Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Forberede frisk Retinal skiver fra voksne sebrafisk for Ex Vivo Imaging eksperimenter

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/56977

Summary

Imaging Netthinnen vev kan gi encellede informasjon som ikke kan samles inn fra tradisjonelle biokjemiske metoder. Denne protokollen beskriver utarbeidelse av netthinnen skiver fra sebrafisk for AC confocal bildebehandling. Fluorescerende kodet genetisk sensorer eller indikator fargestoffer tillater visualisering av mange biologiske prosesser i forskjellige retinal celletyper.

Abstract

Netthinnen er en kompleks vev som starter og integrerer de første trinnene av visjonen. Dysfunksjon av netthinnen celler er et kjennetegn på mange blendende sykdommer, og fremtidige behandlinger hengslene på grunnleggende forståelse om hvordan ulike retinal celler fungere normalt. Få slik informasjon biokjemiske metoder har vist seg vanskelig fordi bidrag bestemt celletyper er redusert i netthinnen celle miljøet. Live netthinnen bildebehandling gir utsikt over mange biologiske prosesser på subcellular nivå, takket være et økende antall genetisk kodet fluorescerende biosensors. Men har denne teknikken hittil vært begrenset til tadpoles og sebrafisk larver, ytterste retinal lag av isolerte netthinne, eller lavere oppløsning avbilding av Netthinne i levende dyr. Her presenterer vi en metode for å generere live ex vivo retinal skiver fra voksne sebrafisk for live bildebehandling via AC confocal mikroskopi. Dette preparatet gir tverrgående skiver med alle retinal lag og de fleste celletyper synlig for å utføre AC confocal tenkelig eksperimenter ved hjelp av perfusjon. Transgene sebrafisk uttrykke fluorescerende proteiner eller biosensors i spesifikke netthinnen celletyper eller organeller brukes til å trekke ut encellede informasjon fra en intakt netthinnen. I tillegg kan retinal skiver lastet med fluorescerende indikator fargestoffer, legge til i metodens allsidighet. Denne protokollen ble utviklet for imaging Ca2 + innen sebrafisk membran fotoreseptorer, men med riktig indikatorer det kan tilpasses for å måle Ca2 + eller metabolitter i Müller celler, bipolar og vannrette celler, microglia, amacrine celler eller retinal ganglieceller. Netthinnens pigment epitel fjernes fra skiver slik denne metoden ikke er egnet for å studere celle type. Med praksis er det mulig å generere føljetong skiver fra en dyr for flere eksperimenter. Denne tilpasses teknikken gir et kraftig verktøy for å svare på mange spørsmål om retinal cellebiologi, Ca2 +og energi homeostase.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) har blitt mye brukt i medisinske og grunnleggende forskning1, på grunn av dens liten størrelse, rask utvikling og virveldyr organsystemer. Naturlig gjennomsiktighet sebrafisk Larvene kombinert med etablerte metoder for transgenesis har aktivert detaljert visualisering av cellulære prosesser i en levende dyr. En rekke genetisk kodet fluorescerende biosensors har blitt målrettet til bestemte sebrafisk celler å oppdage Ca2 + 2, hydrogenperoksid3, apoptotisk aktivisering4 og ATP5.

I vivo avbilding av sebrafisk Larvene har ført til gjennombrudd innen nevrovitenskap, inkludert tilordning av hjernen krets6 og narkotika utvikling for sentrale nervesystemet lidelser7. Sebrafisk er godt egnet for visjon forskning fordi deres Netthinne har laminær struktur og Nevron typer høyere virveldyr, og de viser robust visuelle atferd8,9. Flere typer retinal degenerations analoge til menneskelig sykdom er modellert vellykket og studerte i sebrafisk10,11, inkludert live bildebehandling av personlige fotoreseptorer degenereres i en netthinnen2, 12.

Mens i vivo larver sebrafisk bildebehandling er et verdifullt verktøy, blir det mer utfordrende som fisk vokse og utvikle pigmentering, og noen farmakologiske behandlinger kan ikke trenge gjennom en hel dyr. Videre, endre visse cellulære prosesser med utvikling og alder, gjør senere tidspunkt kritisk for forståelse funksjon og progresjon av sykdommen i voksen dyr. Biokjemiske metoder som immunoblot, quantitiative PCR, O2 forbruk og metabolomic analyser kan gi viktige ledetråder om biologi av netthinnen som helhet, men det er vanskelig å skjelne bidrag av individuelle celletyper påvirket av sykdom. Imaging isolert netthinnen vev ex vivo utenom disse problemene, og mens imaging flatt montert Netthinne gir utsikt over den ytre Netthinne13, dypere indre retinal funksjoner er skjult. Tverrgående retinal skiver, som de presenterte i fast immunohistochemical analyser, aktiverer et klart syn på alle lag og celletyper men tilbyr bare ett bilde dynamisk prosessene i normal funksjon og sykdom.

