Summary
הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.
Abstract
הרשתית היא רקמה מורכבת יוזם ו משתלב הצעדים הראשונים של חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית מהווה סימן היכר של מחלות רבות מסנוור, טיפולים עתידיים-טיבית ההבנות הבסיסיות על הרשתית כמה שונה התאים לתפקד כרגיל. צובר מידע כזה עם שיטות ביוכימיות הוכיחו קשה כי תרומות של סוגי תאים מסוים הם הצטמצמו בחצרו תאים ברשתית. הדמיה רשתית חיה יכול לספק תצוגה של תהליכים ביולוגיים רבים על רמה של subcellular, בזכות מספר גדל והולך של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט. עם זאת, טכניקה זו כה הוגבלה ראשנים של הזחלים דג זברה, שכבות הרשתית החיצונית ביותר של הרשתיות מבודד, או הדמיה ברזולוציה נמוכה יותר של הרשתית בבעלי חיים. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת חיים שמחוץ ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה בשידור חי דרך מיקרוסקופיה קונפוקלית. הכנה זו מניבה פרוסות רוחבי עם כל שכבות הרשתית ואת רוב סוגי תאים גלויים לביצוע ניסויים הדמיה קונאפוקלית באמצעות זלוף. דג זברה מהונדס לביטוי החלבונים פלורסנט או ביולוגיים סוגי תאים ברשתית מסוימים או organelles משמשים כדי לחלץ מידע מתא בודד רשתית העין שלמות. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות ברשתית עם צבעי פלורסנט מחוון, הוספת צדדיות של השיטה. פרוטוקול זה פותחה עבור הדמיה Ca2 + בתוך דג זברה חרוט photoreceptors, אבל עם סמנים תקין זה יכול להיות מותאם למדוד Ca2 + או מטבוליטים של תאים, התאים הפרעה דו קוטבית או אופקי, מיקרוגלייה, תאי אמקרין או רשתית מולר תאי גנגליון. אפיתל הפיגמנט ברשתית יוסר פרוסות כך שיטה זו אינה מתאימה ללמוד את סוג התא. בפועל, זה ניתן להפיק פרוסות טורי מחיה לחיה לניסויים מרובים. טכניקה זו הסתגלות מספק כלי רב עוצמה עבור לענות על שאלות רבות אודות ביולוגיה של התא רשתית, Ca2 +אנרגיה הומאוסטזיס.
Introduction
דג זברה (רזבורה rerio) להיות בשימוש נרחב רפואי ומחקר מדעי בסיסי1, בשל גודלו הקטן, פיתוח מהיר ומערכות איברים חוליות. השקיפות הטבעית של הזחלים דג זברה בשילוב עם שיטות הוקמה transgenesis אפשרו ויזואליזציה מפורטת של תהליכים תאיים בחיים. מספר של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט סומנו כמטרות לתאים דג זברה ספציפי כדי לזהות Ca2 + 2, מימן על-חמצני3, מוות הפעלה4 ו- ATP5
In vivo הדמיה של דג זברה הזחלים הוביל פריצת דרך בתחום של מדעי המוח, כולל מיפוי של המוח המעגלים6 , פיתוח תרופות עבור מערכת העצבים המרכזית הפרעות7. דג זברה מתאימים היטב לחקר הראייה שלהם כוללים את מבנה למינריות והסוגים נוירון של חולייתנים הגבוהים, הם מציגים התנהגויות חזותיים חזקים8,9. מספר סוגים של הרשתית degenerations מקביל מחלות אנושיות המודל בהצלחה ולמד דג זברה10,11, כולל הדמיה חיה של הפרט photoreceptors מושחת בתוך הרשתית2, 12.
בעוד ויוו דג זברה זחל הדמיה הוא כלי רב ערך, הוא הופך להיות יותר מאתגר כמו דגים לגדול ולהתפתח פיגמנטציה, טיפולי תרופתי כלשהו לא יכול לחדור חיה שלמה. יתר על כן, תהליכים תאיים מסוימים לשנות עם הגיל, ופיתוח עושה מאוחר יותר נקודות זמן קריטי עבור הפונקציה להבנה, התקדמות המחלה בבעלי חיים למבוגרים. שיטות ביוכימיות כגון immunoblot, quantitiative ה-PCR, צריכת2 O ניתוחים metabolomic יכול לספק רמזים חשובים על הביולוגיה של הרשתית בכללותה, אך קשה להבחין תרומות של סוגי תאים בודדים מושפע המחלה. הדמיה רקמת רשתית מבודד שמחוץ עוקף בעיות אלה, בעוד הדמיה במול הרשתיות הנטען מעניק תצוגה של הרשתית החיצונית13, תכונות ברשתית פנימי עמוק יותר מטושטשות. אופסין # רטינל רוחבי פרוסות, כגון אלה הציג באופן קבוע ניתוחים immunohistochemical, מאפשרים תצוגה ברורה של כל שכבות וסוגי תא אלא מציעים רק תמונה אחת של תהליכים דינמיים מעורב תפקוד תקין ומחלות.
כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת שמחוץ רוחבי ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה. זה דומה שיטות להכנת פרוסות ברשתית דו-חיים, דג זברה מחקרים אלקטרופיזיולוגיות מורפולוגי14,15, עם שינויים חשובים עבור זמן לשגות הדמיה שמחוץ באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. קרינה פלואורסצנטית תגובות ביולוגיים או צבעי פרוסות מנוטרים בזמן אמת עם מיקרוסקופ קונפוקלי תוך אספקת סוכנים תרופתי באמצעות זלוף. בעוד השיטה פותחה עבור הדמיה photoreceptors, זה יכול להיות אפשרי להשתמש בו ליצירת אפקטים של תאים, תאים דו-קוטביים, תאים אופקיים, תאי אמקרין או תאי גנגליון מולר עם סמנים פלורסנט המתאים. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות עם צבעי פלורסנט תא חדיר דוח תא הכדאיות, תחבורה vesicular, הפונקציה מיטוכונדריאלי או מצב חמצון-חיזור. בתכשיר רב תכליתי מאפשר הדמיה של מגוון רחב של תהליכים subcellular לאורך הרשתית, כולל Ca2 + דינמיקה, אותות, מצב מטבולי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת וושינגטון אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. הכנת בעלי חיים וציוד
הערה: אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא גיליון כהה של רקמות המקיפים את החלק החיצוני של הרשתית פיגמנטציה של מי יכול לטשטש תכונות ברשתית ונזק הרקמה כאשר קונאפוקלית הדמיה vivo לשעבר. בחושך, RPE של דג זברה "ניתק" מן הרשתית; כהה להתאים דג כדי להקל על הסרת בעתיד RPE מן הרשתית לפני הדמיה וגזירה.
- להעביר דגים טנק ההשרצה מלא דגים מים, ואז עוטפים את הטנק ההשרצה עם בד כהה או למקם אותו בארון חשוך.
- כהה להתאים דג זברה במשך לפחות שעה לפני המתת חסד כדי לאפשר ליד הפרדה מוחלטת של RPE מן הרשתית. 30 דקות כהה הסתגלות מספיקה להסיר את רוב RPE, למרות חלקים ממנו עשויים להישאר intercalated בין photoreceptors.
- להמיס ~ 15 מ"ל של נפט ריבה בתוך 50-mL על פלטה חמה, ואז מצייר 3 מ"ל של הנוזל לתוך מזרק טיפ 3-mL slip. היפוך מזרק, מקום בארון תקשורת מבחנה, ולאפשר וזלין להתקרר.
- להפוך תא עם פרוסות לשימוש חוזר בשקופית מיקרוסקופ רגיל 7 ס"מ X 2.5 ס"מ.
- שימוש ברור לק, צייר קווים צרים כדי ליצור מלבן 3 ס"מ X 2.5 ס"מ במרכז השקופית, לאפשר לו להתייבש, ולאחר מכן להוסיף שכבה נוספת של לק הקווים.
- הכנת הדמיה סולמות על שער גולשת להחזיק פרוסות במהלך דימות. הפרוסות יהוו "אחזו" של הסולם.
- לדימות סטטי או הזרקת ניסויים עם זרימה מינימלית פתרון, להפוך סולמות וזלין בהיקף של שתי רצועות שטוח רחב מקבילים של וזלין על 18 מ מ זכוכית מרובע שער גולשת. השתמש במזרק כדי להחיל שני משוטחים ~ 1 ס מ. מריחות זמן של וזלין מקורר 0.5 ס מ זו מזו על תגית כיסוי.
- מוכן בפורס רקמות.
- לנקות תער קצה כפול עם אתנול ולאפשר לו אוויר יבש. לחתוך את זה לרבעים עם מספריים, תחילה לאורכו חצאים ואז לחצות כל להב.
- למקם את התא עם פרוסות על הבמה של בפורס רקמות, מרכז זה בצורה אופקית על הבמה ולסמן מהקצה הארוך עם הסמן הקבע עבור יישור.
- טעינת מקטע להב על גבי הזרוע מבצעה רקמות, להבטיח שהלהב שקרים שטוח, ממורכז בשקופית בלי לגעת הלק, ואז בעדינות להדק את המנגנון להב. נמוך הזרוע להב על-ידי התאמת הידית ¼ להפוך, ואז המקום פיסת נייר סינון במרכז הקאמרית הדמיה ובדיקה לחתוך את זה. אם הנייר לא מתאים באופן מלא באמצעות, הרכב מחדש את הלהב.
- באמצעות המזרק, למקם נקודה קטנה אחת של ג'לי נפט מקורר בצלוחית ס מ-10 ~ 1.5 ס מ בצד ימין של המרכז. לחץ על הסולם הדמיה באמצעות מלקחיים עם הריבה נפט פונה כלפי מעלה. להכין עוד נקודה קטנה וזלין ~ 1 ס מ משולי כניסה לחדר ההדמיה.
- להתאים את המזרק וזלין עם מחט 20 גרם, הפקק זה. . תחזיקי את המחט לתוך המזרק ולהשתמש בה כדי להפוך שני 1 ס מ זמן מקבילים רצועות דקיקות של וזלין לאורכו במרכז החדר עם פרוסות. מרחב את הרצועות ~ 1 ס מ אחד מהשני.
- להפוך כלי לולאה של העין תיל הניתן לשימוש חוזר על-ידי גלישת במרכז ~ קטע 4 ס מ של חוט טונגסטן 30 g סביב זוג פעם שהחלונות סגורים מלקחיים. להתאים את הקוטר של הלולאה על-ידי הזזה החוט למעלה או למטה המלקחיים עד שזה מעט גדול יותר יש עין דג זברה, בדרך כלל ~ 2-3 מ מ. לסובב את קצות חוט ולאבטח אותם לסוף מקל עץ 6 ס מ באמצעות הקלטת מעבדה.
- להכין תמיסת רינגר.
- הפשרת 50 X תוספת מניות פתרון (טבלה 1) ולהוסיף אותו טרי לפתרון באגירה HEPES, הלא-ביקרבונט רינגר (טבלה 2) בשעות הבוקר של הניסוי; לדלל 200 µL של פתרון מניות תוספת כל 10 מ"ל של תמיסת רינגר צינור חרוטי צנטריפוגה או בקבוק זכוכית סטריליים. לניסויים הדמיה סטטי, להכין לפחות 30 מ של תמיסת רינגר לכל ניסוי. נפח תמיסת רינגר הדרושים לניסויים זלוף יהיה תלוי קצב הזרימה ואת הזמן הכולל ניסוי.
