Summary
Proyección de imagen del tejido retiniano puede proporcionar información de unicelulares que no se desprende de los métodos bioquímicos tradicionales. Este protocolo describe la preparación de rodajas de retinales de pez cebra para la proyección de imagen confocal. Fluorescentes genéticamente codifican sensores o indicador tintes permiten visualización de numerosos procesos biológicos en los tipos de células retinianas distintas.
Abstract
La retina es un tejido complejo que inicia e integra de los primeros pasos de la visión. Disfunción de células de la retina es una de muchas enfermedades cegadoras y terapias futuras dependen de entendimientos fundamentales sobre cómo diferentes de la retina las células funcionan normalmente. Obtener esa información con métodos bioquímicos ha demostrado ser difícil porque las contribuciones de los tipos de la célula particular se disminuyen en el ambiente de células retinianas. En proyección de imagen retiniana puede proporcionar una vista de los numerosos procesos biológicos a nivel subcelular, gracias a un número creciente de biosensores fluorescentes genéticamente codificados. Sin embargo, esta técnica hasta el momento se ha limitado a los renacuajos y larvas de pez cebra, las capas más externas de la retinales de retinas aisladas, o proyección de imagen de resolución baja de retinas en animales vivos. Aquí presentamos un método para generar vivo ex vivo rebanadas de retina de pez cebra adulto vivo imagen mediante microscopía confocal. Esta preparación rinde rebanadas transversales con todas las capas retinianas y más tipos de células visibles para realizar experimentos de proyección de imagen confocales mediante perfusión. Pez cebra transgénico expresando proteínas fluorescentes o biosensores en tipos de células retinianas específicas u organelos se utilizan para extraer información de unicelular de una retina intacta. Además, rebanadas de retinales se pueden cargar con indicador fluorescente tintes, añadiendo a la versatilidad del método. Este protocolo fue desarrollado para la proyección de imagen Ca2 + en fotorreceptores del cono de pez cebra, pero con los marcadores adecuados podría adaptarse para medir Ca2 + o metabolitos en células de Müller, células bipolares y horizontales, microglia, células amacrinas o retina células del ganglio. El epitelio retiniano del pigmento se retira de rebanadas por lo que este método no es adecuado para el estudio de ese tipo de célula. Con la práctica, es posible generar seriales rebanadas de un animal para experimentos múltiples. Esta técnica adaptable proporciona una poderosa herramienta para responder a muchas preguntas sobre biología celular retiniana, Ca2 +y homeostasis de la energía.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en ampliamente utilizado en investigación científica básica y médica1, debido a su tamaño pequeño, rápido desarrollo y sistemas de órganos vertebrados. La transparencia natural de larvas de pez cebra combinado con métodos establecidos para transgénesis han permitido la visualización detallada de los procesos celulares en un animal vivo. Una serie de biosensores fluorescentes genéticamente codificados ha sido blanco específico de pez cebra células para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrógeno3, activación de apoptosis4 y ATP5.
En vivo la proyección de imagen de larvas de pez cebra ha llevado a avances en el campo de las neurociencias, incluida la asignación de cerebro los circuitos6 y7trastornos del desarrollo de medicamentos para el sistema nervioso central. Pez cebra son muy adecuadas para la investigación de visión porque sus retinas la estructura laminar y tipos de neuronas de vertebrados superiores, y muestran comportamientos visual robusto8,9. Varios tipos de degeneraciones retinianas análogas a la enfermedad en humanos han sido modelados con éxito y estudió en el pez cebra10,11, incluyendo proyección de imagen viva de los fotorreceptores individuales degeneren en una retina de2, 12.
Mientras que en vivo imágenes de larvas de pez cebra es una valiosa herramienta, se convierte en más difícil como peces crecen y desarrollan la pigmentación, y algunos tratamientos farmacológicos pueden impregnar un animal entero. Además, ciertos procesos celulares cambian con desarrollo y edad, haciendo más adelante momentos críticos para la función de la comprensión y la progresión de la enfermedad en animales adultos. Métodos bioquímicos como inmunoblot, quantitiative PCR, el consumo de O2 y análisis metabolómicos pueden proporcionar pistas importantes sobre la biología de la retina en su totalidad, pero es difícil distinguir las contribuciones individuales de tipos de células afectadas por de la enfermedad. Imagen tejido retiniano aislado ex vivo pasa por alto estas cuestiones y mientras que la proyección de imagen plana montados retinas ofrece una vista de la retina externa13, características retinianos internos más profundo se oculta. Rebanadas de retina transversal, tales como los presentados en análisis immunohistochemical, permiten una visión clara de todas las capas y tipos de la célula pero nadamas una sola instantánea de los procesos dinámicos implicados en la enfermedad y la función normal.