Her presenterer vi en metode for å generere ex vivo tverrgående retinal skiver fra voksne sebrafisk for bildebehandling. Det ligner på metoder for å forberede amfibier og sebrafisk retinal skiver for elektrofysiologiske og morfologiske studier14,15, med viktige Modifikasjoner for tidsforløp imaging ex vivo bruker AC confocal mikroskopi. Fluorescens svar biosensors eller fargestoffer i skiver overvåkes i sanntid med AC confocal mikroskop samtidig farmakologiske midler å bruke perfusjon. Mens metoden ble utviklet for imaging fotoreseptorer, kan det være mulig å bruke det for å visualisere Müller celler, bipolar celler, vannrette celler, amacrine celler eller retinal ganglieceller med passende fluorescerende indikatorer. I tillegg kan skiver lastet med fluorescerende celle-permeable fargestoffer rapporten celle levedyktighet, vesicula transport, mitokondrie funksjon eller redox tilstand. Dette allsidige preparatet kan visualisering av en rekke subcellular prosesser gjennom netthinnen, inkludert Ca2 + dynamikk, signaltransduksjon og metabolske tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av University of Washington institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. klargjør dyr og utstyr

Merk: Netthinnens pigment epitel (RPE) er en mørk ark av vevet rundt utsiden av netthinnen med pigmentering kan skjule netthinnen funksjoner og skade vevet når AC confocal imaging ex vivo. I mørket, er RPE av sebrafisk trukket fra netthinnen; mørk tilpasse fisk å lette fremtidig fjerning av RPE fra netthinnen før slicing og bildebehandling.

  1. Overføre fisk til en gyting tank fylt med fisk vann, og deretter bryte gyting tanken med mørke stoffet eller plassere den i et mørkt skap.
    1. Mørk tilpasse sebrafisk minst 1t før euthanasia tillate nær fullstendig separasjon av RPE fra netthinnen. 30 min mørk tilpasning er tilstrekkelig å fjerne de fleste RPE, selv om deler av det kan være intercalated mellom fotoreseptorer.
  2. Smelte ~ 15 mL av petroleum gelé i en 50-mL kanne på en kokeplate og deretter trekke 3 mL væske inn en 3-mL slip tips sprøyte. Invertere sprøyten, sett i et reagensrør rack, og tillater vaselin avkjøles.
  3. Gjøre en gjenbrukbare kutting kammer på en vanlig 7 cm X 2,5 cm microscope skyve.
    1. Bruker klart neglelakk, maling smale linjer til å opprette en 3 cm X 2,5 cm rektangel i midten av lysbildet, la dem tørke og deretter legge et lag av neglelakk til linjene.
  4. Forberede tenkelig stiger på dekselet slips å holde skiver under bildebehandling. Skiver vil danne "trinnene" av stigen.
    1. For statisk avbildning eller injeksjon eksperimenter med minimal løsning flyt, gjøre vaselin stiger bestående av to flat bredt parallelle strimler av vaselin på 18 mm firkantet glass cover slips. Bruke sprøyten til å bruke to flatet ~ 1 cm lang utstryk av avkjølt vaselin 0,5 cm fra hverandre på cover slip.
  5. Klar vev sliceren.
    1. Rengjøre en dobbel kant razor blad med etanol og la den til luften tørr. Skjær den i kvartaler med saks, først på langs i halvdeler og over hvert blad.
    2. Plasser kutting kammeret på scenen av vev sliceren, midtstille den horisontalt på scenen og merke en langside med permanent markør for justering.
    3. Laste en blad inndeling på vev slicer armen, sikre bladet ligger flatt og midtstilt på lysbildet uten å berøre på neglelakk, så forsiktig stramme blad apparatet. Lavere blad armen av teren ¼ slår, deretter sted en papirlapp filter i midten av tenkelig kammer og test kutt. Hvis papiret ikke er kuttet helt gjennom, Monter bladet.
  6. Bruke sprøyten, plassere en enkelt liten prikk av avkjølt i en 10 cm Petriskål ~ 1,5 cm til høyre for sentrum. Trykk en tenkelig stigen i det ved hjelp av pinsett med vaselin grossist. Gjøre en annen liten vaselin dot ~ 1 cm fra inntak av tenkelig chamber.
  7. Passer vaselin sprøyten med en 20g nål og slipp den. Hold nålen på sprøyten og bruke to 1 cm lange tynne parallelle strimler av vaselin på langs i midten av kutting kammeret. Plass strimler ~ 1 cm fra hverandre.
  8. Gjør et gjenbrukbart wire øye loop verktøy av emballasjen midten av en ~ 4 cm segment av 30 g tungsten kabelen rundt et par lukket tang når tett. Justere diameter av løkken ved å skyve wire opp eller ned tang før det er litt større enn en sebrafisk øye, vanligvis ~ 2-3 mm. vri kabelendene og sikre dem på slutten av en 6 cm trestav med laboratoriet tape.
  9. Forberede Ringer i løsningen.
    1. Tine 50 X supplement lagerløsning (tabell 1) og legge den ferske HEPES-bufret, ikke-bikarbonat Ringer i løsningen (tabell 2) morgenen eksperimentet. fortynne 200 µL av supplement lagerløsning i hver 10 mL av Ringer i løsningen i en konisk sentrifuge rør eller sterilt glassflaske. For statisk tenkelig eksperimenter, forberede minst 30 mL av Ringer i løsningen per forsøk. Antall Ringer i løsning nødvendig for perfusjon eksperimenter avhenger gjennomstrømning og totale eksperiment tid.
    2. Sjekk at pH i supplert løsningen er 7.4 bruker en digital pH-sonde eller pH papir, og juster deretter med fortynnet NaOH eller HCl.
    3. Oxygenate supplert Ringer i løsning på isen av bobler av 100% oksygen gass i minst 5 minutter ved hjelp av en standard medisinsk oksygentank og regulator utstyrt med en slange, eller valgfrie gass bubbler manifold brukt for perfusjon. Lagre oksygenrikt Ringer i løsning på isen i et forseglet konisk sentrifuge rør eller sterilt glassflaske nær disseksjon mikroskopet; Bruk denne løsningen for disseksjon, bildebehandling, og å fortynne fargestoffer eller farmakologiske agenter.
    4. Hvis andre løsninger brukes i forsøket, som Na+-ledig Ringer i løsning (tabell 3), Gjenta trinn 1.9.1.-1.9.3.
  10. Samle Petri retter, tang, mikro-saks og andre verktøy i disseksjon mikroskopet og forberede en fisk vann isbadet sebrafisk euthanasia.