- סימון כי ה-pH של התמיסה שהושלם הוא 7.4 באמצעות בדיקה pH דיגיטלי או נייר pH, להתאים בהתאם עם לדלל NaOH או HCl.
- חמצן תמיסת רינגר שהושלם על הקרח על ידי בעבוע בגז חמצן 100% לפחות 5 דקות באמצעות חמצן רפואי רגיל הרגולטור מצויד עם צינור, או יריעה bubbler גז אופציונלי המשמש זלוף. לאחסן תמיסת רינגר מחומצן על הקרח צינור צנטריפוגה חרוט אטום או בקבוק זכוכית סטריליים ליד המיקרוסקופ לנתיחה; השתמש פתרון זה עבור ניתוח, הדמיה, וכדי לדלל צבעי או סוכנים תרופתי.
- אם פתרונות אחרים נמצאים בשימוש הניסוי, כגון Na+-חינם תמיסת רינגר (טבלה 3), חזור על שלבים 1.9.1.-1.9.3.
- לאסוף צלחות פטרי, מלקחיים, מיקרו-מספריים וכלים אחרים בקרבת המיקרוסקופ לנתיחה, ולהכין אמבט קרח מים דגים דג זברה המתת חסד.
2. הכנת פרוסות ברשתית (ראה איור 1)
- עבודה תחת תאורת אדום כדי למזער את הסתגלות אור (אשר יכול להפוך את המקל RPE צמוד יותר ברשתית), המתת חסד דג זברה על ידי טבילה באמבט קרח עד מגע תגובה אובד, בדרך כלל 1-2 דקות להעביר את הדג על צלחת פטרי ולהשתמש אזמל כדי cervically לנקוע אך לא לערוף את הדגים.
- להשתמש את לולאת תיל כדי לשחרר את רקמת חיבור סביב עין אחת ולאחר מכן משוך את העין קדימה בעדינות עם הלולאה ביד אחת. באמצעות מיקרו-מספריים ביד אחרים, חותכים את עצב הראייה לבן מתחת לעין, מטפל לא לחתוך האחורי של העין.
- להעביר את העין באמצעות מלקחיים צלחת פטרי של תמיסת רינגר קר על קרח, וחזור על העין השנייה. שמור את העיניים בחושך או באור אדום עד RPE יוסר הרשתית.
- לנתח את eyecups תחת מיקרוסקופ לנתיחה צריכת חשמל נמוכה בכל טיפת תמיסת רינגר קר על משטח זכוכית פשוטה בצלחת פטרי.
- פירס הקרנית עם מלקחיים בסדר, ואז בעדינות להסיר חתיכות של הקליר, קרנית שביר ואת בסקלרה כסוף עם מלקחיים או מספריים. להסיר ולמחוק את העדשה ואת רוב בסקלרה (ראה איור 1A), להתמודד עם עיינית מבודד את מינימלית.
- חתיכות של שומן, פיסות קטנות בסקלרה ולאחר RPE שחור יכול להישאר מחוברים עיינית ומוסר מן הרשתית מאוחר יותר. אם הרשתית מפריד בין RPE בשלב 2.4.1, להמשיך עם הפעולות באמצעות לנקוט משנה זהירות לא לפגוע ברשתית מבודד עדין.
- הצב עיינית פתוח כלפי מטה (RPE למעלה) בשקופית ולאחר וחותכים שליש או רבעונים עם סכין גילוח קצוות יחיד טריים בתנועה אחת (ראה איור 1B). למחוק את חתיכות רקמה זה מאוד מעוגלים.
- הר שטוח הרשתית על נייר סינון.
- רטוב פיסת נייר סינון עם תמיסת רינגר ומניחים אותו על השקופית ליד החלקים עיינית. השתמש מלקחיים שטוח בעת טיפול בנייר סינון רטוב שלם כדי להימנע ניקב אותו. הוסף תמיסת רינגר קר לכסות נייר סינון והן רקמות.
- בזהירות באמצעות מלקחיים בכל יד, גרור נייר הסינון מתחת כל חתיכה עיינית עם RPE, photoreceptors פונה כלפי מעלה, כלומר עם האחורי של העין כלפי מעלה. מקם את החלקים עיינית בשורה בודדת לאורך מרכז נייר הסינון (ראה איור 1C). להתמודד עם החלקים עיינית בעדינות עם מלקחיים בסדר רק ליד קצה או פינה.
- כדי לסייע הרשתיות לדבוק נייר הסינון, במקום נייר הסינון הרטוב על מגבת נייר יבש 3 s לפתיל לחות כלפי מטה, אבל לא לתת את רקמת להיות יבש. חזור עד החלקים עיינית לשכב על נייר הסינון. החלת יניקה עדינה על החלק התחתון של נייר הסינון עוזר לשטח את הרשתית, אך השלב זה לא הכרחי.
- אם שחור יריעות RPE נשארים על חתיכות עיינית, להשתמש מלקחיים בסדר לקלף בעדינות את זה משם החל אחד בפינה (ראה איור 1D) ואילו הרקמה יושב טיפה של תמיסת רינגר. צריך הרשתית תמריא נייר הסינון, חזור על השלב wicking הנגן 2.5.3. הרשתית עשוי להיראות ורוד עקב פיגמנטים חזותי מולבן.
- חזור על ניתוח רשתית, שטוח הרכבה בשלבים 2.4-2.6 העין השנייה, אם רצונך בכך, שמירה על הרשתית רכוב שטוח הראשון שקוע בתוך תמיסת רינגר קר. כדי לייעל את ההליך עם פרוסות, אפשר למקם חתיכות של שתי הרשתיות על נייר סינון אחד. ברגע RPE הוסר, הפרוטוקול יכול להתבצע תחת אור חדר רגיל אלא אם כן ניסויים מחייבים החושך.