Aquí, presentamos un método para generar ex vivo transversal rebanadas de retina de pez cebra adulto para la proyección de imagen. Es similar a los métodos para la preparación de rodajas de retina de anfibios y peces cebra para estudios electrofisiológicos y morfológicos14,15, con modificaciones importantes para lapso de tiempo de imagen ex vivo con confocal microscopia. Respuestas de fluorescencia de biosensores o tintes en rodajas son monitoreadas en tiempo real con un microscopio confocal mientras que entregan los agentes farmacológicos mediante perfusión. Mientras que el método fue desarrollado por fotorreceptores la proyección de imagen, puede ser factible utilizar para visualizar las células de Müller, células bipolares, células horizontales, células amacrinas o las células ganglionares de la retina con marcadores fluorescentes apropiados. Además, se pueden cargar rebanadas con tintes fluorescentes permeable a la célula a la viabilidad celular de informe, transporte vesicular, función mitocondrial o estado redox. Esta preparación permite la visualización de una amplia gama de procesos subcelulares a lo largo de la retina, incluyendo dinámicas de Ca2 + , transduction de la señal y estado metabólico.
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Protocol
Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Washington institucional Animal Care y Comité de uso.
1. preparación de animales y equipos
Nota: El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es una hoja oscura de tejido que rodea el exterior de la retina cuya pigmentación puede ocultar características retinianas y daño del tejido cuando confocal ex vivola proyección de imagen. En la oscuridad, el RPE del pez cebra se retrae de la retina; oscuro se adaptan pescado para facilitar la extracción futura del RPE de la retina antes de corte y proyección de imagen.
- Transferencia de peces a un tanque de desove llenado con agua de pescado y luego Envuelva el tanque de desove con la tela oscura o colocarlo en un gabinete oscuro.
- Oscuro se adaptan pez cebra durante al menos 1 h antes de la eutanasia para permitir cerca de separación completa del RPE de la retina. adaptación de la oscuridad de 30 min es suficiente para eliminar la mayoría RPE, aunque pedazos de él pueden quedar intercalados entre fotorreceptores.
- Derretir ~ 15 mL de petróleo gelatina en un vaso de precipitados de 50 mL en una placa caliente y dibuje 3 mL del líquido en una jeringa de punta slip de 3 mL. Invertir la jeringa, colocar en un bastidor de tubo de ensayo y permitir a jalea de petróleo para enfriar.
- Hacer una cámara reutilizable de corte en un portaobjetos de microscopio simple de 7 X 2,5 cm.
- Usar esmalte de uñas claro, las líneas estrechas de la pintura para crear un rectángulo de 3 cm X 2,5 cm en el centro de la diapositiva, deje que se seque y luego agregar otra capa de esmalte de uñas a las líneas.
- Preparar imágenes escaleras en cubreobjetos para sostener rodajas durante proyección de imagen. Las rebanadas forman los "peldaños" de la escalera.
- Para la proyección de imagen estática o experimentos de inyección con flujo de la solución mínima, hacen escaleras de vaselina que consiste en dos tiras de plano ancho paralelas de vaselina sobre cubreobjetos de cristal cuadrado de 18 mm. Utilice la jeringa para aplicar dos aplanada ~ 1 cm largo los borrones de transferencia de vaselina por 0,5 cm de separación en la hoja de cubierta.
- Listo la máquina de cortar tejido.
- Limpiar una hoja de afeitar de doble filo con etanol y déjelo al aire seco. Córtela en cuartos con las tijeras, primero longitudinalmente en dos mitades y luego en cada hoja.
- Coloque la cámara de corte en el escenario de la máquina de cortar tejido, centro horizontalmente en el escenario y marcan un canto largo con marcador permanente para la alineación.
- Cargar una sección de la hoja en el brazo de la máquina de cortar de tejido, asegúrese que la cuchilla se encuentra plano y centrado en el portaobjetos sin tocar el esmalte de uñas, luego apriete suavemente el aparato de la hoja. Baje el brazo de la cuchilla mediante el ajuste de la perilla ¼ vuelta, entonces lugar un trozo de papel de filtro en el centro de la proyección de imagen de la cámara y prueba de corte. Si el papel no se corta a través, volver a montar la cuchilla.
- Usando la jeringa, colocar un punto pequeño de vaselina refrescado en un plato de Petri de 10 cm ~ 1,5 cm a la derecha del centro. Pulse una imagen escalera en ella con pinzas con la jalea de petróleo hacia arriba. Hacer otra pequeña vaselina punto ~ 1 cm desde el borde de entrada de la cámara de proyección de imagen.