2. forberedelser retinal skiver (se figur 1)

  1. Arbeider under røde omgivelseslyset å minimere lys tilpasning (som kan gjøre RPE pinne tettere til netthinnen), euthanize sebrafisk ved neddykkelse i isbadet til touch svar er tapt, vanligvis 1-2 min. overføre fisken til en Petriskål og bruke skalpell til cervically dislocate men ikke halshugge fisken.
  2. Bruk wire loop for å løsne bindevev rundt ett øye, og deretter trekke øyet frem forsiktig med loopen i den ene hånden. Med mikro-saks i den andre hånden, kuttet hvit synsnerven under øyet, ta vare ikke for å kutte baksiden av øyet.
  3. Overføre øyet ved hjelp av pinsett til en Petriskål av kaldt Ringer i løsning på is og gjenta for andre øyet. Holde øynene i mørke eller under rødt lys til RPE fjernes fra netthinnen.
  4. Dissekere eyecups under strømsparingsmodus disseksjon mikroskop i en dråpe kaldt Ringer i løsningen på et vanlig glass lysbilde i en Petriskål.
    1. Pierce hornhinnen med fine tang, så fjern stykker av klare, skjøre hornhinnen og sølvfargede sclera med tang eller saks. Kast linsen og det meste av sclera (se figur 1A), og håndtere den isolerte eyecup minimal.
    2. Stykker av fett, små biter av sclera, og svart RPE kan være knyttet til eyecup og fjernet fra netthinnen senere. Hvis netthinnen skiller fra RPE i trinn 2.4.1, fortsette med de samme trinnene bruker ekstra forsiktig ikke for å skade delikat isolert netthinnen.
    3. Plasser eyecup åpne side ned (RPE opp) på lysbildet, og skåret i tredjedeler eller kvartaler med en frisk enkel kant barberblad i én bevegelse (se figur 1B). Kast biter av vev som er svært buede.
  5. Flat mount netthinnen på filter papir.
    1. Våt filter papir med Ringer i løsningen og plassere den på lysbildet ved eyecup bitene. Bruke flat tang når du håndterer intakt våt filter papir for å unngå punktering det. Legge til kaldt Ringer i løsning for å dekke både filter papir og vev.
    2. Bruk tang i hver hånd, nøye dra filter papir under hver eyecup brikke med RPE og fotoreseptorer vendt opp, dvs med baksiden av øyet grossist. Plasser eyecup bitene i en enkelt linje langs midten av filter papir (se figur 1 c). Håndter bitene eyecup forsiktig med fine tang bare nær en kant eller et hjørne.
    3. For å hjelpe Netthinne overholder filter papir, plassere det våte filter papiret på en tørr tørkepapir for 3 å veken fuktighet nedover, men ikke la vev blir tørre. Gjenta til eyecup brikker ligge flatt på filter papir. Bruke skånsom på undersiden av filter papir hjelper flat netthinnen, men dette trinnet er ikke nødvendig.
  6. Hvis svart ark RPE forblir på eyecup stykker, bruke fine tang forsiktig Peel det bort fra ett hjørne (se figur 1 d) mens vevet sitter i en dråpe Ringer i løsningen. Netthinnen bør løfte filter papir, gjenta fuktspredende trinnet i 2.5.3. Det kan hende at netthinnen rosa på grunn av ubleket visuelle pigmenter.
  7. Gjenta netthinnen disseksjon og flat montering trinn i 2.4-2.6 for det andre øyet, hvis ønskelig, holde første flat-montert netthinnen i kaldt Ringer i løsningen. For å effektivisere kutting prosedyren, kan deler av begge Netthinne plasseres på ett filter papir. Når RPE er fjernet, kan protokollen utføres under vanlig rom lys med mindre eksperimenter nødvendiggjøre mørke.
  8. Plasser filter papir på et lysbilde og trimme den i et rektangel med en enkel kant razor blad, forlater ~ 0,5 cm filter papir på hver side av linjen av netthinne. Flytte filter papir til forberedt kutting chamber, presse lang filter papir kantene i tynne vaselin linjene ved hjelp av pinsett og fordype netthinnen i 3-4 dråper kaldt Ringer i løsningen.
    Merk: Noen fargestoffer, som lipofile fargestoffer, beste lastes inn i flat monterer på dette stadiet før kutting. Dette kan være lastet, onde bort med en vev, og vasket i kutting kammeret. For eksempel C12 558/568 BODIPY intenst flekker retinal celle membraner og photoreceptor ytre segmenter (se figur 4A) når lastet på ~ 5 µg/mL til 15 min ved romtemperatur (vanligvis 23-27 ° C), etterfulgt av en vask i overflødig Ringer i løsning .
  9. Overføre kutting kammeret til vev slicer scenen, plassere langsiden langs merkede og sikre kammeret ender på scenen med laboratoriet tape. Starter i den ene enden, kuttet netthinnen og filter papir med fast, milde press på slicing armen. Kontroller at den første sektoren ble kuttet fullt, deretter bruke mikrometer for å kutte ~ 400 µm skiver.
  10. Samle tenkelig stigen.
    1. Plass til kutting kammeret skiver retinal deler i Petriskål fra trinn 1.7 tilstøtende til avbilding stigen (se figur 1E). Fylle fatet med kaldt Ringer i løsning å senke innholdet.
    2. Ved hjelp av pinsett og holde skiver neddykket, forsiktig overføre strimler av filter papir og netthinnen til stigen ved å skyve Petriskål fra venstre til høyre. Ta vare ikke for å berøre Netthinne direkte. Rotere sektorene 90° og begrave filter papir kantene i vaselin.
    3. Fint plasser retinal skiver i stigen med tang slik at retinal lag er synlig under disseksjon mikroskopet (se figur 1G). For skiver på hver ende av stigen, sørge for at vevet vender innover mot de andre sektorene å minimere bevegelse av vev under injeksjon eller flyt. Forkaste alle retinal sektorer som ikke er godt overholdt filter papir (se figur 2A).
  11. Eventuelt laste fargestoffer i netthinnen skiver på dette stadiet og vask i overflødig Ringer i løsningen før bildebehandling.
    Merk: Propidium iodide (PI) og Hoechst 33342 robust flekken atomkjerner av døde og alle celler, henholdsvis (se figur 2B), når inkubert med retinal skiver på 5 µg/mL for 20 min ved romtemperatur. Tetramethylrhodamine (TMRM) som er akkumuleres i aktivt respiring mitokondrier gjennom netthinnen når ruges 1 nM i 30 min ved romtemperatur.
  12. Mens sektorene er flekker, forberede tenkelig kammer og injeksjon apparatet. Bruk sprøyten flush slangen med Ringer i løsning og tømme bobler, legge den åpne enden av slangen i tenkelig kammer innløpet og lukke stopcock. Fjern sprøyten og fyll den med reagent(s) for injeksjon og knytte det til slangen.
  13. Bruk tang til å overføre dekkglassvæske med retinal skiver til tenkelig chamber, trykke på dekkglassvæske i prikk av vaselin nær innløp kanten av tenkelig chamber (se figur 1 H). Fyll tenkelig kammeret Ringer i løsning å dekke skiver.