- למקם את נייר הסינון בשקופית, לקצץ אותו לתוך מלבן עם קצוות יחיד תער, עוזב ~ 0.5 ס מ של נייר סינון משני צדדיו של הקו של הרשתית. להעביר נייר הסינון לתא עם פרוסות מוכנים לדחוף את הקצוות נייר סינון רב הקווים וזלין דק באמצעות מלקחיים, לטבול את הרשתיות ב 3-4 טיפות של תמיסת רינגר קר.
הערה: צבעים מסוימים, כגון צבעי lipophilic, בצורה הטובה ביותר נטענים לתוך טעינות שטוחה בשלב זה לפני חיתוך. אלה יכולים להיות טעון, רשעים משם עם רקמה, רחץ בבית הבליעה עם פרוסות. למשל, C12 558/568 BODIPY בעוצמה כתמי ברשתית תא ממברנות ואת מקטעי החיצוני קולט אור (ראה איור 4A) כאשר נטען בבית ~ 5 µg/mL למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (בדרך כלל 23-27 ° C), ואחריו שטיפה של תמיסת רינגר עודף . - להעביר את התא עם פרוסות לבמה מבצעה רקמות, מקם קצה ארוך לאורך הקו מסומן ולאחר לאבטח את הקצוות קאמרית על הבמה עם קלטת מעבדה. מתחיל בקצה אחד, חותכים את הרשתית ואת נייר סינון באמצעות המשרד, עדין הלחץ על הזרוע עם פרוסות. בדוק כי הפרוסה הראשונה. חתכו באופן מלא, ואז השימוש של מיקרומטר לחתוך ~ 400 פרוסות מיקרומטר.
- להרכיב את הסולם הדמיה.
- המקום התא עם פרוסות עם מקטעים ברשתית הפרוס בצלוחית הפטרי מהשלב 1.7 הסמוכים ההדמיה סולם (ראה איור 1E). למלא את הצלחת עם תמיסת רינגר קר ומטביעים את תוכנו.
- בעזרת מלקחיים ושמירה על פרוסות מתחת למים, בעדינות להעביר רצועות של נייר סינון ואת הרשתית הסולם על ידי הזזה הפטרי משמאל לימין. לטפל לא כדי לגעת הרשתיות ישירות. סיבוב הפרוסות ב- 90° ולקבור את קצוות נייר סינון ב וזלין.
- דק מקם פרוסות ברשתית בסולם עם מלקחיים כך שכבות הרשתית הם נראים בבירור תחת המיקרוסקופ לנתיחה (ראה איור 1 ג'י). עבור פרוסות בכל קצה של הסולם, ודא כי הרקמה פונה פנימה כלפי הפרוסות אחרים כדי למזער את התנועה של הרקמה במהלך זריקה או זרימה. למחוק את כל הפרוסות ברשתית שאינם טוב דבקה נייר הסינון (ראה איור 2 א).
- אם רצונך בכך, טען צבעי לפרוסות ברשתית בשלב זה ולשטוף בתוך תמיסת רינגר עודף לפני הדמיה.
הערה: Propidium יודיד (PI) ו Hoechst 33342 robustly כתם הגרעינים של מתים, כל התאים, בהתאמה (ראה איור 2B), כאשר מודגרות עם פרוסות רשתית-5 µg/mL עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. Tetramethylrhodamine (TMRM) שמצטבר המיטוכונדריה respiring באופן פעיל לאורך הרשתית כאשר מודגרות-1 ננומטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. - בעוד הם מכתימה הפרוסות, להכין את המנגנון קאמרית, הזרקת הדמיה. השתמש במזרק כדי לשטוף את הצנרור עם תמיסת רינגר, לטהר בועות, לצרף את הקצה הפתוח של הצנרת לים קאמרית הדמיה וסגור את צימוד. הסר את המזרק, למלא אותו reagent(s) להזרקה, לאחר מכן לחבר אותו מחדש אל הצנרת.
- להשתמש מלקחיים כדי להעביר את coverslip עם פרוסות ברשתית לחדר ההדמיה, הקשת את coverslip אל הנקודה של וזלין סמוך לקצה כניסת לשכת הדמיה (ראה איור 1 H). למלא את התא הדמיה עם תמיסת רינגר כדי לכסות את פרוסות.
3. הדמיה פרוסות רשתית
- במקום לחדר ההדמיה מלא עם המנגנון הזרקת מחוברים על השלב של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מצויד עם 20 או 40 X מים טובלים העדשה. לאבטח לחדר ההדמיה עם קטעי הבמה.
- הורידו את העדשה וטבלו מעל הסולם, ולהתמקד פרוסה בקצה אחד של הסולם תחת אור עמום מואר טרנס. לבחון כל פרוסה כיוון הדפסה לרוחב, נוכחות של מקטעי החיצוני קולט אור, הדבקה מאובטח על נייר הסינון.
- בחרו בפרוסה הטוב ביותר עבור זמן לשגות הדמיה ולהגדיר את התוכנה מיקרוסקופ עבור ייבוא תמונות זמן לשגות. בטבלה 4 מתאר הגדרות אופייניות הדמיה עבור פלורסנט סמנים שונים, צבעי.
הערה: קצב רכישת התמונה משתנה בהתאם המיקרוסקופ marker(s) פלורסנט, תהליך ביולוגי נחקר. למשל, השתמש ברזולוציית 800 x 800 פיקסלים, מהירות סריקה µs/פיקסל 2, קצב מסגרות 10-s הדמיה סידן דינאמיקה של photoreceptors עם GCaMP3, צבע אדום.- אם הוא זמין, להשתמש בתוכנה כדי לעקוב אחר ציוני דרך פיזית ב הפרוסה (מקטעי החיצוני קולט אור, גופי התא, גרעינים) לסייע ולהתפכחות פוטנציאליים במהלך זמן לשגות. גם להגדיר את התוכנה כדי לפקח פלורסצנטיות בזמן אמת על פני הפרוסה.