- Montar la jeringa de vaselina con una aguja de 20g y lo destape. Mantenga la aguja sobre la jeringa y se usa para hacer dos tiras paralelas largo y fino de 1 cm de vaselina a lo largo en el centro de la cámara de corte. Espacio de las tiras de ~ 1 cm de separación.
- Hacer una herramienta de lazo de ojo de cable reutilizable envolviendo el centro de un ~ segmento de 4 cm de alambre de tungsteno de 30 g alrededor de un par de pinzas cerrada una vez. Ajustar el diámetro del lazo deslizando el cable hacia arriba o hacia abajo de las pinzas hasta que esté ligeramente más grande que un ojo de pez cebra, típicamente ~ 2-3 mm. retuerza los extremos del alambre y asegurar al final de un palo de madera de 6 cm con cinta de laboratorio.
- Preparar solución de Ringer.
- Descongelar 50 X suplemento solución (tabla 1) y añadir fresco a solución de Ringer tamponada con HEPES, no bicarbonato (tabla 2) la mañana del experimento; Diluya 200 μL de solución stock de suplemento en cada 10 mL de solución de Ringer en un tubo de centrífuga cónico o una botella de vidrio estéril. Para los experimentos de imagen estática, preparar por lo menos 30 mL de solución de Ringer por experimento. El volumen de solución de Ringer para experimentos de perfusión dependerá de la velocidad de flujo y tiempo total del experimento.
- Compruebe que el pH de la solución suplementado es usando una sonda de pH digital o papel de pH de 7.4 y ajustar en consecuencia a diluir NaOH o HCl.
- Oxigenar la solución de Ringer suplementado en hielo por burbujas de gas de oxígeno 100% durante al menos 5 minutos utilizando un regulador con una manguera y tanque de oxígeno médico estándar, o el colector de burbujeador de gas opcional para perfusión. Almacene la solución de Ringer oxigenada en el hielo en un tubo de centrífuga cónico sellada o en frasco estéril cerca del microscopio de disección; Utilice esta solución para la disección, la proyección de imagen y para diluir los tintes o agentes farmacológicos.
- Si se utilizan otras soluciones en el experimento, como Na+-libre de solución de Ringer (tabla 3), repita los pasos 1.9.1.-1.9.3.
- Recoger platos de Petri, pinzas, micro tijeras y otras herramientas cerca del microscopio de disección y preparar un baño de hielo de agua de peces para la eutanasia de peces cebra.
2. preparar rodajas retinianas (véase figura 1)
- Trabajar bajo luz ambiente para minimizar la adaptación a la luz (que puede hacer el palillo del RPE más firmemente a la retina), eutanasia pez cebra por inmersión en el baño de hielo hasta que se pierde la respuesta táctil, normalmente 1-2 min transferir el pescado a un plato de Petri y utilizar un bisturí para dislocarse cervical pero no descabezar el pescado.
- Utilice el bucle de alambre para aflojar el tejido conectivo alrededor de un ojo y luego tire hacia adelante el ojo suavemente con el lazo en una mano. Utilizando micro tijeras en la otra mano, corte del nervio óptico blanco debajo del ojo, teniendo cuidado de no para cortar la parte posterior del ojo.
- Transferir el ojo con unas pinzas a un plato de Petri, solución de Ringer frío en hielo y repita para el segundo ojo. Mantener los ojos en la oscuridad o bajo luz roja hasta que el RPE se retira de la retina.
- Diseccionar las ojeras bajo un microscopio de disección de bajo poder en una gota de solución de Ringer frío sobre un portaobjetos de vidrio llano en una placa Petri.
- Perforar la córnea con unas pinzas finas, a continuación, retire suavemente los trozos del claro, quebradizo y esclera plateada con pinzas o tijeras. Retire y deseche el objetivo y la mayor parte de la esclerótica (véase figura 1A) y el ocular aislado como mínimo.
- Pedazos de grasa, trocitos de esclera y negro RPE pueden permanecer Unidos a la ojera y quitado más adelante de la retina. Si la retina se separa del RPE en paso 2.4.1, proceder con los mismos pasos con precaución para no dañar la delicada retina aislada.
- Coloque el lado abierto de la ojera hacia abajo (RPE para arriba) en la diapositiva y cortar en tercios o cuartos con una cuchilla de filo único fresco en un solo movimiento (ver figura 1B). Descartar piezas de tejido que son muy curvas.
- Montaje plano de retina en papel de filtro.
- Moje un pedazo de papel de filtro con solución de Ringer y colocar en la diapositiva junto a las piezas del cilindro. Use pinzas planas al manipular el papel de filtro húmedo intacto para evitar pincharlo. Añadir solución de Ringer frío para cubrir el papel filtro y el tejido.