3. imaging retinal skiver

  1. Plass fylt tenkelig kammeret med tilkoblede injeksjon apparatet på scenen av en oppreist AC confocal mikroskop utstyrt med 20 eller 40 X vann dipping linsen. Sikre tenkelig kammeret med scene klipp.
  2. Senke dipping linsen over stigen og fokusere på et stykke i den ene enden av stigen under svake trans-opplyste lyset. Undersøke hvert stykke orientering på tvers, photoreceptor ytre segmenter, og sikre heft til filter papir.
  3. Velge det beste stykket for tid forfalle bildebehandling og konfigurere mikroskop programvaren for tid forfalle bildeopptak. Tabell 4 skisserer tenkelig standardinnstillingene for ulike fluorescerende markører og fargestoffer.
    Merk: Antall bildeopptak varierer avhengig av mikroskopet, fluorescerende marker(s) og biologisk prosess blir studert. For eksempel bruke 800 x 800 piksler oppløsning, 2 µs/bildepunkt skannehastighet og en 10-s bildefrekvens for imaging kalsium dynamikk i fotoreseptorer med GCaMP3 og en rød farge.
    1. Hvis tilgjengelig, kan du bruke programvaren til å spore fysiske landemerker i sektoren (photoreceptor ytre segmenter, cellen legemer, kjerner) for å hjelpe potensielle nyorientering under tid forfalle. Også konfigurere programvaren til å overvåke sanntid fluorescens over sektoren.
  4. Begynne bildebehandling og overvåke planlagte fluorescens. Når fluorescens over stykket stabiliserer (vanligvis innen 2-5 min), Fortsett med eksperimentet. For injeksjon, åpne sprøyte stopcock, deretter langsomt trykke ned og trekke tilbake på stempelet å hjelpe blanding.
    Merk: For eksempel avskaffe mitokondrie funksjon ved å injisere en konsentrert løsning av protonophore CCCP å nå en siste konsentrasjon på 1 µM i tenkelig kammeret. Dette medfører en robust Ca2 + brast i photoreceptor stoffer rapportert av GCaMP, og en jevn nedgang i mitokondrie membran potensial rapportert av TMRM.
  5. Nøye overvåke sektorene for drift under eksperimentet, og bruke programvaren foreta mikro-justeringer etter fysisk landemerker. Vanligvis Drive i Z-retningen under injeksjon eller perfusjon er < 5 µm.

