Summary
Imagerie tissu rétinien peut fournir des informations de cellule unique qui ne peut pas être recueillies de méthodes biochimiques traditionnelles. Ce protocole décrit la préparation de rétiniens tranches de poisson zèbre pour l’imagerie confocale. Fluorescentes codé génétiquement des capteurs ou indicateur colorants permettent la visualisation de nombreux processus biologiques en types distincts de cellules rétiniennes.
Abstract
La rétine est un tissu complex qui initie et intègre les prémices de la vision. La dysfonction des cellules de la rétine est une caractéristique de nombreuses maladies aveuglantes et thérapies futures dépendent de compréhensions fondamentale sur la rétine comment différente cellules de fonctionnent normalement. Obtenir ces informations avec des méthodes biochimiques s’est avérée difficile parce que les contributions des types de cellules particulières sont diminuées dans le milieu des cellules rétiniennes. Imagerie rétinienne direct peut fournir une vue de nombreux processus biologiques niveau subcellulaire, grâce à un nombre croissant de biocapteurs fluorescents génétiquement encodés. Cependant, cette technique a été jusqu'à présent limitée à des têtards et des larves de poisson zèbre, les couches rétiniennes ultrapériphériques des rétines isolés ou imagerie de résolution plus faible des rétines animaux vivants. Nous présentons ici une méthode pour générer des vivants ex vivo rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie live par microscopie confocale. Cette préparation donne des tranches transversales avec toutes les couches rétiniennes et la plupart des types de cellules visibles permettant d’effectuer des expériences d’imagerie confocale utilisant une perfusion. Poisson zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ou biocapteurs dans les types de cellules rétiniennes spécifiques ou organites sont utilisés pour extraire les informations de la cellule unique d’une rétine intacte. En outre, tranches rétiniens peuvent être chargés avec indicateur fluorescent colorants, ajoutant à la polyvalence de la méthode. Ce protocole a été développé pour l’imagerie Ca2 + au sein de poisson-zèbre cônes photorécepteurs, mais avec des marqueurs de bon, il pourrait être adapté pour mesurer Ca2 + ou métabolites dans Müller cellules, cellules bipolaires et horizontales, cellules microgliales, cellules amacrines ou la rétine cellules ganglionnaires. L’épithélium pigmentaire rétinien est retiré des tranches si cette méthode ne consiste pas pour l’étude de ce type de cellule. Avec la pratique, il est possible de générer des tranches de série d’un animal pour des expériences multiples. Cette technique adaptable fournit un outil puissant pour répondre à nombreuses questions sur la biologie des cellules rétiniennes, Ca2 +et l’homéostasie énergétique.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) a devenu employé couramment dans la recherche scientifique médicale et base1, en raison de sa petite taille, de développement rapide et de systèmes d’organes vertébrés. La transparence naturelle des larves de poisson zèbre combinée à des méthodes établies pour la transgénèse ont permis une visualisation détaillée des processus cellulaires dans un animal vivant. Un certain nombre de biocapteurs fluorescents génétiquement codées ont été la cible de cellules spécifiques zebrafish pour détecter Ca2 + 2, peroxyde d’hydrogène3, apoptotic activation4 et ATP5.
L’imagerie in vivo des larves de poisson zèbre a donné lieu à des percées dans le domaine des neurosciences, y compris la cartographie du cerveau circuits6 et7de troubles de développement de médicaments pour le système nerveux central. Poisson zèbre conviennent bien pour la recherche de vision parce que leurs rétines présentent la structure laminaire et types de neurones des vertébrés supérieurs, et ils affichent des comportements visuels robuste8,9. Plusieurs types de dégénérescences rétiniennes analogues à la maladie humaine ont été modélisés avec succès et étudiées chez le poisson zèbre10,11, y compris l’imagerie direct des photorécepteurs individuels dégénérer dans une rétine2, 12.
En vivo imagerie de larves de poisson zèbre est un outil précieux, il devient plus difficile que les poissons grandissent et développent de pigmentation, et certains traitements pharmacologiques ne peuvent pénétrer un animal entier. En outre, certains procédés cellulaires changent avec l’âge et le développement faisant plus tard points dans le temps critique pour la fonction de la compréhension et la progression de la maladie chez les animaux adultes. Méthodes biochimiques tels qu’immunoblot, quantitative PCR, O2 consommation et métabolomique analyses peuvent fournir des indices importants sur la biologie de la rétine dans son ensemble, mais il est difficile de discerner les contributions individuelles de types de cellules touchées par maladie. Imagerie des tissus rétiniens isolés ex vivo permet de contourner ces problèmes et tandis qu’imaging plate montés rétines offre une vue sur la rétine externe13, plus profonds intérieurs caractéristiques rétiniennes sont obscurcies. Tranches de rétinal transversal, telles que celles présentées dans fixe des analyses immunohistochimiques, permettent une vision claire de tous les calques et les types de cellules mais seulement offrent un aperçu unique des processus dynamiques impliqués dans la maladie et de la fonction normale.