- להתחיל הדמיה ונטר פלורסצנטיות בסיסית. כאשר קרינה פלואורסצנטית לאורך הפרוסה מייצבת (בדרך כלל תוך 2-5 דקות), להמשיך את הניסוי. להזרקה, לפתוח את צימוד מזרק, ואז לאט לאט נלחצים, למשוך בחזרה על הבוכנה פעמיים כדי לסייע ערבוב.
הערה: למשל, לבטל את פונקציית מיטוכונדריאלי באמצעות הזרקה של תמיסה מרוכזת של protonophore CCCP להגיע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבית הבליעה הדמיה. זה גורם חזקים Ca2 + פרץ ציטוזול קולט אור שדווחו על-ידי GCaMP, ואז ירידה מתמדת בקרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים שדווחו על-ידי TMRM. - מקרוב לפקח פרוסות עבור סחיפה במהלך הניסוי, להשתמש בתוכנה כדי לבצע מיקרו-התאמות על פי ציוני דרך פיזית. בדרך כלל להיסחף Z-כיוון במהלך ההזרקה או זלוף < 5 מיקרומטר.
4. הדמיה את פרוסות ברשתית במהלך הניסויים זלוף איפה פתרונות משתנות או זרמו ללא הרף
הערה: הדמיה רשתית פרוסות במהלך הניסויים זלוף איפה פתרונות מוחלפים או זרמו ללא הרף דומה של תוכנית ההתקנה עבור ניסויים לדימות או הזרקת סטטי, עם השינויים הבאים.
- במקום סולמות וזלין שמתואר בשלב 1.4, להשתמש יציבות סולמות שעווה להחזיק פרוסות ברשתית יציב במהלך פתרון זרימה.
- מקום שני צילינדרים מקבילים קטן של שעווה שיניים unflavored מדהים ~ 0.5 ס מ זו מזו על coverslip. על משטח שטוח, השתמש אגודל להקיש כל גליל כלפי מטה והחוצה לכיוון קצה coverslip מקבילים. ציון שני צילינדרים שעברו שיטוח אופקית עם coverslip #1 (ראה איור 1E, בצד ימין) ואז למרוח שכבה דקה של ריבה נפט בין רצועות שעווה עם מרית.
- בעת בניית הסולם הדמיה בשלב 2.10.2, לחץ את הקצוות פרוס נייר סינון התוצאות השעווה באמצעות מלקחיים בסדר (איור 1 ג'י).
- כדי להגדיר עבור זלוף בשלב 2.12, למלא מאגרי מזרק עם פתרונות preoxygenated, או השתמש את סעפת גז אופציונלי לחמצן את פתרונות כל המאגר. ריקון כל צינורות עם תמיסת רינגר, להבטיח שכל קווי זרימה כאשר נפתח ולטהר בועות גדולות.
- לפני מילוי החדר הדמיה בשלב 2.13, השתמש במזרק כדי למקם נקודה נוספת של וזלין על כל פינה חשוף של coverslip כדי למנוע אפשרות הזזה רוחבית במהלך זרימת.
- כאשר תא ההדמיה מלא רכוב על הבמה מיקרוסקופ, להפעיל את העצמות וחבר הצנרת העצמות. לבדוק את הזרימה של תמיסת רינגר ולהשתמש את micropositioner כדי ולצלם את הצינור ליניקת על החדר יצוא כך כמויות קטנות של נוזל נמשכים לפני התא גולשת (בדרך כלל ~ 1 מ מ מעל פני השטח פתרון עבור קצב זרימה 2 mL/min). שמור תמיסת רינגר זורם בעת בחירת פרוסות בשלב 3.4.
- כדי לערוך את הניסוי בשלב 3.4 עבור זלוף, עבור זרימה של פתרונות על-ידי סגירת של צימוד של הפתרון הראשון בעת פתיחת של הפתרון השני.
- למשל, כדי לרוקן חוץ-תאי נה+ מן החדר הדמיה, השתמש שני מאגרים מזרק מלא רינגר פתרון או נה+-ללא פתרון (טבלה 3). זרימה תמיסת רינגר כדי לקבוע תוכנית בסיסית ולאחר מכן לעבור ל נה+-הפתרון החופשי. התוצאה גדולה cytosolic Ca2 + מגביר בקטעים החיצוני קולט אור וגופים התא (ראה איור 4).
- עבור מערכות כוח המשיכה-fed זלוף, לנטר את הרמה של פתרון כל המאגר אז קצב הזרימה היא קבועה במהלך דימות. בנוסף מאגרי מים לפי הצורך בפתרונות מחומצן, או לשמור על רציף חמצן מבעבעים עם סעפת גז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיצוב יציב והכיוון רוחבי של פרוסות הם המפתח הדמיה מוצלח עם זריקה או זלוף של סוכנים תרופתי. לבחון ותמקם בזהירות פרוסות לפני קונאפוקלית הדמיה לפי הצורך כדי להבטיח שכל השכבות ברשתית הם גלויים (איור 2 א, הפרוסה השנייה). אם פרוסה מסובבים מעט קדימה (איור 2 א, פרוסה השלישי), חבילות של מקטעי החיצוני יהיה גלויים, שינויים קטנים יכולה להתבצע באמצעות מלקחיים להביא את שכבות הרשתית הרצוי אל המוקד. פרוסות לקוי דבקה נייר הסינון (איור 2A, לחתוך לי) או שמירה RPE (איור 2A, פורסים iv) צריך לשמש עבור זמן לשגות הדמיה.
הכדאיות התא הוא בעל חשיבות עליונה כדי התבוננות תהליכים פיזיולוגיים שמחוץ; הכדאיות התא כתם כגון propidium יודיד (PI), מומלץ להשתמש assay בריאות בעודו חותך רשתית לתרגל. תאים מתים סמוך לקצה חיתוך של כל הפרוסות יצטברו PI בגרעין (איור 2B, לוחות שמאלה), תוך 5-10 מיקרומטר עמוק יותר לתוך הפרוסה, תאים בריאים עם מורפולוגיה תקינה, לא מכתים PI יכול לדימות. לדוגמה, photoreceptors, תאים שלילי PI מתחת לקצה לחתוך בדרך כלל להציג סטריאוטיפי מקוטב, מוארך מורפולוגיה (איור 2B, לוחות נכון). Photoreceptors מורדם בפרוסות ברשתית במשך לפחות 4 שעות כאשר הוא מאוחסן בתמיסת רינגר מחומצן.
מבנים התא רשתית רבים ניתן לאבחן באמצעות שילובים של סמנים הטרנסגניים ואת צבעי; דוגמה תמונות קונאפוקלית של טריות פרוסות ברשתית עם כפולים ומשולשים תיוג פלורסנט מוצגים באיור3. כדי להמחיש את הדינמיקה של חרוט קולט אור רשתית תוך-פלזמית (ER) ביחס הגרעין, יכול counterstained ברשתית פרוסות דג הטרנסגניים לבטא GFP ממוקד חרוט ER17 עם צבע גרעינית (איור 3 א). אסטרטגיה דומה יכול להיות מועסק כדי להציג את שלד התא אקטין באמצעות רשתית פרוסות דג זברה מהונדס לבטא אקטין התמזגו-GFP18 (איור 3B). עם מקדם תא ספציפי אחר, תאים מולר יכול להיות המסומנת tdTomato חלבון פלואורסצנטי אדום19 , דמיינו בפרוסות ברשתית (איור 3C, החלונית העליונה). ספיגת הגלוקוז לתוך הרשתית ניתן לבדיקה ויוו מאת אורלית gavaging למבוגרים דג זברה עם פלורסנט גלוקוז אנלוגי (NBDG), אשר הופך שולבו תאים גלויים פרוסה ברשתית21 (איור 3C, החלונית התחתונה). דג זברה מהונדס זוגי יכול להיות מועסק כדי לפקח על מספר תהליכים בתא או סוגי תאים במשולב, כגון Ca2 + הדינמיקה של תת סוג של קונוסים. איור 3D מציג ערכת תיוג משולש עבור סוג זה של הניסוי, עם tdTomato לידי ביטוי ארוך באורך הגל קונוסים2 יחד עם mitochondrially, ממוקדות Ca2 + חיישן (mito-GCaMP) הביע קונוסים כל22 כתם גרעינית.
זמן לשגות הדמיה של תאים ברשתית הוא יתרון מפתח של הכנה זו פרוסה. למשל, Ca2 + תנודות חרוט קולט אור ציטוזול ניתן להקליט ולצפות במעשיהם לכמת מאוחר יותר במהלך טיפול תרופתי, ניסוי מתואר באיור4. איור 4A מראה פרוסות ברשתית לבטא את Ca2 + חיישן GCaMP2 (למעלה) או פקד eGFP16 (למטה) בחרוט photoreceptors counterstained עם lipophilic צבע אדום. בניסוי זה נה+ isotonically התרוקן מן החדר הדמיה באמצעות זלוף, לעורר גדולים על ידי העלאות cytosolic Ca2 + קטע החיצוני ולגוף התא כפי שהיא משתקפת GCaMP (איור 4A, החלונית העליונה) זריחה של הרשתית פרוסות Ca לביטוי2 +-רגישות eGFP מושפע טיפול זה (איור 4A, החלונית התחתונה). זמן לשגות סרטים ניתן לנתח באמצעות תוכנת ImageJ כדי לבודד ולכמת פלורסצנטיות תגובות קונוס אחד מקטעי החיצוני, גופי התא, הסינפסות (איור 4B).
| תוספת פתרון | ||
| 50 X מניות * ריכוז (מ מ) | ריכוז בעבודה (מ מ) | |
| D-גלוקוז | 500 | 10 |
| סודיום לקטט | 50 | 1 |
| פירובט נתרן | 25 | 0.5 |
| -גלוטמין | 25 | 0.5 |
| גלוטתיון מופחת | 25 | 0.5 |
| חומצה אסקורבית | 15 | 0.3 |
| * חנות aliquots ב-20 ºC < 6 חודשים; להוסיף טרי תמיסת רינגר | ||
טבלה 1. רכיבים של 50 X תוספת פתרון מניות וריכוזי עבודה סופית.
| תמיסת רינגר | |
| ריכוז (מ מ) | |
| NaCl | 133 |
| אשלגן כלורי | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| 2PO NaH4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6-אייץ '-2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| ה-pH ל 7.4 באמצעות NaOH | |
| חנות-ºC 4 לבקבוק סטרילי < 1 חודש | |
בטבלה 2. הרכיבים של תמיסת רינגר סטנדרטי.
| נה+-חינם תמיסת רינגר | |
| ריכוז (מ מ) | |
| טריס | 147 |
| HCl | 120 |
| JCM | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| 2פו ח'4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6-אייץ '-2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| ה-pH ל 7.4 באמצעות HCl | |
| חנות-ºC 4 לבקבוק סטרילי < 1 חודש | |
בטבלה 3. מרכיבי Na+-חינם תמיסת רינגר.
| הגדרות הדמיה קונפוקלי | |||
| Fluorophore | עירור | מסנן פליטה | |
| אורך גל | עוצמת לייזר | ||
| GFP (כולל GCaMP) | 488 ננומטר | 2 - 5% | eGFP או AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 ננומטר | 1% | דאפי |
| NBDG | 488 ננומטר | 10% | eGFP או AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
בטבלה 4. הדמיה תנאים סמני פלורסנט, צבעי שהוצגו בדמויות 2-4.