4. imaging retinal skiver under perfusjon eksperimenter der løsninger er endret eller fløt kontinuerlig

Merk: Imaging retinal skiver under perfusjon eksperimenter der løsninger er endret eller fløt kontinuerlig ligner på oppsett for statisk avbildning eller injeksjon eksperimenter, med følgende endringer.

  1. I stedet for vaselin stiger beskrevet i trinn 1.4, bruke kraftigere voks stiger for å holde retinal skiver stødig under løsning flyt.
    1. Sett to små parallelle sylindre med unflavored dental voks ~ 0,5 cm fra hverandre på en dekkglassvæske. På et flatt underlag, bruk en tommel for å trykke hver sylinder ned og ut mot parallelle kanten av dekkglassvæske. Scorer begge flat sylindere horisontalt med en #1 dekkglassvæske (se figur 1E, høyre) deretter smøre et tynt lag med vaselin mellom voks strimler med en slikkepott.
    2. Ved montering tenkelig stigen i trinn 2.10.2, trykk skiver filter papir kantene i voks resultatet ved hjelp av fine pinsett (figur 1G).
  2. Sette opp for perfusjon i trinn 2.12, fyll sprøyten reservoarer med preoxygenated løsninger, eller bruke valgfrie gass manifold for å oxygenate løsninger i hver reservoaret. Tøm alle rør med Ringer i løsning, sikre alle linjer strømme når åpnet og tømme store bobler.
  3. Før du fyller tenkelig kammeret i trinn 2.13, bruke sprøyten for å plassere en prikk av petroleum gelé over hjørnene eksponert på dekkglassvæske å hindre at det glir sidelengs under flyt.
  4. Når imaging kammeret er fylt og montert på mikroskopet scenen, slå på aspirator og koble aspirator slangen. Test flyten av Ringingens løsning og bruk micropositioner å plassere aspirator røret over utløp kammeret slik at små mengder av væske trekkes før kammeret flyter (vanligvis ~ 1 mm på havoverflaten løsning for en 2 mL/min flow rate). Holde Ringer i løsningen strømmer mens du velger skiver i trinn 3.4.
  5. For å gjennomføre eksperimentet i trinn 3.4 for perfusjon, slå strømmen av løsninger ved å lukke stopcock av den første løsningen under åpning av den andre løsningen.
    1. For eksempel, for å tømme ekstracellulære Na+ fra tenkelig kammer, bruk to sprøyte reservoarer fylt med Ringer i løsning eller Na+-ledig løsning (tabell 3). Flow Ringer i løsningen å opprette planlagte, og deretter bytte til Na+-ledig løsning. Dette resulterer i store cytosolic Ca2 + øker i photoreceptor ytre segmenter og cellen legemer (se Figur 4).
  6. For gravitasjon-matet perfusjon systemer, Overvåk nivået på løsning i hver reservoaret slik at infusjonshastigheten er konstant under bildebehandling. Toppen av reservoarene behov med oksygenrikt løsninger eller opprettholde kontinuerlig oksygen bobler med gass manifold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stødig plassering og orientering på tvers av sektorer er nøkkelen til vellykket bildebehandling med injeksjon eller perfusjon av farmakologiske agenter. Nøye undersøke og flytte skiver før AC confocal imaging for å sikre alle retinal lag er synlig (figur 2A, del ii). Hvis en skive er rotert fremover litt (figur 2A, del iii), bunter av ytre segmenter vises og små justeringer kan gjøres med tang for å bringe ønsket retinal lagene i fokus. Skiver dårlig overholdt filter papir (figur 2A, skjær jeg) eller beholde RPE (figur 2A, skjær iv) bør ikke brukes for tid forfalle bildebehandling.

Cellen levedyktighet er viktig å observere fysiologiske prosesser ex vivo; en celle levedyktighet flekker som propidium iodide (PI) anbefales å analysen cell helse mens praktisere netthinnen kutting. Døde celler nær klippekanten på alle sektorer vil akkumuleres PI i sine atomkjerner (figur 2B, venstre paneler), mens 5-10 µm dypere inn i sektoren, friske celler med normal morfologi og ingen PI flekker kan avbildes. For eksempel i fotoreseptorer vise PI negativ celler under klippekanten vanligvis en stereotype polarisert, elongated morfologi (figur 2B, høyre panel). Fotoreseptorer være levedyktig i netthinnen skiver minst 4 h lagret i oksygenrikt Ringer i løsningen.