Nous présentons ici une méthode pour générer des ex vivo transversal rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie. Il est similaire aux méthodes employées pour préparer des amphibiens et des poissons zèbres tranches rétiniennes pour14,des études électrophysiologiques et morphologiques15, avec des modifications importantes pour le laps de temps d’imagerie ex vivo utilisant confocal microscopie. Réponses de la fluorescence des biocapteurs ou colorants en tranches sont surveillés en temps réel avec un microscope confocal tout en livrant des agents pharmacologiques à l’aide de perfusion. Alors que la méthode a été développée pour l’imagerie des photorécepteurs, il peut être possible de l’utiliser pour visualiser les cellules Müller, cellules bipolaires, les cellules horizontales, les cellules amacrines ou cellules ganglionnaires rétiniennes avec des marqueurs fluorescents appropriés. En outre, tranches peuvent être chargés avec des colorants fluorescents perméable à la cellule de la viabilité cellulaire rapport, transport vésiculaire, la fonction mitochondriale ou état redox. Cette préparation polyvalente permet la visualisation d’un large éventail de processus subcellulaires tout au long de la rétine, y compris Ca2 + dynamique, transduction du signal et état métabolique.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’Université de Washington animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.
1. préparer les animaux et les matériels
Remarque : L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est une feuille sombre du tissu entourant l’extérieur de la rétine dont la pigmentation peut obscurcir caractéristiques rétiniennes et endommager les tissus lorsque ex vivod’imagerie confocale. Dans l’obscurité, la RPE de poisson-zèbre est rentrée de la rétine ; obscurité adapter poisson pour faciliter le retrait futur du RPP de la rétine avant de trancher et de l’imagerie.
- Transférer les poissons dans un réservoir de frai rempli d’eau de poissons, puis envelopper le réservoir frai avec tissu foncé ou placez-le dans un placard sombre.
- Obscurité adapter zebrafish pendant au moins 1 h avant l’euthanasie pour permettre à près la séparation complète du RPP de la rétine. adaptation à l’obscurité 30 min est suffisante pour enlever la plupart des RPE, bien que les morceaux de celui-ci peuvent rester intercalées entre les photorécepteurs.
- Faire fondre le ~ 15 mL de pétrole gelée dans un bécher de 50 mL sur une plaque chauffante et puis dessinez 3 mL du liquide dans une seringue de 3 mL de glissement. Inverser la seringue, placer dans un tube à essai rack et permettre à la gelée de pétrole refroidir.
- Faire une chambre de tranchage réutilisable sur une lame de microscope ordinaire 7 X 2,5 cm.
- À l’aide de vernis à ongles transparent, lignes étroites de peinture pour créer un rectangle de 3 X 2,5 cm dans le centre de la diapositive, laisser sécher et puis ajoutez une autre couche de vernis à ongles aux lignes.
- Préparer des échelles d’imagerie sur les lamelles de tenir les tranches en imagerie. Les tranches seront formeront les « barreaux » de l’échelle.
- Pour l’imagerie statique ou expériences d’injection avec écoulement de la solution minimale, faire vaseline échelles constituée de deux bandes parallèles plates larges de vaseline sur les lamelles de 18 mm en verre. Utiliser la seringue pour appliquer deux aplati ~ frottis long de 1 cm de vaseline refroidi à 0,5 cm de distance sur la lamelle couvre-objet.
- La coupeuse de tissu est prêt.
- Nettoyer une lame de rasoir double avec de l’éthanol et laisser sécher à l’air. Coupez-le en quartiers avec des ciseaux, tout d’abord longitudinalement en deux moitiés, puis sur chaque lame.
- Placez la chambre tranchage sur la scène de la coupeuse de tissu, centrez-le horizontalement sur la scène et marquez un long bord avec un marqueur permanent pour l’alignement.
- Charger une section de la lame sur le bras de coupeuse de tissu, s’assurer que la lame se trouve plates et centré sur la diapositive sans toucher le vernis à ongles, puis serrez légèrement l’appareil de la lame. Abaisser le bras de lame en ajustant le bouton ¼ tourner, puis placer un morceau de papier filtre dans le centre de la chambre de l’imagerie et l’épreuve Coupez-le. Si le papier n’est pas coupé entièrement par le biais, remonter la lame.
- À l’aide de la seringue, placez un seul petit point de vaseline refroidi dans une boîte de Pétri 10 cm ~ 1,5 cm à droite du centre. Appuyez sur une échelle d’imagerie à l’aide de forceps avec la gelée de pétrole vers le haut. Faire un autre petit vaseline dot ~ 1 cm du bord d’entrée de la chambre d’imagerie.
- Adapter la seringue de gelée de pétrole avec une aiguille de 20g et il décapsuler. Tenez l’aiguille sur la seringue et en profite pour faire deux bandes parallèles longues et minces de 1 cm de gelée de pétrole sur la longueur au centre de la chambre de tranchage. Les bandes d’espace ~ 1 cm de distance.
- Faire un outil de boucle de œil fil réutilisable en enveloppant le centre d’un ~ segment de 4 cm de fil de tungstène 30 g autour d’une paire de fois bien fermée forceps. Ajuster le diamètre de la boucle en faisant glisser le fil vers le haut ou vers le bas la pince jusqu'à ce qu’il est légèrement plus grand qu’un oeil de poisson-zèbre, généralement ~ 2-3 mm. Torsadez les extrémités des fils et les fixer à l’extrémité d’un bâton en bois de 6 cm à l’aide de ruban de laboratoire.
- Préparer une solution de Ringer.
