Summary
Imaging retinala vävnaden kan ge encelliga information som inte kan samlas in från traditionella biokemiska metoder. Det här protokollet beskriver beredning av retinal skivor från zebrafisk för confocal imaging. Fluorescerande kodade genetiskt sensorer eller indikator färgämnen tillåta visualisering av många biologiska processer i olika retinala celltyper.
Abstract
Näthinnan är en komplex vävnad som initierar och integrerar de första stegen av vision. Dysfunktion av näthinnans celler är ett kännetecken för många förblindande sjukdomar och framtida terapier gångjärn på grundläggande överenskommelser om hur olika retinala celler fungera normalt. Att få sådan information med biokemiska metoder har visat sig svårt eftersom bidrag särskilt celltyper minskas i näthinnans cell miljö. Levande retinal imaging kan ge en bild av många biologiska processer på en subcellulär nivå, tack vare ett växande antal genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Denna teknik har dock hittills begränsats till grodyngel och zebrafiskar larver, de yttersta retinala lagrarna av isolerade näthinnor, eller lägre upplösning imaging av näthinnor med levande djur. Här presenterar vi en metod för att skapa levande ex vivo retinal skivor från vuxna zebrafiskar för levande imaging via konfokalmikroskopi. Detta preparat ger tvärgående skivor med alla retinala lagren och de flesta celltyper som är synliga för att utföra confocal imaging experiment med perfusion. Transgena Sebrafisken uttrycker fluorescerande proteiner eller biosensorer i specifik retinal celltyper eller organeller används för att extrahera encelliga information från en intakt näthinnan. Dessutom, kan retinal skivor läsas med fluorescerande indikator färgämnen, lägga till metodens mångsidighet. Detta protokoll utvecklades för imaging Ca2 + inom zebrafiskar kon fotoreceptorer, men med ordentlig markörer kan det anpassas för att mäta Ca2 + eller metaboliter i Müller celler, bipolär och horisontella celler, mikroglia, amakrina celler eller retinal ganglionceller. Pigmentepitelet tas bort från skivor så denna metod inte är lämplig för att studera denna celltyp. Med praxis är det möjligt att generera serial skivor från ett djur för flera experiment. Denna anpassningsbar teknik erbjuder ett kraftfullt verktyg för att svara på många frågor om retinal cellbiologi, Ca2 +och energi homeostas.
Introduction
Zebrafiskar (Danio rerio) har blivit allmänt används i medicinska och grundläggande vetenskaplig forskning1, på grund av dess liten storlek, snabb utveckling och ryggradsdjur organsystem. Naturliga insyn i zebrafiskar larver kombinerat med etablerade metoder för genmodifiering har aktiverat detaljerad visualisering av cellulära processer i ett levande djur. Ett antal genetiskt kodade fluorescerande biosensorer har varit riktad till specifika zebrafiskar celler att upptäcka Ca2 + 2, väteperoxid3, apoptotiska aktiveringen4 och ATP5.
In vivo imaging av zebrafisk larver har lett till genombrott inom neurovetenskap, inklusive kartläggning av hjärnans kretsar6 och läkemedelsutveckling för centrala nervsystemet sjukdomar7. Zebrafisk är väl lämpade för vision forskning eftersom deras näthinnor har laminär struktur och neuron typer av högre ryggradsdjur, och de visar robust visuella beteenden8,9. Flera typer av retinal degeneration analogt med mänskliga sjukdomar har modellerad framgångsrikt och studerade zebrafiskar10,11, inklusive levande avbildning av enskilda fotoreceptorer urartar inom en näthinnan2, 12.
I vivo larval zebrafiskar imaging är ett värdefullt verktyg, blir det mer utmanande som fisken växa och utveckla pigmentering, och vissa farmakologiska behandlingar inte kan genomsyra hela djur. Vidare, vissa cellulära processer förändras med utvecklingen och ålder, att göra senare tidpunkter kritiska för förståelse funktion och utvecklingen av sjukdom hos vuxna djur. Biokemiska metoder såsom immunoblot, quantitiative PCR, O2 konsumtion och metabolomiska analyser kan ge viktiga ledtrådar om biologi av näthinnan som helhet, men det är svårt att urskilja bidrag enskilda celltyper som påverkas av sjukdom. Imaging isolerade retinala vävnaden ex vivo kringgår dessa frågor, och medan imaging platt monterade näthinnor ger en vy av den yttersta näthinnan13, djupare inre retinal funktioner döljs. Tvärgående retinal skivor, såsom de presenteras i fast immunhistokemiska analyser, aktivera en klar bild av alla lager och celltyper men bara erbjuda en enda ögonblicksbild av dynamiska processer i normal funktion och sjukdom.