Mange retinal celle strukturer kan visualiseres ved hjelp av kombinasjoner av transgene markører og fargestoffer; eksempel AC confocal bilder av fersk retinal skiver med dobbel og trippel fluorescerende merking presenteres i Figur 3. For å visualisere dynamikken i membran photoreceptor endoplasmatiske retikulum (ER) i forhold til kjernen, kan netthinnen skiver fra transgene fisk uttrykke GFP rettet mot kjegle ER17 være counterstained med en kjernefysisk fargestoff (figur 3A). En lignende strategi kan brukes til å vise begrepsordbok cytoskeleton bruker retinal skiver fra transgene sebrafisk som uttrykker GFP-smeltet begrepsordbok18 (figur 3B). Med en annen celle-spesifikke promoter, kan Müller celler merkes med røde fluorescerende protein tdTomato19 og visualisert i netthinnen skiver (Figur 3 c, topp panel). Glukose opptak i netthinnen kan være assayed i vivo av muntlig gavaging voksen sebrafisk med et fluorescerende glukose analog (NBDG), som blir innlemmet i celler i netthinnen skive21 (Figur 3 c, nedre panelet). Dobbel transgene sebrafisk kan brukes til å overvåke flere celleprosesser eller celletyper i tandem, slik som Ca2 + dynamikk i en undertype av kjegler. Figur 3D viser en trippel merking ordningen for denne typen eksperiment, med tdTomato i lang-bølgelengde kjegler2 sammen med mitochondrially-målrettet Ca2 + sensor (mito-GCaMP) i alle kjegler22 og en kjernefysisk flekk.

Tid forfalle avbilding av netthinnen celler er en viktig fordel med dette stykke prep. For eksempel, kan Ca2 + svingninger i membran photoreceptor stoffer være observert og senere kvantifisert under farmakologiske manipulasjon, et eksperiment avbildet i Figur 4. Figur 4A viser retinal skiver uttrykke den Ca2 + sensor GCaMP2 (øverst) eller kontroll eGFP16 (nederst) i membran fotoreseptorer counterstained med en rød lipofile fargestoff. I dette eksperimentet er Na+ isotonically utarmet fra tenkelig kammeret ved hjelp av perfusjon, fremkaller stor økning i cytosolic Ca2 + for ytre segmentet og celle kroppen slik GCaMP (figur 4A, topp panel). Fluorescens av retinal skiver uttrykke Ca2 +-ufølsom eGFP er upåvirket av denne behandlingen (figur 4A, nedre panelet). Tid forfalle filmer kan analyseres ved hjelp av ImageJ programvare å isolere og kvantifisere fluorescens svar fra enkelt membran ytre segmenter og cellen legemer synapser (figur 4B).

Supplement løsning
50 x lager * konsentrasjon (mM) arbeider konsentrasjon (mM)
D-glukose 500 10
natrium laktat 50 1
natrium pyruvate 25 0,5
L-glutamin 25 0,5
redusert glutation 25 0,5
askorbinsyre 15 0,3
* Lagre dele på-20 º c < 6 måneder; legge til friske Ringer i løsning

Tabell 1. Komponenter på 50 X supplement lagerløsning og siste arbeider konsentrasjoner.

Ringer i løsning
konsentrasjon (mM)
NaCl 133
KCl 2.5
CaCl2 · 2H2O 2
NaH2PO4 1.5
MgCl2 · 6H2O 1.5
HEPES 10
pH 7,4 med NaOH
Lagre på 4 ºC i sterilt flaske < 1 måned

Tabell 2. Komponenter i standard Ringer i løsningen.

Na+-ledig Ringer i løsning
konsentrasjon (mM)
TRIS 147
HCl 120
KCl 1
CaCl2 · 2H2O 2
KH2PO4 1.5
MgCl2 · 6H2O 1.5
HEPES 10
pH 7,4 bruker HCl
Lagre på 4 ºC i sterilt flaske < 1 måned

Tabell 3. Komponenter i Na+-ledig Ringer i løsning.

AC confocal Imaging-innstillinger
Fluorophore Eksitasjon Utslipp Filter
Bølgelengde Laser intensitet
GFP (inkludert GCaMP) 488 nm 2 - 5% eGFP eller AlexaFluor 488
tdTomato 559 nm 5% AlexaFluor 594
PI 559 nm 2% PI
Hoechst 33342 405 nm 1% DAPI
NBDG 488 nm 10% eGFP eller AlexaFluor 488
C12 558/568 BODIPY 559 nm 1% AlexaFluor 594
TMRM 559 nm 3% RFP