- Décongeler les 50 X supplément solution mère (tableau 1) et ajoutez-le fraîche à une solution de Ringer tampon HEPES, non-bicarbonate (tableau 2), le matin de l’expérience ; diluer 200 µL de solution mère de supplément dans chaque 10 mL de solution de Ringer dans un tube à centrifuger conique ou une bouteille en verre stérile. Pour des expériences d’imagerie statiques, préparer au moins 30 mL de solution de Ringer par expérience. Le volume de solution de Ringer, nécessaire pour les expériences de perfusion dépendra du débit et le temps total d’expérience.
- Vérifier que le pH de la solution supplémenté est de 7,4 à l’aide d’une sonde pH numérique ou papier pH et ajuster en conséquence avec diluer NaOH ou HCl.
- Oxygéner supplémenté de Ringer sur glace par barbotage avec 100 % de gaz oxygène pendant au moins 5 min à l’aide d’un réservoir d’oxygène thérapeutique standard et régulateur équipé d’un tuyau ou le collecteur de barboteur gaz facultatif utilisé pour la perfusion. Stocker la solution de Ringer oxygénée sur glace dans un tube à centrifuger conique étanche ou une bouteille de verre stériles près le microscope à dissection ; Utilisez cette solution pour la dissection, imagerie et pour diluer les teintures ou agents pharmacologiques.
- Si les autres solutions sont utilisées dans l’expérience, tels que Na+-gratuit solution de Ringer (tableau 3), répétez les étapes 1.9.1.-1.9.3.
- Recueillir des boîtes de Pétri, forceps, micro-ciseaux et autres outils près le microscope à dissection et préparez un bain d’eau glacée de poisson zebrafish euthanasie.
2. préparation des tranches rétiniennes (voir Figure 1)
- Travail sous un éclairage ambiant rouge afin de minimiser l’adaptation de lumière (qui peut rendre le bâton pre plus étroitement à la rétine), euthanasier zebrafish par immersion dans un bain de glace jusqu'à ce que la réponse tactile est perdue, généralement 1 à 2 min. transférer les poissons dans une boîte de Pétri et utiliser un scalpel pour doivent disloquer mais pas décapiter le poisson.
- Desserrez tissu conjonctif autour d’un œil la boucle, puis tirez sur l’oeil en avant doucement avec la boucle dans une main. En revanche, à l’aide de micro-ciseaux couper le nerf optique blanc sous l’oeil, en prenant soin de ne pas pour couper le fond de le œil.
- Transférer le œil avec une pincette pour une boîte de Pétri de solution de Ringer froid sur la glace et répéter pour le deuxième œil. Gardez les yeux dans l’obscurité ou sous lumière rouge jusqu'à ce que le pre est supprimé de la rétine.
- Disséquer les œilletons sous un microscope de dissection de faible puissance dans une goutte de solution de Ringer froid sur une lame de verre plat dans une boîte de Pétri.
- Percer la cornée avec une pince fine, puis retirez délicatement les morceaux de claire et cassante cornée et sclérotique argenté avec une pince ou des ciseaux. Retirez et jetez la lentille et la plupart de la sclère (voir Figure 1 a) et gérer le œilleton isolé minimalement.
- Morceaux de graisse, petites portions de la sclère ou RPE noir peuvent rester attachés à le œilleton et retiré de la rétine plus tard. Si la rétine détache la RPE à l’étape 2.4.1, aller de l’avant avec les mêmes étapes à l’aide de redoubler de prudence ne pas d’endommager la rétine sensible isolée.
- Position ouverte côté œilleton (pre vers le haut) sur la diapositive et les couper en tiers ou quarts avec un grattoir à lame unique fraîche en un seul mouvement (voir Figure 1 b). Jeter des morceaux de tissu qui sont fortement courbées.
- Rétine Mont plat sur un papier filtre.
- Mouillez un morceau de papier filtre avec une solution de Ringer et placez-le sur la diapositive à côté les morceaux de le œilleton. Faire pinces plates en manipulant le papier-filtre humide intact afin d’éviter toute perforation il. Ajouter une solution de Ringer froid pour couvrir le filtre papier et le tissu.
- Avec une pincette dans chaque main, glisser avec précaution le papier-filtre sous chaque pièce œilleton avec le RPE et photorécepteurs vers le haut, c'est-à-dire avec l’arrière de le œil vers le haut. Placer les morceaux de le œilleton en une seule ligne le long du centre du papier filtre (voir Figure 1). Gérer les morceaux œilleton doucement avec une pince fine seulement près d’un bord ou un coin.
- Pour aider les rétines à respecter le papier filtre, placez le papier filtre mouillé sur une serviette en papier sèche pour 3 s à évacue l’humidité vers le bas, mais ne pas laisser le tissu s’assèchent. Répétez jusqu'à ce que les morceaux de le œilleton se trouvent plat sur le papier filtre. Application légère succion sur le dessous du papier-filtre aide aplatir la rétine, mais cette étape n’est pas essentielle.
- Si noirs feuilles de RPE restent sur les pièces de le œilleton, utiliser des pinces fines à éplucher doucement à partir d’un coin (voir Figure 1) tandis que le tissu est assis dans une goutte de solution de Ringer. Devrait la rétine décoller le papier filtre, répéter l’étape mèche en 2.5.3. La rétine peut sembler rose due à des pigments visuels écrus.
- Répétez la dissection de la rétine et plat montage étapes de 2,4 à 2,6 pour le deuxième œil, si vous le souhaitez, garder la rétine premier plat monté, immergée dans une solution de Ringer froid. Afin de simplifier la procédure de découpage en tranches, morceaux des deux rétines peuvent être placés sur un papier filtre. Après avoir retiré la RPE, le protocole est réalisable sous une lumière ambiante normale à moins que les expériences nécessitent des ténèbres.
- Placer le papier filtre dans une diapositive et ajuster en un rectangle avec une lame de rasoir seul, laissant ~ 0,5 cm de papier filtre de chaque côté de la ligne des rétines. Déplacer le papier filtre à la chambre de tranchage préparée, pousser les bords du papier filtre long dans les lignes minces de vaseline à l’aide de pinces et immerger les rétines dans 3-4 gouttes de solution de Ringer froid.
Remarque : Certains colorants, tels que des colorants lipophiles, sont chargés mieux en supports plat à ce stade avant de trancher. Ceux-ci peuvent être chargés, méchants loin avec un mouchoir et lavés dans la chambre de tranchage. Par exemple, C12 558/568 BODIPY intensément taches rétinienne cell membranes et segments externes photorécepteur (voir la Figure 4 a) lors du chargement à ~ 5 µg/mL pendant 15 min à température ambiante (en général de 23 à 27 ° C), suivie d’un lavage dans une solution de Ringer excès . - La chambre de tranchage de transfert à l’étape de trancheuse de tissu, placez le long du bord le long de la ligne tracée et fixer les extrémités de la chambre à la scène avec du ruban adhésif de laboratoire. Commençant à un bout, couper la rétine et le papier filtre en exerçant une pression ferme et douce sur le bras de tranchage. Vérifiez que la première tranche a été coupée entièrement, puis utilisez le micromètre à couper ~ 400 µm tranches.
- Assemblez l’échelle d’imagerie.
- Place la chambre de tranchage avec des sections rétiniennes en tranches dans la boîte de Pétri de l’étape 1.7 adjacent à l’imagerie ladder (voir Figure 1E). Remplir le plat avec une solution de Ringer froid à submerger son contenu.
- À l’aide de pinces et de garder les tranches submergés, doucement transfert bandes de papier filtre et la rétine à l’échelle en le faisant glisser de la boîte de Pétri de gauche à droite. Prendre soin de ne pas pour toucher directement les rétines. Faire pivoter les tranches de 90° et d’enterrer les bords du papier filtre en gelée de pétrole.
- Positionner finement tranches rétiniennes à l’échelle avec une pince afin que les couches de la rétiniens sont clairement visibles sous le microscope à dissection (voir Figure 1). Pour obtenir des tranches à chaque extrémité de l’échelle, faire en sorte que le tissu est vers l’intérieur vers les tranches afin de minimiser le mouvement du tissu pendant l’injection ou le débit. Jeter les tranches rétiniennes qui ne sont pas bien respectées le papier filtre (voir la Figure 2 a).
- Si vous le souhaitez, charger des colorants en tranches rétiniennes à ce stade et se laver dans une solution de Ringer excédentaire avant l’imagerie.
Remarque : L’iodure de Propidium (PI) et Hoechst 33342 robustement tacher noyaux de morts et de toutes les cellules, respectivement (voir Figure 2 b), incubés avec tranches rétiniennes à 5 µg/mL pendant 20 min à température ambiante. Tétraméthylrhodamine (TMRM) s’accumule dans les mitochondries activement respiration tout au long de la rétine lorsque incubés à 1 nM pendant 30 min à température ambiante. - Pendant que les tranches sont de coloration, préparer les appareils d’imagerie de la chambre et l’injection. Utiliser la seringue pour rincer le tube avec une solution de Ringer et purger les bulles, fixer l’extrémité ouverte du tuyau à l’entrée d’imagerie de la chambre et fermer le robinet. Retirer la seringue et remplissez-le de présenter pour l’injection, puis rattacher au tuyau.
- Forceps permet de transférer la lamelle avec tranches rétiniennes à la chambre d’imagerie, poussant la lamelle vers le point de gelée de pétrole près du bord de l’entrée de la chambre d’imagerie (voir la Figure 1 H). Remplir la chambre d’imagerie avec une solution de Ringer pour couvrir les tranches.
3. imagerie rétiniennes tranches
- Placez la chambre remplie d’imagerie avec le dispositif d’injection connectés sur la scène d’un microscope confocal vertical équipé d’une eau de 20 ou 40 X lentille de trempage. Fixez la chambre d’imagerie avec des clips de la scène.
- Abaisser la lentille du plongement sur l’échelle et se concentrer sur une tranche à une extrémité de l’échelle sous faible lumière trans-éclairé. Examinez chaque tranche pour orientation transversale, présence des segments externes des photorécepteurs et adhérence sécurisée sur le papier filtre.
- Sélectionnez la meilleure tranche pour l’imagerie de laps de temps et configurer le logiciel de microscope pour l’acquisition d’images de temps écoulé. Tableau 4 donne un aperçu des paramètres d’imagerie typiques pour les différents marqueurs fluorescents et colorants.
Remarque : Le taux d’acquisition d’images variera selon le microscope, marqueur fluorescent et des processus biologiques à l’étude. Par exemple, utiliser une cadence de 10 s, 2 vitesse de balayage de µs/pixel et résolution 800 x 800 pixels pour l’imagerie dynamique du calcium dans les photorécepteurs avec GCaMP3 et un colorant rouge.- Le cas échéant, utiliser le logiciel pour tracer des repères physiques dans l’écaille (segments externes des photorécepteurs, corps cellulaires, noyaux) pour faciliter la réorientation éventuelle pendant le laps de temps. Également mis en place le logiciel pour surveiller en temps réel par fluorescence dans l’ensemble de la tranche.