איור 1. סכמטי להכנת דג זברה טריות פרוסות ברשתית. (א) לנתח משם את עיינית, ולמחוק את העדשה ואת בסקלרה (שלב 2.4.1.). (B) לחתוך את עיינית לתוך שלוש חתיכות; למחוק את חתיכת קצה קטן (שלב 2.4.2.). (ג) גרור נייר סינון תחת עיינית חתיכות עם הרשתית הפנימי פונה לכיוון נייר הסינון (שלב 2.5.1.-2.5.2.). (ד) לשטח הרשתית בעזרת מגבת נייר עד לפתיל תמיסת רינגר כלפי מטה דרך נייר הסינון (שלב הנגן 2.5.3.), ואז בעדינות לקלף משם שנותרו RPE עם מלקחיים (שלב 2.6). להעביר נייר הסינון לתא עם פרוסות על הבמה מבצעה רקמות, חותכים פרוסות מיקרומטר 400 (צעדים 2.8., 2.9.). העברה (E) חותך קאמרית עם פרוסות, סולם שעווה או וזלין על צלחת פטרי של תמיסת רינגר (שלב 2.10.1.). (נ) להשתמש מלקחיים בסדר להחליק פרוסות יחיד מן החדר עם פרוסות הסולם תוך שמירה על פרוסות מתחת למים. (G) נייר סינון לסובב רצועות (שחור) 90 ° ולקבור את הקצוות של נייר הסינון שעווה או וזלין (צעדים 2.10.2.-2.10.3.). (H) סכמטית לחדר ההדמיה האחרון עמוסה סולם ופרוסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. דוגמאות של דג זברה טריים רשתית פרוסות אדהזיה נאות הצגת נייר סינון, הכדאיות תא. (א) Brightfield תמונה של טריות פרוסות ברשתית סולם וזלין. פרוסות ii ו- iii הצגת אדהזיה טובה ושכבות ברשתית רוחבי. פרוסות ו- iv שמרו RPE משמעותי, או הינם מאוד מעוקל לא היטב מודבקת על נייר הסינון, לא צריך תמונה. סרגל קנה מידה = 200 (B) מלמעלה למטה Z מונטאז מיקרומטר. פרוסת ברשתית טריים של דג זברה מהונדס לבטא eGFP בתוך קונוס photoreceptors (Tg(gnat2:eGFP)16). צבען Hoechst תוויות כל הגרעינים; propidium יודיד (PI) counterstaining תוויות הגרעינים של תאים מתים, אשר מופיעים סמוך לקצה חיתוך הפרוסה (משמאל). Z-מחסנית שלב גודל = 1 מיקרומטר; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. תנאים הדמיה פלורסנט מתוארים בטבלה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. לטעום תמונות קונאפוקלית של כפולה, משולשת-שכותרתו שמחוץ ברשתית פרוסות דג זברה הטרנסגניים למבוגרים. (א) שני צבעים ערכת הדמיה העסקת GFP הטרנסגניים מתויגות רשתית תוך-פלזמית בקונוסים (Tg(gnat2:calr-GFP)17, העליון) עם Hoechst הגרעין counterstain (כחול, למטה). (B) GFP מתויגות אקטין בקונוסים (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, העליון) עם Hoechst הגרעין counterstain (כחול, למטה). (ג) RFP שכותרתו תאים מולר (Tg(GFAP:tdTomato)19, העליון) של דג להזנה גלוקוז פלורסנט (NBDG) הממחיש את ספיגת הגלוקוז לתוך קונוסים20,21 (ירוק, התחתון). (תמונה זו היא מ 2B איור של Kanow, et al. 21) (D) דוגמה הדמיה תלת-צבעי שימוש כפול דג זברה מהונדס. . שמאלה, RFP ממוקד ארוך באורך הגל קונוס photoreceptors (Tg(trβ2:tdTomato)2). מרכז, סידן ביוסנסור GCaMP ממוקד חרוט קולט אור המיטוכונדריה (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). נכון, בשכבות תמונות של tdTomato (מגנטה) mito-GCaMP (ירוק), Hoechst הגרעין counterstain (כחול). תמונות הסתיימו העוצמה המקסימלית Z-תחזיות של מסגרות 9 לעומק ברקמות מיקרומטר 7; סולם ברים מייצגים 10 מיקרומטר. פלורסנט הדמיה תנאים מתוארים בטבלה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. Ca2 + הדמיה עם GCaMP ושליטה eGFP. (א) להחליפן בתמונות של טריות פרוסות ברשתית לבטא את פלורסנט Ca2 + החיישן GCaMP (gnat2:GCaMP32, העליון) או eGFP (למטה) ב- photoreceptors חרוט. שמאל, פרוסות בנקודת ההתחלה; נכון, פרוסות 2 דקות לאחר Na+ isotonically הייתה דלה מן החדר הדמיה באמצעות זלוף של המבוסס על טריס תמיסת רינגר, אשר מלכודות Ca2 + ב- photoreceptors. גודל ברים = 10 מיקרומטר. תנאים הדמיה פלורסנט מתוארים בטבלה4. (B) מתכוון פלורסצנטיות שינויים של תאים קולט-אור יחיד (מקטעי החיצוני תא גופות, הסינפסות) במהלך זמן לשגות הדמיה של דלדול Na+ . פרוסות היו עם תמונה כל 10 s, ערימות עובדו באמצעות ImageJ, זריחה של GCaMP או eGFP היה מנורמל לאותת מ לצבוע ממברנה. קווים מלאים, GCaMP (n עבור פלחי החיצונית = 15, גופי התא = 24, הסינפסות = 26); קווים מקווקווים, eGFP (n עבור פלחי החיצונית = 26, גופי התא = 20, הסינפסות = 31). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex-vivo הדמיה של דג זברה טריות פרוסות ברשתית הוכיחה להיות כלי רב-תכליתי ללמוד קולט אור ביולוגיה20,21,22, הוא ייחודי בכך שהוא מאפשר ניתוח של תאים בודדים בבוגרת, באופן מלא הרשתית הבדיל. בפועל, זה אפשרי לערוך ניסויים מרובים עם רקמת מדג יחיד, אפילו שימוש בפרוסות טורי מאותו חלק של הרשתית. בנוסף אתגרים והצעות בנוגע הכנה של פרוסות ברשתית הידלדלות אלקטרופיזיולוגיה מחקרים14, ישנם שיקולים חשובים הדמיה ניסויים.
עבור photoreceptors, תא הכדאיות בדרך כלל להרכב מורפולוגיה תאים, ולכן חשוב לטפל הרשתית העדינה מינימלית, במיוחד לאחר RPE הוסר. לאחר בציעת, להשתמש מלקחיים בסדר החלק בזהירות פרוסות אופקית מן החדר עם פרוסות (איור 1F) כדי להעביר להם הסולם ולא מרימים פרוסות ישר למעלה ולשמור תמיד פרוסות שקוע בתוך תמיסת רינגר. במידת האפשר, להרכיב את הסולם של פרוסות ברשתית ליד מיקרוסקופ קונפוקלי כדי למזער את הנזק פרוסות הרעד במהלך ההובלה.
הדבקה חזקה של רקמת רשתית על נייר הסינון הוא קריטי ליצירת פרוסות שיישאר יציב במהלך הניסויים זריקה או זלוף. יש צורך לבחון היטב כל פרוסה מורפולוגיה וליציבות בדיוק לפני הדמיה (איור 2 א); בעדינות טופפת על השולחן מיקרוסקופ בזמן צפייה פרוסה תנועה דרך העדשה עינית קונפוקלי מגלה יציבות על נתח מסוים. למרות אמצעי הזהירות, להיסחף Z-כיוון במהלך ההזרקה או זלוף יכול להציג אתגרים לצורך ניתוח, אז זה שימושי לטעון צבע הבקרה, כגון lipophilic צבענים ממברנות, המיטוכונדריה, כדי stably תווית ממבנה התא המאפשר זיהוי של נורמליזציה (איור 4A, מגנטה). אם פרוסות להיסחף > 10 מיקרומטר Z-כיוון זה לא ייתכן שניתן לשלוף נתונים בתא יחיד שמיש. הסחף מתונה בכיוון X-Y יכול להיפתר עיבוד דפוס באמצעות תוכנות רישום כגון MultiStackReg ImageJ (RRID:SCR_002285).
תחת תנאים סטטיים, זריחה של סמני בפרוסות ברשתית צריכים להישאר יציב, למרות photobleaching יכול להתרחש במהלך דימות. צריך לקחת כדי למזער חשיפה ללייזר במהלך הזמן המעידות על ידי זיקוק פרמטרים כגון לייזר בעוצמה, סריקה מהירות, קצב הפריימים. הדמיה פקדים מומלץ עבור כל סמן פלורסנט בשימוש. פקדים כוללים הזרקת פרפוזיה תמיסת רינגר ללא סוכנים תרופתי בניסויים נפרד או ניסויים הדמיה עם סמנים שאינם ביוסנסור לזרוח צורונים.
בהתאם לייזר קונפוקלי עירור בשימוש, פיגמנטים RPE יכולה לתרום autofluorescence, אפילו לייצר חום במהלך הדימות, לכן חשוב להסיר את רוב רקמת זה לפני חיתוך. Dark-adapting בעלי חיים מסייע בסילוק RPE תוך מזעור נזקים ברשתית המשמש כבסיס. אי-יכולת תמונה של RPE היא מגבלה של הכנת פרוסה, אבל זה עלול להתגבר באמצעות albino חיות עם RPE שקוף. מגבלה נוספת היא כי תאי גנגליון והרגליים קצה של מולר תאים עשויים להפוך מהיווצרות מאת נייר הסינון; כהכנה חלופית הרשתיות עשוי להיות שטוח רכוב עם הצד קולט אור למטה על נייר הסינון ואז לפרוס כדי לספק תצוגה ברורה יותר של הרשתית הכמוסים ביותר. חשוב גם לציין כי ייתכן נותקו תחזיות האופקית הארוכה של תאים מסוימים, כגון תאי אמקרין שדה רחב, במהלך ניתוח או לחתוך. מגבלה הסופית היא כי רבים צבעי פלורסנט להצטבר nonspecifically בקטעים החיצוני קולט אור, אז עבור חלק זה של הרשתית מומלץ להשתמש מקודדים גנטית ביולוגיים מאשר מחוון צבע.
נתתי את המגוון הרחב של הכתב תא פלורסנט זמינים צבעי23,24 בשביל לרקמות ואת גנטית מקודד ביולוגיים פלורסנט בעבר בהצלחה דג זברה2,3,4, 5, הכנת פרוסה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים ביולוגיים רבים מספר סוגי תאים ברשתית (ראה דוגמאות איור 3, איור 4). הדמיה טריות פרוסות ברשתית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר תא חי יכול גם לספק תובנות חדשות מרגשות פונקציה ברשתית ובריאות ברמה subcellular. יתרה מזאת, שיטה זו ניתן להתאים עבור ex-vivo הדמיה של פרוסות רשתית העכבר25. בזמן הכנה מוצלחת של טריות פרוסות רשתית דורש תרגול, זה כלי רב עוצמה שימושי למיעון מגוון רחב של תאים ספציפיים השאלות הביולוגיות של הרשתית בוגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים ראלף נלסון, דניאל Possin להדרכה מתחשב תוך פיתוח זה פרוטוקול, אווה, ג'ורג. אשלי, ואשתו, גייל סטנטון לדור של קווים דג זברה מהונדס יציב. העבודה נתמכה על ידי ה-NSF 2013158531 GRFP ל מ. ג, 5T32EY007031 NIH NEI ג'אקוזי, מ. ג, EY026020 ג'יי-אייץ, ס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