Tabell 4. Bildebehandling fluorescerende markører og fargestoffer presentert i tallene 2-4.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk for å forberede frisk sebrafisk retinal skiver. (A) dissekere bort til eyecup, og kast linsen og sclera (trinn 2.4.1.). (B) skåret i eyecup i tre stykker; Kast små kantstk (trinn 2.4.2.). (C) dra filter papir under eyecup stykker med indre netthinnen vender mot filter papir (trinn 2.5.1.-2.5.2.). (D) trykke sammen netthinnen med et papirhåndkle for å veken Ringer i løsning nedover gjennom filter papir (trinn 2.5.3.), deretter forsiktig skrelle bort gjenværende RPE med tang (trinn 2.6). Flytte filter papir til kutting chamber på vev slicer scenen og 400 µm skiver (trinn 2.8., 2,9.). (E) overføring kutting kammer med skiver og en voks- eller petroleum gelé stige til en Petriskål av Ringer i stoppløsningen (trinn 2.10.1.). (F) bruke fine tang skyve enkelt skiver fra slicing kammeret til stigen samtidig skiver neddykket. (G) Roter filter papir strimler (svart) 90 ° og begrave kantene på papiret filter i voks eller vaselin (trinn 2.10.2.-2.10.3.). (H) skjematisk av siste tenkelig kammeret lastet med en stige og skiver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Eksempler på fersk sebrafisk retinal skiver med god vedheft til filter papir og celle levedyktighet. (A) Brightfield bilde av fersk retinal skiver i en vaselin stige. Skiver ii og iii viser god vedheft og tverrgående retinal lag. Skiver i og iv har beholdt betydelig RPE, eller er svært buede og ikke godt adhered til filter papir, og burde ikke bli avbildet. Skala bar = 200 µm. (B) topp-ned Z montasje av en ny retinal skive fra transgene sebrafisk som uttrykker eGFP i membran fotoreseptorer (Tg(gnat2:eGFP)16). Hoechst fargestoff merker alle atomkjerner; propidium iodide (PI) counterstaining etiketter atomkjerner av døde celler, som vises nær klippekanten på sektoren (til venstre). Z-stabelstørrelse trinn = 1 µm; skala bar = 20 µm. fluorescerende imaging forhold er skissert i Tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Eksempler på AC confocal bilder av dobbel - og trippel-merket ex vivo retinal skiver fra transgene voksen sebrafisk. (A) to farger tenkelig ordningen sysselsetter transgene GFP merket endoplasmatiske retikulum i kjegler (Tg(gnat2:calr-GFP)17, topp) med Hoechst kjernefysiske counterstain (blå, nederst). (B) GFP merket begrepsordbok i kjegler (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, topp) med Hoechst kjernefysiske counterstain (blå, nederst). (C) RFP merket Müller celler (Tg(GFAP:tdTomato)19, topp) fra en sebrafisk matet fluorescerende glukose (NBDG) viser glukose opptak i kjegler20,21 (grønn, bunnen). (Dette bildet er fra figur 2B av Kanow, et al. 21) (D) eksempel på tre farger bildevisning dobbel transgene sebrafisk. Venstre, RFP rettet mot lang-bølgelengde membran fotoreseptorer (Tg(trβ2:tdTomato)2). Center, kalsium biosensor GCaMP rettet mot membran photoreceptor mitokondrier (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). Høyre, kledde bilder av tdTomato (rosa), mito-GCaMP (grønn) og Hoechst kjernefysiske counterstain (blå). Bildene er maksimale intensitet Z-anslagene 9 rammer over 7 µm vev dyp; skala barer representerer 10 µm. fluorescerende tenkelig forholdene er beskrevet i Tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Ca2 + bildebehandling med GCaMP og kontroll eGFP. (A) representant bilder av fersk retinal skiver uttrykke fluorescerende Ca2 + biosensor GCaMP (gnat2:GCaMP32, topp) eller eGFP (nederst) i membran fotoreseptorer. Venstre, skiver på grunnlinjen; høyre, skiver 2 min etter Na+ var isotonically utarmet fra tenkelig kammeret ved hjelp av perfusjon av en Tris-baserte Ringer i løsningen, fanger Ca2 + i fotoreseptorer. Skalere barer = 10 µm. fluorescerende imaging forhold er skissert i Tabell 4. (B) mener fluorescens endringer enkelt photoreceptor rom (ytre segmenter, cellen legemer og synapser) under tid forfalle avbilding av Na+ uttømming. Skiver ble fotografert hver 10 s, stabler ble behandlet med ImageJ og fluorescens GCaMP eller eGFP var normalisert for å signalisere fra membranen fargebad. Heldekkende linjer, GCaMP (n for ytre segmenter = 15, cellen legemer = 24, synapser = 26); stiplede linjer, eGFP (n for ytre segmenter = 26, cellen legemer = 20, synapser = 31). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ex vivo imaging av fersk sebrafisk retinal skiver har vist seg for å være et allsidig verktøy for å studere photoreceptor biologi20,21,22og er unik i at det muliggjør analyse av enkeltceller i en moden, fullt differensiert netthinnen. Med praksis er det mulig å utføre flere eksperimenter med vev fra en enkelt fisk, selv med føljetong skiver fra samme del av netthinnen. I tillegg utfordringer og forslag om utarbeidelse av amfibier retinal skiver for elektrofysiologi studier14finnes det viktige hensyn for imaging eksperimenter.