- Cuidadosamente usando pinzas en cada mano, arrastre el papel de filtro debajo de cada pieza ocular con el EPR y fotorreceptores hacia arriba, es decir, con la parte posterior del ojo hacia arriba. Coloque las piezas del ocular en una sola línea a lo largo del centro del papel filtro (ver figura 1). Manejar las piezas ocular suavemente con unas pinzas finas sólo cerca de un borde o esquina.
- Para ayudar a retinas se adhieren al papel de filtro, colocar el papel filtro húmedo en una toalla de papel seca para 3 s absorberá humedad hacia abajo, pero no deja que el tejido sea seco. Repita hasta que las piezas del cilindro se encuentran en el papel de filtro. Aplicando una succión suave en la parte inferior del papel filtro ayuda a aplanar la retina, pero este paso no es esencial.
- Si negro hojas de RPE se quedan en las piezas del cilindro, utilice pinzas finas pelar suavemente lejos a partir de una esquina (ver figura 1) mientras que el tejido está sentado en una gota de solución de Ringer. Debe la retina levantar el papel de filtro, repito el paso mecha en 2.5.3. La retina puede aparecer rosada por los pigmentos visuales sin blanquear.
- Repita la disección de la retina y planos de montaje medidas en 2.4-2.6 para el segundo ojo, si lo desea, manteniendo la primera retina plana montada inmersa en solución de Ringer frío. Para agilizar el procedimiento de corte, piezas de ambas retinas se pueden colocar en un papel de filtro. Una vez que se ha eliminado el RPE, el protocolo puede realizarse bajo la luz de la habitación normal a menos que experimentos requieren oscuridad.
- Coloca el papel filtro sobre un portaobjetos y recortar en un rectángulo con un solo filo, dejando ~ 0,5 cm de papel de filtro a cada lado de la línea de retinas. Hacia el papel de filtro de la cámara preparada de corte, empuje los bordes de papel de filtro largo de las líneas fina de vaselina con unas pinzas y sumerja las retinas en 3-4 gotas de solución de Ringer frío.
Nota: Algunos colorantes, tales como colorantes lipofílicos, se cargan mejor en montajes planos en esta etapa antes de rebanar. Estos pueden ser cargados, malvados lejos con un pañuelo y lava en la cámara de corte. Por ejemplo, C12 558/568 BODIPY manchas intensamente retiniana de la célula membranas y segmentos externos del fotorreceptor (ver Figura 4A) cuando carga en ~ 5 μg/mL durante 15 min a temperatura ambiente (típicamente 23-27 ° C), seguido de un lavado en solución de Ringer exceso . - Transferencia de la cámara de corte para la etapa de cortar tejido, coloque el borde largo a lo largo de la línea marcada y fije los extremos de la cámara al escenario con la cinta de laboratorio. A partir de un extremo, corte la retina y el papel de filtro, ejerciendo una presión firme y suave en el brazo de corte. Compruebe que el primer segmento fue cortado completamente, entonces use el micrómetro para cortar ~ 400 μm rebanadas.
- Ensamble la escalera por imágenes.
- Lugar la cámara de corte con secciones retinianas en rodajas en el plato de Petri del paso 1.7 adyacente a la proyección de imagen de escalera (ver Figura 1E). Llene el plato con solución de Ringer frío para sumergir su contenido.
- Con unas pinzas y mantener sectores sumergidos, transferir suavemente las tiras de papel de filtro y de la retina a la escalera deslizando la caja Petri de izquierda a derecha. Tenga cuidado de no para tocar la retina directamente. Gire las rebanadas de 90° y enterrar los bordes del papel de filtro en vaselina.
- Finalmente coloque rebanadas retinianas en la escalera con pinzas para que capas retinianas son claramente visibles bajo el microscopio de disección (ver figura 1). Para rebanadas en cada extremo de la escala, asegúrese de que el tejido quede hacia adentro hacia las otras rebanadas para minimizar el movimiento del tejido durante la inyección o flujo. Deseche cualquier retinales sectores que no están bien adheridos al papel de filtro (ver figura 2A).
- Si lo desea, carga colorantes en rodajas retinianas en esta etapa y lavar en solución de Ringer exceso antes de la proyección de imagen.
