Summary
網膜組織を撮像すると、従来の生化学的方法から収集することはできません単一セル情報が提供できます。このプロトコルでは、共焦点レーザー顕微鏡のゼブラフィッシュの網膜スライスの準備について説明します。蛍光遺伝子センサーをエンコードまたはインジケーター染料網膜細胞の多数の生物学的過程の可視化を許可します。
Abstract
網膜は、開始し、ビジョンの最初のステップを統合する複雑な組織です。網膜細胞の機能不全はまばゆいばかりの多くの病気の認刻極印、細胞は正常にどのように異なる網膜について基礎的な理解にかかっている未来の療法。網膜細胞環境で特定の細胞のタイプの貢献が減少されるため、生化学的な方法でそのような情報を得ることが困難に証明しています。ライブ眼底イメージングは、細胞レベルで、遺伝子にエンコードされた蛍光バイオ センサーの増加のおかげで、多数の生物学的プロセスのビューを提供できます。ただし、この手法については、オタマジャクシやゼブラフィッシュ幼虫、孤立した網膜の最も外側の網膜層または生きている動物の網膜の低解像度画像に制限されていますこれまで。共焦点顕微鏡を介してライブ イメージングのための大人のゼブラフィッシュからライブ前のヴィヴォ網膜スライスを生成する手法をご紹介します。この準備には、網膜のすべてのレイヤーと灌流を用いた共焦点イメージング実験を実行するため目に見えるほとんどの携帯型横スライスが得られます。トランスジェニックゼブラフィッシュ表現する蛍光タンパク質や特定の網膜細胞の種類や細胞内小器官のバイオ センサーを使用して、そのまま網膜から単一セル情報を抽出します。さらに、網膜のスライスは、蛍光指示薬染料、メソッドの汎用性を追加することでロードできます。このプロトコルは、Ca2 +ゼブラフィッシュ錐体視細胞内のイメージングのため開発されましたが、Ca2 +やミュラー細胞、バイポーラと水平細胞、ミクログリア、アマクリン細胞や網膜の代謝産物を測定する適切なマーカーを合わせることができます。神経節細胞。網膜色素上皮細胞は、このメソッドはそのセル型の勉強に適してないので、スライスから削除されます。実際には、複数の実験の 1 つの動物からシリアル スライスを生成することが可能です。この適応手法は、網膜細胞生物学、Ca2 +、およびエネルギー恒常性について多くの質問に答えるための強力なツールを提供します。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、広く医療や基礎科学研究1, その小さなサイズ、急速な発展と脊椎動物の器官系のために使用となっています。遺伝子導入のための確立された方法と組み合わせてゼブラフィッシュ幼虫の自然の透明性は、生きている動物の細胞プロセスの詳細な可視化を可能にしました。遺伝的コード化蛍光バイオ センサーの数は、特定のゼブラフィッシュ細胞 Ca2 + 2過酸化水素3、アポトーシス活性化4 ATP5検知する対象となっています。
ゼブラフィッシュ幼虫のin vivoイメージング脳回路6のマッピングを含む、神経科学の分野でブレークスルーをもたらしたし、中枢神経系治療薬の開発の障害7。ゼブラフィッシュは、網膜機能層構造と高等脊椎動物の神経型、彼らは堅牢な視覚的な動作8,9を表示するためにビジョンの研究に適しています。人間の病気に類似している網膜変性のいくつかの種類を正常にモデル化されているし、ゼブラフィッシュ10,11, 個々 の視細胞変性網膜2、内のライブ イメージングなどで勉強 12。
ゼブラフィッシュ稚魚イメージング体内の貴重なツールですが、いくつかの薬理学的治療は、全体の動物を超えることはできませんし、魚が成長し、色素沈着を開発より困難となります。さらに、特定の細胞プロセス変更開発と年齢、後の時間ポイント理解機能と病気の進行に重要な大人の動物。イムノブロット、quantitiative PCR、O2消費、メタボローム解析などの生化学的な方法は、全体として網膜の生物学についての重要な手がかりを提供できますが、貢献によって影響を受ける個々 のセルの種類を見分けることは困難です。病気。これらの問題をバイパスする前のヴィヴォ孤立した網膜組織イメージングとイメージング フラット マウントされた網膜が外側の網膜13のビューを提供より深い内部の網膜の機能が隠されています。横網膜スライス、すべてのレイヤーおよびセルの種類を明確に表示を有効にするが、正常機能と疾患に関与する動的なプロセスの 1 つのスナップショットを提供するだけもので免疫組織化学的解析を固定します。
ここでは、イメージングのための大人のゼブラフィッシュから横網膜スライス前のヴィヴォを生成する手法を提案する.それは電気生理学的・形態学的研究14,15、時間経過前のヴィヴォ共焦点を使用してイメージングの重要な変更との水陸両用機およびゼブラフィッシュ網膜スライスを準備するための方法と同様顕微鏡検査。バイオ センサーやスライスで染料の蛍光反応は灌流を用いた薬理学的エージェントを提供しながら、共焦点顕微鏡を用いたリアルタイムで監視されます。メソッドは、光受容体イメージングのため開発された、適切な蛍光マーカーとミュラー細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、または網膜神経節細胞を可視化するために使用する実行可能な場合があります。さらに、スライスは、レポート セル実行可能性、小胞輸送、ミトコンドリア機能または酸化還元状態に細胞膜透過性の蛍光染料をロードできます。この多目的な準備は、Ca2 +動態、シグナル伝達、代謝の状態など、網膜全体の細胞プロセスの広い範囲の可視化をことができます。
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Protocol
すべての動物実験は、ワシントン機関動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されました。
1. 動物および装置の準備
注: 網膜色素上皮 (RPE) は、組織の周囲が色素沈着することができます網膜機能を隠すし、損傷組織と共焦点イメージングex vivoの網膜の外側の暗いシートです。暗闇の中、ゼブラフィッシュの網膜色素上皮は網膜から離れて撤回されました。暗闇は、スライスとイメージングの前に網膜から RPE の将来の除去を容易にするために魚を適応させます。
- 魚の水で満たされた産卵水槽に魚を転送暗い生地と産卵槽をラップや、暗いキャビネットに配置キーを押します。
- 暗闇は、ゼブラフィッシュ網膜から完全に分離、RPE の近くを許可する安楽死の前に少なくとも 1 時間を適応します。作品は視細胞間介在に残ることがありますが、30 分の暗順応はほとんど RPE を削除するための十分です。
- メルト 〜 石油の 15 mL ホット プレート上 50 mL ビーカーのゼリー寄せ、3 mL スリップ チップ注射器に液体の 3 mL を描画します。注射器を反転、試験管ラックに配置し、冷却するワセリンを許可します。
- プレーン 7 cm X 2.5 cm 顕微鏡のスライドの再利用可能なスライスの商工会議所を作る。
- 明確なマニキュア、スライドの中央に 3 cm × 2.5 cm の長方形を作成するペイントの細い線を使用して、乾燥することし、ラインに爪のポーランド語の別の層を追加します。
- イメージ投射の間のスライスを保持するカバー スリップのイメージングのはしごを準備します。スライスは、梯子の「段」になります。
- 静的な画像または最小限のソリューション フロー注入実験、ワセリン 18 mm 正方形のガラスのカバー スリップ上の 2 つのフラット ワイド ・ パラレル ストリップから成る石油ゼリーはしごを作る。注射器を使用して 2 つの平坦化を適用する ~ 1 cm 長い冷却ワセリン 0.5 cm カバー スリップ上離れて塗抹標本。
- 組織スライサーを準備します。
- エタノールと両刃かみそりの刃を清潔乾燥できるように空気に。それの四分の一にハサミでカット、まず縦半分にし、各ブレードの間で。
- 組織スライサーのステージにスライスのチャンバーを配置、ステージの中央に水平方向に配置の永久的なマーカーで、長い方の端をマークします。
- 組織スライサー アームにブレード セクションをロード、マニキュア液に触れることがなく、スライド上にフラットで中央揃え刃あるを確認し、ゆっくりブレード装置を締めます。低く調整ノブ ¼ によるブレード アーム ターン、イメージング室とテスト センターのフィルター紙の切れ端にそれをカットし、場所。紙を完全に切らない場合、は、ブレードを再マウントします。
- 10 cm のシャーレで冷却ゼリーに石油の 1 つの小さなドットを配置、注射器を使用して 〜 1.5 cm の中心の右に。上向きワセリンと鉗子を使用して、画像のはしごを押します。別の小さなワセリン ドットを作る ~ イメージング室の入口端から 1 cm。
- 20 g 針でワセリン注射器に合わせて、それの上限を取り除きます。注射器に針を押し、スライスの商工会議所の中央に縦のゼリーに石油の 2 つの 1 cm の細長い平行ストリップをするために使用します。ストリップの空間 〜 1 cm。
- 中心をラップすることによって再利用可能なワイヤー目ループ ツールを作る、〜 4 cm のペアに 30 g タングステン ワイヤのセグメントは一度しっかりと鉗子を閉鎖。それは通常ゼブラフィッシュの目よりも少し大きめまで鉗子を上下にワイヤーをスライドさせて、ループの直径を調整 〜 2-3 mm。 ワイヤの両端をねじり、研究所テープを使用して 6 cm の木の棒の端にそれらを確保。
- リンゲル液を準備します。
- サプリメント原液 (表 1) X 50 を解凍し、追加実験; 朝 HEPES バッファー、非重炭酸リンゲル液 (表 2) に新鮮です200 μ L サプリメント リンゲル液円錐形遠心分離機管または滅菌ガラス瓶内のすべての 10 mL の原液を希釈します。静的なイメージング実験用リンゲル液実験あたりの少なくとも 30 mL を準備します。リンゲル液灌流実験に必要な量は流量と総試験時間が異なります。
- チェック補われた溶液の pH は、7.4 デジタル pH プローブまたは ph 試験紙を使用しておよび調整をそれに応じてと希薄水酸化ナトリウムや塩酸。
- 標準医療用酸素タンクとホース装備のレギュレータを使用して少なくとも 5 分間の 100% 酸素ガスをバブリングによって氷の上補われたリンゲル液に酸素または灌流に使用される省略可能なバブラー ガスマニホールド。封印された円錐形遠心分離機管または滅菌ガラス瓶の解剖顕微鏡; 近くの氷の酸素リンゲル液を格納します。解離、イメージング、染料や薬剤を希釈するなどは、このソリューションを使用します。
- 他のソリューションは、Na+などの実験で使用している場合-無料のリンゲル液 (表 3), 1.9.1.-1.9.3 の手順を繰り返します。
- ペトリ皿、鉗子、マイクロ剪刀、解剖顕微鏡の近くの他のツールを収集し、ゼブラフィッシュ安楽死のため魚水氷浴を準備します。
2. 網膜スライス (図 1参照) を準備します。
- (ことができる RPE スティックよりしっかり網膜に) 明順応を抑える赤のアンビエント ライトの下での作業は、氷浴浸漬によるゼブラフィッシュを安楽死させるタッチ応答がなくなるまで、通常 1-2 分のシャーレに魚を転送し、メスを使用します。占拠脱臼しますが、ない魚の首をはねます。
- ワイヤー ループを使用して、1 つの眼の周りの結合組織を緩め、1 つの手の前方ループで軽く目を引き出します。マイクロ剪刀を使用すると、もう一方の手で、目の下、目の後ろを切らないように気を取って白い視神経をカットします。
- 氷の上寒いリンゲル液のシャーレに鉗子を使用して目を転送し、2 番目の目を繰り返します。暗闇の中で、赤い光の下で、網膜色素上皮は網膜から削除されるまで、目をしてください。
- シャーレの明白なガラス スライドの冷たいリンゲル液のドロップで低消費電力解剖顕微鏡の下でアイカップを解剖します。
- 微細鉗子で角膜を貫通し、クリアの部分を慎重に取り外します脆性角膜とピンセットやハサミで銀色の強膜。削除し、レンズと強膜のほとんどを破棄 (図 1A参照)、最小分離のアイカップを処理。
- 強と黒の RPE の小さなビット脂肪の部分は、アイカップに接続したままにすることができます、後で網膜から削除します。網膜は、2.4.1 の手順で RPE と分離している場合は、繊細な孤立した網膜に損傷を与えることは特別な注意を使用して同じ手順に進みます。
- スライドで、アイカップを (RPE) を開いている側を置き、3 分の 2 または 1 つの動きで新鮮なシングル エッジかみそりの刃の四分の一にカット (図 1B参照)。大きくカーブした組織の部分を破棄します。
- ろ紙上フラット マウント網膜。
- リンゲル液ろ紙の部分をウェットし、アイカップ部分の横にあるスライド上に置きます。それを穿刺を避けるために、そのままろ紙を処理するときに、フラット鉗子を使用します。ろ紙と組織の両方をカバーする冷たいリンゲル液を追加します。
- 網膜色素上皮と視細胞が上向き、つまり上向き目の後ろで各アイカップ部分下にろ紙をドラッグして鉗子を使用すると、それぞれの手で、慎重に。フィルター ペーパーの中央に合わせてシングル ライン アイカップ部分の位置 (図 1を参照)。端または隅近くのみ微細鉗子で優しくアイカップ部分を処理します。
- 3 乾燥したペーパー タオルの上に、ろ紙を配置網膜フィルター ペーパーに付着し、下方の水分を芯が s ドライになる組織を聞かせて。アイカップ部分うそろ紙上に平らまでを繰り返します。網膜を平らにするフィルター紙の下側に穏やかな吸引を適用することができますが、この手順は必須ではありません。
- アイカップ部分に RPE の黒シートが残っている場合そっと離れて 1 つから始まってそれの皮をむく微細鉗子を使用して組織は、リンゲル液のドロップに座っている間 (図 1を参照) をコーナーします。べきである網膜のろ紙、リピートから 2.5.3 の吸湿発散性のステップを持ち上げます。網膜は、無漂白の視覚顔料のためピンク表示ことがあります。
- 網膜剥離とフラット最初のフラット マウントをしている網膜冷たいリンガー液中に浸漬に対応する場合も 2 の目を 2.4 から 2.6 の手順のマウントを繰り返します。スライス手順を効率化するため両方の網膜の部分を 1 つのフィルター ペーパーに置かれるかもしれません。RPE を削除すると、プロトコル行えます通常の部屋の光の下で実験が闇を必要としない限り。
- スライドにろ紙を置き、残してシングル エッジかみそりの刃を四角形にトリミング 〜 網膜の線の両側にろ紙の 0.5 cm。フィルター ペーパーを準備されたスライス商工会議所に移動、長いフィルター紙端を薄くワセリン鉗子、線路に押し込み、冷たいリンゲル液の 3-4 滴で網膜を浸します。
注: 脂溶性色素などのいくつかの染料は、スライスする前にこの段階でフラット マウントにロード最高されます。これらに読み込まれたり、ティッシュ、離れて邪悪なスライスの商工会議所で洗浄します。例えば、C12 558/568 BODIPY 激しく網膜汚れ細胞膜と視細胞外側セグメント (図 4 aを参照してください) に読み込まれるとき ~ 5 μ G/ml 室温 (通常 23 から 27 ° C) で 15 分の余分なリンガー液で洗浄後. - スライスの商工会議所を組織スライサー ステージに転送、マークの線に沿って長いエッジの位置、セキュリティで保護された商工会議所は、研究所テープを舞台の終了します。1 つの端から、網膜とスライスの腕にしっかりした、穏やかな圧力を使用してフィルター紙をカットします。最初のスライスを完全に切ったことを確認して、マイクロメータをカットする ~ 400 μ m のスライス。
- イメージングのはしごを組み立てます。
- 場所ステップ 1.7 イメージングに隣接してからシャーレに網膜切片スライス チャンバー内はしご (図 1E参照)。その内容が水没する冷たいリンゲル液で皿を満たし。
- 鉗子を使用して、水中のスライスを維持、優しくペトリ皿を左から右にスライドさせ、ろ紙と網膜のストリップを転送のはしご。網膜に直接触れないように注意してください。スライスを回転 90 ° とワセリンでろ紙の端を埋めます。
- 網膜の層が解剖顕微鏡の下ではっきりと見えるように鉗子ではしごで網膜スライスを細かく配置 (図 1を参照)。はしごの各端にスライス、注射や流れの中に組織の動きを最小限に抑えるため他のスライスの方組織が内側向いていることを確認します。任意の網膜スライスを破棄、ろ紙に付着した (図 2 a参照)。
- 希望する場合は、この段階で網膜スライスに染料をロードあり、イメージングの前に余分なリンゲル液で洗います。
注: Propidium ヨウ化 (PI) とヘキスト 33342 堅牢染色、死者のすべての細胞の核それぞれ (図 2 bを参照)、室温で 20 分間 5 μ G/ml で網膜スライスと孵化させるとき。Tetramethylrhodamine (TMRM) に蓄積 1 で培養したときの網膜を通して積極的に respiring ミトコンドリア室温で 30 分間 nM。 - スライスは、染色、観察室と射出装置を準備します。リンゲル液でチューブをフラッシュし泡をパージ、イメージング室入口に管の開放端を添付し、活栓を閉じるに注射器を使用します。注射器を削除し、注入の reagent(s) でそれを埋める、チューブを取り付けます。
- 鉗子を使用してイメージング室の入口の端に近いゼリーに石油のドットに、coverslip を押すとイメージング室に網膜スライス coverslip を転送する (図 1 H参照)。リンゲル液のスライスをカバーするために部屋を入力します。
3. イメージング網膜スライス
- レンズを浸漬 20 または 40 X 水を搭載した直立した共焦点顕微鏡のステージ上接続されている噴射装置と塗りつぶされたイメージング室を配置します。ステージ クリップとイメージングのチャンバーを固定します。
- はしごの傾斜レンズを下げるし、trans 照らされた薄明かりの下ではしごの 1 つの端にスライスに焦点を当てます。各スライスの横方向、視細胞外側セグメントとフィルター ペーパーに安心の密着性の存在を確認します。
- タイムラプス イメージングのための最高のスライスを選択し、時間経過イメージ獲得のため顕微鏡のソフトウェアを構成します。表 4では、通常、様々 な蛍光マーカーと染料のイメージング設定をについて説明します。
注: 画像集録レートは、顕微鏡や蛍光マーカー、研究されている生物学的プロセスによって異なります。たとえば、GCaMP3 と赤い色素と光受容体のカルシウム動態のイメージングのため 800 x 800 ピクセルの解像度、2 μ s/ピクセル スキャン速度、および 10 秒のフレーム レートを使用します。- 利用可能な場合は、ソフトウェアを使用してスライス (視細胞外側セグメント、細胞体、核) 時間経過の間に潜在的な向きかえのための物理的なランドマークをトレースします。またスライスにまたがるリアルタイム蛍光を監視するソフトウェアを設定します。
- イメージングを開始し、ベースラインの蛍光をモニターします。スライスで蛍光が (通常 2-5 分) 内で安定するとき実験を続行します。注入の注射器の活栓を開いて、ゆっくりと抑制し、2 回混合を支援するためにプランジャーを引きます。
注: たとえば、protonophore イメージングの商工会議所の 1 μ M の最終濃度に到達する CCCP の濃厚溶液を注入することでミトコンドリアの機能を廃止します。これは、堅牢な Ca2 + GCaMP、によって報告された光受容体の細胞質でのバースト、TMRM によって報告されたミトコンドリア膜電位の着実な減少を誘導します。 - 密接に、実験中にドリフト用のスライスを監視し、ソフトウェアを使用して物理的なランドマークによるとマイクロ調整。通常射出中に Z 方向にドリフトや灌流は < 5 μ m。
4. イメージング ソリューションを変更または継続的に流れていた灌流実験中に網膜スライス
注: 網膜イメージング ソリューションが変更される灌流実験中にスライスまたは継続的に流れていた、以下の変更、静的画像処理や注入実験のセットアップに似て。
- 1.4 の手順に記載されている、石油ゼリーはしごではなく網膜スライスが水溶液中に安定した保持するのにより丈夫なワックスはしごを使用します。
- 味付けされていない歯科用ワックスの小さな円柱を配置 〜 0.5 cm 上を離れて。平らな面に各シリンダーをダウンして、カバーガラスの平行エッジに向かって押して親指を使用します。両方をスコア #1 coverslip で水平方向に平坦化されたシリンダー (図 1E、右側にあるを参照してください)、ヘラでワックス ストリップ間ゼリーに石油の薄層を中傷します。
- 2.10.2 の手順でイメージングのはしごの組み立て、微細鉗子 (図 1) を使用してワックス スコアにスライスしたろ紙の端を押します。
- 手順 2.12 で灌流をセットアップする、preoxygenated ソリューションは、シリンジの貯水池を埋めるか酸素各タンクのソリューションにオプション ガスマニホールドを使用します。フラッシュ、リンゲル液ですべてのチューブは、すべての行を開いたときの流れし、大きな泡を削除を確認します。
- 2.13 の手順で部屋を充填する前に、各露出コーナー フロー中に横方向にスライドからそれを防ぐためにカバーガラスの上ゼリーに石油のドットを配置するのに注射器を使用します。
- イメージング室はいっぱいになり顕微鏡ステージ上にマウント、アスピレータをオンに、吸引器のチューブを接続します。リンガーの液の流れをテストし、商工会議所がオーバーフローする前にに液体の少量が描画される流出室の上吸引チューブを位置づけるマイクロポジショナーを使用 (通常 〜 2 mL/分の流量の溶液表面より 1 mm 上)。手順 3.4 でスライスを選択しながら流れるリンゲル液を維持します。
- 灌流の 3.4 の手順で実験を行うには、2 番目のソリューションの開いている間最初のソリューションの活栓を閉じることによって溶液の流れを切り替えてください。
- たとえば、イメージングの商工会議所から細胞外 Na+を使い果たす、リンゲル液ソリューションまたは Na+で満たされた 2 つのシリンジ貯水池を使用-無料の解決策 (表 3)。リンゲル液のベースラインを確立し、Na+に切り替える流れ-無料のソリューション。これは、結果、大規模な細胞内 Ca2 +視細胞外側セグメントの増加と細胞体 (図 4を参照)。
- 重力供給灌流システム、一定の流量はイメージ投射の間各貯水池のソリューションのレベルを監視します。酸素ソリューションは、必要に応じて貯水池オフ先頭または連続的な酸素ガス マニホールドのバブルを維持します。
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Representative Results
安定したポジショニングとスライスの横方向は、注入または灌流薬理学的エージェントの成功イメージング鍵です。慎重に確認し、網膜のすべてのレイヤーが表示されます (図 2 a、スライス ii) ことを確認するために必要な共焦点レーザー顕微鏡の前にスライスの位置を変更します。スライスを回転する場合 (図 2 a、スライス iii) を若干前方外側セグメントの束が表示されます、フォーカスに必要な網膜層をもたらすに鉗子で微調整を行うことができます。スライスは不十分な濾紙に付着した (図 2 a、私をスライス) または RPE を保持 (図 2 aiv をスライス) タイムラプス イメージング用は使用しないでください。
細胞の生理的過程前のヴィヴォ; 観察に重要です。細胞染色など propidium ヨウ化 (PI) は網膜スライス練習しながら細胞の健康を試金すること勧めします。すべてのスライスのカットのエッジ近く死んだ細胞はスライスに 5-10 μ m より深いながら、原子核 (図 2 b、左のパネル)、PI が蓄積されます、通常形態とない PI の染色と健康な細胞のイメージを作成することができます。たとえば、光受容体、切断端面の下の PI 否定的な細胞は通常、ステレオタイプの偏光、細長い形態 (図 2 b、右パネル) が表示されます。光受容体は網膜スライス酸素リンゲル液で格納されている場合、少なくとも 4 時間のために実行可能に残る。
遺伝子マーカーと染料の組み合わせを使用して、多くの網膜細胞構造を視覚化できます。ダブル、トリプルの蛍光標識と新鮮な網膜スライスの共焦点画像の例は、図 3に掲載されています。錐体視細胞核を基準にして小胞体 (ER) の動態を可視化、核染付 (図 3 a) コーン ER17を対象とした gfp 遺伝子導入魚から網膜スライスを counterstained することができます。アクチン細胞骨格アクチンの GFP 融合18 (図 3 b) を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュから網膜スライスを使用してを表示するのには、同様の戦略を用いることができます。別のセルに固有のプロモーターとミュラー細胞を赤色蛍光タンパク質 tdTomato19ラベルの付いたおよび網膜スライス (図 3、上部パネル) で視覚化できます。試金される生体内で蛍光ブドウ糖アナログ (NBDG)、網膜スライス21 (図 3、下部パネル) で表示されているセルに組み込むとなると口頭で gavaging アダルト ゼブラフィッシュ網膜へのグルコース取り込みができます。複数の細胞プロセスやコーンのサブタイプにおける Ca2 +動態など、タンデムでの細胞の種類を監視するダブル トランスジェニックゼブラフィッシュを用いることができます。図 3 Dは、tdTomatomitochondrially をターゲットとした Ca 2 +センサー (水戸-GCaMP) すべてのコーン22単位と長波長の円錐形2単位の実験では、このタイプのトリプル ラベル付けスキーム核の染色。
網膜細胞タイムラプス イメージングは、このスライスの準備の重要な利点です。例えば、円錐形の光受容体の細胞質の Ca2 +変動を観察し、図 4で示す実験薬理学的操作中に後で定量化できます。図 4 aは、Ca2 +センサー GCaMP2 (上) またはコントロール eGFP16 (下) 赤脂溶性色素 counterstained 錐体光受容体で表現する網膜のスライスを示しています。この実験では Na+は isotonically から枯渇、灌流を用いたイメージング室 GCaMP (図 4 a、上部パネル) を反映してゾル性細胞質 Ca2 +外側セグメントと細胞体が大幅に増加を引き起こします。網膜の蛍光スライス表現する Ca2 +-鈍感 eGFP です (図 4 a、下部パネル) この処理によって影響を受ける。時間経過の映画は、ImageJ ソフトウェアを使用して単一の円すいの外側セグメントや細胞体シナプス (図 4 b) から蛍光応答を定量化分析できます。
| ソリューションを補完します。 | ||
| 株式 * 濃度 (mM) x 50 | 使用濃度 (mM) | |
| D-グルコース | 500 | 10 |
| 乳酸ナトリウム | 50 | 1 |
| ピルビン酸ナトリウム | 25 | 0.5 |
| L-グルタミン | 25 | 0.5 |
| 還元型グルタチオン | 25 | 0.5 |
| アスコルビン酸 | 15 | 0.3 |
| * 保存-20 ° C で因数 < 6 ヶ月;リンゲル液に新鮮なを追加します。 | ||
表 1。50 X のコンポーネントは、原液および最終的な作業濃度を補います。
| リンゲル液 | |
| 濃度 (mM) | |
| 塩化ナトリウム | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 ·2 H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 ·6 H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| NaOH を使用して 7.4 に pH | |
| < 1 ヶ月滅菌ボトルに 4 ° C で保存します。 | |
表 2。標準リンゲル液の成分。
| Na+-無料のリンゲル液 | |
| 濃度 (mM) | |
| トリス | 147 |
| HCl | 120 |
| KCl | 1 |
| CaCl2 ·2 H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 ·6 H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH 7.4 HCl を使用するには | |
| < 1 ヶ月滅菌ボトルに 4 ° C で保存します。 | |
表 3。Na のコンポーネント+-無料のリンゲル液。
| 共焦点イメージングの設定 | |||
| 蛍光体 | 励起 | 排出フィルター | |
| 波長 | レーザ強度 | ||
| GFP (GCaMP を含む) | 488 nm | 2-5% | eGFP または AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| ヘキスト 33342 | 405 nm | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10% | eGFP または AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
表 4。蛍光マーカーの染料の図 2-4 を提示条件をイメージングします。
図 1。新鮮なゼブラフィッシュ網膜スライスを準備するスケマティック。(A)は離れて、アイカップを解剖し、レンズと強膜 (ステップ 2.4.1。) を破棄します。(B)は 3 つの部分にアイカップをカットします。小さなエッジ部分 (ステップ 2.4.2。) を破棄します。(C)は、フィルター紙 (ステップ 2.5.1.-2.5.2) に向かって内側の網膜にアイカップ部分の下でろ紙をドラッグします。(D)リンゲル液下方 (ステップ 2.5.3。)、フィルター ペーパーを通して芯に紙タオルを使用して Flatten 網膜優しくはがして鉗子 (ステップ 2.6) で RPE を離れて残り。組織スライサー ステージにろ紙をスライスの商工会議所に移動し、400 μ m のスライスをカット (2.8 を手順します。、2.9。)。スライス スライスと商工会議所とリンゲル液 (ステップ 2.10.1。) のシャーレにワックスやワセリンのはしご(E)移転(F)は、冠水したスライスを保ちながらはしごにスライスの商工会議所から単一スライスのスライドに微細鉗子を使用します。(G)回転フィルター紙 (黒) 90 ° をストリップし、ワックスやワセリン (手順 2.10.2.-2.10.3) におけるろ紙の端を埋めます。(H)最終的なイメージング室の模式図は、はしごとスライス読み込まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。新鮮なゼブラフィッシュ網膜の例スライスろ紙と細胞生存率を表示する適切な接着します。(A)ワセリンはしごで新鮮な網膜スライスの明視野イメージ。スライス ii および iii は、良好な接着性と横網膜層を表示します。スライス i と iv 実質的な RPE を保持しているか非常に湾曲した、ろ過紙ないよく付着としないイメージを作成する必要があります。スケール バー = 200 μ m の範囲(B)トップダウン Z 錐体光受容体 (Tg(gnat2:eGFP)16) 内を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュから新鮮な網膜スライスのモンタージュ。ヘキスト染料ラベルすべて核;propidium ヨウ化 (PI) counterstaining ラベル (左) のスライスのカットのエッジ付近に表示死んだ細胞の核です。Z スタック ステップ サイズ 1 μ m を =スケール バー = 20 μ m 蛍光イメージング条件は表 4で概説されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。サンプルの共焦点画像アダルト トランスジェニックゼブラフィッシュから網膜スライス前のヴィヴォダブルとトリプル ラベルします。(A)遺伝子 GFP を用いた 2 色イメージング方式はヘキスト核対比染色 (青、下) と錐体 (Tg(gnat2:calr-GFP)17, 上部) 小胞体をタグ付けされます。(B) GFP はヘキスト核対比染色 (青、下) と錐体 (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, 上部) アクチンをタグ付き。(C) RFP、ゼブラフィッシュから標識ミュラー細胞 (Tg(GFAP:tdTomato)19, トップ) 円錐形20,21 (緑、下) にグルコース取り込みを示す蛍光グルコース (NBDG) を与えられます。(この画像は図 2 bの Kanow、らから21) (D)ダブル トランスジェニックゼブラフィッシュを用いた 3 色画像の例。左、RFP の長波長の円錐形の光受容体 (Tg(trβ2:tdTomato)2) を対象とします。センター、カルシウム バイオ センサー GCaMP 円錐形の光受容体のミトコンドリア (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22) を対象とします。右、ヘキスト核対比染色 (青)、水戸 GCaMP (緑)、tdTomato (マゼンタ) の画像を重ねて表示されます。画像は 9 フレームの最大強度 Z 予測 7 μ m の組織の深さ;スケール バー表す 10 μ m 蛍光イメージング条件は表 4のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。Ca2 +イメージング GCaMP とコントロールの eGFP と。(A)蛍光 Ca2 +バイオ センサー GCaMP (gnat2:GCaMP32、トップ) を表現する新鮮な網膜スライスまたは錐体視細胞の eGFP (下) の代表的なイメージ。左、ベースラインでスライス右、Na+だった isotonically トラップ Ca2 +視細胞でトリス ベース リンガーの液の灌流を用いたイメージング室から枯渇後 2 分をスライスします。スケール バー = 10 μ m の範囲の蛍光イメージング条件は表 4で概説されます。(B)は、Na+枯渇のタイムラプス イメージング中に単一視細胞コンパートメント (外側セグメント、細胞体シナプス) の蛍光変化を意味します。スライスをイメージしましたすべての 10 s、スタックは、ImageJ を用いた処理され、GCaMP または eGFP の蛍光膜色素から信号を正常化しました。実線、GCaMP (外側セグメントの n = 15、細胞体シナプス 24 の = = 26);破線、eGFP (外側セグメントの n = 26、細胞体シナプス 20 = = 31)。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
新鮮なゼブラフィッシュ網膜スライスのex vivoイメージング光受容体生物学20,21,22を勉強するための多彩なツールがあると証明した、ユニークなことは完全に成熟した、単一細胞の解析を可能に差別化された網膜。練習では、網膜の同じ部分からシリアル スライスを使用して、1 つの魚からの組織と複数の実験を行うことが可能です。課題と電気生理学研究14両生類網膜スライスの準備などに関する提案に加え、イメージング実験に関する重要な考慮事項があります。
光受容体の RPE が削除された後に特に最低でも、繊細な網膜を処理する上で重要な細胞生存率が一般に細胞の形態と相関します。スライスした後まっすぐにスライスを持ち上げるのではなくスライスの商工会議所 (図 1 f) 梯子にそれらを転送するから水平方向にスライスを慎重にスライドさせて、常にリンゲル液に浸漬スライスする微細鉗子を使用します。可能であれば、網膜スライス輸送中の揺れからスライスへのダメージを最小限に抑えるための共焦点顕微鏡の近くのはしごを組み立てます。
濾紙に網膜組織の強い接着注入または灌流実験中でも安定したスライスの作成にとって重要です。形態と安定性 (図 2 a); をイメージングする直前の各スライスを慎重に検査する必要があります。特定のスライスの安定性を明らかに共焦点接眼レンズを通してスライスの動きを表示しながらやさしく顕微鏡テーブルをタッピングします。注入中に Z 方向にドリフトの注意、にもかかわらずまたは灌流することができます分析、課題を提示するコントロール色素をロード、脂溶性色素膜とミトコンドリアのために安定などラベルの識別可能なセル構造に便利ですので正規化 (図 4 aマゼンタ)。スライスは、Z 方向の > 10 μ m をドリフトする場合それは使用可能な単一セルのデータを抽出することが可能かもしれない。X、Y 方向に適度なドリフトは、ImageJ (RRID:SCR_002285) の登録ソフトウェア MultiStackReg などを使用して、後処理で修正できます。
イメージング中に退色が発生が静的な条件の下で網膜スライスにおけるマーカーの蛍光で安定してなければなりません。レーザー強度などのパラメーターを調整して、時間の経過中にレーザ露光を最小限に抑える、スキャン速度、およびフレーム レートに注意が必要があります。画像コントロールは、各蛍光マーカーの使用に適しています。コントロールには、注入または灌リンゲル液別実験薬理学的エージェントを使用せず恒常蛍光を発する非バイオ マーカー イメージング実験の実施が含まれます。
によって使用されている共焦点励起レーザー、RPE の顔料は蛍光に貢献できるし、スライスする前にこの組織の大部分を削除することが重要ですので、イメージング中にも熱を生成します。基になる網膜への損傷を最小限に抑えながら、RPE の除去 dark-adapting 動物のエイズ。これは透明な RPE とアルビノ動物を使用して克服することがありますが、RPE をイメージすることができないはこのスライス標本の制限です。別の制限は、網膜神経節細胞とミューラー細胞の最後の足がなるによって隠されることビューからフィルター ペーパー;代替の準備として、網膜は、フィルター紙の上を光受容側とマウントされ、最も内側にある網膜の明確なビューを提供するために、スライス フラットにあります。また、広いフィールド アマクリン細胞など、いくつかのセルの長い水平投影が郭清またはスライス中に切断されるかもしれない注意してくださいすることが重要です。最終的な制限は、網膜のこの部分にインジケーターの染料ではなく、遺伝子にエンコードされた使用バイオ センサーをお薦めしますので、このような多くの蛍光染料に蓄積特異的視細胞外側セグメントです。
組織の染料23,24使用可能な蛍光セル記者の広い範囲を与えられ、遺伝子ゼブラフィッシュ2,3,4、で正常に使用される蛍光バイオ センサーをエンコード5、いくつかの網膜細胞型 (図 3, 図 4の例を参照してください) で多数の生物学的過程を研究するこのスライスの準備をされる可能性があります。新鮮な網膜スライス生細胞超解像顕微鏡を用いたイメージングと、また、細胞レベルで網膜機能と健康にエキサイティングな新しい洞察を提供できます。さらに、このメソッドはマウス網膜スライス25 ex vivoイメージングのために適応することができます。新鮮な網膜スライスの成功の準備には、練習が必要ですが、それは成熟した網膜細胞固有の生物学的質問の広い範囲に対処するために役立つ強力なツールです。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
思いやりのある指導を安定したトランスジェニックゼブラフィッシュの行の世代のこのプロトコル、および Eva Ma、アシュリー ジョージとゲイル ・ スタントンを開発しながら、ラルフ ・ ネルソンとダニエル Possin に感謝します。仕事は、m. g. w. c. と m. g.、NIH ネイ 5T32EY007031 に NSF GRFP 2013158531 と j. h. s. b. に EY026020 によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
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