Här presenterar vi en metod för att generera ex vivo tvärgående retinal skivor från vuxna zebrafiskar för avbildning. Det är liknande metoder för att förbereda amfibie och zebrafiskar retinal skivor elektrofysiologiska och morfologiska studier14,15, med viktiga ändringar för tid förfaller imaging ex vivo på confocal mikroskopi. Fluorescens Svaren av biosensorer eller färgämnen i skivor övervakas i realtid med en confocal Mikroskop samtidigt leverera farmakologiska agenter med perfusion. Medan metoden utvecklades för imaging fotoreceptorer, kan det vara praktiskt att använda den för att visualisera Müller celler, bipolära celler, horisontella celler, amakrina celler eller retinala ganglionceller med lämpliga fluorescerande markörer. Dessutom kan skivor laddas med fluorescerande cell-permeable färgämnen till rapporten cellernas viabilitet, vesikulär transport, mitokondriell funktion eller redox staten. Denna mångsidiga förberedelse kan visualisering av ett brett utbud av subcellulär processer i hela näthinnan, inklusive Ca2 + dynamics, signaltransduktion och metabola tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av University of Washington institutionella djur vård och användning kommittén.
1. förbereda djur och utrustning
Obs: Retinal pigmentepitel (RPE) är en mörka blad av vävnaden som omger utsidan av näthinnan vars pigmentering kan skymma retinal funktioner och skada vävnaden när confocal imaging ex vivo. I mörker, är RPE av zebrafisk tillbakadragen från näthinnan; mörka anpassa fisk att underlätta framtida borttagning av RPE från näthinnan innan skivning och imaging.
- Överföra fisk till en lekande tank fylld med fiskevatten, och sedan Linda lekbeståndets tanken med mörkt tyg eller placera den i ett mörkt skåp.
- Mörka anpassa zebrafiskar för minst 1 h innan eutanasi att tillåta nära fullständig åtskillnad av RPE från näthinnan. 30 min mörka anpassning är tillräckliga för att undanröja de flesta RPE, men delar av det kan förbli ortodoxas mellan fotoreceptorer.
- Smälta ~ 15 mL petroleum jelly i en 50 mL bägare på en värmeplatta och sedan rita 3 mL vätska i en spruta med 3 mL slip i spetsen. Vänd sprutan, placera i ett provrör rack och tillåta vaselin svalna.
- Göra en återanvändbar skivning kammare på ett vanligt 7 X 2,5 cm objektglas.
- Med genomskinligt nagellack, måla smala linjer för att skapa en 3 X 2,5 cm rektangel i mitten av bilden, låt det torka och sedan lägga ytterligare ett lager av nagellacket till raderna.
- Förbereda imaging stegar på täckglas att hålla skivor under imaging. Skivor kommer att utgöra de ”stegpinnarna” av stege.
- För statiska avbildningar eller injektion experiment med minimal lösning flöde, göra vaselin stegar bestående av två platta breda parallella remsor av vaselin på 18 mm fyrkantig glas täckglas. Använd sprutan för att tillämpa två tillplattade ~ 1 cm lång utstryk av kylda vaselin 0,5 cm mellanrum på cover slip.
- Redo utsnittet vävnad.
- Rengör en dubbel kant rakblad med etanol och låt den torka. Skär den i fjärdedelar med sax, först på längden i halvor och sedan tvärs över varje blad.
- Placera skivning kammaren på scenen av utsnittet vävnad, centrera det vågrätt på scenen och markera en långsida med permanenta märkpenna för justering.
- Ladda ett blad avsnitt på vävnad slicer armen, se till att bladet ligger platt och centrerat i bilden utan att vidröra nagellacket och sedan försiktigt dra bladet apparaten. Lägre blad armen genom att justera vredet ¼ Vrid, placera en papperslapp filter i mitten av imaging plenisalen och test skär den. Om papperet inte skärs helt igenom, montera bladet.
- Med hjälp av sprutan, placera en enda liten prick kyls vaselin i en 10-cm petriskål ~ 1,5 cm till höger om mitten. Tryck på en tänkbar stege till det med tången med den vaselin uppåt. Göra en annan liten vaselin dot ~ 1 cm från inlopp kant imaging kammaren.
- Passar vaselin sprutan med 20g nål och uncap den. Håll nålen på sprutan och använda det för att två 1 cm lång tunn parallella remsor av vaselin på längden i mitten av skivning kammaren. Utrymme remsorna ~ 1 cm mellanrum.
- Göra en återanvändbar tråd ögat loop verktyg med omslag i mitten av en ~ 4 cm segment av 30 g volframtråd runt ett par stängt pincett en gång tätt. Justera diametern på öglan genom att dra tråd upp eller ner tången tills den är något större än en zebrafiskar ögat, vanligtvis ~ 2-3 mm. vrida kabeländarna och säkra dem till slutet av en 6-cm träpinne med laboratorium tejp.
- Förbereda Ringers lösning.
- Tina 50 X tillägg stamlösning (tabell 1) och tillsätt den färska till HEPES-buffrat, icke-bikarbonat Ringers lösning (tabell 2) på morgonen av experiment; Späd 200 µL av tillägg stamlösning i varje 10 mL Ringers lösning i ett koniskt centrifugrör eller steril glasflaska. För statisk avbildning experiment, förbereda minst 30 mL lösning per experiment. Volymen av Ringers lösning behövs för perfusion experiment kommer att bero på det flöde och den totala experiment tid.
- Kontrollera att den kompletterade lösningen pH 7,4 använder en digital pH-givare eller pH-papper, och justera med detta med utspädd NaOH eller HCl.
- Syresätta kompletterade Ringers lösning på is av bubblande med 100% syrgas för minst 5 min med en standard medicinskt oxygen tank och regulator utrustad med en slang, eller valfritt gas bubbelflaskan grenröret används för perfusion. Lagra syresatt Ringers lösning på is i ett förseglat koniskt centrifugrör eller steril glasflaska nära mikroskopet dissektion; Använd denna lösning för dissektion, imaging, och späd färgämnen eller farmakologiska medel.
- Om andra lösningar som används i experimentet, som Na+-gratis Ringers lösning (tabell 3), upprepa steg 1.9.1.-1.9.3.
- Samla petriskålar, pincett, mikro-saxar och andra verktyg nära mikroskopet dissektion, och förbereda en fisk vatten isbad zebrafiskar dödshjälp.
2. förbereda retinal skivor (se figur 1)
- Arbetar under röda omgivande ljus att minimera ljus anpassning (som kan göra RPE pinnen mer tätt på näthinnan), eutanasi zebrafisk genom nedsänkning i isbadet tills anslagskänslighet förloras, vanligtvis 1-2 min. föra fisken till en petriskål och använda en skalpell till cervically dislocate men inte halshugga fisken.
- Använd Trådögla för att lossa bindväv runt ena ögat, och sedan dra ögat fram försiktigt med öglan i ena handen. Med hjälp av mikro-sax i andra handen, skär vit synnerven under ögat, noga med att inte skära baksidan delen av ögat.
- Överför ögat använder tången till en petriskål av kall Ringers lösning på is, och upprepa för det andra ögat. Hålla ögonen i mörker eller under rött ljus tills RPE tas bort från näthinnan.
- Dissekera ögonmusslorna under en strömsnål dissektion Mikroskop i en droppe kalla Ringers lösning på en vanlig glasskiva i en petriskål.
- Pierce hornhinnan med fin pincett, sedan försiktigt bort stycken Clear, sprött hornhinnan och silvrig sklera med pincett eller sax. Avlägsna och kassera linsen och de flesta av sklera (se figur 1A), och hantera den isolerade ögonmusslan minimalt.
- Bitar av fett, små bitar av sklera och svart RPE kan sitta kvar ögonmusslan och bort från näthinnan senare. Om näthinnan separerar från RPE i steg 2.4.1, fortsätta med samma steg med extra försiktighet för att inte skada känsliga isolerade näthinnan.
- Placera ögonmussla öppna nedåt (RPE upp) på bilden och skär i tredjedelar eller kvartal med en färsk enda kant rakblad i en enda rörelse (se figur 1B). Kassera bitar av vävnad som är mycket böjda.
- Flat mount näthinnan på filterpapper.
- Fukta en bit av filterpapper med Ringers lösning och placera den i bilden bredvid ögonmussla bitar. Använd platt tång vid hantering intakt våta filterpappret för att undvika punktera det. Lägg kallt Ringers lösning för att täcka både filterpapper och vävnad.
- Med tången i varje hand, försiktigt dra pappersfiltret under varje ögonmussla bit med RPE och fotoreceptorer uppåt, dvs med baksidan av ögat uppåt. Placera ögonmussla bitar i en linje längs mitten av pappersfiltret (se figur 1 c). Hantera ögonmussla bitarna försiktigt med fin pincett endast nära en kant eller ett hörn.
- För att hjälpa näthinnor följa pappersfiltret, placera våta filterpappret på en torr pappershandduk för 3 s att transportera fukt nedåt, men inte låta vävnaden bli torr. Upprepa tills ögonmussla bitarna ligga platt på pappersfiltret. Tillämpa skonsam sugkraft på undersidan av pappersfiltret hjälper till att platta till näthinnan, men detta steg är inte nödvändigt.
- Om svarta ark av RPE förblir på ögonmussla bitar, Använd fin pincett att försiktigt dra den bort start från en hörna (se figur 1 d) medan vävnaden sitter i en droppe Ringers lösning. Näthinnan bör lyft av pappersfiltret, upprepa steget fuktspridande i 2.5.3. Näthinnan kan visas rosa på grund av oblekt visuella pigment.
- Upprepa näthinnan dissektion och platt montering steg i 2.4-2.6 för det andra ögat, om så önskas, att hålla första platt-monterad näthinnan nedsänkt i kallt Ringers lösning. För att effektivisera förfarandet för skivning, får bitar av båda näthinnor placeras på ett filterpapper. När RPE har tagits, kan protokollet utföras under normal rumsbelysning såvida experiment kräver mörker.
- Placera filterpappret på en bild och trimma den till en rektangel med en enda kant rakblad, lämnar ~ 0,5 cm filtrerpapper på vardera sidan av linjen av näthinnor. Flytta pappersfiltret till beredda skivning kammaren, Skjut lång filterpapper kanterna i de tunna vaselin linjer med pincett och fördjupa näthinnor i 3-4 droppar kallt Ringers lösning.
Obs: Vissa färgämnen, såsom fettlösliga färgämnen, läses bäst in platta fästen i detta skede innan skivning. Dessa kan vara laddad, wicked bort med en vävnad och tvättas i skivning kammaren. Till exempel C12 558/568 BODIPY intensivt fläckar retinal cell membran och ljusmätare yttre segment (se figur 4A) när den är lastad på ~ 5 µg/mL för 15 min i rumstemperatur (normalt 23-27 ° C), följt av en tvätt i överskott Ringers lösning . - Överföra skivning kammaren till vävnad slicer scenen, placera den långa kanten längs den markerade linjen och säkert kammaren slutar på scenen med laboratorium tejp. Börjar i ena änden, skär näthinnan och filterpapper med bestämda, mjuka tryck på skivning armen. Kontrollera att den första sektionens klipptes fullt, sedan använda Mikrometern för att skära ~ 400 µm skivor.
- Montera den imaging stegen.
- Plats skivning kammaren med skivad retinal sektioner i petriskål från steg 1,7 anslutning till bildtagning stege (se figur 1E). Fyll skålen med kall Ringers lösning att dränka dess innehåll.
- Med hjälp av pincetten och hålla skivor nedsänkt, försiktigt överför remsor av filterpapper och näthinnan till stegen genom att skjuta petriskål från vänster till höger. Se till att inte röra näthinnor direkt. Rotera sektorerna 90° och begrava filterpapper kanterna i vaselin.
- Fint placera retinal skivor i stege med pincett så att näthinnans skikt är tydligt synliga under mikroskopet dissektion (se figur 1 g). För skivor på varje ände av stege, se till att vävnaden är vänd inåt mot de andra skivorna för att minimera rörelse i vävnaden under injektion eller flöde. Kassera alla retinala skivor som inte är väl anslutit sig till pappersfiltret (se figur 2A).
- Om du vill ladda färgämnen i näthinnans skivor i detta skede och tvätta i överskott Ringers lösning före imaging.
Obs: Propidium jodid (PI) och Hoechst 33342 kraftfullt fläcken kärnor i döda och alla celler, respektive (se figur 2B), när inkuberas med retinal skivor på 5 µg/mL för 20 min i rumstemperatur. Tetrametylrodamin (TMRM) ackumuleras i aktivt respiring mitokondrier i hela näthinnan när inkuberas vid 1 nM i 30 min i rumstemperatur. - Medan skivor färgning, förbereda imaging kammare och injektion apparaten. Använd en spruta för att spola slangen med Ringers lösning och rensa bubblor, bifoga den öppna änden av slangen till imaging kammare inlopp och Stäng Avstängningskranen. Bort sprutan och fyll den med reagenserna injektionsvätska, sedan sätter du tillbaka det till slangen.
- Använd tången för att överföra täckglaset med retinal skivor till imaging kammaren, att trycka på täckglaset till pricken vaselin nära inloppet kanten av imaging kammaren (se figur 1 H). Fyll i imaging kammaren med Ringers lösning att täcka skivor.
3. imaging retinal skivor
- Placera fyllda imaging kammaren med anslutna injektion apparaten på scenen av en upprätt confocal Mikroskop utrustad med 20 eller 40 X vatten doppning lins. Säkra imaging salen med scen klipp.
- Lägre doppa linsen över stegen, och fokusera på en skiva i ena änden av stege under dim trans-tänd ljus. Undersöka varje skiva för tvärgående orientering, förekomst av ljusmätare yttre segment och säker vidhäftning till pappersfiltret.
- Välj bästa skiva för tid förfaller imaging och konfigurera den Mikroskop mjukvaran för time lapse bild förvärv. Tabell 4 beskrivs typiska imaging inställningar för olika fluorescerande markörer och färgämnen.
Obs: Andelen bild förvärv varierar beroende på den Mikroskop, fluorescerande marker(s) och biologisk process studeras. Exempelvis använda 800 x 800 pixlars upplösning, 2 µs/pixel scan hastighet och en 10-s bildhastighet för imaging kalcium dynamik i fotoreceptorer med GCaMP3 och ett rött färgämne.- Om tillgängligt, kan du använda programvaran för att spåra fysiska sevärdheter i segmentet (ljusmätare yttre segment, cell organ, kärnor) för att hjälpa potentiella omorientering under tidsfördröjning. Också konfigurera programvaran att övervaka i realtid fluorescens i segmentet.
- Påbörja imaging och övervaka baslinjen fluorescens. När fluorescens hela segmentet stabiliserar (vanligtvis inom 2-5 min), Fortsätt med experimentet. Injektionsvätska, öppna Avstängningskranen spruta, sedan långsamt sänka och dra tillbaka kolven två gånger för att underlätta blandning.
Obs: avskaffa exempelvis mitokondriell funktion genom att injicera en koncentrerad lösning av protonophore CCCP att nå en slutlig koncentration på 1 µM i imaging kammaren. Detta framkallar en robust Ca2 + brast i ljusmätare cytosol rapporterats av GCaMP, sedan en stadig minskning mitokondriella membranpotential som rapporterats av TMRM. - Noga övervaka skivor för drift under experimentet, och använda programvaran för att göra mikro-justeringar enligt fysiska sevärdheter. Normalt glida i Z-riktningen under injektion eller perfusion är < 5 µm.
4. imaging retinal skivor under perfusion experiment där lösningar ändras eller flödade kontinuerligt
Obs: Imaging retinal skivor under perfusion experiment där lösningar byts eller flödade ständigt påminner om inställningar för statiska avbildningar eller injektion experiment, med följande ändringar.
- Istället för vaselin stegar beskrivs i steg 1.4, använda kraftigare vax stegar för att hålla retinal skivor stadig under lösning flöde.
- Placera två små parallella cylindrar av unflavored dentalvax ~ 0,5 cm mellanrum på ett täckglas. På en plan yta, Använd en tumme för att trycka varje cylinder ner och ut mot täckglaset parallella kant. Poäng både tillplattad cylindrar horisontellt med en #1 täckglas (se figur 1E, höger) sedan smeta ett tunt lager vaselin mellan vaxremsor med en spatel.
- Vid montering på imaging stegen i steg 2.10.2, tryck skivad filterpapper kanterna i vax poängen med fin pincett (figur 1 g).
- Ställ in för perfusion i steg 2.12, Fyll sprutan reservoarer med preoxygenated lösningar, eller använda det valfria gas grenröret för att syresätta lösningar i varje reservoar. Spola alla slangar med Ringers lösning, se till att alla linjer flöda när öppnas och rensa stora bubblor.
- Innan du fyller imaging kammaren i steg 2.13, Använd sprutan för att placera en annan dot vaselin över varje utsatt hörn av täckglaset att förhindra det från att glida i sidled under flöde.
- När imaging kammaren är fylld och monterad på Mikroskop scenen, aktivera Sugenheten och Anslut hygienfilter slangen. Testa flödet av den Ringers lösning och använda micropositioner att placera hygienfilter röret över utflöde kammare så att små mängder vätska dras innan kammaren flödar över (vanligtvis ~ 1 mm ovanför lösning för en 2 mL/min flödeshastighet). Hålla Ringers lösning flyter samtidigt att välja skivor i steg 3,4.
- För att genomföra experimentet i steg 3,4 för perfusion, växla flödet av lösningar genom att stänga Avstängningskranen av den första lösningen när du öppnar det av den andra lösningen.
- Exempelvis för att tömma extracellulära Na+ från imaging kammaren, använda två spruta reservoarer fylld med Ringers lösning eller Na+-gratis lösning (tabell 3). Flow Ringers lösning för att upprätta baslinjen och sedan växla till Na+-gratis lösning. Detta resulterar i stora cytosoliska Ca2 + ökar i ljusmätare yttre segment och cell organ (se figur 4).
- För gravitation matad perfusion system, övervaka nivån av lösning i varje behållare så att flödet är konstant under imaging. Toppa reservoarer som behövs med syresatt lösningar eller upprätthålla kontinuerlig syre bubblar med gas grenröret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stabil positionering och tvärgående orientering av skivor är nyckeln till framgångsrik imaging med injektion eller genomblödning av farmakologiska medel. Noggrant undersöka och flytta skivor före confocal imaging som behövs för att säkerställa alla retinala lagren är synlig (figur 2A, del ii). Om en skiva är roterad framåt något (figur 2A, segment iii), buntar av yttre segment kommer att vara synlig och små justeringar kan göras med pincett att få önskad retinala lagren i fokus. Segment följs dåligt pappersfiltret (figur 2A, skiva jag) eller behålla RPE (figur 2A, skiva iv) bör inte användas för tid förfaller avbildning.