Nota: Yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33342 robusta mancha de núcleos de muertos y todas las células, respectivamente (ver figura 2B), cuando se incuban con rebanadas de retinales a 5 μg/mL durante 20 min a temperatura ambiente. Tetramethylrhodamine (TMRM) se acumula en las mitocondrias respiran activamente a lo largo de la retina cuando se incuban en 1 nM durante 30 min a temperatura ambiente. - Mientras que las rebanadas están manchando, preparar el aparato de inyección y cámara de proyección de imagen. Utilice la jeringa para lavar el tubo con solución de Ringer purgar burbujas, conecte el extremo abierto de la tubería a la entrada de cámara imagen y cerrar la llave de paso. Retire la jeringa y llenar con reagent(s) para la inyección, después lo vuelva a colocar a la tubería.
- Use pinzas para transferir el cubreobjetos con las rebanadas de la retinales a la cámara de proyección de imagen, presiona el cubreobjetos en el punto de jalea de petróleo cerca del borde de entrada de la cámara de proyección de imagen (ver figura 1 H). Llene la cámara de proyección de imagen con solución de Ringer para cubrir las rebanadas.
3. la proyección de imagen retinianas rebanadas
- Coloque la cámara llenada de imágenes con el aparato de inyección conectado en el escenario de un microscopio confocal vertical equipado con un 20 o 40 X lente de inmersión. Asegure la cámara de proyección de imagen con los clips de la etapa.
- Baje el lente de inmersión sobre la escalera y centrarse en un segmento en un extremo de la escala bajo la tenue luz trans iluminado. Examinar cada rebanada de orientación transversal, presencia de segmentos externos del fotorreceptor y la adherencia segura para el papel de filtro.
- Seleccione el mejor segmento para obtener imágenes de lapso de tiempo y configurar el software del microscopio para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Tabla 4 describe la configuración de imagen típicos para varios marcadores fluorescentes y tintes.
Nota: La tasa de adquisición de la imagen variará dependiendo el proceso biológico en estudio, microscopio y marcador fluorescente. Por ejemplo, utilizar resolución de 800 x 800 píxeles, velocidad de exploración de 2 μs/pixel y una velocidad de fotogramas de 10-s para la proyección de imagen dinámica del calcio en fotorreceptores con GCaMP3 y un colorante rojo.- Si está disponible, utilice el software para rastrear señales físicas en la rebanada (segmentos externos del fotorreceptor, cuerpos celulares, núcleos) a la ayuda potencial reorientación durante el lapso de tiempo. También configurar el software para controlar fluorescencia en tiempo real a través de la rebanada.
- Comienza la proyección de imagen y monitor de referencia fluorescencia. Cuando la fluorescencia a través de la rebanada se estabiliza (normalmente dentro de 2-5 min), continuar con el experimento. Para la inyección, abrir la llave de paso de la jeringa, luego lentamente Presione y tire hacia atrás del émbolo dos veces para facilitar la mezcla.
Nota: por ejemplo, abolir la función mitocondrial mediante la inyección de una solución concentrada de protonophore CCCP para alcanzar una concentración final de 1 μm en la sala de proyección de imagen. Esto induce robusto Ca2 + en citosol de fotorreceptor reportado por GCaMP y luego una disminución constante de potencial de membrana mitocondrial por TMRM. - Estrechamente monitorizar segmentos de deriva durante el experimento y utilizar el software para micro-ajustar según hitos físicos. Por lo general deriva en la dirección Z durante la inyección o perfusión es < 5 μm.
4. la proyección de imagen retinianas rebanadas durante experimentos de perfusión que cambió o fluía continuamente soluciones
Nota: Proyección de imagen retiniana rebanadas durante experimentos de perfusión donde las soluciones cambian o fluía continuamente es similar a la configuración para los experimentos de imágenes o inyección estática, con las siguientes modificaciones.
- En vez de vaselina se describe en el paso 1.4 escaleras de mano, use resistentes escaleras de cera para sostener rodajas retinianas constante durante el flujo de la solución.
- Colocar dos pequeños cilindros paralelos de cera dental de ~ 0,5 cm de separación en un cubreobjetos. Sobre una superficie plana, use un dedo para presionar cada cilindro hacia abajo y hacia fuera hacia el borde paralelo del cubreobjetos. Puntuación de ambos cilindros aplanados horizontalmente con un cubreobjetos de #1 entonces (véase la Figura 1E, lado derecho) Untar una capa delgada de vaselina entre las tiras de cera con una espátula.
- Al montar la imagen escalera paso 2.10.2, presione los bordes del papel de filtro en rodajas en las puntuaciones de la cera con unas pinzas finas (figura 1).
- Para configurar para perfusión en paso 2.12, jeringa embalses se llenan de soluciones preoxygenated, o utilice el colector de gas opcional para oxigenar las soluciones en cada depósito. Lave todos los tubos con solución de Ringer, asegurar que todas las líneas de fluyen cuando abre y purga grandes burbujas.
- Antes de llenar la cámara de proyección de imagen en el paso 2.13, utilice la jeringa para colocar otro punto de jalea de petróleo sobre cada esquina expuesta del cubreobjetos para evitar que se deslice lateralmente durante el flujo.
- Cuando la cámara de proyección de imagen se llena y se monta en la platina del microscopio, encienda el aspirador y conecte el tubo del aspirador. Prueba el flujo de solución de Ringer y el micropositioner para situar el tubo de aspirador sobre la cámara de salida para que pequeñas cantidades de líquido se extraen antes de que la cámara se desborda (típicamente ~ 1 mm por encima de la superficie de la solución para un caudal de 2 mL/min). Mantener la solución de Ringer, que fluye al seleccionar sectores en el paso 3.4.
- Para realizar el experimento en el paso 3.4 para perfusión, interruptor de flujo de soluciones cerrando la llave de paso de la primera solución de apertura de la segunda solución.
- Por ejemplo, para agotar el Na extracelular+ de la cámara de proyección de imagen, utilice dos embalses de jeringa llenados con solución de Ringer Na+-libre de solución (cuadro 3). Flujo de solución de Ringer para establecer línea de base, luego cambiar a Na+-libre de solución. Esto resulta en grandes citosólica Ca2 + aumenta en los segmentos externos del fotorreceptor y cuerpos de la célula (ver figura 4).
- Para sistemas de gravedad de la perfusión, controlar el nivel de solución en cada presa para que el flujo es constante durante la proyección de imagen. Superior de embalses según sea necesario con soluciones oxigenadas o mantener oxígeno continuo burbujeo con el colector de gas.
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Representative Results
Colocación estable y orientación transversal de rebanadas son clave para la proyección de imagen exitosa con inyección o perfusión de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine y colocar rebanadas antes de la proyección de imagen confocal según sea necesario para asegurar que todas las capas retinianas son visibles (figura 2A, sector ii). Si se hace girar un trozo ligeramente hacia adelante (figura 2A, sector iii), paquetes de segmentos externos será visibles y pequeños ajustes pueden realizarse con pinzas para poner las capas retinianas deseadas en foco. Rebanadas mal adhirieron al papel filtro (figura 2A, cortar i) o RPE de retención (figura 2A, cortar iv) no debe utilizarse para obtener imágenes de lapso de tiempo.
Viabilidad de las células es fundamental para observar los procesos fisiológicos ex vivo; una viabilidad celular mancha tales como yoduro de propidio (PI) se recomienda analizar la salud celular y practicar corte de retina. Células muertas cerca del borde de corte de todos los sectores acumularán PI en sus núcleos (figura 2B, los paneles de la izquierda), mientras que 5-10 μm más profundas en la división, las células sanas con morfología normal y ninguna coloración de la PI pueden ser reflejadas. Por ejemplo, en fotorreceptores, células negativas PI debajo del borde de corte comúnmente mostrar una morfología polarizada, alargada estereotipada (figura 2B, los paneles de la derecha). Fotorreceptores siguen siendo viables en rebanadas retinianas durante al menos 4 horas cuando se almacena en solución de Ringer oxigenada.
Muchas estructuras de la célula retiniana pueden visualizarse utilizando combinaciones de marcadores transgénicos y colorantes; imágenes confocales ejemplo de frescas rebanadas retinianas con etiquetas fluorescentes dobles y triples se presentan en la figura 3. Para visualizar la dinámica de cono fotorreceptores retículo endoplásmico (ER) en relación con el núcleo, rebanadas de retinales de peces transgénicos expresando GFP dirigida a cono ER17 pueden ser contratinción con un colorante nuclear (Figura 3A). Una estrategia similar se puede emplear para ver el citoesqueleto de actina con rebanadas de retinales de pez cebra transgénico expresa actina fusionada a GFP18 (figura 3B). Con otro promotor específico de célula, las células de Müller pueden ser etiquetadas con la proteína fluorescente roja tdTomato19 y visualizadas en rebanadas retinianas (figura 3, panel superior). La captación de glucosa en la retina puede ser ensayado en vivo por vía oral gavaging pez cebra adulto con un fluorescente de glucosa análogo (NBDG), que se incorpora en las células visibles en una rebanada retiniana21 (figura 3, panel inferior). Pez cebra transgénico doble puede ser empleado para controlar múltiples procesos celulares o tipos de células en tándem, como Ca2 + dinámica en un subtipo de conos. Figura 3D muestra un triple esquema de etiquetado para este tipo de experimento, con tdTomato expresada en conos de longitud de onda larga2 orientada a mitochondrially Ca2 + sensor (mito GCaMP) expresado en los conos22 y una tinción nuclear.
Imágenes de lapso de tiempo de células de la retina son una ventaja clave de esta preparación para el corte. Por ejemplo, fluctuaciones de Ca2 + en citosol de fotorreceptores del cono pueden ser observadas y posteriormente cuantificadas durante manipulación farmacológica, un experimento que se muestra en la figura 4. Figura 4A muestra retinianas rebanadas expresando el Ca2 + sensor GCaMP2 (arriba) o control eGFP16 (abajo) en fotorreceptores del cono contratinción con un rojo tinte lipofílico. En este experimento Na+ isotonically se agota de la cámara de proyección de imagen usando la perfusión, evocando grandes aumentos en citosólica Ca2 + por el segmento externo y el cuerpo de la célula como se refleja por la GCaMP (Figura 4A, panel superior). Fluorescencia de retina rebanadas expresando Ca2 +-eGFP insensible se ve afectada por este tratamiento (Figura 4A, panel inferior). Películas de lapso de tiempo pueden ser analizadas utilizando el software ImageJ para aislar y cuantificar las respuestas de la fluorescencia de segmentos externo solo cono, cuerpos celulares y las sinapsis (Figura 4B).
| Complementar la solución | ||
| 50 x bolsa * concentración (mM) | concentración de trabajo (mM) | |
| D-glucosa | 500 | 10 |
| lactato de sodio | 50 | 1 |
| piruvato de sodio | 25 | 0.5 |
| L-glutamina | 25 | 0.5 |
| glutatión reducido | 25 | 0.5 |
| ácido ascórbico | 15 | 0.3 |
| * almacenar alícuotas a-20 º c < 6 meses; Añadir fresco a solución de Ringer | ||
Tabla 1. Componentes de 50 X complementan la solución madre y concentraciones finales de trabajo.
| Solución de Ringer | |
| concentración (mM) | |
| NaCl | 133 |
| JCM | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH a 7,4 con NaOH | |
| almacenar a 4 º c en frasco estéril < 1 mes | |
Tabla 2. Componentes de la solución estándar de Ringer.
| Na+-libre de solución de Ringer | |
| concentración (mM) | |
| TRIS | 147 |
| ICM | 120 |
| JCM | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH a 7.4 con HCl | |
| almacenar a 4 º c en frasco estéril < 1 mes | |
Tabla 3. Componentes de Na+-libre de solución de Ringer.
| Configuración de la proyección de imagen confocal | |||
| Fluoróforo | Excitación | Filtro de emisión de | |
| Longitud de onda | Intensidad del laser | ||
| GFP (incluyendo GCaMP) | 488 nm | 2 - 5% | eGFP o AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 nm | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10% | eGFP o AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
Tabla 4. Condiciones de la proyección de imagen para marcadores fluorescentes y tintes presentados en las figuras 2-4.
Figura 1. Esquema para la preparación de pez cebra dulce retina rodajas. (A) a diseccionar la ojera y deseche el lente y esclerótica (paso 2.4.1.). (B) corte el cilindro en tres pedazos; Deseche la pequeña arista (paso 2.4.2.). (C) arrastre papel filtro bajo pedazos de ocular con la retina interna hacia el papel de filtro (paso de 2.5.1.-2.5.2.). (D) retina aplane utilizando una toalla de papel para mecha solución de Ringer hacia abajo a través del papel de filtro (paso 2.5.3), luego suavemente pelar lejos restante RPE con fórceps (paso 2.6). Pasar el papel filtro a la cámara de corte en la etapa de cortar tejido y cortar rodajas de μm 400 (pasos 2.8., 2.9.). Transferencia (E) cortar cámara con láminas y una escalera de cera o jalea de petróleo para un plato de Petri, solución de Ringer (paso 2.10.1.). (F) utilice pinzas finas para deslizar rodajas solo de la cámara de corte para la escalera manteniendo rodajas sumergidas. (G) papel de filtro gira tiras (negro) 90 ° y enterrar los bordes del papel de filtro en cera o vaselina (pasos 2.10.2.-2.10.3.). (H) esquema de la cámara de proyección de imagen final cargado de una escalera y rebanadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ejemplos de retina de pez cebra frescas rebanadas de mostrar adhesión apropiada para el papel de filtro y la viabilidad celular. (A) imagen trasmitida de frescas rebanadas retinianas en una escalera de jalea de petróleo. Segmentos ii y iii muestran buena adherencia y transversales capas retinianas. Sectores i y iv han conservado sustancial RPE, o son altamente curvada y no bien adheridos para el papel de filtro y no debe ser reflejadas. Barra de escala = 200 μm. Z de arriba hacia abajo (B) montaje una fresca rebanada retina de pez cebra transgénico que expresan eGFP en los fotorreceptores del cono (Tg(gnat2:eGFP)16). Colorante Hoechst etiquetas todos los núcleos; (PI) el yoduro de propidio