
- Selezionare la sezione migliore per l'imaging del lasso di tempo e configurare il software di microscopio per acquisizione di immagini di lasso di tempo. Tabella 4 illustra le impostazioni tipiche di imaging per vari marcatori fluorescenti e coloranti.
Nota: Il tasso di acquisizione di immagini variano a seconda il microscopio fluorescente marker(s) e processo biologico in fase di studio. Ad esempio, utilizzare 800 x 800 pixel di risoluzione, velocità di scansione: 2 µs/pixel e un 10-s frame rate per imaging dinamica del calcio nei fotorecettori con GCaMP3 e un colorante rosso.- Se disponibile, è possibile utilizzare il software per rintracciare i luoghi d'interesse fisici nella fetta (segmenti esterni del fotoricettore, corpi delle cellule, i nuclei) per aiutare i potenziale riorientamento durante il lasso di tempo. Anche impostare il software per monitorare in tempo reale fluorescenza tutta la fetta.
- Begin imaging e monitor fluorescenza della linea di base. Quando fluorescenza attraverso la fetta si stabilizza (in genere entro 2-5 min), procedere con l'esperimento. Per iniezione, aprire il rubinetto della siringa, poi lentamente deprimere e tirarsi indietro lo stantuffo due volte per facilitare la miscelazione.
Nota: per esempio, abolire la funzione mitocondriale iniettando una soluzione concentrata di protonophore CCCP per raggiungere una concentrazione finale di 1 µM nella camera di imaging. Questo induce un robusto Ca2 + scoppiare in cytosol del fotoricettore segnalato da GCaMP, quindi una diminuzione costante nel potenziale di membrana mitocondriale, segnalato da TMRM. - Strettamente monitorare fette per drift durante l'esperimento e utilizzare il software per fare micro-regolazioni secondo punti di riferimento fisici. In genere deriva in direzione Z durante l'iniezione o l'aspersione è < 5 µm.
4. imaging retinici fette durante gli esperimenti di perfusione dove le soluzioni vengono modificati o scorreva continuamente
Nota: Imaging retinico fette durante gli esperimenti di perfusione cui soluzioni vengono modificate o scorreva continuamente è simile alla configurazione per esperimenti di imaging o iniezione statici, con le seguenti modifiche.
- Invece di vaselina scale descritte al punto 1.4, utilizzare scale di cera più robuste per tenere fette retiniche costante durante il flusso di soluzione.
- Posizionare due piccoli cilindri paralleli di Cera dentaria unflavored ~ 0,5 cm di distanza su un vetrino coprioggetti. Su una superficie piana, utilizzare il pollice per premere giù e fuori verso il bordo parallelo del coprivetrino ogni cilindro. Punteggio ottenuto entrambi cilindri appiattiti orizzontalmente con un vetrino coprioggetto #1 (Vedi Figura 1E, lato destro) quindi spalmano un sottile strato di gelatina di petrolio tra le strisce di cera con una spatola.
- Durante il montaggio la scaletta imaging nel passaggio 2.10.2, premere i bordi di carta da filtro tagliata nei punteggi di cera utilizzando una pinzetta (Figura 1).
- Per impostare per aspersione al punto 2.12, riempire serbatoi siringa con soluzioni preoxygenated o utilizzare il collettore gas opzionale per ossigenare soluzioni in ogni serbatoio. Lavare tutte le tubazioni con soluzione di Ringer, garantire che tutte le linee di flusso quando aperto ed eliminazione dei fogli inceppati grandi bolle.
- Prima di riempire la camera di imaging al punto 2.13, usare la siringa per mettere un altro punto di vaselina sopra ogni spigolo esposto del coprivetrino per evitare che scivolino lateralmente durante il flusso.
- Quando la camera di imaging è riempita e montata sul tavolino del microscopio, accendere l'aspiratore e collegare il tubo dell'aspiratore. Verificare il flusso della soluzione di Ringer e utilizzare il micropositioner per situare il tubo aspiratore sopra la camera di deflusso in modo che piccole quantità di liquido disegnati prima che la camera di overflow (in genere ~ 1 mm sopra la superficie di soluzione per una portata di 2 mL/min). Mantenere la soluzione di Ringer che scorre mentre si selezionano le fette al punto 3.4.
- Per condurre l'esperimento al punto 3.4 per aspersione, passare il flusso delle soluzioni chiudendo il rubinetto della prima soluzione durante l'apertura che la seconda soluzione.
- Per esempio, per esaurire extracellulare Na+ dal vano di imaging, utilizzare due serbatoi siringa riempite con soluzione di Ringer o Na+-libera soluzione (tabella 3). Soluzione di Ringer per stabilire la linea di base, quindi passare a Na+di flusso-soluzione gratuita. Ciò provoca grande Ca citosolico2 + aumenta nei segmenti esterni dei fotorecettori e corpi cellulari (Vedi Figura 4).
- Per sistemi di perfusione di gravità, è necessario monitorare il livello della soluzione in ciascun serbatoio quindi la portata è costante durante la formazione immagine. Coronare il serbatoi secondo necessità con soluzioni ossigenati, o mantenere continuo ossigeno spumeggiante con valvola del gas.
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Representative Results
Posizionamento stabile e orientamento trasversale delle fette sono la chiave a successo imaging con iniezione o aspersione di agenti farmacologici. Esaminare attentamente e riposizionare le fette prima di imaging confocale come necessario per garantire a tutti gli strati della retina sono visibili (Figura 2A, sezione ii). Se una fetta è ruotata leggermente in avanti (Figura 2A, sezione iii), fasci di segmenti esterni saranno visibili e possono effettuare piccole regolazioni con forcipe degli strati retinici desiderati di mettere a fuoco. Fette scarsamente rispettati la carta da filtro (Figura 2A, affettare i) o il mantenimento di RPE (Figura 2A, affettare iv) non deve essere utilizzato per l'imaging del lasso di tempo.
La vitalità cellulare è fondamentale per osservare processi fisiologici ex vivo; una vitalità cellulare macchia come ioduro di propidio (PI) è raccomandato di saggiare la salute delle cellule mentre pratica retina affettare. Le cellule morte vicino a bordo di taglio di tutte le sezioni si accumuleranno PI nei loro nuclei (Figura 2B, pannelli a sinistra), mentre 5-10 µm più profondo nella slice, le cellule sane con morfologia normale e nessuna colorazione PI possono essere imaged. Ad esempio, nei fotorecettori, cellule negative PI sotto il bordo del taglio comunemente visualizzare una morfologia stereotypical polarizzata, di forma allungata (Figura 2B, pannelli di destra). Fotorecettori rimangono vitali in fette retiniche per almeno 4 ore se conservato in soluzione di Ringer ossigenato.
Molte strutture cellulari della retina possono essere visualizzate utilizzando combinazioni di marcatori transgenici e coloranti; esempio immagini confocal di fette fresche della retina con Contrassegno fluorescente doppie e triple sono presentate nella Figura 3. Per visualizzare la dinamica del cono del fotoricettore del reticolo endoplasmatico (ER) rispetto al nucleo, retiniche fette da pesci transgenici che esprimono GFP mirati a cono ER17 possono controcolorati con un colorante nucleare (Figura 3A). Una simile strategia può essere impiegato per visualizzare il citoscheletro di actina utilizzando retiniche fette dallo zebrafish transgenici che esprimono actina fusi con GFP18 (Figura 3B). Con un'altra cellula-specifico promotore, cellule di Müller possono essere etichettate con la proteina fluorescente rosso tdTomato19 e visualizzate in fette retiniche (Figura 3, pannello superiore). L'assorbimento del glucosio nella retina possa essere dosati in vivo di oralmente gavaging di zebrafish adulto con un analogico glucosio fluorescente (NBDG), che diventa parte integrante le celle visibili in una fetta della retina21 (Figura 3, pannello inferiore). Zebrafish transgenici doppio può essere impiegato per monitorare più processi delle cellule o tipi cellulari in tandem, come Ca2 + dinamiche in un sottotipo di coni. Figura 3D Mostra un triplo schema di etichettatura per questo tipo di esperimento, con tdTomato espressa in lunghezza d'onda coni2 insieme al targeting per mitochondrially Ca2 + sensore (mito-GCaMP) espressa in tutti i coni22 e una macchia nucleare.
Formazione immagine del lasso di tempo delle cellule retiniche è un vantaggio chiave di questa fetta di prep. Per esempio, Ca2 + fluttuazioni nel citosol dei fotorecettori cono possono essere osservate e successivamente quantificate durante la manipolazione farmacologica, un esperimento descritto in Figura 4. Figura 4A Mostra retiniche Slice esprimendo il Ca2 + sensore GCaMP2 (in alto) o controllo eGFP16 (in basso) nei fotorecettori cono controcolorati con una tintura rossa lipofilica. In questo esperimento Na+ isotonically è impoverito dalla camera di imaging mediante aspersione, evocando i grandi aumenti in citosolico Ca2 + per il segmento esterno e il corpo cellulare come riflesso di GCaMP (Figura 4A, pannello superiore). Fette di fluorescenza della retina che esprimono Ca2 +-eGFP insensibile è influenzato da questo trattamento (Figura 4A, pannello inferiore). Film di lasso di tempo possono essere analizzati utilizzando il software ImageJ per isolare e quantificare le risposte di fluorescenza da segmenti esterni cono singolo, corpi cellulari e sinapsi (Figura 4B).
| Soluzione di supplemento | ||
| 50 x stock * concentrazione (mM) | concentrazione di lavoro (mM) | |
| D-glucosio | 500 | 10 |
| lattato di sodio | 50 | 1 |
| piruvato di sodio | 25 | 0,5 |
| L-Glutammina | 25 | 0,5 |
| glutatione ridotto | 25 | 0,5 |
| acido ascorbico | 15 | 0.3 |
| * conservare le aliquote a-20 º c < 6 mesi; aggiungere fresco alla soluzione di Ringer | ||
Tabella 1. Componenti di 50 X integrano la soluzione di riserva e le concentrazioni finali di lavoro.
| Soluzione di Ringer | |
| concentrazione (mM) | |
| NaCl | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH 7.4 usando NaOH | |
| conservare a 4 ° c in bottiglia sterile < 1 mese | |
Tabella 2. Componenti della soluzione di Ringer standard.
| Na+-senza soluzione di Ringer | |
| concentrazione (mM) | |
| TRIS | 147 |
| HCl | 120 |
| KCl | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH 7.4 utilizzando HCl | |
| conservare a 4 ° c in bottiglia sterile < 1 mese | |
Tabella 3. Componenti di Na+-senza soluzione di Ringer.
| Impostazioni di Imaging confocale | |||
| Fluoroforo | Eccitazione | Filtro di emissione | |
| Lunghezza d'onda | Intensità del laser | ||
| GFP (compreso GCaMP) | 488 nm | 2 - 5% | eGFP o AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 nm | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10% | eGFP o AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
Tabella 4. Condizioni di formazione immagine per marcatori fluorescenti e coloranti presentati nella Figure 2-4.
Figura 1. Schematica per la preparazione di freschi zebrafish retinica fette. (A) distanza sezionare il paraocchi e scartare lente e sclera (passo 2.4.1.). (B) tagliare il paraocchi in tre pezzi; scartare il pezzo piccolo bordo (passo 2.4.2.). (C) trascinare la carta da filtro sotto pezzi di conchiglia oculare con retina interna rivolta verso la carta da filtro (passo 2.5.1.-2.5.2.). (D) Flatten retina utilizzando un tovagliolo di carta per favorire la soluzione di Ringer verso il basso attraverso il filtro di carta (punto 2.5.3.), poi Sbucci delicatamente distanza rimanente RPE con forcipe (punto 2.6). Spostare la carta da filtro alla camera di taglio sul palco affettatrice del tessuto e tagliare 400 µm fette (passi 2.8., 2,9.). (E) trasferimento affettare camera con le fette e una scala di cera o vaselina per una capsula di Petri della soluzione di Ringer (fase 2.10.1.). (F) utilizzare una pinzetta per estrarre singole fette dal vano di affettare alla scala mantenendo fette sommersi. (G) ruota carta da filtro strisce (nero) 90 ° e seppellire i bordi della carta da filtro in cera o vaselina (passaggi 2.10.2.-2.10.3.). (H) schema della sezione imaging finale caricato con una scaletta e fette. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esempi di zebrafish fresco retinica fette visualizzati da una corretta adesione alla carta da filtro e vitalità cellulare. (A) immagine di campo chiaro di fette fresche della retina in una scala di vaselina. Sezioni ii e iii visualizzare buona adesione e strati retinici trasversali. Fette di i e iv hanno mantenuto sostanziale RPE, o sono altamente curvo e non ben rispettati la carta da filtro e non dovrebbe essere imaged. Barra della scala = montaggio 200 µm. Z Top-down (B) di una fetta della retina fresca dallo zebrafish transgenici che esprimono eGFP nei fotorecettori cono (Tg(gnat2:eGFP)16). Colorante Hoechst etichette di tutti i nuclei; propidio ioduro (PI) controcolorazione etichette di nuclei di cellule morte, che appaiono vicino al bordo di taglio della fetta (a sinistra). Dimensione passo Z-stack = 1 µm; barra della scala = 20 µm. condizioni di imaging fluorescenti sono indicate nella tabella 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Immagini confocal di doppio e triplo-etichettati ex vivo retinica fette dallo zebrafish adulto transgenici campione. (A) schema di imaging di due colori che impiegano transgenici GFP taggato reticolo endoplasmatico coni (Tg(gnat2:calr-GFP)17, parte superiore) con colorante di contrasto nucleare Hoechst (blu, in basso). (B) GFP etichettato actina nei coni (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, top) con colorante di contrasto nucleare Hoechst (blu, in basso). (C) RFP etichettati cellule di Müller (Tg(GFAP:tdTomato)19, parte superiore) da un zebrafish alimentati glucosio fluorescente (NBDG) dimostrando l'assorbimento del glucosio in coni20,21 (verde, in basso). (Questa immagine è da Figura 2B di Kanow, et al. 21) (D) esempio di tre colori imaging utilizzando zebrafish transgenici doppio. Sinistra, RFP mirati ai fotorecettori cono di lunghezza d'onda (Tg(trβ2:tdTomato)2). Centro, biosensore calcio GCaMP mirati ai mitocondri di cono fotorecettore (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). Bene, sovrapposte immagini di tdTomato (magenta), mito-GCaMP (verde) e colorante di contrasto nucleare Hoechst (blu). Le immagini sono intensità massima Z-proiezioni di 9 telai sopra una profondità di tessuto 7 µm; scala bar rappresentano 10 di µm. fluorescente condizioni imaging sono indicate nella tabella 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. CA2 + imaging con GCaMP e controllo eGFP. (A) immagini rappresentative di fette fresche della retina, esprimendo il fluorescente Ca2 + biosensore GCaMP (gnat2:GCaMP32, parte superiore) o eGFP (in basso) nei fotorecettori cono. Sinistra, fette alla linea di base; bene, fette 2 min dopo Na+ isotonically è stato impoverito dalla camera di imaging mediante perfusione di un Tris-basato soluzione di Ringer lattato, che intrappola Ca2 + nei fotorecettori. Barre di scala = 10 µm. condizioni di imaging fluorescenti sono indicate nella tabella 4. (B) significa cambiamenti di fluorescenza dei compartimenti del singolo fotoricettore (segmenti esterni, corpi cellulari e sinapsi) durante la formazione immagine del lasso di tempo di svuotamento Na+ . Fette erano imaged ogni 10 s, gli stack sono stati elaborati utilizzando ImageJ e fluorescenza di GCaMP o di eGFP è stata normalizzata per segnalare dalla tintura di membrana. Linee continue, GCaMP (n per segmenti esterni = 15, corpi cellulari = 24, sinapsi = 26); linee tratteggiate, eGFP (n per segmenti esterni = 26, corpi cellulari = 20, sinapsi = 31). Barre di errore rappresentano errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ex vivo imaging di zebrafish fresco fette retinica ha dimostrato di essere un versatile strumento per lo studio del fotoricettore biologia20,21,22ed è unico in quanto permette l'analisi delle singole cellule in un maturo, completamente retina differenziato. Con la pratica, è possibile condurre esperimenti multipli con il tessuto da un singolo pesce, utilizzando anche fette di serie dalla stessa parte della retina. Oltre alle sfide e suggerimenti relativi alla preparazione delle fette della retina anfibio per studi di elettrofisiologia14, ci sono considerazioni importanti per l'imaging di esperimenti.
Per fotorecettori, attuabilità delle cellule è in genere correlato con morfologia delle cellule, quindi è importante gestire la retina delicata minimamente, particolarmente dopo l'EPR è stato rimosso. Dopo il taglio, è necessario utilizzare una pinzetta per far scorrere delicatamente fette orizzontalmente dalla camera di taglio (Figura 1F) per trasferirli alla scala piuttosto che di fette di sollevamento verso l'alto e tenere sempre fette immersi in soluzione di Ringer. Se possibile, montare la scala delle fette della retina vicino al microscopio confocale per minimizzare i danni a fette da agitazione durante il trasporto.