Cellernas viabilitet är avgörande för att observera fysiologiska processer ex vivo; en cellviabilitet fläcken som propidium jodid (PI) rekommenderas till assay cell hälsa samtidigt öva näthinnan skivning. Döda celler nära den skurna kanten av alla skivor kommer att ackumuleras PI i sina kärnor (figur 2B, vänster paneler), medan 5-10 µm djupare in i segmentet, friska celler med normal morfologi och ingen PI färgning kan avbildas. Exempelvis i fotoreceptorer visas PI negativa celler nedanför den skurna kanten vanligen ett stereotypa polariserade, avlånga morfologi (figur 2B, rätt panelerna). Fotoreceptorer förbli livskraftig i näthinnans skivor för minst 4 h när de lagras i syresatt Ringers lösning.
Många retinala cellstrukturer kan visualiseras med hjälp av kombinationer av transgena markörer och färgämnen; exempel confocal bilder av färska retinal skivor med dubbel- och Trebäddsrum fluorescerande märkning presenteras i figur 3. För att visualisera dynamiken i kon ljusmätare endoplasmatiska nätverket (ER) i förhållande till kärnan, kan retinal skivor från transgen fisk uttrycker GFP riktade till konen ER17 vara counterstained med en nukleär färgämne (figur 3A). En liknande strategi kan användas för att Visa aktin cytoskelettet använder retinal skivor från transgena Sebrafisken uttrycker GFP-smält aktin18 (figur 3B). Med en annan cell-specifika promotorn, kan Müller celler vara märkt med röd fluorescerande protein tdTomato19 och visualiseras i näthinnans skivor (figur 3 c, övre panelen). Glukosupptag i näthinnan kan vara analyseras i vivo av oralt gavaging vuxen zebrafiskar med en fluorescerande glukos analoga (NBDG), som blir införlivas celler synliga i en retinal slice21 (figur 3 c, nedre panelen). Dubbelrum transgena zebrafiskar kan användas för att övervaka flera cellprocesser eller celltyper i tandem, såsom Ca2 + dynamik i en undertyp av kottar. Figur 3D visar en trippel etikettschema för denna typ av experiment, med tdTomato uttryckt i lång våglängd kottar2 tillsammans med mitochondrially-riktade Ca2 + sensor (mito-GCaMP) uttryckt i alla kottar22 och en nukleär fläck.
Time lapse avbildning av näthinnans celler är en viktig fördel med denna skiva prep. Exempelvis kan Ca2 + fluktuationer i kon ljusmätare cytosol observeras och senare kvantifieras under farmakologisk manipulation, ett experiment som avbildas i figur 4. Figur 4A visar retinal skivor uttrycker i Ca2 + sensor GCaMP2 (överst) eller kontroll andra16 (botten) i kon fotoreceptorer counterstained med ett rött lipofila färgämne. I detta experiment är Na+ isotonically utarmat från imaging kammaren med perfusion, frammana stora ökningar i cytosoliskt Ca2 + för yttre segment och cell kropp som reflekteras av GCaMP (figur 4A, övre panelen). Fluorescens av retinal skivor uttrycker Ca2 +-okänsliga andra påverkas inte av denna behandling (figur 4A, nedre panelen). Time lapse filmer kan analyseras med hjälp av ImageJ programvara att isolera och kvantifiera fluorescens svaren från enda kon yttre segment, cellen organ och synapser (figur 4B).
| Komplement lösning | ||
| 50 x lager * koncentration (mM) | arbeta koncentration (mM) | |
| D-glukos | 500 | 10 |
| natrium laktat | 50 | 1 |
| natrium pyruvat | 25 | 0,5 |
| L-glutamin | 25 | 0,5 |
| reducerat glutation | 25 | 0,5 |
| askorbinsyra | 15 | 0,3 |
| * lagra alikvoter vid-20 ° c < 6 månader; lägga till färska Ringers lösning | ||
Tabell 1. Komponenter av 50 X komplettera stamlösning och slutliga arbetande koncentrationer.
| Ringers lösning | |
| koncentration (mM) | |
| NaCl | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH till 7,4 med NaOH | |
| förvaras vid 4 ° c i steril flaska < 1 månad | |
Tabell 2. Komponenter i standard Ringers lösning.
| Na+-gratis Ringers lösning | |
| koncentration (mM) | |
| TRIS | 147 |
| HCl | 120 |
| KCl | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH till 7,4 använder HCl | |
| förvaras vid 4 ° c i steril flaska < 1 månad | |
Tabell 3. Komponenter av Na+-gratis Ringers lösning.
| Confocal Imaging inställningar | |||
| Fluorophore | Magnetisering | Utsläpp Filter | |
| Våglängd | Laser intensitet | ||
| GFP (inklusive GCaMP) | 488 nm | 2 - 5% | Andra eller AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 nm | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10% | Andra eller AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
Tabell 4. Imaging villkoren för fluorescerande markörer och färgämnen som presenteras i figurerna 2-4.