For fotoreseptorer korrelerer celle levedyktighet generelt med cellen morfologi, så det er viktig å behandle delikat netthinnen minimal, spesielt etter at RPE er fjernet. Etter kutting, bruke fine tang forsiktig skyve skiver horisontalt fra slicing kammeret (figur 1F) overføre dem til stigen løfte skiver rett opp, og alltid holde skiver neddykket i Ringer i løsningen. Hvis mulig, samle stigen av netthinnen skiver nær AC confocal mikroskop for å minimere skiver trza under transport.

Sterk vedheft av netthinnen vev til filter papir er avgjørende for å opprette stykker som vil forbli stabil under injeksjon eller perfusjon eksperimenter. Det er nødvendig å nøye undersøke hver skive morfologi og stabilitet like før imaging (figur 2A); trykke forsiktig tabellen mikroskop mens viser stykke bevegelse gjennom AC confocal okulær linsen avslører stabiliteten i en bestemt del. Til tross for forholdsregler, drive i Z-retningen under injeksjon eller perfusjon kan presentere utfordringer for analyse, så det er nyttig å belaste en kontroll fargestoff, som lipofile fargestoffer membraner og mitokondrier, til stabilt merke en identifiserbar cellestruktur for Normalisering (figur 4A, magenta). Hvis skiver Drive > 10 µm i Z-retningen kan det ikke være mulig å trekke brukbare encellede data. Moderat drift i X-Y-retningen kan løses i etterbehandling bruker registrering programvare MultiStackReg for ImageJ (RRID:SCR_002285).

Statisk tilfeller bør fluorescens av markører i netthinnen skiver forbli stabile, selv om photobleaching kan oppstå under bildebehandling. Forsiktighet bør utvises minimere laser eksponering under tid bortfaller ved å avgrense parametere som laser intensitet, scan hastighet og bildefrekvens. Tenkelig kontroller anbefales for hver fluorescerende merke som brukes. Omfatter sprøytebruk perfusing Ringer i løsning uten farmakologiske agenter i separate forsøk eller gjennomføre tenkelig eksperimenter med ikke-biosensor indikatorer som fluoresce constitutively.

Avhengig av AC confocal eksitasjon laser brukes, kan pigmenter i RPE bidra til autofluorescence og selv generere varme under bildebehandling, så det er viktig å fjerne det meste av dette vevet før kutting. Dark-Adapting dyr hjelpemidler i fjerning av RPE samtidig minimere skade på underliggende netthinnen. Manglende evne til å bilde av RPE er en begrensning av dette stykket preparatet, selv om dette kan overvinnes ved å bruke albino dyr med en gjennomsiktig RPE. En annen begrensning er at retinal ganglieceller og slutten føtter Müller celler kan bli skjult fra visningen av filter papir; som et alternativ forberedelse kan Netthinne være flat montert med photoreceptor side ned på filter papir og deretter skiver for å gi en bedre oversikt over innerste netthinnen. Det er også viktig å merke seg at lange horisontale projeksjoner av noen celler, for eksempel bredt felt amacrine celler, kan bli kuttet under disseksjon eller kutting. Et siste begrensning er at mange fluorescerende fargestoffer akkumuleres nonspecifically i photoreceptor ytre segmenter, så for denne delen av netthinnen det er tilrådelig å bruke genetisk kodet biosensors i stedet for indikator fargestoffer.

Gitt det brede utvalget av tilgjengelige fluorescerende celle reporter fargestoffer23,24 til vev og genetisk kodet fluorescerende biosensors brukt med hell i sebrafisk2,3,4, 5, dette stykke preparatet kan brukes til å studere mange biologiske prosesser i flere retinal celletyper (se eksempler i Figur 3, Figur 4). Imaging frisk retinal skiver med levende celle super-oppløsning mikroskopi kan også gi spennende ny innsikt til netthinnen funksjon og helse på et subcellular nivå. Videre, denne metoden kan tilpasses for ex vivo bildebehandling musen retinal skiver25. Mens vellykket utarbeidelse av fersk retinal skiver krever praksis, er det et kraftig verktøy som er nyttig for å løse et bredt spekter av celle-spesifikke biologiske spørsmål i en moden netthinnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Ralph Nelson og Daniel Possin for gjennomtenkte veiledning mens utvikle denne protokollen, og Eva Ma, Ashley George og Gail Stanton for generering av stabil transgene sebrafisk linjer. Arbeidet ble støttet av NSF GRFP 2013158531 til M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. og M.G., og EY026020 J.H. og SB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
  3. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  4. Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
  5. Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
  6. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  7. Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
  8. Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
  9. Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
  10. Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
  11. Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
  12. Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
  13. Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
  14. Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
  15. Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
  16. Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
  17. George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
  18. George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
  19. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  20. Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
  21. Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
  22. Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
  23. Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
  24. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
  25. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).

Tags

Nevrovitenskap problemet 135 sebrafisk netthinnen photoreceptor vev slice fluorescens biosensor live bildebehandling mikroskopi nevrovitenskap molekylærbiologi cellebiologi
Forberede frisk Retinal skiver fra voksne sebrafisk for <em>Ex Vivo</em> Imaging eksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M.,More

Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter