Summary
Визуализации тканей сетчатки может предоставить информацию одной ячейки, которые не могут быть собраны от традиционных биохимических методов. Этот протокол описывает подготовка конфокальная томография сетчатки кусочки от данио рерио. Флуоресцентный генетически закодированный датчики или индикатор красители позволяют визуализации многочисленных биологических процессов в типах различных клеток сетчатки.
Abstract
Сетчатка является сложной ткани, которая инициирует и интегрирует первые шаги видения. Дисфункция клеток сетчатки является отличительной чертой многих ослепительный заболеваний, и будущее терапии зависят от основных договоренностей о как различные сетчатки, что клетки нормально функционировать. Получение такой информации с биохимическими методами оказалось сложным делом, потому что вклад конкретной ячейке типов уменьшаются в обстановке клеток сетчатки. Живой сетчатки изображений может предоставить представление многочисленных биологических процессов на субклеточном уровне, благодаря растущее количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчиков. Однако этот метод до настоящего времени была ограничена головастиков и личинки данио рерио, внешнего слоев сетчатки изолированных сетчатки или ниже резолюции томография сетчатки в живых животных. Здесь мы представляем метод для создания живых ex vivo сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для живых изображений через confocal микроскопии. Эта подготовка дает поперечные срезы со всех слоев сетчатки и большинство типов клеток, видимые для выполнения конфокальный изображений эксперименты с использованием перфузии. Трансгенные данио рерио выражая флуоресцентные белки или биодатчики в типы конкретных сетчатки клетки или органеллы используются для извлечения информации одной ячейки из нетронутыми сетчатки. Кроме того фрагменты сетчатки могут быть загружены с флуоресцентный индикатор красители, Добавление метода универсальность. Этот протокол был разработан для визуализации Ca2 + в zebrafish конус фоторецепторов, но с надлежащей маркеры могут быть адаптированы для измерения Ca2 + или метаболитов в клетки Мюллер, биполярных и горизонтальные клетки, микроглии, Амакриновые клетки или сетчатки клетках ганглия. Пигментный эпителий сетчатки удаляется из кусочков, поэтому этот метод не подходит для изучения этого типа ячейки. С практикой это возможно для создания последовательных фрагментов из одного животного для нескольких экспериментов. Эта адаптируемых техника предоставляет мощный инструмент для ответа на многие вопросы о биологии клетки сетчатки, Ca2 +и энергетического гомеостаза.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) стала широко используется в медицинской и базовые научные исследования1, из-за ее небольшого размера, быстрое развитие и позвоночных органов и систем. Естественный прозрачности данио рерио личинок в сочетании с установленными методами для трансгенез позволили подробные визуализации клеточных процессов в живых животных. Количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчики были направлены конкретные данио рерио клеток, чтобы обнаружить Ca2 + 2, перекись водорода3, apoptotic активации4 и5СПС.
В естественных условиях изображений данио рерио личинок привела к открытий в области неврологии, включая картирование мозга цепь6 и разработки лекарств для центральной нервной системы расстройств7. Данио рерио хорошо подходят для видения исследований, потому что их сетчатки располагают слоистые структуры и типы нейрон высших позвоночных животных, и они отображают надежного визуального поведения8,9. Несколько типов сетчатки дегенерации аналогичных болезней человека были смоделированы успешно и учился в zebrafish10,11, включая живые изображения отдельных фоторецепторов, вырождающихся в сетчатке2, 12.
В то время как в естественных условиях личиночной данио рерио изображений является ценным инструментом, он становится более сложным, как рыба расти и развиваться пигментации, и некоторые фармакологические методы лечения не могут пронизывать весь животного. Кроме того некоторые клеточные процессы изменения с развитием и возраст, делая позднее время очков важна для понимания функций и прогрессирование болезни у взрослых животных. Биохимические методы, такие как immunoblot, quantitiative ПЦР, O2 потребления и Метаболомные анализов может обеспечить важные подсказки о биологии сетчатки в целом, но это трудно различить взносов типов отдельных клеток, пострадавших от болезни. Imaging изолированных ткани сетчатки ex vivo обходит эти проблемы и хотя плоских изображений навесные сетчатки открывается вид наружной сетчатки13, глубже внутренний сетчатки особенности скрываются. Поперечная сетчатки ломтиками, такие, как те, которые представлены в фиксированной Иммуногистохимический анализ, дать четкое представление о всех слоев и типов клеток, но предлагают только один моментальный снимок динамических процессов, участвующих в нормальной функции и болезней.
Здесь мы представляем метод для генерации ex vivo поперечной сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для изображений. Он похож на методы подготовки амфибий и данио рерио сетчатки ломтиками для электрофизиологических и морфологических исследований14,15, с важными изменениями для визуализации ex vivo с помощью конфокальной промежуток времени микроскопия. Флуоресценции ответы биодатчики или красителей в ломтики контролируются в режиме реального времени с Конфокальный микроскоп пока поставляющ фармакологических агентов с помощью перфузии. В то время как метод был разработан для визуализации фоторецепторов, это может быть целесообразно использовать для визуализации ячеек, биполярных клеток, горизонтальные клетки, Амакриновые клетки или клетки сетчатки ганглия Мюллер с соответствующим флуоресцентные маркеры. Кроме того фрагменты могут быть загружены с люминесцентными красками клеток проницаемой для отчета жизнеспособности клеток, везикулярный транспорт, митохондриальной функции или окислительно-восстановительного состояния. Этот универсальный препарат позволяет визуализировать широкий спектр внутриклеточных процессов на протяжении всего сетчатки, включая Ca2 + динамика, сигнала и метаболических состояние.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были утверждены университета Вашингтона институциональных животное уход и использование Комитета.
1. Подготовка животных и оборудования
Примечание: Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), это темный лист ткани вокруг снаружи сетчатки, чьи пигментация может скрывать сетчатки особенности и повреждать ткани когда конфокальное изображение ex vivo. В темноте НПП данио рерио отказался от сетчатки; Темный адаптировать рыбы для облегчения будущего удаления НПП от сетчатки до нарезки и обработки изображений.
- Передавать нереста бак с водой рыбы, рыбы и затем обернуть нереста танк с темной ткани или поместить его в темный шкаф.
- Темный адаптировать данио рерио для по крайней мере за 1 час до эвтаназии разрешить вблизи полное разделение НПП от сетчатки. 30 мин темно-адаптации достаточно удалить большинство ПЭС, хотя куски могут оставаться вставными между фоторецепторов.
- Расплава ~ 15 мл нефти желе в 50-мл стакан на горячей плите, а затем обратить 3 мл жидкости в шприц 3 мл скольжения подсказки. Инвертировать шприц, место в стойке пробирку и позволяют вазелином для охлаждения.
- Делать многоразовые режущей камеры на равнине 7 см X 2,5 см микроскопа.
- С помощью четких лак, краска узкие линии для создания прямоугольника, 3 X 2,5 см в центре слайда, дайте ему высохнуть, а затем добавить еще один слой лака на линии.
- Подготовка изображений лестниц на скользит крышка для хранения фрагментов во время визуализации. Ломтики составят «ступеньками» лестницы.
- Для статических изображений или инъекции эксперименты с минимальным решения потока сделайте вазелин лестницы, состоящий из двух плоской широкой параллельных полос вазелин на 18 мм квадратных стеклянные крышки скользит. Использовать шприц для применения двух уплощенная ~ 1 см длиной мазках охлаждением вазелин 0,5 см друг от друга на крышку выскальзования.
- Готовые срез ткани.
- Очистите лезвие бритвы двойной край с этанолом и позволить ему воздух сухой. Разрезать его на четверти с ножницами, сначала вдоль пополам, пополам, а затем через каждое лезвие.
- Место среза камеры на сцене срез ткани, центр его горизонтально на сцене и Марк длинный край с постоянным маркером для выравнивания.
- Загрузить лопаточная часть на руку срез ткани, убедитесь, что лезвие лежит плоские и центрированы на слайде без касатьться Лак для ногтей, а затем осторожно затянуть аппаратом лезвия. Ниже лезвие руку, регулируя ручку ¼ повернуть, то место, где лом фильтровальной бумаги в центре тепловизионные камеры и испытаний отрезать его. Если документ полностью не прорезать, установите лезвие.
- С помощью шприца, место одну небольшую точку охлаждением вазелин в чашке Петри 10 см ~ 1,5 см справа от центра. Нажмите изображения лестница в нее с помощью щипцов с вазелином, вверх. Сделать еще один небольшой вазелин dot ~ 1 см от края входе тепловизионные камеры.
- Соответствовать вазелин шприц с иглой 20g и ЭСКАТО его. Удерживая иглу на шприц и использовать его для создания двух 1 см длинные тонкие параллельные полоски вазелин продольно в центре режущей камеры. Пространство полоски ~ 1 см друг от друга.
- Сделать инструмент цикла глаз многоразовые проволоки, завернув в центре ~ сегмент 4 см 30 g Вольфрамные проволоки вокруг пару раз плотно закрыты щипцами. Отрегулировать диаметр цикла, двигая провод вверх или вниз щипцы, до тех пор, пока это немного больше, чем глаз данио рерио, обычно ~ 2-3 мм. концы проволоки и закрепите их в конце 6-см деревянной палочкой, с использованием лабораторных ленты.
- Подготовьте раствор Рингера.
- Оттепель 50 X дополнение Стоковый раствор (Таблица 1) и добавить свежий раствор Рингера HEPES в буфер, не бикарбонат (Таблица 2) утром эксперимента; Разбавьте 200 мкл дополнения Стоковый раствор каждые 10 мл раствора Рингера в конической пластиковых пробирок или стерильной стеклянной бутылке. Для статических изображений экспериментов Подготовьте по крайней мере 30 мл раствора Рингера в эксперимент. Объем раствора Рингера, необходимые для перфузии эксперименты будет зависеть от скорости потока и времени всего эксперимента.
- Проверьте, что рН раствора дополнить с помощью цифровой рН зонд или бумага рН 7,4 и отрегулировать соответственно с разбавляют NaOH или HCl.
- Кислородсодержащих дополненными Рингера раствор на льду по восходящей с 100% кислород газ по крайней мере 5 минут, используя стандартные медицинские танк кислород и регулятор оснащены шлангом, или дополнительный газ барботер коллектор для перфузии. Хранят раствор Рингера кислородом на льду в запечатанном конические пластиковых пробирок или стерильной стеклянной бутылке рядом рассечение Микроскоп; Используйте это решение для вскрытия, изображений и для разбавления краски или фармакологических агентов.
- Если другие решения используются в эксперименте, например Na+-свободный раствор Рингера (Таблица 3), повторите шаги 1.9.1.-1.9.3.
- Собирать Петри, щипцы, микро ножницы и другие инструменты вблизи Микроскоп рассечение и подготовить Ванна ледяной воде рыбы для данио рерио эвтаназии.
2. Подготовка сетчатки ломтиками (см. Рисунок 1)
- Работа под красный освещенности для сведения к минимуму свет адаптации (которая может сделать палку НПП более плотно сетчатки), усыпить данио рерио путем погружения в ледяной ванне до тех пор, пока ответ ощупь теряется, обычно 1-2 мин передать Петри блюдо рыбы и использовать скальпеля для cervically вывихнуть, но не обезглавить рыбы.
- Используйте провод петли для ослабления соединительной ткани вокруг один глаз, а затем потяните вперед глаза мягко с цикла в одной руке. С помощью микро ножницы с другой стороны, отрежьте белый зрительного нерва под глаза, стараясь не вырезать в задней части глаза.
- Перевести глаза, используя пинцет в чашке Петри холодного звонка решения на льду и повторите для второго глаза. Держите глаза в темноте или под красный свет до тех пор, пока НПП удаляется от сетчатки.
- Вскрыть выкручиваются под микроскопом рассечение малой мощности в капле раствора холодного звонка на слайде простого стекла в чашке Петри.
- Проколоть роговицы с тонкой щипцами, а затем аккуратно удалить кусочки прозрачной, ломкие роговицы и склеры серебристые с ножницами или щипцами. Снимите и выбросьте объектива и большую часть склеры (см. рис. 1а) и обрабатывать изолированных наглазник минимально.
- Куски жира, маленькие кусочки склеры, и черный ПЭС может оставаться прикрепленной к наглазник и удалены от сетчатки позже. Если сетчатка отделяет от НПП в шаге 2.4.1, продолжите те же шаги, с помощью особую осторожность, чтобы не повредить тонкий изолированных сетчатки.
- Положение наглазник открытой стороной вниз (ПЭС вверх) на слайде и разрезать на трети или кварталы с свежий одним краем лезвия в одном движении (см. рис. 1B). Выбросите куски ткани, которые высоко изогнуты.
- Плоский горе сетчатки на фильтровальной бумаге.
- Влажные кусок фильтровальной бумаги с раствор Рингера и поместите его на слайде рядом с наглазник штук. Избежание проколов его используйте плоские щипцы при обработке нетронутыми мокрой фильтровальной бумаги. Добавьте решение холодного звонка для покрытия фильтровальной бумаги и ткани.
- С помощью щипцов в каждой руке, тщательно перетащите фильтр бумага под каждый кусок наглазник с ПЭС и фоторецепторов вверх, т.е. с задней части глаза вверх. Положение части наглазник в отдельной строке вдоль по центру фильтра бумаги (см. рис. 1 c). Обрабатывать наглазник куски аккуратно пинцетом штраф только возле ее край или угол.
- Чтобы помочь сетчатки придерживаться фильтровальная бумага, место мокрый фильтр бумага на сухой салфеткой для 3 s фитиль влагу вниз, но не позволяйте ткани становятся сухими. Повторяйте до тех пор, пока кусочки наглазник ли плашмя на фильтровальной бумаге. Применяя нежный всасывания к нижней фильтр-бумаги помогает сгладить сетчатки, но этот шаг не является необходимым.
- Если черный листы НПП остаются на куски, наглазник, используйте тонкой щипцы для мягко чистить его прочь, начиная от одного угла (см. рис. 1 d) ткани, сидя в капле раствора Рингера. Следует сетчатки Поднимите фильтровальной бумаги, повторите шаг влагу в 2.5.3. Сетчатки может появиться розовый благодаря небеленой зрительных пигментов.
- Повторите сетчатки диссекции и плоским монтажные шаги в 2.4-2.6 для второго глаза, при желании, сохраняя первую установлен телевизор с плоским сетчатки, погружен в раствор Рингера-холодной. Чтобы упорядочить процесс нарезки, кусочки обоих сетчатки может делаться на один фильтр-бумаги. После того, как был удален ПЭС, протокол может осуществляться при нормальной комнатной свет Если эксперименты требуют тьмы.
- Поместите документ фильтр на слайде и обрезать его в прямоугольник с одним краем лезвия бритвы, оставляя ~ 0,5 см фильтровальной бумаги по обе стороны от линии сетчатки. Переместить фильтровальную бумагу в зале подготовленный нарезки, вставьте тонкий вазелин линий, с помощью щипцов края длинный фильтр-бумаги и погружать сетчатки в 3-4 капли раствора холодного звонка.
Примечание: Некоторые красители, например липофильных красители, лучше всего загружаются в плоские кронштейны на данном этапе до нарезки. Эти можно загружен, злой прочь с ткани и промывают в зале нарезки. Например, C12 558/568 BODIPY интенсивно пятна сетчатки клетки мембран и наружной сегментов фоторецепторных (см. рис. 4A) при загрузке на ~ 5 мкг/мл за 15 мин при комнатной температуре (обычно 23-27 ° C), следуют мыть в раствор Рингера-избыток . - Передавать режущей камеры на сцену срез ткани, позиция длинной вдоль линии заметное и безопасного камеры заканчивается на сцену с лентой лаборатории. Начало в один конец, сократить сетчатки и фильтр-бумаги с помощью фирмы, нежное давление на нарезки руку. Проверьте, что Первый срез был сокращен полностью, затем использовать микрометр сократить ~ 400 мкм ломтиками.
- Соберите изображений лестница.
- Место режущей камеры с нарезанный сетчатки секций в Петри из шага 1.7 рядом изображений лестница (см. Рисунок 1E). Блюдо Залейте раствор Рингера-холодной затопить его содержимое.
- С помощью щипцов и сохранения фрагментов погружения, мягко передавать полоски фильтровальной бумаги и сетчатки по лестнице, двигая Петри слева направо. Заботиться, чтобы не коснуться сетчатки непосредственно. Поворот секторов 90° и похоронить фильтровальная бумага краев вазелином.
- Мелко позиция сетчатки ломтики в лестнице с щипцами, так, что слоях сетчатки видны под микроскопом диссекции (см. Рисунок 1 g). Для фрагментов на каждом конце лестницы убедитесь, что ткань лицом внутрь к другим ломтики для сведения к минимуму движения ткани во время инъекции или потока. Отменить все сетчатки фрагменты, которые не являются хорошо придерживаться фильтровальную бумагу (см. рис. 2а).
- При желании, загрузить красители сетчатки ломтиками на данном этапе и стирать в раствор Рингера-избыток до изображений.
Примечание: Пропидий йодидом (PI) и Hoechst 33342 энергично пятно ядер мертвых и всех клеток, соответственно (см. рис. 2B), когда инкубировали с сетчатки ломтики на 5 мкг/мл в течение 20 минут при комнатной температуре. Тетраметилродамина (TMRM) накапливается в активно дышащими митохондрий всей сетчатке когда инкубировали в 1 Нм для 30 мин при комнатной температуре. - В то время как окрашивание срезов, подготовьте тепловизионные камеры и инъекции аппарата. Очистка труб с раствор Рингера и удалить пузыри, придавать тепловизионные камеры входе открытый конец трубы и закрыть запорный используйте шприц. Удалите шприц и заполнить его с reagent(s) для инъекций, а затем присоедините его к трубе.
- Используйте щипцы для передачи coverslip сетчатки кусочками тепловизионные камеры, нажав coverslip в точку вазелин на краю входе тепловизионные камеры (см. Рисунок 1 H). Тепловизионные камеры заполните раствором Рингера для покрытия ломтиками.
3. томография сетчатки фрагментов
- Место заполненные тепловизионные камеры с аппарат подключенным инъекций на сцене вертикально конфокального микроскопа, с 20 или 40 X воды, окуная объектива. Закрепите тепловизионные камеры с этап клипов.
- Нижняя погружения объектив над лестницей и сосредоточиться на кусочек на одном конце лестницы под тусклым транс освещенные светом. Проверьте каждый фрагмент для поперечной ориентации, наличие внешнего сегментов фоторецепторных и безопасных адгезии к фильтровальной бумаги.
- Выберите лучший кусочек для визуализации промежуток времени и настройте Микроскоп программное обеспечение для захвата изображений в промежуток времени. В таблице 4 описываются типичные параметры изображений для различных флуоресцентные маркеры и красители.
Примечание: Скорость загрузки изображений будет варьироваться в зависимости от Микроскоп, флуоресцентный marker(s) и биологических процессов, которые изучаются. Например используйте 800 x 800 пикселей, скорость сканирования 2 МКС/пиксель и частоту кадров 10-s для визуализации динамики кальция в фоторецепторных клеток с GCaMP3 и красного красителя.- Если возможно, используйте программное обеспечение для отслеживания физических достопримечательности срез (внешняя сегментов фоторецепторных, сотовые органов, ядра) для оказания помощи потенциальным переориентацию во время промежуток времени. Также настроить программное обеспечение для мониторинга в реальном времени флуоресценции через фрагмент.
- Начать изображений и отслеживать базовые флуоресценции. Когда флуоресценции через срез стабилизируется (обычно в течение 2-5 мин), продолжите эксперимент. Для инъекций Откройте запорный шприц, затем медленно угнетают и привлечь обратно на поршень дважды, чтобы помочь смешивания.
Примечание: например, отменить митохондрий путем инъекций концентрированный раствор protonophore CCCP до конечной концентрации 1 мкм в тепловизионной камере. Это побуждает надежные Ca2 + ворвались в цитозоле фоторецептора, сообщил GCaMP, то устойчивое снижение митохондриального мембранного потенциала сообщил TMRM. - Внимательно следить за фрагментов для смещения во время эксперимента и использовать программное обеспечение, микро-коррективы согласно физической достопримечательности. Как правило дрейф в Z-направлении во время инъекции или перфузии является < 5 мкм.
4. томография сетчатки фрагменты во время экспериментов перфузии, где решения изменяются или текла постоянно
Примечание: Изображение сетчатки ломтики во время экспериментов перфузии, где решения изменяются или текла постоянно похож на установки для статических изображений или инъекции экспериментов, со следующими изменениями.
- Вместо вазелина лестницы, описанный в шаге 1.4 Используйте крепкий воск лестницы провести сетчатки ломтики устойчивый во время решения потока.
- Место два небольших параллельных цилиндры неприправленный зубоврачебный воск ~ 0,5 см друг от друга на coverslip. На плоской поверхности используйте большой палец нажать вниз и наружу к параллельно краю coverslip каждого цилиндра. Оценка как плоские цилиндры горизонтально с #1 coverslip (см. Рисунок 1E, справа) затем смазать тонким слоем вазелина между восковые полоски с помощью шпателя.
- При сборке изображений лестница на шаге 2.10.2, нажмите краев нарезанные фильтровальной бумаги в воск баллы с помощью тонкой щипцы (рис. 1 g).
- Чтобы настроить для перфузии на шаге 2.12, заполните шприц водохранилищ с preoxygenated решениями, или использовать Факультативный газового коллектора для насыщения кислородом решения в каждом резервуаре. Промойте все трубки с раствор Рингера, убедитесь, что все линии потока при открытии и очищать большие пузыри.
- Перед заполнением тепловизионные камеры на шаге 2.13, используйте шприц поставить другой точка вазелин каждый подвергается угол coverslip, чтобы предотвратить его от боков скольжения во время потока.
- Когда тепловизионные камеры заполнен и установлен на микроскопа, включите аспиратор и подключение шланга аспиратора. Проверка потока раствора Рингера и использовать micropositioner, чтобы расположить Аспиратор трубки над отток камеры так, что небольшое количество жидкости рисуются, прежде чем камера переполнения (обычно ~ 1 мм над поверхностью раствора для скорости потока 2 мл/мин). Держите раствор Рингера, пропуская при выборе фрагментов в шаге 3.4.
- Для проведения эксперимента в шаге 3.4 для перфузии, переключение потока решений, закрыв кран первого решения при открытии второго решения.
- Например, чтобы разрушающих внеклеточный Na+ из тепловизионной камеры, используйте два шприца резервуары заполнены раствором Рингера или Na+-бесплатное решение (Таблица 3). Поток раствор Рингера для установления базового уровня, а затем переключиться на Na+-бесплатные решения. Это приводит к большой цитозольной Ca2 + увеличение внешних сегментов фоторецепторных и клеток органов (см. Рисунок 4).
- Для самотечных перфузии систем контролировать уровень решения в каждом резервуаре, поэтому скорость потока постоянна во время визуализации. Довершение водохранилищ, при необходимости с кислородом решения, или поддерживать непрерывное кислородом пузырьков с газового коллектора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стабильные позиционирования и поперечной ориентации фрагменты являются ключом к успешной изображений с инъекций или перфузии фармакологических агентов. Тщательно изучить и изменить срезов до конфокальная томография при необходимости обеспечить всех слоев сетчатки видны (рисунок 2A, фрагмент ii). Если фрагмент поворачивается слегка вперед (рис. 2A, ломтик iii), связки внешних слоев будут видны и небольшие поправки могут быть сделаны с щипцами принести желаемого слоев сетчатки в фокус. Ломтики слабо придерживаться фильтровальная бумага (рис. 2A, кусок я) или сохранения НПП (рис. 2A, фрагмент iv) не должен использоваться для визуализации промежуток времени.
Жизнеспособность клеток имеет первостепенное значение для наблюдения за физиологические процессы ex vivo; жизнеспособность клеток пятна, такие как пропидий йодидом (PI) рекомендуется для assay клетки здравоохранения во время нарезки практикующих сетчатки. Мертвые клетки вблизи среза всех фрагментов будет накапливаться PI в их ядрах (Рисунок 2Б, левой панели), а 5-10 мкм глубже в срез, может быть imaged здоровые клетки с нормальной морфологией и окрашивание не Пи. К примеру в фоторецепторных клеток, PI отрицательные клетки ниже среза обычно содержат стереотипные поляризованные, удлиненные морфологии (Рисунок 2Б, правой панели). Фоторецепторы остаются жизнеспособными в сетчатки ломтики для по крайней мере 4 ч при хранении в раствор Рингера кислородом.
Многие структуры сетчатки клетки могут быть визуализированы с помощью комбинации трансгенных маркеры и красителей; Пример конфокальный изображения Ломтики свежих сетчатки с двойной и тройной люминесцентные маркировки представлены на рисунке 3. Для визуализации динамики конуса фоторецепторных эндоплазменный ретикулум (ER) относительно ядра, можно counterstained сетчатки фрагменты из трансгенной рыбы, выражая GFP, ориентированные на конус ER17 с ядерной краситель (рис. 3A). Аналогичные стратегии могут быть использованы для просмотра Цитоскелет актина, используя сетчатки кусочки от трансгенных данио рерио, выражая GFP-кварцевое актина18 (рис. 3B). С другой клетки конкретной промоутера Мюллер клетки могут быть помечены красной флуоресцентный белок tdTomato19 и визуализирована в сетчатки срезы (рис. 3 c, верхней панели). Поглощение глюкозы в сетчатке могут быть Оксиметрический анализ в естественных условиях , устно gavaging взрослых данио рерио с флуоресцентные глюкозы аналоговый (NBDG), который становится частью клетки видна в сетчатки ломтик21 (рис. 3 c, Нижняя панель). Двойной трансгенных у рыбок данио могут быть использованы для мониторинга нескольких клеточных процессов или типы клеток в тандеме, таких как Ca2 + динамика в субклассе конусов. 3D рисунок показывает схему тройной маркировки для этого типа эксперимента, с tdTomato в2 длинноволновых конусов вместе с таргетингом на mitochondrially Ca2 + датчик (mito-GCaMP) выразил все шишки22 и ядерных пятно.
Визуализации промежуток времени клетки сетчатки является ключевым преимуществом этого фрагмента преп. Например Ca2 + колебания в цитозоле фоторецепторных конуса может наблюдается и позднее количественно во время фармакологических манипуляции, эксперимент, изображенные на рисунке 4. На рисунке 4A показывает сетчатки ломтиками, выражая Ca2 + датчик GCaMP2 (сверху) или управления eGFP16 (внизу) в конус фоторецепторов, counterstained с красной липофильных красителя. В этом эксперименте Na+ isotonically истощены из тепловизионной камеры, с помощью перфузии, вызывая увеличений в цитозольной Ca2 + для внешнего сегмента и клеток тела, как это отражено в GCaMP (рис. 4A, верхней панели). Флуоресценции сетчатки ломтиками выражая Ca2 +-нечувствительным eGFP не подвержен влиянию этого лечения (рис. 4A, Нижняя панель). Время перерыва фильмы могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ изолировать и количественно флуоресценции ответы от одного конуса внешние сегменты, клеток органов и синапсы (рис. 4B).
| Дополнить решение | ||
| 50 x складе * концентрации (мм) | Рабочая концентрация (мм) | |
| D-глюкоза | 500 | 10 |
| Лактат натрия | 50 | 1 |
| пируват натрия | 25 | 0.5 |
| L-глютамина | 25 | 0.5 |
| восстановленного глутатиона | 25 | 0.5 |
| Аскорбиновая кислота | 15 | 0,3 |
| * Храните аликвоты при температуре-20 ° < 6 месяцев; добавить свежий раствор Рингера | ||
Таблица 1. Компоненты из 50 X дополнение Стоковый раствор и окончательный рабочей концентрации.
| Раствор Рингера | |
| концентрация (мм) | |
| NaCl | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| рН 7,4, с использованием NaOH | |
| хранить при 4 ° c в стерильный флакон < 1 месяц | |
Таблица 2. Компоненты решения стандартных звонаря.
| Na+-свободной раствор Рингера | |
| концентрация (мм) | |
| ТРИС | 147 |
| HCl | 120 |
| ДКК | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| рН 7,4, с использованием HCl | |
| хранить при 4 ° c в стерильный флакон < 1 месяц | |
В таблице 3. Компоненты Na+-Бесплатные раствор Рингера.
| Конфокальная томография параметры | |||
| Флюорофор | Возбуждения | Фильтр выбросов | |
| Длина волны | Лазерного света | ||
| Зелёный флуоресцентный белок (включая GCaMP) | 488 нм | 2 - 5% | eGFP или AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 Нм | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 Нм | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 нм | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 нм | 10% | eGFP или AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 Нм | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 Нм | 3% | ППП |
Таблица 4. Визуализации условия для флуоресцентных маркеров и красители, представлены в 2-4 цифры.
Рисунок 1. Схема для подготовки сетчатки Ломтики свежих данио рерио. (A) прочь вскрыть наглазник и отказаться от объектива и склеры (шаг 2.4.1.). (B) Разрежьте наглазник на три части; отбросить небольшой края кусок (шаг 2.4.2.). (C) перетащите фильтр-бумаги под наглазник штук с внутренней сетчатки, обращенной к фильтровальной бумаги (шаг 2.5.1.-2.5.2.). (D) Flatten сетчатки с помощью бумажное полотенце, чтобы фитиль раствор Рингера вниз через фильтровальную бумагу (шаг 2.5.3.), затем аккуратно чистить прочь оставшихся ПЭС с щипцами (шаг 2.6). Переместить фильтр бумага режущей камеры на сцене срез ткани и нарезать ломтиками 400 мкм (шаги 2.8., 2.9.). (E) передача нарезка Камера с ломтиками и воска или вазелином лестница в чашку Петри, раствора Рингера (шаг 2.10.1.). (F) используйте тонкой щипцы для слайд одного ломтика от режущей камеры на лестнице при сохранении фрагментов погружения. (G) повернуть фильтр бумага полоски (черный) 90 ° и похоронить края фильтр-бумаги в воск или вазелином (шаги 2.10.2.-2.10.3.). (H) схема окончательного тепловизионные камеры загружены с лестницей и дольками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Ломтики примеры свежие данио рерио сетчатки отображения правильного прилегания к фильтровальной бумаги и жизнеспособность клеток. (A) Brightfield изображение сетчатки Ломтики свежих в лэддере вазелином. Ломтики ii и iii отображения хорошей адгезии и поперечных слоев сетчатки. Ломтики i и iv сохранили существенные ПЭС, или сильно изогнутый и не четко соблюдать фильтровальная бумага и не должен быть образ. Шкалы бар = 200 µm. Z сверху вниз (B) монтаж ломтиком свежего сетчатки от трансгенных данио рерио, выражая eGFP в конус фоторецепторов (16Tg(gnat2:eGFP)). Хойста этикетки всех ядер; пропидий йодидом (PI) counterstaining этикетки ядер мертвых клеток, которые появляются вблизи среза фрагмента (слева). Размер шага Z-стек = 1 мкм; шкалы бар = 20 мкм. флуоресцентных изображений условия изложены в таблице 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Образец конфокальный образов двойной и тройной маркировкой ex vivo сетчатки кусочков от трансгенных взрослых рыбок данио. (A) два цвета изображений схема использования трансгенных GFP с меткой эндоплазматического ретикулума конусов (Tg(gnat2:calr-GFP)17, сверху) с Hoechst ядерной изображение (синий, внизу). (B) GFP с меткой актина конусов (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, сверху) с Hoechst ядерной изображение (синий, внизу). (C) ППП, помечены Мюллер клеток (Tg(GFAP:tdTomato)19, верхней) от данио рерио кормили флуоресцентные глюкозы (NBDG), демонстрируя поглощение глюкозы в шишки20,21 (зеленые, снизу). (Это изображение является Рисунок 2B Kanow, и др. 21) (D) пример трехцветного изображения, используя двойной трансгенных данио рерио. Слева, ППП, ориентированные на длинноволновых конус фоторецепторов (2Tg(trβ2:tdTomato)). Центр, кальция биосенсор GCaMP, ориентированные на конус фоторецепторных митохондрии (22Tg(gnat2:mito-GCaMP3)). Справа накладными изображениями tdTomato (пурпурный), mito-GCaMP (зеленый) и "Хёхст" ядерной изображение (синий). Изображения являются максимальная интенсивность Z-прогнозы 9 фреймов над глубиной ткани 7 мкм; масштаб бары представляют 10 мкм. флуоресцентных изображений условия изложены в таблице 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. CA2 + изображений с GCaMP и управления eGFP. (A) представитель образы Ломтики свежих сетчатки, выражая флуоресцентные Ca2 + биосенсор GCaMP (gnat2:GCaMP32, топ) или eGFP (внизу) в конус фоторецепторов. Слева, фрагменты в базовых данных; справа кусочки 2 мин, после того, как Na+ isotonically был исчерпан из тепловизионной камеры, с помощью перфузионного раствор Рингера трис основе, который ловушки Ca2 + в фоторецепторных клеток. Масштаб баров = 10 мкм. флуоресцентных изображений условия изложены в таблице 4. (B) означает изменения флюоресценции одного фоторецепторных отсеков (внешние сегменты, клеток органов и синапсы) во время перерыва изображений истощения Na+ . Ломтики были образы каждые 10 сек, стеки были обработаны с помощью ImageJ, и флуоресценции GCaMP или eGFP нормализована сигнал от мембраны красителя. Сплошные линии, GCaMP (n для наружной сегментов = 15, сотовые органов = 24, синапсы = 26); пунктирные линии, eGFP (n для наружной сегментов = 26, клетки тела = 20, синапсы = 31). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo томография сетчатки Ломтики свежих данио рерио оказался универсальный инструмент для изучения фоторецепторных биологии20,21,22и является уникальным в том, что он позволяет анализ единичных клеток в зрелых, полностью дифференцированные сетчатки. С практикой можно проводить несколько экспериментов с ткани от одной рыбы, даже с использованием последовательных фрагментов из той же части сетчатки. Помимо проблемы и предложения относительно подготовки амфибии сетчатки фрагментов для исследования электрофизиологии14являются важными факторами для визуализации экспериментов.
Для фоторецепторов жизнеспособность клеток обычно коррелирует с морфологии клеток, поэтому очень важно для обработки деликатных сетчатки минимально, особенно после того, как был удален НПП. После нарезки, используйте тонкой щипцами осторожно слайд ломтиками горизонтально от режущей камеры (Рисунок 1F) для их передачи по лестнице вместо подъема ломтиков прямо вверх, и всегда держать ломтиками, погружен в раствор Рингера. Если это возможно Соберите лестница сетчатки срезов рядом Конфокальный микроскоп для сведения к минимуму ущерба кусочки от тряски во время перевозки.
Сильная адгезия ткани сетчатки к фильтровальная бумага имеет решающее значение для создания фрагментов, которые будут оставаться стабильными во время инъекции или перфузии экспериментов. Необходимо тщательно проверить каждый ломтик морфологии и стабильности перед изображений (рисунок 2A); осторожно нажав таблице Микроскоп во время просмотра фрагмента движения через конфокальный глазной линзы показывает стабильность конкретного фрагмента. Несмотря на меры предосторожности, дрейф в Z-направлении во время инъекции или перфузии могут представлять вызовы для анализа, так что это полезно для загрузки элемента управления краска, такие как липофильных красителей для мембраны и митохондрии, чтобы стабильно ярлык идентифицируемой клеточной структуры для нормализация (рис. 4A, пурпурный). Если фрагменты Дрифт > 10 мкм в Z-направлении может оказаться невозможным извлечь пригодные для использования данные одной ячейки. Умеренные дрейф в направлении X-Y может быть исправлена в пост-обработки с помощью регистрации программного обеспечения, такие как MultiStackReg для ImageJ (RRID:SCR_002285).
В статических условиях флуоресценции маркеров в сетчатки срезы должны оставаться стабильными, хотя Фотообесцвечивание может произойти во время визуализации. Следует позаботиться о минимизации лазерного облучения во время провалы путем уточнения параметров, таких как лазерной интенсивности, сканирования скорость и частота кадров. Визуализации элементов управления, рекомендуется для каждого флуоресцентные метки используется. Элементы управления включают инъекций perfusing раствор Рингера без фармакологических агентов в отдельных экспериментов или проведение визуализации эксперименты с не биосенсор маркерами, которые флуоресцировать конститутивно.
В зависимости от лазерного конфокального возбуждения используется пигменты в ПЭС может способствовать аутофлюоресценция и даже генерировать тепло во время визуализации, поэтому важно удалить большую часть этой ткани до нарезки. Dark-adapting животных СПИД в удалении НПП при сведении к минимуму повреждение основной сетчатки. Неспособность изображения ПЭС является ограничением этой подготовки срез, хотя это может быть преодолено с помощью альбинос животных с прозрачным НПП. Еще одним ограничением является, что клетки сетчатки ганглия и конце ноги Мюллер клеток может стать скрыт из представления фильтровальной бумаги; как альтернативная подготовка сетчатки могут быть плоскими монтируется с фоторецепторных стороной вниз на бумаге фильтра и затем нарезанный обеспечить более четкое представление о сокровенной сетчатки. Важно также отметить, что длинные горизонтальные проекции некоторых клеток, таких как широкое поле Амакриновые клетки, может быть разорвано во время вскрытия или нарезки. Окончательный ограничением является, что многие флуоресцентных красителей nonspecifically накапливаются в наружной сегментов фоторецепторных, поэтому для этой части сетчатки это целесообразно использование генетически закодированный биодатчики, вместо того, чтобы индикатор красители.
Учитывая широкий спектр доступных люминесцентные клеток репортер красители23,24 для ткани и генетически закодирована флуоресцентные биодатчики, успешно используется в zebrafish2,3,4, 5, этот фрагмент подготовки могут быть использованы для изучения многочисленных биологических процессов в нескольких типах клеток сетчатки (см. примеры в, Рисунок 3 Рисунок 4). Imaging Ломтики свежих сетчатки, с помощью микроскопии суперразрешением живой клетки может также обеспечить захватывающие новые идеи сетчатки функции и здравоохранения на субклеточном уровне. Кроме того этот метод может быть адаптирована для ex vivo изображений мыши сетчатки фрагменты25. В то время как успешную подготовку Ломтики свежих сетчатки требует практики, это мощный инструмент, который является полезным для решения широкий спектр биологических клеток конкретных вопросов в зрелых сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Ральф Нельсон и Daniel Possin для продуманного руководства при разработке этот протокол и Eva мА, Эшли Джордж и Гэйл Стэнтон для формирования стабильных данио рерио трансгенных линий. Работа была поддержана NSF GRFP 2013158531 для м.г., низ NEI 5T32EY007031 туалетное и м.г. и EY026020 J.H. и с.б.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