Figur 1. Schematiska för att förbereda färska zebrafiskar retinal skivor. (A) dissekera bort ögonmusslan och kasta linsen och sklera (steg 2.4.1.). (B) skär ögonmusslan i tre bitar; Kassera liten kant pjäs (steg 2.4.2.). (C) dra filterpapper under ögonmussla bitar med inre näthinnan vänd mot pappersfiltret (steg 2.5.1.-2.5.2.). (D) plattar näthinnan med en pappershandduk för att veken Ringers lösning nedåt genom filtrerpapper (steg 2.5.3.), sedan dra försiktigt bort återstående RPE med pincett (steg 2,6). Flytta pappersfiltret till skivning kammaren på vävnad slicer scenen och skär 400 µm skivor (steg 2.8., 2.9.). (E) överföra skivning kammare med skivor och en vax eller vaselin stege till en petriskål Ringers lösning (steg 2.10.1.). (F) använda fin pincett för att glida enda skivor från skivning kammaren till stegen samtidigt skivor nedsänkt. (G) rotera filterpapper remsor (svart) 90 ° och begrava kanterna av pappersfiltret i vax eller vaselin (steg 2.10.2.-2.10.3.). (H) Schematisk bild av den slutliga imaging kammaren laddad med en stege och skivor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på färska zebrafiskar retinal skivor visar korrekt vidhäftning till filterpapper och cellernas viabilitet. (A) Brightfield bilden av färska retinal skivor i en vaselin stege. Skivor ii och iii visar god vidhäftning och tvärgående näthinnans skikt. Skivor i och iv har kvar betydande RPE, eller är mycket böjda och inte väl fastsatta att pappersfiltret och bör inte avbildas. Skalstapeln = 200 µm. (B) Top-down Z montage av en frisk retinala skiva från transgena Sebrafisken uttrycker andra i kon fotoreceptorer (Tg(gnat2:eGFP)16). Hoechst dye etiketter alla kärnor; propidium jodid (PI) counterstaining etiketter kärnor av döda celler, som visas nära den skurna kanten av slice (vänster). Z-stack stegstorlek = 1 µm, skalstapeln = 20 µm. fluorescerande imaging villkor beskrivs i tabell 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Prova confocal bilder av dubbel - och trippel-märkt ex vivo retinal skivor från transgena vuxen zebrafiskar. (A) två-imaging färgschema anställa transgena GFP taggade endoplasmatiska retiklet i kottar (Tg(gnat2:calr-GFP)17, toppen) med Hoechst nukleära motfärg (blå, nederst). (B) GFP taggade aktin i kottar (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, toppen) med Hoechst nukleära motfärg (blå, nederst). (C) RFP märkt Müller celler (Tg(GFAP:tdTomato)19, top) från en zebrafiskar matas fluorescerande glukos (NBDG) visar glukosupptag in kottar20,21 (gröna, botten). (Denna bild är från figur 2B i Kanow, et al. 21) (D) exempel på tre-Color imaging använder dubbla transgena zebrafiskar. Vänster, RFP riktade till lång våglängd kon fotoreceptorer (Tg(trβ2:tdTomato)2). Center, kalcium biosensor GCaMP riktade till konen ljusmätare mitokondrier (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). Höger, överlagras bilder av tdTomato (magenta), mito-GCaMP (grön) och Hoechst nukleära motfärg (blå). Bilderna är maximal intensitet Z-projektionerna av 9 ramar över en 7 µm vävnad djup; skala barer representerar 10 µm. fluorescerande imaging villkoren sammanfattas i tabell 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ca2 + bildbehandling med GCaMP och kontroll andra. (A) representativa bilder av färska retinal skivor uttrycker den fluorescerande Ca2 + biosensor GCaMP (gnat2:GCaMP32, top) eller andra (botten) i kon fotoreceptorer. Vänster, skivor vid baslinjen; höger, skivor 2 min efter Na+ var isotonically utarmat från imaging kammaren använder genomblödning av en Tris-baserade Ringers lösning, som fällor Ca2 + i fotoreceptorer. Skala barer = 10 µm. fluorescerande imaging villkor beskrivs i tabell 4. (B) menar fluorescens förändringar av enstaka ljusmätare fack (yttre segment, cellen organ och synapser) under tiden förfaller avbildning av Na+ utarmning. Skivor var avbildade varje 10 s, stackar bearbetades med hjälp av ImageJ och fluorescens av GCaMP eller andra var normaliserade för att signalera från membran färgämnet. Heldragna linjer, GCaMP (n för yttre segment = 15, cellen organ = 24, synapser = 26); streckade linjer, andra (n för yttre segment = 26, cellen organ = 20, synapser = 31). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo imaging av färska zebrafiskar retinal skivor har visat sig vara ett mångsidigt verktyg för att studera ljusmätare biologi20,21,22, och är unikt genom att det möjliggör analys av enstaka celler i en mogen, fullt differentierade näthinnan. Med praxis är det möjligt att genomföra flera experiment med vävnad från en enda fisk, även med seriell skivor från samma del av näthinnan. Förutom de utmaningar och förslag angående beredning av amfibie retinal skivor för elektrofysiologi studier14finns det viktiga överväganden för imaging experiment.