- Commencer l’imagerie et surveiller la fluorescence de la ligne de base. Lorsque fluorescence dans l’ensemble de la tranche se stabilise (généralement moins de 2-5 min), procéder à l’expérimentation. Pour injection, ouvrir le robinet de la seringue, puis lentement enfoncer et faire reculer le piston double à l’aide de mélange.
NOTE : par exemple, supprimer la fonction mitochondriale en injectant une solution concentrée de la protonophore CCCP pour atteindre une concentration finale de 1 µM dans la salle d’imagerie. Ceci induit une robuste Ca2 + fait irruption dans le cytosol de photorécepteur rapporté par GCaMP, puis une diminution constante au potentiel de membrane mitochondrial rapporté par TMRM. - Suivre de près les tranches de la dérive pendant l’expérience et utiliser le logiciel pour faire des micro-ajustements selon les repères physiques. Généralement dériver dans la direction Z pendant l’injection ou la perfusion est < 5 µm.
4. imagerie rétiniennes tranches au cours d’expériences de perfusion où les solutions sont modifiées ou coulées en continu
Remarque : Imagerie rétinienne tranches au cours d’expériences de perfusion lorsque les solutions sont changées ou coulé en continu est semblable à la configuration pour des expériences d’imagerie ou injection statiques, avec les modifications suivantes.
- Au lieu de la gelée de pétrole échelles décrits à l’étape 1.4, utiliser des échelles de cire pour tranches rétiniens stable durant l’écoulement de la solution.
- Placer les deux petits cylindres parallèles de cire dentaire non aromatisé ~ 0,5 cm de distance sur un lamelle couvre-objet. Sur une surface plane, appuyez chaque cylindre puis vers le bord parallèle de la lamelle à l’aide d’un pouce. Marquer les deux cylindres aplaties horizontalement avec un lamelle couvre-objet #1 (voir la Figure 1E, côté droit) puis enduisent une fine couche de gelée de pétrole entre les bandes de cire avec une spatule.
- Lors du montage de l’échelle d’imagerie à l’étape 2.10.2, appuyez sur les bords du papier de filtre en tranches dans les scores de cire à l’aide de pinces fines (Figure 1).
- Pour mettre en place une perfusion à l’étape 2.12, remplir les réservoirs de seringue avec preoxygenated solutions, ou utiliser le collecteur de gaz en option pour oxygéner les solutions dans chaque réservoir. Purger tous les tuyaux avec une solution de Ringer, s’assurer que toutes les lignes de flux lorsque ouverte et purge des grosses bulles.
- Avant de remplir la chambre d’imagerie à l’étape 2.13, utilisez la seringue au lieu d’un autre point de gelée de pétrole sur chaque coin exposée de la lamelle couvre-objet pour l’empêcher de glisser latéralement au cours de l’écoulement.
- Lorsque la chambre d’imagerie est remplie et montée sur la platine du microscope, allumer l’aspirateur et raccordez le tuyau de l’aspirateur. Tester le flux de solution de Ringer et l’autre permet de situer le tube de l’aspirateur au-dessus de la chambre de sortie afin que les petites quantités de liquide sont débourbées avant que la chambre déborde (généralement ~ 1 mm au-dessus de la surface de la solution pour un débit de 2 mL/min). Garder une solution de Ringer qui coule tout en sélectionnant les tranches à l’étape 3.4.
- Pour mener l’expérience à l’étape 3.4 pour perfusion, passer le flux des solutions en fermant le robinet d’arrêt de la première solution lors de l’ouverture de la deuxième solution.
- Par exemple, pour épuiser extracellulaire Na+ de la chambre d’imagerie, utiliser deux réservoirs de seringue remplies de solution de Ringer ou de Na+-gratuit solution (tableau 3). Couler une solution de Ringer pour établir la ligne de base, puis basculez vers Na+-solution sans. Cela se traduit par grand Ca cytosolique2 + augmente dans les segments externes des photorécepteurs et de corps cellulaires (voir Figure 4).
- Pour les systèmes de perfusion gravitaire, surveiller le niveau de solution dans chaque réservoir donc le débit est constant au cours de l’imagerie. Couronner de réservoirs selon les besoins avec les solutions oxygénées ou d’entretien continu d’oxygène bouillonnant avec le collecteur de gaz.
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Representative Results
Un positionnement stable et l’orientation transversale de tranches sont essentiels à l’imagerie réussie avec injection ou perfusion d’agents pharmacologiques. Examiner soigneusement et repositionner les tranches avant l’imagerie confocale selon les besoins pour s’assurer que toutes les couches rétiniennes sont visibles (Figure 2 a, tranche ii). Si une tranche est tournée légèrement vers l’avant (Figure 2 a, tranche iii), faisceaux de segments externes seront visibles et petits réglages peuvent être effectués avec une pince pour mettre les couches rétiniennes désirées au point. Tranches mal respecté le papier filtre (Figure 2 a, je tranche) ou de conserver un RPE (Figure 2 a, tranche iv) ne doit pas être utilisé pour l’imagerie de laps de temps.