Forte adesione del tessuto retinico per la carta da filtro è fondamentale per la creazione di fette che rimarranno stabile durante gli esperimenti di iniezione o aspersione. È necessario ispezionare attentamente ogni fetta per morfologia e stabilità appena prima di imaging (Figura 2A); picchiettando delicatamente il tavolino portaoggetti mentre visualizzazione fetta movimento attraverso la lente oculare confocale rivela la stabilità di una determinata sezione. Nonostante le precauzioni, deriva in direzione Z durante l'iniezione o perfusione può presentare particolari difficoltà per l'analisi, quindi è utile caricare una tintura di controllo, come coloranti lipofilici per membrane e mitocondri, a stabilmente etichettare una struttura della cella identificabile per normalizzazione (Figura 4A, magenta). Se fette deriva > 10 µm in direzione Z non sarebbe possibile estrarre i dati di cella singola utilizzabili. Deriva moderata in direzione X-Y può essere corretto in post-elaborazione con software di registrazione come MultiStackReg per ImageJ (RRID:SCR_002285).
In condizioni statiche, la fluorescenza dei marcatori in fette retiniche dovrebbe rimanere stabile, anche se photobleaching può verificarsi durante la formazione immagine. Prestare la massima attenzione a minimizzare l'esposizione laser durante il lasso di tempo dalla raffinazione parametri quali intensità del laser, scansione velocità e frequenza fotogrammi. Comandi di imaging sono suggeriti per ogni marcatore fluorescente utilizzato. I controlli includono l'iniezione che irrora la soluzione di Ringer senza agenti farmacologici negli esperimenti separati o conducendo esperimenti imaging con marcatori non biosensore che reagiscono in costitutivamente.
A seconda del laser confocale eccitazione utilizzato, pigmenti nel RPE possono contribuire alla autofluorescenza e persino generare calore durante imaging, quindi è importante rimuovere la maggior parte di questo tessuto prima di affettare. Dark-Adapting aids animali nella rimozione del RPE, riducendo al minimo i danni alla retina sottostante. Incapacità di RPE di immagine è una limitazione di questa fetta di preparazione, anche se questo può essere superato utilizzando animali albini con un trasparente RPE. Un'altra limitazione è che le cellule retiniche del ganglio e piedi fine delle cellule di Müller possono diventare oscurati da vista dalla carta da filtro; come una preparazione alternativa retine possono essere piatte montato con il lato del fotoricettore giù su carta da filtro e poi affettato per fornire una visione più chiara della retina più interna. È anche importante notare che le proiezioni orizzontali e lunghe di alcune cellule, quali cellule amacrine ampio campo, siano separabili durante la dissezione o affettare. Una limitazione finale è che molti coloranti fluorescenti si accumulano non specifico nei segmenti esterni del fotoricettore, quindi per questa parte della retina si consiglia di biosensori uso geneticamente codificato piuttosto che indicatore coloranti.
Data l'ampia gamma di reporter delle cellule fluorescenti disponibili coloranti23,24 per tessuto e geneticamente codificati biosensori fluorescente utilizzati con successo in zebrafish2,3,4, 5, questa preparazione fetta potrebbe essere utilizzato per lo studio di numerosi processi biologici in diversi tipi di cellule retiniche (Vedi esempi in Figura 3, , Figura 4). Fette fresche della retina, usando la microscopia di Super-risoluzione di cellule vive di imaging potrebbe anche fornire emozionanti nuove comprensioni per funzione retinica e la salute a livello subcellulare. Inoltre, questo metodo può essere adattato per l'ex vivo imaging di mouse fette retinica25. Mentre la corretta preparazione di fette fresche della retina richiede pratica, è un potente strumento che è utile per affrontare una vasta gamma di cellule specifiche domande biologiche in una retina matura.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Ralph Nelson e Daniel Possin per guida premurosa durante lo sviluppo di questo protocollo ed Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton per la generazione di linee di zebrafish transgenici stabile. Il lavoro è stato supportato da NSF GRFP 2013158531 a M.G., 5T32EY007031 NIH NEI W.C. e M.G. ed EY026020 di J.H. e S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
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