För fotoreceptorer korrelerar cellernas viabilitet generellt med cellmorfologi, så det är viktigt att hantera känsliga näthinnan minimalt, särskilt efter RPE har avlägsnats. Efter skivning, Använd fin pincett att försiktigt glida skivor horisontellt från skivning kammaren (figur 1F) för att överföra dem till stegen i stället för att lyfta skivor rakt upp, och alltid hålla skivor nedsänkt i Ringers lösning. Om möjligt, montera stegen av retinal skivor nära de confocal mikroskopet för att minimera skador på skivor från skakar under transport.
Stark vidhäftning av retinala vävnaden att pappersfiltret är avgörande för att skapa skivor som förblir stabila under injektion eller perfusion experiment. Det är nödvändigt att noga inspektera varje skiva för morfologi och stabilitet strax före imaging (figur 2A); försiktigt knacka tabellen Mikroskop medan visning slice rörelse genom confocal okularlinsen avslöjar stabiliteten i en viss sektor. Trots försiktighetsåtgärder, glida i Z-riktningen under injektion eller perfusion kan presentera utmaningar för analys, så det är användbart att ladda kontroll färgämne, såsom fettlösliga färgämnen för membran och mitokondrier, till stabilt etikett en identifierbar cellstruktur för normalisering (figur 4A, magenta). Om skivor avdrift > 10 µm i Z-riktningen kanske det inte möjligt att extrahera användbara encelliga data. Måttlig avdrift i X-Y riktning kan korrigeras i efterbehandlingen med registrering programvara såsom MultiStackReg för ImageJ (RRID:SCR_002285).
Under statiska förhållanden, bör fluorescens markörer i näthinnans skivor förbli stabila, visserligen fotoblekning kan inträffa vid imaging. Försiktighet bör iakttas att minimera laser exponering under tiden förfaller genom raffinering av parametrar såsom laser intensitet, skanna hastighet och bildhastighet. Imaging kontroller rekommenderas för varje fluorescerande markör som används. Kontrollerna omfattar injicering startas Ringers lösning utan farmakologiska agenter i separata experiment eller genomföra imaging experiment med icke-biosensor markörer som fluorescerar konstitutivt.
Beroende på confocal excitation laser används, kan pigment i RPE bidra till autofluorescens och även generera värme under imaging, så det är viktigt att ta bort de flesta av denna vävnad innan skivning. Dark-adapting djur aids i borttagning av RPE samtidigt minimera skador på underliggande näthinnan. Oförmåga att bild RPE är en begränsning av denna skiva förberedelse, men detta kan lösas med hjälp av albino djur med en transparent RPE. En annan begränsning är att retinala ganglionceller och slutet fötter av Müller celler kan bli skyms från beskådar av pappersfiltret; som en alternativ beredning kan näthinnor vara platt monterad med ljusmätare sida ner på pappersfiltret och sedan skivade för att ge en tydligare bild av innersta näthinnan. Det är också viktigt att notera att lång horisontell projektioner av vissa celler, till exempel brett fält amakrina celler, kan avskiljas under dissektion eller skivning. En sista begränsning är att många fluorescerande färgämnen ackumuleras nonspecifically i ljusmätare yttre segment, så för denna del av näthinnan är det lämpligt att använda genetiskt kodade biosensorer i stället för indikator färgämnen.
Med tanke på det breda utbudet av tillgängliga fluorescerande cell reporter färgämnen23,24 för vävnad och genetiskt kodade fluorescerande biosensorer används framgångsrikt i zebrafiskar2,3,4, 5, detta segment preparat kunde användas för att studera många biologiska processer i flera typer av näthinnans celler (se exempel i figur 3, figur 4). Imaging färska retinal skivor med levande cell super-resolution mikroskopi kan också ge spännande nya insikter till näthinnans funktion och hälsa på en subcellulär nivå. Ytterligare, den här metoden kan anpassas för ex vivo imaging mus retinal skivor25. Medan framgångsrik beredning av färsk retinal skivor kräver övning, är det ett kraftfullt verktyg som är användbara för att hantera ett brett utbud av cell-specifika biologiska frågor i en mogen näthinna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Ralph Nelson och Daniel Possin för vägledning som samtidigt utveckla detta protokoll, och Eva Ma, Ashley George och Gail Stanton för generering av stabil transgena zebrafiskar linjer. Arbetet stöddes av NSF GRFP 2013158531 att M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. och M.G. och EY026020 till J.H. och S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