La viabilité cellulaire est primordiale pour observer les processus physiologiques ex vivo; une viabilité cellulaire tache comme l’iodure de propidium (PI) est recommandé pour doser la santé cellulaire tout en pratiquant rétine tranchage. Les cellules mortes près de l’arête du toutes tranches accumulera PI dans leurs noyaux (Figure 2 b, panneaux de gauche), tandis que 5-10 µm plus profondément dans la tranche, les cellules saines à morphologie normale et aucune coloration de PI peuvent être photographiées. Par exemple, dans les photorécepteurs, cellules négatives PI sous le bord coupé affichent couramment une morphologie polarisée, allongée stéréotypée (Figure 2 b, panneaux de droite). Photorécepteurs demeurent viables dans des tranches rétiniennes pendant au moins 4 h s’il est conservé dans une solution de Ringer oxygénée.
Plusieurs structures de cellules rétiniennes peuvent être visualisées à l’aide de combinaisons de marqueurs transgéniques et de teintures ; images confocales exemple de frais tranches rétiniennes avec marquage fluorescent doubles et triples sont présentés à la Figure 3. Pour visualiser la dynamique des cônes photorécepteurs réticulum endoplasmique (re) par rapport au noyau, rétine de tranches de poissons transgéniques exprimant la GFP ciblé à cône ER17 peuvent être Eosine avec un colorant nucléaire (Figure 3 a). Une stratégie similaire peut être utilisée pour afficher le cytosquelette d’actine en utilisant des tranches rétiniennes de poisson-zèbre transgénique exprimant l’actine GFP fusionnée18 (Figure 3 b). Avec un autre promoteur spécifique des cellules, cellules de Müller peuvent être étiquetés avec la protéine fluorescente rouge tdTomato19 et visualisées en tranches de la rétiniens (Figure 3, panneau supérieur). Captation du glucose dans la rétine peut être analysée en vivo par gavage oralement les Danio adultes avec un fluorescent glucose analogique (NBDG), qui devient incorporé dans les cellules visibles dans une tranche rétinienne21 (Figure 3, panneau inférieur). Zebrafish transgénique double peut être employée pour surveiller plusieurs prolongements cellulaires ou des types de cellules en tandem, comme Ca2 + dynamique dans un sous-type de cônes. Figure 3D montre un schéma d’étiquetage triple pour ce type d’expérience, avec tdTomato exprimée en longueur d’onde cônes2 et axés sur les mitochondries Ca2 + capteur (mito-GCaMP) exprimée dans tous les cônes22 et une tache nucléaire.
Imagerie de laps de temps des cellules rétiniennes est un avantage clé de la préparation de cette tranche. Par exemple, Ca2 + des fluctuations dans le cytosol de photorécepteur de cône peuvent être observées et quantifiées plus tard au cours de la manipulation pharmacologique, une expérience décrite à la Figure 4. Figure 4 a montre rétiniennes tranches exprimant le Ca2 + capteur GCaMP2 (haut) ou contrôle eGFP16 (en bas) en cônes photorécepteurs Eosine avec un colorant rouge lipophile. Dans cette expérience Na+ est épuisée millieux de la chambre d’imagerie à l’aide de perfusion, évoquant les fortes augmentations cytosolique Ca2 + pour le segment externe et un corps cellulaire comme en témoigne GCaMP (Figure 4 a, panneau supérieur). Tranches de fluorescence de la rétine exprimant Ca2 +-eGFP insensible n’est pas affecté par ce traitement (Figure 4 a, panneau de fond). Films de laps de temps peuvent être analysés à l’aide de logiciels ImageJ à isoler et à quantifier les réponses de fluorescence des segments externes cône unique, corps cellulaires et synapses (Figure 4 b).
| Solution de complément | ||
| 50 x stock * concentration (mM) | concentration en travail (mM) | |
| D-glucose | 500 | 10 |
| lactate de sodium | 50 | 1 |
| pyruvate de sodium | 25 | 0,5 |
| L-glutamine | 25 | 0,5 |
| glutathion réduit | 25 | 0,5 |
| acide ascorbique | 15 | 0,3 |
| * stocker les aliquotes à-20 ºC < 6 mois ; Ajouter frais de solution de Ringer | ||
Le tableau 1. Composants de 50 X supplément solution-mère et la concentration finale de travail.
| Solution de Ringer | |
| concentration (mM) | |
| NaCl | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH de 7.4 à l’aide de NaOH | |
| conserver à 4 ° c dans le flacon stérile < 1 mois | |
Le tableau 2. Composants d’une solution de Ringer standard.
| Na+-Solution de Ringer sans | |
| concentration (mM) | |
| TRIS | 147 |
| HCl | 120 |
| JCM | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH à 7,4 avec HCl | |
| conserver à 4 ° c dans le flacon stérile < 1 mois | |
Tableau 3. Composants de Na+-solution de Ringer sans.
| Imagerie confocale paramètres | |||
| Fluorophore | Excitation | Filtre d’émission | |
| Longueur d’onde | Intensité du laser | ||
| GFP (y compris les GCaMP) | 488 nm | 2 - 5 % | eGFP ou AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5 % | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2 % | PI |
| Hoechst 33342 | 405 nm | 1 % | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10 % | eGFP ou AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1 % | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3 % | DP |
Tableau 4. Imagerie des conditions pour les marqueurs fluorescents et colorants présentés dans les Figures 2-4.
