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Neuroscience

पूर्व Vivo इमेजिंग प्रयोगों के लिए वयस्क Zebrafish से ताजा रेटिना स्लाइस की तैयारी

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/56977
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, University of Washington, 2Department of Ophthalmology, University of Washington

Summary

इमेजिंग रेटिना ऊतक एकल सेल जानकारी है कि पारंपरिक जैव रासायनिक तरीकों से इकट्ठा नहीं किया जा सकता प्रदान कर सकते हैं । यह प्रोटोकॉल zebrafish से रेटिना स्लाइस के लिए फोकल इमेजिंग की तैयारी का वर्णन करता है । फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर या संकेतक रंजक अलग रेटिना सेल प्रकार में कई जैविक प्रक्रियाओं के दृश्य की अनुमति देते हैं ।

Abstract

रेटिना एक जटिल ऊतक है कि शुरू और दृष्टि के पहले कदम को एकीकृत है । रेटिना कोशिकाओं की शिथिलता कई चकाचौंध रोगों की एक बानगी है, और भविष्य के उपचार कैसे अलग रेटिना कोशिकाओं सामान्य रूप से कार्य के बारे में मौलिक समझ पर टिका. जैव रासायनिक तरीकों के साथ इस तरह की जानकारी प्राप्त करना मुश्किल साबित हो गया है क्योंकि विशेष कोशिका प्रकार के योगदान रेटिना सेल वातावरण में कम कर रहे हैं. लाइव रेटिना इमेजिंग एक सेलुलर स्तर पर कई जैविक प्रक्रियाओं का एक दृश्य प्रदान कर सकते हैं, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जैव संवेदी की बढ़ती संख्या के लिए धन्यवाद. हालांकि, इस तकनीक को इस प्रकार अब तक सीमित किया गया है tadpoles और zebrafish लार्वा, अलग रेटिना की सबसे बाहरी रेटिना परतों, या कम रहने जानवरों में रेटिना का रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग । यहाँ हम लाइव इमेजिंग के लिए वयस्क zebrafish से फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से लाइव पूर्व वीवो रेटिना स्लाइसें पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । यह तैयारी सभी रेटिना परतों और सबसे सेल प्रकार छिड़काव का उपयोग कर फोकल इमेजिंग प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए दृश्यमान के साथ अनुप्रस्थ स्लाइस पैदावार । ट्रांसजेनिक zebrafish में फ्लोरोसेंट प्रोटीन या विशिष्ट रेटिना सेल प्रकार या organelles में संवेदी व्यक्त करने के लिए एक बरकरार रेटिना से एकल सेल जानकारी निकालने के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अतिरिक्त, रेटिना स्लाइस फ्लोरोसेंट संकेतक रंजक के साथ लोड किया जा सकता है, विधि की बहुमुखी प्रतिभा को जोड़ने. इस प्रोटोकॉल इमेजिंग ca के लिए विकसित किया गया था2 + zebrafish शंकु photoreceptors के भीतर, लेकिन उचित मार्करों के साथ इसे मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता ca2 + या चयापचयों म्यूलर कोशिकाओं में, द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं, microglia, amacrine कोशिकाओं, या रेटिना नाड़ीग्रंथि कक्ष । इस विधि उस कक्ष प्रकार का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है तो रेटिना वर्णक उपकला स्लाइस से निकाल दिया गया है । अभ्यास के साथ, यह कई प्रयोगों के लिए एक जानवर से धारावाहिक स्लाइसें उत्पन्न करने के लिए संभव है. यह अनुकूलनीय तकनीक रेटिना सेल जीव विज्ञान, सीए2 +, और ऊर्जा homeostasis के बारे में कई सवालों के जवाब देने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है ।

Introduction

zebrafish (ढाणियो rerio) व्यापक रूप से चिकित्सा और बुनियादी वैज्ञानिक अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है1, अपने छोटे आकार, तेजी से विकास और हड्डीवाला अंग प्रणालियों के कारण । transgenesis के लिए स्थापित तरीकों के साथ संयुक्त zebrafish लार्वा की प्राकृतिक पारदर्शिता एक जीवित जानवर में सेलुलर प्रक्रियाओं का विस्तृत दृश्य सक्षम है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट के एक नंबर सेंसर विशिष्ट zebrafish कोशिकाओं को लक्षित किया गया है Ca2 + 2, हाइड्रोजन पेरोक्साइड3, अपोप्तोटिक सक्रियकरण4 और एटीपी5का पता लगाने ।

vivo में इमेजिंग zebrafish लार्वा तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में सफलताओं के लिए नेतृत्व किया गया है, मस्तिष्क सर्किट6 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों7के लिए दवा विकास की मानचित्रण सहित । Zebrafish दृष्टि अनुसंधान के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि उनके रेटिना लामिना संरचना और उच्च रीढ़ के ंयूरॉन प्रकार की सुविधा है, और वे मजबूत दृश्य व्यवहार8,9प्रदर्शन । मानव रोग के अनुरूप रेटिना अध ' के कई प्रकार के सफलतापूर्वक मॉडलिंग की गई है और zebrafish में अध्ययन किया गया है10,11, एक रेटिना2के भीतर व्यक्तिगत photoreceptors चूकने की लाइव इमेजिंग सहित, 12.

vivo लार्वा zebrafish इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, यह मछली बढ़ने और रंजकता विकसित करने के रूप में और अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है, और कुछ औषधीय उपचार एक पूरे जानवर रिस नहीं कर सकता. इसके अलावा, कुछ सेलुलर विकास और उंर के साथ परिवर्तन प्रक्रियाओं, बाद में समय समझने समारोह और वयस्क पशुओं में रोग की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण अंक बना । immunoblot, quantitiative पीसीआर, ओ2 खपत, और metabolomic विश्लेषण के रूप में जैव रासायनिक तरीकों के रूप में एक पूरे के रूप में रेटिना के जीव विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह अलग से प्रभावित कोशिका प्रकार के योगदान विचार मुश्किल है रोग. इमेजिंग पृथक रेटिना ऊतक पूर्व vivo इन मुद्दों को नजरअंदाज कर, और जबकि इमेजिंग फ्लैट घुड़सवार रेटिना के बाहरी रेटिना13के एक दृश्य affords, गहरे भीतरी रेटिना सुविधाओं अस्पष्ट हैं. अनुप्रस्थ ऐसे निश्चित immunohistochemical विश्लेषण में प्रस्तुत उन के रूप में रेटिना स्लाइस, सभी परतों और कोशिकाओं के प्रकार के एक स्पष्ट दृश्य सक्षम है, लेकिन केवल गतिशील सामांय समारोह और रोग में शामिल प्रक्रियाओं का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं ।

यहां, हम इमेजिंग के लिए वयस्क zebrafish से पूर्व vivo अनुप्रस्थ रेटिना स्लाइस पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । यह electrophysiological और रूपात्मक अध्ययन के लिए amphibian और zebrafish रेटिना स्लाइस की तैयारी के लिए तरीकों के समान है14,15, समय के लिए महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ चूक इमेजिंग पूर्व vivo का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी. छिड़काव का उपयोग कर औषधीय एजेंटों देने जबकि एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं स्लाइस में प्रतिदीप्ति या रंजक के जवाब. जबकि विधि इमेजिंग photoreceptors के लिए विकसित किया गया था, यह उपयुक्त फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ म्यूलर कोशिकाओं, द्विध्रुवी कोशिकाओं, क्षैतिज कोशिकाओं, amacrine कोशिकाओं, या रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं visualizing के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए संभव हो सकता है. इसके अतिरिक्त, स्लाइस को सेल व्यवहार्यता, vesicular परिवहन, mitochondrial समारोह, या redox राज्य की रिपोर्ट करने के लिए फ्लोरोसेंट सेल-पारगंय रंजक के साथ लोड किया जा सकता है । यह बहुमुखी तैयारी रेटिना भर उपसेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के दृश्य की अनुमति देता है, Ca2 + गतिशीलता, संकेत transduction और चयापचय राज्य सहित.