Figure 1. Schématique pour la préparation de poisson zèbre fraîche tranches rétinienne. (A) disséquer loin le œilleton et jetez la lentille et la sclérotique (étape 2.4.1.). (B) couper le œilleton en trois morceaux ; jeter le morceau de petit bord (étape 2.4.2.). (C) faites glisser le filtre papier sous les pièces de le œilleton avec la rétine interne orienté vers le filtre en papier (étape 2.5.1.-2.5.2.). (D) Flatten rétine à l’aide d’une serviette en papier à mèche de solution de Ringer vers le bas à travers le filtre en papier (étape 2.5.3.), puis délicatement éplucher restant loin des RPE avec une pince (étape 2.6). Déplacer le papier filtre vers la chambre de tranchage sur la scène de coupeuse de tissu et couper 400 µm tranches (étapes 2.8., 2.9.). (E) transfert de tranchage de chambre avec des tranches et une échelle de cire ou de la vaseline pour une boîte de Pétri de solution de Ringer (étape 2.10.1.). (F) utiliser des pinces fines pour glisser des tranches unique de la chambre de tranchage à l’échelle tout en gardant les tranches submergés. (G) tourner le papier-filtre bandes (noir) 90 ° et enterrer les bords du papier filtre en cire ou gelée de pétrole (étapes 2.10.2.-2.10.3.). (H) schéma de la chambre d’imagerie finale chargé avec une échelle et tranches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Exemples de frais zebrafish rétinienne tranches affichant une bonne adhérence au papier filtre et la viabilité cellulaire. (A) image de fond clair de frais tranches rétiniennes dans une échelle de gelée de pétrole. Tranches d’ii et iii affichent bonne adhérence et transversales couches rétiniennes. Tranches d’i et iv ont conservé des RPE substantielle, ou sont fortement courbées et pas bien collés sur le papier filtre et ne devrait pas être photographiés. Echelle = 200 µm. Z de haut en bas (B) montage d’une tranche de rétine fraîche de poisson-zèbre transgénique exprimant eGFP en cônes photorécepteurs (Tg(gnat2:eGFP)16). Étiquettes de Hoechst colorant tous les noyaux ; (PI) de l’iodure de propidium contre-coloration étiquettes de noyaux de cellules mortes, qui apparaissent près de l’arête de la tranche (à gauche). Z-étape de jetons = 1 µm ; Echelle = 20 µm. conditions d’imagerie fluorescentes sont décrites dans le tableau 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Échantillon des images confocales de double et triple-marqué ex vivo rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte transgénique. (A) deux couleurs d’imagerie employant des GFP transgénique tag réticulum endoplasmique dans les cônes (Tg(gnat2:calr-GFP)17, top) avec Hoechst contre-colorant nucléaire (fond bleu). (B) le GFP tag actine dans les cônes (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, top) avec Hoechst contre-colorant nucléaire (fond bleu). (C) DP étiqueté cellules de Müller (Tg(GFAP:tdTomato)19, haut) d’un poisson zèbre nourris fluorescent glucose (NBDG) démontrant l’absorption du glucose en cônes20,21 (vert, en bas). (Cette image est de la Figure 2 b de Kanow, et al. 21) (D) exemple d’imagerie trois couleurs à l’aide de double zebrafish transgénique. Gauche, DP ciblé à longueur d’onde cônes photorécepteurs (Tg(trβ2:tdTomato)2). Centre, biocapteur de calcium GCaMP destiné aux mitochondries de photorécepteurs cônes (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). À droite, recouvert d’images de tdTomato (magenta), mito-GCaMP (vert) et Hoechst contre-colorant nucléaire (bleu). Les images sont intensité maximale Z-projections de 9 cadres sur une profondeur de tissu 7 µm ; échelle barres représentent 10 µm. Fluorescent d’imagerie des conditions sont décrites dans le tableau 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Ca2 + imagerie avec GCaMP et contrôle eGFP. (A) les images représentatives de frais tranches rétiniennes exprimant le fluorescent Ca2 + biocapteur GCaMP (gnat2:GCaMP32, haut de la page) ou eGFP (en bas) en cônes photorécepteurs. Gauche, tranches au départ ; à droite, tranches 2 min après que Na+ a été appauvri millieux de la chambre d’imagerie utilisant une perfusion de solution de Ringer axée sur les Tris, qui emprisonne Ca2 + dans les photorécepteurs. Barreaux de l’échelle = 10 µm. conditions d’imagerie fluorescentes sont décrites dans le tableau 4. (B) signifie changements de fluorescence des compartiments unique photorécepteur (segments externes, les corps cellulaires et synapses) au cours de l’imagerie en temps écoulé de l’appauvrissement de Na+ . Tranches ont été photographiés toutes les 10 s, cheminées ont été traitées à l’aide de ImageJ et fluorescence de GCaMP ou eGFP a été normalisée pour signaler de la teinture de la membrane. Les lignes pleines, GCaMP (n pour les segments externes = 15, corps cellulaires = 24, synapses = 26) ; les lignes pointillées, eGFP (n pour les segments externes = 26, corps cellulaires = 20, synapses = 31). Barres d’erreur représentent erreur type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ex vivo imagerie rétinienne tranches de poisson zèbre fraîche s’est avéré pour être un outil polyvalent pour l’étude des photorécepteurs biologie20,21,22et est unique parce qu’il permet l’analyse des cellules individuelles dans un âge mûr, entièrement rétine différenciée. Avec la pratique, il est possible de réaliser des expériences multiples avec des tissus provenant d’un seul poisson, même en utilisant des tranches de série de la même partie de la rétine. Outre les défis et les suggestions concernant la préparation des tranches rétinienne amphibiens de l’électrophysiologie études14, il y a des considérations importantes pour des expériences d’imagerie.
Pour les photorécepteurs, viabilité cellulaire en général est en corrélation avec la morphologie cellulaire, il est donc important de traiter la rétine sensible au minimum, particulièrement après que la RPE a été supprimé. Après le tranchage, utilisez pince fine pour glisser soigneusement les tranches horizontalement de la chambre de tranchage (Figure 1F) pour les transférer vers l’échelle plutôt que de tranches de levage vers le haut et gardez toujours les tranches immergés dans une solution de Ringer. Si possible, montez l’échelle des tranches rétiniennes près de microscope confocal pour limiter les dégâts aux tranches de trembler pendant le transport.
Adhérence forte du tissu rétinien pour le papier filtre est essentiel pour créer des tranches qui demeureront stables au cours d’expériences d’injection ou perfusion. Il est nécessaire d’inspecter soigneusement chaque tranche de morphologie et de la stabilité juste avant l’imagerie (Figure 2 a) ; tapotant doucement la table microscope tandis que Regarde un tranche de mouvement à travers la lentille oculaire confocale révèle la stabilité d’une tranche particulière. Malgré les précautions, la dérive dans la direction Z pendant l’injection ou la perfusion peut présenter des défis pour l’analyse, elle est donc utile charger un colorant de contrôle tels que lipophiles teint pour les membranes et les mitochondries, à stablement une structure de cellule identifiable pour le label normalisation (Figure 4 a, magenta). Si tranches dérivent > 10 µm dans la direction Z il n’est peut-être pas possible d’extraire des données utilisables de cellule unique. Dérive modérée sur l’axe X-Y peut être corrigée dans le post-traitement à l’aide de logiciels d’enregistrement tels que MultiStackReg pour ImageJ (RRID:SCR_002285).
Dans des conditions statiques, fluorescence de marqueurs en tranches rétiniennes devrait rester stable, bien que photobleaching peut survenir au cours de l’imagerie. Il faut pour minimiser l’exposition de laser pendant est caduque de temps en affinant les paramètres tels que l’intensité du laser, scanner, vitesse et cadence. Contrôles d’imagerie sont recommandés pour chaque marqueur fluorescent utilisé. Les contrôles incluent injection ou perfusion de Ringer sans agents pharmacologiques dans des expériences distinctes ou menant des expériences d’imagerie avec marqueurs non-biocapteur qui réagissent en constitutivement.
Selon le laser confocal excitation utilisé, pigments dans la RPE peuvent contribuer à autofluorescence et même générer de la chaleur au cours de l’imagerie, il est donc important enlever la plupart de ce tissu avant de découper. Dark-Adapting sida animaux en retrait du RPP tout en minimisant les dommages à la rétine sous-jacente. Incapacité d’imager la RPE est une limitation de cette préparation de tranche, même si cela peut être surmonté en utilisant des animaux albinos avec un RPE transparent. Une autre limitation est que les cellules ganglionnaires rétiniennes et embouts de cellules de Müller peuvent sont cachés vue par le papier filtre ; une autre préparation rétines peuvent être plats monté avec le côté de photorécepteur vers le bas sur le papier filtre et ensuite en tranches pour fournir une vue plus claire de la rétine plus intime. Il est également important de noter que projections longtemps horizontales de certaines cellules, telles que les cellules amacrines de grand champ, peuvent être rompues au cours de la dissection ou le tranchage. Une limitation définitive est que beaucoup de colorants fluorescents s’accumulent non spécifique dans les segments externes des photorécepteurs, donc pour cette partie de la rétine, il est conseillé d’utilisation codée génétiquement biocapteurs plutôt que des colorants de l’indicateur.
Étant donné le large éventail de journaliste de cellules fluorescentes disponibles colorants23,24 pour tissus et codé génétiquement des biocapteurs fluorescents utilisés avec succès dans le poisson-zèbre2,3,4, 5, cette préparation de tranche pourrait être utilisée pour étudier de nombreux processus biologiques dans plusieurs types de cellules rétiniennes (voir exemples dans la Figure 3, , Figure 4). D’imagerie fraîches tranches rétiniennes à l’aide de la microscopie des cellules vivantes Super-résolution pourrait également fournir des passionnantes nouvelles perspectives pour la fonction rétinienne et la santé sur un niveau subcellulaire. En outre, cette méthode peut être adaptée pour l’imagerie ex vivo de souris rétinienne tranches25. Alors que le succès de la préparation de tranches fraîches de rétiniens nécessite pratique, c’est un outil puissant qui est utile pour traiter un large éventail de questions biologiques spécifiques des cellules dans un âge mûr de la rétine.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions Ralph Nelson et Daniel Possin d’orientation réfléchie tout en développant ce protocole, Eva Ma, Ashley George et Gail Stanton pour génération de lignes zebrafish transgénique stable. Le travaux ont été subventionnés par NSF GRFP 2013158531 de M.G., NIH NEI 5T32EY007031 aux W.C. et M.G. et EY026020 à J.H. et S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
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