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों वाशिंगटन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. पशुओं और उपकरणों की तैयारी

नोट: रेटिना वर्णक उपकला (RPE) रेटिना जिसकी रंजकता रेटिना सुविधाओं अस्पष्ट और ऊतक नुकसान कर सकते हैं जब फोकल इमेजिंग पूर्व vivoके बाहर आसपास के ऊतकों के एक काले रंग की चादर है. अंधकार में, zebrafish का RPE रेटिना से दूर मुकर जाता है; डार्क मछली टुकड़ा करने की क्रिया और इमेजिंग से पहले रेटिना से RPE के भविष्य को हटाने की सुविधा ।

  1. मछली पानी से भरे टैंक को एक अंडे में स्थानांतरित करें, और फिर अंधेरे कपड़े के साथ अंडे को लपेटने या एक अंधेरे कैबिनेट में जगह है ।
    1. गहरी इच्छामृत्यु के लिए पहले से कम 1 ज के लिए zebrafish के लिए रेटिना से RPE की पूरी जुदाई के पास अनुमति देते हैं । 30 मिन डार्क अनुकूलन सबसे RPE को दूर करने के लिए पर्याप्त है, हालांकि इसके टुकड़े photoreceptors के बीच intercalated रह सकता है ।
  2. एक गर्म प्लेट पर एक ५० मिलीलीटर चोंच में पेट्रोलियम जेली के ~ 15 मिलीलीटर पिघला और फिर 3 मिलीलीटर पर्ची टिप सिरिंज में तरल के 3 मिलीलीटर आकर्षित । उलटा सिरिंज, एक परीक्षण ट्यूब रैक में जगह है, और पेट्रोलियम जेली शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. एक सादा 7 सेमी एक्स २.५ सेमी माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक पुन: प्रयोज्य टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष बनाओ ।
    1. स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करना, संकीर्ण लाइनों रंग स्लाइड के केंद्र में एक 3 सेमी X २.५ सेमी आयत बनाने के लिए, यह शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर लाइनों के लिए नेल पॉलिश की एक और परत जोड़ें ।
  4. इमेजिंग के दौरान स्लाइस रखने के लिए कवर स्लिप्स पर इमेजिंग सीढ़ी तैयार करें । स्लाइस सीढ़ी की "rungs" बनेगी ।
    1. न्यूनतम समाधान प्रवाह के साथ स्थिर इमेजिंग या इंजेक्शन प्रयोगों के लिए, पेट्रोलियम जेली 18 मिमी वर्ग कांच कवर फिसल जाता है पर पेट्रोलियम जेली के दो फ्लैट व्यापक समानांतर स्ट्रिप्स से मिलकर सीढ़ी बनाते हैं । सिरिंज का उपयोग करने के लिए कवर पर्ची पर दो चपटा ~ 1 सेमी ठंडा पेट्रोलियम जेली ०.५ सेमी की लंबी धब्बों को लागू करने के लिए ।
  5. ऊतक स्लाइसर तैयार.
    1. इथेनॉल के साथ एक डबल एज उस्तरा ब्लेड साफ और यह शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं । यह एक ब्लेड भर में तो आधा में कैंची, पहले लंबाई के साथ क्वार्टर में कटौती ।
    2. ऊतक स्लाइसर के मंच पर टुकड़ा करने की क्रिया चैंबर प्लेस, यह क्षैतिज मंच पर केंद्र और संरेखण के लिए स्थाई मार्कर के साथ एक लंबी बढ़त निशान ।
    3. ऊतक स्लाइसर हाथ पर एक ब्लेड अनुभाग लोड, ब्लेड फ्लैट और नेल पॉलिश को छूने के बिना स्लाइड पर केंद्रित है, तो धीरे ब्लेड उपकरण कस सुनिश्चित करें । घुंडी ¼ बारी का समायोजन करके ब्लेड हाथ कम है, तो इमेजिंग चैंबर के केंद्र में फिल्टर पेपर के एक स्क्रैप जगह और परीक्षण यह कटौती. अगर कागज पूरी तरह से कटौती के माध्यम से नहीं है, ब्लेड remount ।
  6. सिरिंज का प्रयोग, एक 10 सेमी पेट्री डिश में ठंडा पेट्रोलियम जेली के एक छोटे से डॉट जगह केंद्र के अधिकार के लिए ~ १.५ cm । यह ऊपर का सामना करना पड़ पेट्रोलियम जेली के साथ संदंश का उपयोग में एक इमेजिंग सीढ़ी दबाएँ । इमेजिंग चैंबर के प्रवेश किनारे से एक और छोटे पेट्रोलियम जेली डॉट ~ 1 सेमी बनाओ ।
  7. एक 20g सुई के साथ पेट्रोलियम जेली सिरिंज फिट और यह uncap. सिरिंज पर सुई पकड़ो और यह टुकड़ा करने की क्रिया चैंबर के केंद्र में पेट्रोलियम जेली लंबाई के दो 1 सेमी लंबी पतली समानांतर स्ट्रिप्स बनाने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं । अंतरिक्ष स्ट्रिप्स ~ 1 सेमी के अलावा ।
  8. बंद संदंश की एक जोड़ी के आसपास 30 ग्राम टंगस्टन तार के एक ~ 4 सेमी खंड के केंद्र लपेटकर एक बार कसकर एक पुन: प्रयोज्य तार आंख पाश उपकरण बनाओ । तार फिसलने से ऊपर या नीचे संदंश जब तक यह थोड़ा एक zebrafish आंख से बड़ा है, आमतौर पर ~ 2-3 mm मोड़ से पाश के व्यास को समायोजित करें और उन्हें एक 6-cm लकड़ी छड़ी प्रयोगशाला टेप का उपयोग कर के अंत करने के लिए सुरक्षित ।
  9. घंटी का समाधान तैयार करें ।
    1. गल 50X के पूरक स्टॉक समाधान (तालिका 1) और इसे HEPES-बफ़र्ड, गैर-बिकारबोनिट रिंगर समाधान (तालिका 2) की सुबह प्रयोग के लिए ताजा जोड़ें; एक शंकु केंद्रापसारक ट्यूब या बाँझ कांच की बोतल में घंटी के समाधान के हर 10 मिलीलीटर में पूरक स्टॉक समाधान के २०० µ एल पतला । स्थैतिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए, प्रति प्रयोग ंयूनतम 30 मिलीलीटर की घंटी का समाधान तैयार करें । छिड़काव प्रयोगों के लिए आवश्यक है घंटी समाधान की मात्रा प्रवाह दर और कुल प्रयोग समय पर निर्भर करेगा ।
    2. जांच करें कि पूरक समाधान का पीएच ७.४ एक डिजिटल पीएच जांच या पीएच कागज का उपयोग कर रहा है, और NaOH या एचसीएल पतला के साथ तदनुसार समायोजित ।
    3. आक्सीजन बर्फ पर १००% ऑक्सीजन गैस के साथ bubbling द्वारा एक मानक चिकित्सा ऑक्सीजन टैंक और नियामक एक नली, या वैकल्पिक गैस bubbler कई गुना छिड़काव के लिए इस्तेमाल के साथ लगे का उपयोग कर के लिए 5, 8% से कम समय के लिए प्राणवायु का समाधान पूरक है । एक सील शंकु केंद्रापसारक ट्यूब या विच्छेदन माइक्रोस्कोप के पास बाँझ कांच की बोतल में बर्फ पर स्टोर oxygenated घंटी के समाधान; विच्छेदन, इमेजिंग, और रंजक या औषधीय एजेंटों को पतला करने के लिए इस समाधान का उपयोग करें ।
    4. यदि प्रयोग में अन्य समाधानों का उपयोग किया जा रहा है, जैसे ना+-फ्री रिंगर का समाधान (तालिका 3), तो चरणों को दोहराएँ 1.9.1.-1.9.3.
  10. पेट्री व्यंजन, संदंश, सूक्ष्म कैंची और विच्छेदन माइक्रोस्कोप के पास अन्य उपकरणों को इकट्ठा, और zebrafish इच्छामृत्यु के लिए एक मछली पानी बर्फ स्नान तैयार करते हैं ।

2. रेटिना स्लाइस तैयार करना ( चित्र 1देखें)

  1. लाल परिवेश प्रकाश के तहत कार्य करने के लिए प्रकाश अनुकूलन (जो RPE कर सकते है और अधिक कसकर रेटिना के लिए छड़ी), euthanize zebrafish बर्फ स्नान में विसर्जन तक स्पर्श प्रतिक्रिया खो दिया है, आमतौर पर 1-2 min । मछली एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण और एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा का पता लगाने लेकिन मछली नहीं decapitate ।
  2. एक आंख के आसपास संयोजी ऊतक ढीला करने के लिए तार पाश का प्रयोग करें, और फिर एक हाथ में पाश के साथ धीरे से आगे आँख खींच. दूसरे हाथ में माइक्रो कैंची का प्रयोग, आंख के नीचे सफेद ऑप्टिक तंत्रिका काट, ध्यान लेने के लिए आंख के पीछे नहीं काट ।
  3. बर्फ पर ठंड घंटी समाधान के एक पेट्री डिश के लिए संदंश का उपयोग कर आंख हस्तांतरण, और दूसरी आंख के लिए दोहराएं । आंखों को अंधकार में या लाल बत्ती के नीचे रखें जब तक RPE को रेटिना से न निकाला जाए ।
  4. काटना एक पेट्री डिश में एक सादे गिलास स्लाइड पर ठंडे घंटी के समाधान की एक बूंद में एक कम बिजली विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत eyecups ।
    1. ठीक संदंश के साथ कॉर्निया पियर्स, तो धीरे संदंश या कैंची के साथ स्पष्ट, भंगुर कॉर्निया और चांदी श्वेतपटल के टुकड़े को हटा दें । लेंस को निकालें और छोड़ें और अधिकांश श्वेतपटल ( चित्र 1aदेखें), और पृथक eyecup को ंयूनतम संभालें ।
    2. वसा के टुकड़ों, श्वेतपटल के छोटे टुकड़े, और काले RPE eyecup से जुड़े रह सकते है और बाद में रेटिना से हटा दिया । रेटिना चरण 2.4.1 में RPE से अलग है, तो नाजुक अलग रेटिना को नुकसान नहीं अतिरिक्त सावधानी का उपयोग कर एक ही कदम के साथ आगे बढ़ना.
    3. स्थिति eyecup ओपन साइड नीचे स्लाइड पर (RPE), और एक प्रस्ताव में एक ताजा एकल बढ़त उस्तरा ब्लेड के साथ तिहाई या तिमाहियों में कटौती ( चित्र 1bदेखें) । ऊतक है कि अत्यधिक घुमावदार है के टुकड़े त्यागें ।
  5. फिल्टर कागज पर फ्लैट माउंट रेटिना ।
    1. गीले रिंगर समाधान के साथ फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा है और यह eyecup टुकड़े के बगल में स्लाइड पर जगह है । यह puncturing से बचने के लिए बरकरार गीला फिल्टर कागज हैंडलिंग जब फ्लैट संदंश का प्रयोग करें । ठंडा घंटी के समाधान जोड़ें दोनों फिल्टर कागज और ऊतक को कवर करने के लिए ।
    2. प्रत्येक हाथ में संदंश का प्रयोग, ध्यान से RPE और photoreceptors का सामना करना पड़ के साथ एक eyecup टुकड़ा के नीचे फिल्टर कागज खींचें, यानी ऊपर की ओर आंख के पीछे के साथ । फिल्टर पेपर के केंद्र के साथ एक ही पंक्ति में eyecup टुकड़े की स्थिति ( चित्रा 1Cदेखें). eyecup टुकड़े धीरे ठीक संदंश के साथ ही एक किनारे या कोने के पास संभाल ।
    3. मदद करने के लिए रेटिना फिल्टर कागज का पालन करें, एक सूखी कागज तौलिया पर गीला फिल्टर कागज 3 एस के लिए जगह बाती नमी नीचे है, लेकिन चलो नहीं ऊतक शुष्क हो जाते हैं । दोहराएं जब तक eyecup टुकड़े फिल्टर कागज पर फ्लैट झूठ । फिल्टर कागज के नीचे करने के लिए कोमल चूषण लागू करने रेटिना समतल में मदद करता है, लेकिन यह कदम आवश्यक नहीं है ।
  6. यदि RPE की काली चादरें eyecup टुकड़े पर रहते हैं, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे इसे छील दूर एक कोने से शुरू ( चित्र 1 डीदेखें), जबकि ऊतक है घंटी समाधान की एक बूंद में बैठा है. फिल्टर कागज से रेटिना लिफ्ट चाहिए, 2.5.3 में बाती कदम दोहराएं । रेटिना गुलाबी ब्लीच्ड दृश्य pigments के कारण प्रकट हो सकता है.
  7. दोहराएं रेटिना विच्छेदन और फ्लैट में बढ़ते कदम 2.4-2.6 दूसरी आंख के लिए, यदि वांछित, रखने के पहले फ्लैट घुड़सवार रेटिना ठंड घंटी समाधान में डूबे । टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए, दोनों रेटिना के टुकड़े एक फिल्टर कागज पर रखा जा सकता है । एक बार RPE हटा दिया गया है, प्रोटोकॉल सामांय कमरे के प्रकाश के तहत किया जा सकता है जब तक कि प्रयोगों जरूरत अंधेरे ।
  8. एक स्लाइड पर फिल्टर कागज प्लेस और यह एक एकल धार उस्तरा ब्लेड के साथ एक आयत में ट्रिम कर दीजिए, छोड़ने ~ ०.५ रेटिना की रेखा के दोनों ओर फ़िल्टर कागज के सेमी । तैयार टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष के लिए फ़िल्टर कागज ले जाएं, पतली पेट्रोलियम जेली लाइनों में लंबे समय फिल्टर कागज के किनारों धक्का संदंश का उपयोग, और शीत घंटी समाधान के 3-4 बूंदें में रेटिना विसर्जित कर दिया ।
    नोट: lipophilic रंजक के रूप में कुछ रंजक, सबसे अच्छा टुकड़ा करने की क्रिया करने से पहले इस स्तर पर फ्लैट माउंट में भरी हुई हैं । ये लोड किया जा सकता है, एक ऊतक के साथ दूर दुष्ट, और टुकड़ा करने की क्रिया चैंबर में धोया । उदाहरण के लिए, सी12 558/568 BODIPY तीव्रता दाग रेटिना सेल झिल्ली और photoreceptor बाहरी क्षेत्रों ( चित्रा 4a) जब ~ 5 µ g/mL पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आम तौर पर 23-27 डिग्री सेल्सियस), अतिरिक्त घंटी के समाधान में एक धोने के बाद पर भरी हुई देखें .
  9. ऊतक स्लाइसर मंच के लिए टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष स्थानांतरण, चिह्नित लाइन के साथ लंबी बढ़त की स्थिति, और सुरक्षित कक्ष प्रयोगशाला टेप के साथ मंच को समाप्त होता है । एक छोर पर शुरू, रेटिना और फिल्टर कागज फर्म का उपयोग कर, टुकड़ा करने की क्रिया हाथ पर कोमल दबाव में कटौती । जांच करें कि पहला टुकड़ा पूरी तरह से काट दिया गया था, तो माइक्रोमीटर का उपयोग करने ~ ४०० µm स्लाइसें काट ।
  10. इमेजिंग सीढ़ी इकट्ठा ।
    1. इमेजिंग सीढ़ी से सटे कदम १.७ से पेट्री डिश में कटा हुआ रेटिना वर्गों के साथ टुकड़ा करने की क्रिया चैंबर प्लेस ( चित्रा 1Eदेखें). ठंडी घंटी के समाधान के साथ पकवान भरने के लिए अपनी सामग्री जलमग्न ।
    2. संदंश और स्लाइसें जलमग्न रखने का उपयोग करना, धीरे से सही करने के लिए बाएं से पेट्री डिश फिसलने से सीढ़ी के लिए फिल्टर कागज और रेटिना के स्ट्रिप्स हस्तांतरण । सीधे रेटिना को छूने के लिए नहीं ध्यान रखना । स्लाइसें ९० ° घुमाएं और पेट्रोलियम जेली में फिल्टर कागज किनारों दफन ।
    3. पतले संदंश के साथ सीढ़ी में रेटिना स्लाइस की स्थिति इतनी है कि रेटिना परतों विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं ( चित्रा 1Gदेखें). सीढ़ी के प्रत्येक छोर पर स्लाइस के लिए, यह सुनिश्चित करें कि ऊतक इंजेक्शन या प्रवाह के दौरान ऊतक की गति को कम करने के लिए अन्य स्लाइस की ओर आवक का सामना करना पड़ रहा है । ऐसे किसी भी रेटिना स्लाइस को छोड़ें, जो फ़िल्टर काग़ज़ पर अच्छी तरह से पालन नहीं किए जाते ( चित्र 2aदेखें) ।
  11. यदि वांछित, इस स्तर पर रेटिना स्लाइस में लोड रंजक और इमेजिंग करने से पहले अतिरिक्त घंटी के समाधान में धो.
    नोट: Propidium आयोडाइड (PI) और Hoechst ३३३४२ मजबूती से मृत और सभी कोशिकाओं के नाभिक दाग, क्रमशः ( चित्रा2 ए देखें), जब 5 µ जी पर रेटिना स्लाइस के साथ मशीन/ Tetramethylrhodamine (TMRM) रेटिना भर में सक्रिय रूप से respiring mitochondria में जमा जब कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1 एनएम में मशीन ।
  12. स्लाइस धुंधला कर रहे हैं, जबकि इमेजिंग चैंबर और इंजेक्शन उपकरण तैयार करते हैं । सिरिंज का उपयोग करने के लिए है घंटी समाधान के साथ टयूबिंग फ्लश और बुलबुले मिटाना, इमेजिंग चैंबर प्रवेश करने के लिए टयूबिंग के खुले अंत देते हैं, और टोंटी बंद करो । सिरिंज निकालें और यह इंजेक्शन के लिए एजेंट (ओं) के साथ भरें, तो यह टयूबिंग के लिए reattach ।
  13. इमेजिंग चैंबर के लिए रेटिना स्लाइस के साथ coverslip हस्तांतरण करने के लिए संदंश का प्रयोग करें, इमेजिंग चैंबर के प्रवेश किनारे के पास पेट्रोलियम जेली की बिंदी में coverslip दबाने ( चित्राएक देखें). स्लाइस को कवर करने के लिए घंटी के समाधान के साथ इमेजिंग चैंबर भरें ।

3. इमेजिंग रेटिना स्लाइस

  1. एक 20 या 40X पानी सूई लेंस से सुसज्जित एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर कनेक्टेड इंजेक्शन उपकरण के साथ भरा इमेजिंग चैंबर प्लेस । स्टेज क्लिप्स के साथ इमेजिंग चैंबर सुरक्षित ।
  2. सीढ़ी पर कम सूई लेंस, और मंद ट्रांस प्रबुद्ध प्रकाश के तहत सीढ़ी के एक छोर पर एक स्लाइस पर ध्यान केंद्रित । अनुप्रस्थ अभिविन्यास के लिए प्रत्येक स्लाइस की जांच करें, photoreceptor बाहरी क्षेत्रों की उपस्थिति, और फिल्टर कागज के लिए सुरक्षित आसंजन.
  3. समय चूक इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा टुकड़ा का चयन करें और समय चूक छवि अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर विन्यस्त. तालिका 4 विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्करों और रंगों के लिए ठेठ इमेजिंग सेटिंग्स रूपरेखा ।
    नोट: छवि अधिग्रहण की दर माइक्रोस्कोप, फ्लोरोसेंट मार्कर (ओं), और जैविक प्रक्रिया का अध्ययन किया जा रहा है के आधार पर भिंन होगा । उदाहरण के लिए, 800x800 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन, 2 µs/पिक्सेल स्कैन गति, और GCaMP3 और एक लाल रंग के साथ photoreceptors में इमेजिंग कैल्शियम गतिशीलता के लिए एक 10-s फ़्रेम दर का उपयोग करें ।
    1. यदि उपलब्ध हो, टुकड़ा (photoreceptor बाहरी क्षेत्रों, कोशिका निकायों, नाभिक) में भौतिक स्थलों का पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए समय चूक के दौरान संभावित अभिविन्यास सहायता । इसके अलावा टुकड़ा भर में वास्तविक समय प्रतिदीप्ति की निगरानी करने के लिए सॉफ्टवेयर की स्थापना की ।
  4. इमेजिंग शुरू और आधारभूत प्रतिदीप्ति मॉनिटर । जब टुकड़ा भर प्रतिदीप्ति स्थिर (आमतौर पर 2-5 मिनट के भीतर), प्रयोग के साथ आगे बढ़ना । इंजेक्शन के लिए, सिरिंज टोंटी खोलने के लिए, फिर धीरे दबाना और मिश्रण सहायता करने के लिए दो बार गोताख़ोर पर वापस आकर्षित.
    नोट: उदाहरण के लिए, protonophore CCCP के एक केंद्रित समाधान इंजेक्शन द्वारा mitochondrial समारोह समाप्त इमेजिंग चैंबर में 1 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । यह एक मजबूत Ca2 + photoreceptor cytosol GCaMP द्वारा रिपोर्ट में फट लाती है, तो mitochondrial झिल्ली संभावित TMRM द्वारा रिपोर्ट में एक स्थिर कमी ।
  5. बारीकी से प्रयोग के दौरान बहाव के लिए स्लाइस की निगरानी, और भौतिक स्थलों के अनुसार सूक्ष्म समायोजन करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । आमतौर पर Z-दिशा में इंजेक्शन के दौरान बहाव या छिड़काव < 5 µm है ।

4. इमेजिंग रेटिना स्लाइसें छिड़काव प्रयोगों के दौरान जहां समाधान बदल रहे है या लगातार प्रवाहित

नोट: इमेजिंग रेटिना स्लाइस छिड़काव प्रयोगों के दौरान जहां समाधान बदल रहे हैं या लगातार प्रवाहित स्थिर इमेजिंग या इंजेक्शन प्रयोगों के लिए, निम्न संशोधनों के साथ सेटअप करने के लिए समान है ।

  1. पेट्रोलियम जेली चरण १.४ में वर्णित सीढ़ी के बजाय, मजबूत मोम सीढ़ी का उपयोग करने के लिए रेटिना स्लाइस समाधान प्रवाह के दौरान स्थिर पकड़ ।
    1. एक coverslip के अलावा दो छोटे unस्वादिष्ट दंत मोम के समानांतर सिलिंडरों ~ ०.५ सेमी प्लेस । एक सपाट सतह पर, एक अंगूठे का उपयोग करने के लिए प्रत्येक सिलेंडर प्रेस नीचे और coverslip के समानांतर किनारे की ओर । एक #1 coverslip के साथ क्षैतिज दोनों चपटा सिलेंडरों स्कोर ( चित्रा 1E, दाईं ओर) फिर एक रंग के साथ मोम स्ट्रिप्स के बीच पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत धब्बा देखें ।
    2. जब चरण 2.10.2 में इमेजिंग सीढ़ी कोडांतरण, मोम स्कोर में कटा हुआ फ़िल्टर कागज किनारों ठीक संदंश का उपयोग कर प्रेस (चित्रा 1G) ।
  2. २.१२ चरण में छिड़काव के लिए सेट अप करने के लिए, preoxygenated समाधान के साथ सिरिंज जलाशयों भरें, या प्रत्येक जलाशय में आक्सीजन समाधान के लिए वैकल्पिक गैस कई गुना का उपयोग करें । घंटी के समाधान के साथ सभी टयूबिंग फ्लश, सभी लाइनों के प्रवाह को सुनिश्चित जब खोला और बड़े बुलबुले पर्ज करें ।
  3. २.१३ कदम में इमेजिंग चैंबर भरने से पहले, सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक और coverslip के उजागर कोने पर पेट्रोलियम जेली का डॉट जगह के प्रवाह के दौरान बाद में फिसलने से इसे रोकने के लिए.
  4. जब इमेजिंग चैंबर भरा है और माइक्रोस्कोप मंच पर घुड़सवार, aspirator पर बारी और aspirator टयूबिंग कनेक्ट । परीक्षण के रिंगर समाधान के प्रवाह और micropositioner का उपयोग करने के लिए बहिर्वाह कक्ष पर aspirator ट्यूब उपकररों ताकि तरल की छोटी मात्रा से दूर तैयार कर रहे है चैंबर ओवरफ्लो (आमतौर पर ~ 1 एक 2 मिलीलीटर के लिए समाधान सतह से ऊपर मिमी/ ३.४ चरण में स्लाइस का चयन करते समय घंटी का समाधान बहने रखें.
  5. छिड़काव के लिए चरण ३.४ में प्रयोग का संचालन करने के लिए, दूसरे समाधान के खुलने के दौरान पहले समाधान के टोंटी को बंद करके समाधानों का प्रवाह स्विच करें ।
    1. उदाहरण के लिए, इमेजिंग चैंबर से extracellular ना+ चूस करने के लिए, रिंगर समाधान या ना+-मुक्त समाधान (तालिका 3) से भरा दो सिरिंज जलाशयों का उपयोग करें । आधार रेखा स्थापित करने के लिए रिंगर समाधान प्रवाह, फिर ना+-मुक्त समाधान करने के लिए स्विच । यह बड़े cytosolic Ca में परिणाम2 + photoreceptor बाहरी क्षेत्रों और सेल निकायों में बढ़ जाती है ( चित्रा 4देखें) ।
  6. गुरुत्वाकर्षण फेड छिड़काव प्रणालियों के लिए, प्रत्येक जलाशय में समाधान के स्तर की निगरानी तो प्रवाह की दर इमेजिंग के दौरान लगातार है । oxygenated समाधान के साथ की जरूरत के रूप में जलाशयों से ऊपर, या लगातार गैस कई गुना के साथ bubbling ऑक्सीजन बनाए रखने ।

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Representative Results

स्थिर स्थिति और स्लाइस के अनुप्रस्थ अभिविन्यास इंजेक्शन या औषधीय एजेंटों के छिड़काव के साथ सफल इमेजिंग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. ध्यान से जांच करें और स्लाइस के लिए सभी रेटिना परतों को सुनिश्चित करने की जरूरत के रूप में फोकल इमेजिंग से पहले स्थिति (चित्रा 2a, स्लाइस द्वितीय) दिखाई दे रहे हैं । यदि एक स्लाइस को थोड़ा आगे घुमाया जाता है (चित्र 2a, स्लाइस iii), तो बाहरी सेगमेंट के बंडल दिखाई देंगे और ध्यान में वांछित रेटिना परतों को लाने के लिए संदंश के साथ छोटे समायोजन किए जा सकते हैं. स्लाइस खराब फ़िल्टर काग़ज़ (चित्र 2a, स्लाइस i) या बनाए रखने RPE (चित्र 2a, स्लाइस iv) का पालन समय चूक इमेजिंग के लिए नहीं किया जाना चाहिए ।

कोशिका व्यवहार्यता शारीरिक प्रक्रियाओं को देख के लिए सर्वोपरि है विवो पूर्व; ऐसे propidium आयोडाइड (PI) के रूप में एक सेल व्यवहार्यता दाग परख सेल स्वास्थ्य के लिए सिफारिश की है, जबकि रेटिना टुकड़ा करने की क्रिया का अभ्यास । सभी स्लाइस के कट एज के पास मृत कोशिकाओं को उनके नाभिक में PI संचित (आंकड़ा बी b, बाएं पैनल) होगा, जबकि 5-10 µm टुकड़ा में गहरी, सामांय आकृति विज्ञान और कोई PI धुंधला के साथ स्वस्थ कोशिकाओं imaged जा सकता है । उदाहरण के लिए, photoreceptors में, कट एज के नीचे PI नकारात्मक कोशिकाओं को आमतौर पर एक टकसाली ध्रुवीकरण, लम्बी आकृति विज्ञान (चित्र b, सही पैनल) प्रदर्शित करते हैं । Photoreceptors जब oxygenated घंटी के समाधान में संग्रहीत कम से 4 ज के लिए रेटिना स्लाइस में व्यवहार्य रहते हैं ।

कई रेटिना सेल संरचनाओं ट्रांसजेनिक मार्करों और रंगों के संयोजन का उपयोग कर visualized किया जा सकता है; डबल और ट्रिपल फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ ताजा रेटिना स्लाइस का उदाहरण फोकल छवियों चित्रा 3में प्रस्तुत कर रहे हैं । शंकु photoreceptor endoplasmic जालिका (एर) नाभिक के सापेक्ष की गतिशीलता कल्पना करने के लिए, ट्रांसजेनिक मछली से रेटिना स्लाइसें व्यक्त GFP कोन एर करने के लिए लक्षित17 एक परमाणु डाई (चित्रा 3) के साथ counterstained जा सकता है । इसी तरह की रणनीति के लिए actin cytoskeleton ट्रांसजेनिक से रेटिना स्लाइस का उपयोग कर GFP-जुड़े actin18 (चित्र बी) व्यक्त zebrafish को देखने के लिए नियोजित किया जा सकता है । एक और सेल विशेष प्रमोटर के साथ, म्यूलर कोशिकाओं लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato19 और रेटिना स्लाइस (चित्रा 3सी, शीर्ष पैनल) में visualized के साथ लेबल किया जा सकता है । रेटिना में ग्लूकोज में उतार एक फ्लोरोसेंट ग्लूकोज अनुरूप (NBDG) के साथ मौखिक रूप से gavaging वयस्क zebrafish द्वारा vivo में परख किया जा सकता है, जो एक रेटिना स्लाइस में दिखाई कोशिकाओं में शामिल हो जाता है21 (चित्रा 3सी, नीचे पैनल). डबल ट्रांसजेनिक zebrafish में एकाधिक कक्ष प्रक्रियाओं या कक्ष प्रकारों पर नजर रखने के लिए नियोजित किया जा सकता है, जैसे कि कोन के एक उपप्रकार में Ca2 + गतिशीलता । चित्रा 3 डी प्रयोग के इस प्रकार के लिए एक ट्रिपल लेबलिंग योजना से पता चलता है, tdTomato के साथ लंबी तरंग दैर्ध्य शंकु में व्यक्त2 mitochondrially के साथ एक साथ-लक्षित Ca2 + सेंसर (मिळो-GCaMP) सभी शंकु में व्यक्त22 और एक परमाणु दाग ।

रेटिना कोशिकाओं की समय चूक इमेजिंग इस टुकड़ा प्रस्तुत करने का एक महत्वपूर्ण लाभ है । उदाहरण के लिए, Ca2 + शंकु photoreceptor cytosol में उतार चढ़ाव देखा जा सकता है और बाद में औषधीय हेरफेर के दौरान quantified, एक प्रयोग चित्रा 4में चित्रित किया । चित्रा 4a रेटिना एक लाल lipophilic डाई के साथ कोन photoreceptors counterstained में सीए2 + सेंसर GCaMP2 (ऊपर) या नियंत्रण eGFP16 (नीचे) व्यक्त स्लाइस से पता चलता है. इस प्रयोग में ना+ isotonically इमेजिंग चैंबर छिड़काव का उपयोग करने से समाप्त हो गया है, cytosolic Ca में बड़ी वृद्धि पैदा2 + बाहरी खंड और कोशिका शरीर के रूप में GCaMP द्वारा परिलक्षित (चित्रा 4a, शीर्ष पैनल) । रेटिना स्लाइसर कै2 +-असंवेदनशील eGFP के प्रतिदीप्ति इस उपचार (चित्रा 4a, नीचे पैनल) से अप्रभावित है । समय चूक फिल्मों ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए अलग और एकल शंकु बाहरी क्षेत्रों, कोशिका निकायों, और synapses (चित्रा 4B) से प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाओं को बढ़ाता है विश्लेषण किया जा सकता है ।

अनुपूरक समाधान
50X स्टॉक * एकाग्रता (मिमी) कार्य एकाग्रता (मिमी)
D-ग्लूकोज ५०० 10
सोडियम स्तनपान कराने वाली ५० 1
सोडियम पाइरूवेट 25 ०.५
L-glutamine 25 ०.५
घटे glutathione 25 ०.५
ascorbic एसिड 15 ०.३
* दुकान aliquots पर-20 º सी < 6 महीने; घंटी के समाधान के लिए ताजा जोड़ें

तालिका 1. 50X के घटकों के पूरक स्टॉक समाधान और अंतिम काम सांद्रता ।

घंटी का समाधान
एकाग्रता (मिमी)
Nacl १३३
KCl २.५
CaCl2 · 2H२हे 2
णः2पो4 १.५
MgCl2 · 6H२हे १.५
HEPES 10
७.४ के लिए पीएच NaOH का उपयोग
बाँझ बोतल में 4 º c पर स्टोर < 1 महीना

तालिका 2. मानक घंटी के समाधान के घटक ।

Na+-फ्री रिंगर का समाधान
एकाग्रता (मिमी)
Tris १४७
Hcl १२०
KCl 1
CaCl2 · 2H२हे 2
KH2पो4 १.५
MgCl2 · 6H२हे १.५
HEPES 10
एचसीएल का उपयोग करने के लिए पीएच ७.४
बाँझ बोतल में 4 º c पर स्टोर < 1 महीना

तालिका 3. ना के अवयव+-फ्री रिंगर समाधान ।

फोकल इमेजिंग सेटिंग्स
Fluorophore उत्तेजना उत्सर्जन फ़िल्टर
तरंगदैर्ध्य लेजर तीव्रता
GFP (GCaMP सहित) ४८८ एनएम 2-5% eGFP या AlexaFluor ४८८
tdTomato ५५९ एनएम 5% AlexaFluor ५९४
Pi ५५९ एनएम 2% Pi
Hoechst ३३३४२ ४०५ एनएम 1% DAPI
NBDG ४८८ एनएम 70c eGFP या AlexaFluor ४८८
सी12 558/568 BODIPY ५५९ एनएम 1% AlexaFluor ५९४
TMRM ५५९ एनएम 3% Rfp

तालिका 4. 2-4 आंकड़े में प्रस्तुत फ्लोरोसेंट मार्करों और रंगों के लिए इमेजिंग शर्तों ।

Figure 1
चित्र 1. ताजा zebrafish रेटिना स्लाइसें तैयार करने के लिए योजनाबद्ध । (क) काटना दूर eyecup, और लेंस और श्वेतपटल (कदम 2.4.1.) को त्यागें । (ख) eyecup को तीन टुकड़ों में काट लें; छोटा किनारा टुकड़ा (step 2.4.2.) छोड़ें । (ग) फिल्टर पेपर (step 2.5.1.-2.5.2.) की ओर का सामना करना पड़ इनर रेटिना के साथ eyecup टुकड़ों के तहत खींचें फिल्टर कागज । (घ) फ़िल्टर कागज के माध्यम से नीचे बाती है रिंगर समाधान के लिए एक कागज तौलिया का उपयोग करके रेटिना समतल (कदम 2.5.3.), तो धीरे संदंश के साथ RPE शेष दूर छील (२.६ कदम) । फ़िल्टर काग़ज़ ऊतक स्लाइसर चरण पर टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में ले जाएं और ४०० µm स्लाइस (चरण २.८., २.९.) काटें । (ङ) स्लाइस के साथ टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष हस्तांतरण और एक मोम या एक रिंगर समाधान की पेट्री डिश के लिए पेट्रोलियम जेली सीढ़ी (step 2.10.1.) । (च) ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष से सीढ़ी के लिए एक स्लाइस स्लाइड जबकि जलमग्न स्लाइस रखते हुए । (G) फ़िल्टर पेपर स्ट्रिप्स (black) ९० ° घुमाएँ और मोम या पेट्रोलियम जेली में फिल्टर पेपर के किनारों को दफनाने (steps 2.10.2.-2.10.3.) । एक सीढ़ी और स्लाइस के साथ भरी हुई अंतिम इमेजिंग चैंबर की (एच) योजनाबद्ध. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. फिल्टर कागज और कोशिका व्यवहार्यता के लिए उचित आसंजन प्रदर्शित ताजा zebrafish रेटिना स्लाइसें के उदाहरण. (क) एक पेट्रोलियम जेली सीढ़ी में ताजा रेटिना स्लाइस की Brightfield छवि । स्लाइस द्वितीय और तृतीय अच्छा आसंजन और अनुप्रस्थ रेटिना परतों प्रदर्शित करते हैं । स्लाइस मैं और iv पर्याप्त RPE बनाए रखा है, या उच्च घुमावदार और अच्छी तरह से नहीं कर रहे है फिल्टर कागज का पालन किया, और छवि नहीं होना चाहिए । स्केल बार = २०० µm. (B) ट्रांसजेनिक zebrafish से एक ताजा रेटिना स्लाइस का टॉप-डाउन जेड असेंबल करना कोन photoreceptors (टीजी (gnat2: eGFP)16) में eGFP व्यक्त करता है । Hoechst डाय लेबल केलेली नाभिक; propidium आयोडाइड (PI) counterstaining लेबल मृत कोशिकाओं के नाभिक, जो स्लाइस की कट एज के पास दिखाई देते हैं (बाएं) । Z-स्टैक चरण आकार = 1 µm; स्केल बार = 20 µm. फ्लोरोसेंट इमेजिंग शर्तें तालिका 4में उल्लिखित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. ट्रांसजेनिक वयस्क zebrafish से डबल और ट्रिपल-लेबल पूर्व vivo रेटिना स्लाइस का नमूना फोकल छवियां । (क) दो रंग इमेजिंग योजना को रोजगार ट्रांसजेनिक GFP टैग endoplasmic जालिका शंकु में (टीजी (gnat2: calr-GFP)17, शीर्ष) Hoechst परमाणु counterstain (नीला, नीचे) के साथ । (ख) GFP (टीजी (gnat2: LifeAct-GFP)18, Hoechst नाभिकीय counterstain (नीला, नीचे) के साथ शीर्ष) शंकु में actin टैग की गईं । (ग) आरएफपी लेबल म्यूलर कोशिकाओं (टीजी (GFAP: tdTomato)19, शीर्ष) एक zebrafish फेड फ्लोरोसेंट ग्लूकोज (NBDG) शंकु20,21 (हरे, नीचे) में ग्लूकोज का प्रदर्शन से । (यह छवि Kanow, एट अल के चित्र बी से है । 21) (D) डबल ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करते हुए थ्री-कलर इमेजिंग का उदाहरण । वाम, आरएफपी लंबी तरंग दैर्ध्य शंकु photoreceptors (टीजी (trβ2: tdTomato)2) को लक्षित । केंद्र, कैल्शियम GCaMP photoreceptor mitochondria (टीजी (gnat2: मिळो-GCaMP3)22) को लक्षित । ठीक है, tdTomato (रानी), मिळो-GCaMP (हरा), और Hoechst नाभिकीय counterstain (नीला) की छवियों मढ़ा । छवियां अधिकतम तीव्रता Z-एक 7 µm ऊतक गहराई से अधिक 9 फ्रेम के अनुमानों रहे हैं; स्केल पट्टियों का प्रतिनिधित्व 10 µm. फ्लोरोसेंट इमेजिंग शर्तें तालिका 4में उल्लिखित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. Ca2 + GCaMP और नियंत्रण eGFP के साथ इमेजिंग. (क) ताजा रेटिना स्लाइस के प्रतिनिधि छवियों फ्लोरोसेंट सीए2 + (gnat2: GCaMP32, शीर्ष) या शंकु photoreceptors में eGFP (नीचे) GCaMP. बाएं, बेसलाइन पर स्लाइस; सही, स्लाइस 2 मिनट Na के बाद+ isotonically इमेजिंग चैंबर से समाप्त हो गया था छिड़काव का उपयोग कर एक Tris आधारित है रिंगर समाधान है, जो जाल सीए2 + में photoreceptors. स्केल पट्टियां = 10 µm. फ्लोरोसेंट इमेजिंग शर्तें तालिका 4में उल्लिखित हैं । (ख) एक photoreceptor डिब्बों (बाहरी क्षेत्रों, कोशिका निकायों, और synapses) के प्रतिदीप्ति परिवर्तन का मतलब है ना+ कमी की समय चूक इमेजिंग के दौरान । स्लाइसें हर 10 एस imaged थे, ढेर ImageJ का उपयोग कर संसाधित किया गया, और GCaMP या eGFP के प्रतिदीप्ति को झिल्ली डाई से संकेत सामान्यीकृत था । ठोस रेखाएं, GCaMP (बाहरी खंडों के लिए n = 15, कक्ष निकाय = 24, synapses = 26); डैश्ड रेखाएं, eGFP (बाहरी खंडों के लिए n = 26, कक्ष निकाय = 20, synapses = 31) । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ताजा zebrafish रेटिना स्लाइस की पूर्व vivo इमेजिंग photoreceptor जीव विज्ञान20,21,22के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी उपकरण साबित हो गया है, और है कि यह एक परिपक्व में एकल कोशिकाओं का विश्लेषण, पूरी तरह से सक्षम बनाता है में अद्वितीय है विभेदित रेटिना । अभ्यास के साथ, यह भी रेटिना के एक ही भाग से धारावाहिक स्लाइस का उपयोग कर, एक ही मछली से ऊतक के साथ कई प्रयोगों का संचालन करने के लिए संभव है. चुनौतियों और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन के लिए amphibian रेटिना स्लाइस की तैयारी के बारे में सुझाव के अलावा14, इमेजिंग प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण विचार हैं ।

photoreceptors के लिए, सेल व्यवहार्यता आम तौर पर कक्ष आकृति विज्ञान के साथ संबद्ध है, तो यह नाजुक रेटिना न्यूनतम संभाल करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से RPE हटा दिया गया है के बाद. टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए ध्यान से क्षैतिज स्लाइसर चैंबर (चित्रा 1F) से दूर टुकड़े करने के लिए उंहें सीढ़ी के लिए स्थानांतरण के बजाय सीधे ऊपर स्लाइस उठाने, और हमेशा के लिए है घंटी समाधान में डूबे स्लाइसें रखो । यदि संभव हो तो, परिवहन के दौरान मिलाते से स्लाइस को नुकसान को कम करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप के पास रेटिना स्लाइस की सीढ़ी को इकट्ठा ।

फिल्टर कागज करने के लिए रेटिना ऊतक के मजबूत आसंजन स्लाइसें कि इंजेक्शन या छिड़काव प्रयोगों के दौरान स्थिर रहेगा बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । केवल इमेजिंग (चित्र 2a) से पहले आकृति विज्ञान और स्थिरता के लिए प्रत्येक स्लाइस को सावधानीपूर्वक निरीक्षण करना आवश्यक है; धीरे माइक्रोस्कोप तालिका दोहन जबकि फोकल नेत्र लेंस के माध्यम से टुकड़ा आंदोलन को देखने के एक विशेष टुकड़ा की स्थिरता का पता चलता है । सावधानियों के बावजूद, जेड में बहाव-दिशा इंजेक्शन या छिड़काव के दौरान विश्लेषण के लिए चुनौतियां मौजूद कर सकते हैं, इसलिए यह झिल्ली और mitochondria के लिए lipophilic रंजक के रूप में एक नियंत्रण डाई, लोड करने के लिए, छुरा के लिए एक पहचाने जाने योग्य कोशिका संरचना लेबल उपयोगी है सामान्यीकरण (चित्र 4a, रानी). यदि स्लाइस प्रवाह > 10 µm Z-दिशा में यह उपयोगी एकल-कक्ष डेटा को निकालने के लिए संभव नहीं हो सकता है । X-Y दिशा में मध्यम बहाव ImageJ (RRID: SCR_002285) के लिए MultiStackReg जैसे पंजीकरण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पोस्ट-प्रोसेसिंग में ठीक किया जा सकता है ।

photobleaching इमेजिंग के दौरान हो सकता है, हालांकि स्थिर स्थितियों के अंतर्गत, रेटिना स्लाइस में मार्कर के प्रतिदीप्ति स्थिर रहना चाहिए । देखभाल लेजर तीव्रता, स्कैन गति, और फ्रेम दर जैसे मापदंडों को परिष्कृत करके समय चूक के दौरान लेजर जोखिम को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए । इमेजिंग नियंत्रण प्रत्येक फ्लोरोसेंट मार्कर इस्तेमाल के लिए सिफारिश कर रहे हैं । नियंत्रण इंजेक्शन या perfusing रिंगर अलग प्रयोगों में औषधीय एजेंटों के बिना समाधान शामिल है, या गैर के साथ इमेजिंग प्रयोगों का आयोजन--संवेदी मार्करों कि fluoresce constitutively.

फोकल उत्तेजना लेजर के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है, RPE में pigments autofluorescence के लिए योगदान और भी इमेजिंग के दौरान गर्मी उत्पंन कर सकते हैं, तो यह टुकड़ा करने की क्रिया करने से पहले इस ऊतक के सबसे हटाने के लिए महत्वपूर्ण है । अंधेरे अनुकूली पशुओं RPE को हटाने में एड्स, जबकि अंतर्निहित रेटिना को नुकसान को कम करने । छवि के लिए अक्षमता RPE इस टुकड़ा तैयारी की एक सीमा है, हालांकि यह एक पारदर्शी RPE के साथ albino जानवरों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है । एक और सीमा है कि रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं और म्यूलर कोशिकाओं के अंत पैर फिल्टर कागज से देखने से अस्पष्ट हो सकता है; एक वैकल्पिक तैयारी रेटिना के रूप में फ्लैट फिल्टर कागज पर नीचे photoreceptor पक्ष के साथ घुड़सवार और फिर अंतरतम रेटिना की एक स्पष्ट दृश्य प्रदान करने के लिए कटा हुआ हो सकता है । यह भी नोट करना महत्वपूर्ण है कि कुछ कक्षों के लंबे क्षैतिज अनुमानों, जैसे चौड़े फ़ील्ड amacrine कक्षों, विच्छेदन या टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान गंभीर हो सकते हैं । एक अंतिम सीमा है कि कई फ्लोरोसेंट रंजक photoreceptor बाहरी क्षेत्रों में विशेष रूप से जमा है, तो रेटिना के इस भाग के लिए यह उचित है के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग के बजाय संकेतक रंजक का उपयोग करें ।

उपलब्ध फ्लोरोसेंट सेल रिपोर्टर की विस्तृत श्रृंखला को देखते हुए23,ऊतक के लिए24 और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट zebrafish2,3,4में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया संवेदी 5, इस स्लाइस तैयारी कई रेटिना सेल प्रकार में अनेक जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( चित्रा 3, चित्रा 4) में उदाहरण देखें. इमेजिंग ताजा रेटिना स्लाइस लाइव सेल सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग भी एक उपसेलुलर स्तर पर रेटिना समारोह और स्वास्थ्य के लिए रोमांचक नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है । इसके अलावा, इस विधि माउस रेटिना स्लाइसें के पूर्व vivo इमेजिंग25के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । जबकि ताजा रेटिना स्लाइस की सफल तैयारी अभ्यास की आवश्यकता है, यह एक शक्तिशाली उपकरण है कि एक परिपक्व रेटिना में सेल विशिष्ट जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए उपयोगी है.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल विकसित करते हुए, और ईवा Ma, एशले जॉर्ज और गेल Stanton स्थिर ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की पीढ़ी के लिए राल्फ नेल्सन और डैनियल Possin विचारशील मार्गदर्शन के लिए धंयवाद । इस कार्य को NSF GRFP २०१३१५८५३१ से M.G., NIH नेि 5T32EY007031 को W.C. और M.G. को, और EY026020 को J.H. और S.B. को समर्थन दिया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

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References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
  3. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  4. Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
  5. Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
  6. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  7. Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
  8. Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
  9. Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
  10. Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
  11. Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
  12. Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
  13. Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
  14. Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
  15. Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
  16. Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
  17. George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
  18. George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
  19. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  20. Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
  21. Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
  22. Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
  23. Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
  24. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
  25. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).

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<em>पूर्व Vivo</em> इमेजिंग प्रयोगों के लिए वयस्क Zebrafish से ताजा रेटिना स्लाइस की तैयारी
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Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

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