contratinción etiquetas de núcleos de células muertas, que aparecen cerca del borde del corte de la rebanada (izquierda). El tamaño de paso Z-stack = 1 μm; barra de escala = 20 μm. condiciones de proyección de imagen fluorescente se detallan en la tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Muestra de imágenes confocales de marcado de doble y triple ex vivo rebanadas retina de pez cebra transgénico de adulto. (A) esquema de dos colores que emplean transgénico GFP había marcado retículo endoplasmático en conos (Tg(gnat2:calr-GFP)17, arriba) con Hoechst contratinción nuclear (azul, abajo). (B) GFP marcado actina en conos (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, arriba) con Hoechst contratinción nuclear (azul, abajo). (C) RFP etiquetado como las células de Müller (Tg(GFAP:tdTomato)19, arriba) de un pez cebra alimentados fluorescente glucosa (NBDG) que demuestran la absorción de glucosa en conos20,21 (verde, parte inferior). (Esta imagen es de figura 2B de Kanow, et al. 21) (D) ejemplo de la proyección de imagen tricolor utilizando el pez cebra transgénico doble. Izquierda, convocatoria dirigida a los fotorreceptores del cono de longitud de onda larga (Tg(trβ2:tdTomato)2). Centro, biosensores de calcio GCaMP dirigida a las mitocondrias cono fotorreceptores (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). Derecha, se superponen imágenes de tdTomato (magenta), mito-GCaMP (verde) y Hoechst contratinción nuclear (azul). Las imágenes son Z-proyecciones de máxima intensidad de 9 marcos sobre 7 μm tejido de profundidad; barras representa 10 μm. fluorescente imágenes condiciones de escala se describen en la tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. CA2 + proyección de imagen con GCaMP y control eGFP. (A) imágenes representativas de frescas rebanadas retinianas expresando el fluorescente Ca2 + biosensor GCaMP (gnat2:GCaMP32, arriba) o eGFP (abajo) en fotorreceptores del cono. Izquierda, rodajas basales; derecha, rodajas de 2 min después de Na+ isotonically estaba agotado de la cámara de imágenes con perfusión de solución de Ringer en base de Tris, que atrapa el Ca2 + en fotorreceptores. Barras de la escala = 10 μm. condiciones de proyección de imagen fluorescente se detallan en la tabla 4. (B) significan cambios de fluorescencia de compartimientos solo fotorreceptores (segmentos externos, cuerpos de la célula y sinapsis) durante la proyección de imagen de lapso tiempo de agotamiento de Na+ . Fueron imágenes de rebanadas cada 10 s, pilas se procesaron utilizando el ImageJ y fluorescencia de GCaMP o eGFP fue normalizada para la señal del tinte de la membrana. Líneas sólidas, GCaMP (n de segmentos externos = 15, cuerpos de la célula = 24, sinapsis = 26); las líneas punteadas, eGFP (n para segmentos externos = 26, cuerpos de la célula = 20, sinapsis = 31). Barras de error representan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Ex vivo la proyección de imagen de pez cebra frescas rebanadas retiniana ha demostrado para ser una herramienta versátil para el estudio de fotorreceptor biología20,21,22y es el única que permite el análisis de células individuales en una madura totalmente diferenciados retina. Con la práctica, es posible realizar múltiples experimentos con el tejido de un solo pez, incluso usando rebanadas seriales de la misma parte de la retina. Además de los retos y sugerencias con respecto a la preparación de rodajas de retina de anfibios para electrofisiología estudios14, hay consideraciones importantes para experimentos de imagen.
Para fotorreceptores, viabilidad celular generalmente se correlaciona con la morfología de la célula, por lo que es importante manejar la delicada retina mínimamente, particularmente después de que el EPR se ha eliminado. Después de cortar, usar pinzas finas para Deslice cuidadosamente rebanadas horizontalmente de la cámara de corte (Figura 1F) para transferirlos a la escalera en lugar de rebanadas de elevación hacia arriba y mantenga rodajas sumergidas en solución de Ringer. Si es posible, ensamble la escalera de retinales rebanadas cerca del microscopio confocal para minimizar el daño a rodajas de agitación durante el transporte.
Fuerte adherencia de tejido retiniano para el papel de filtro es fundamental para la creación de sectores que permanecerán estables durante experimentos de inyección o perfusión. Es necesario inspeccionar cuidadosamente cada rebanada para morfología y estabilidad justo antes de la proyección de imagen (figura 2A); golpeando suavemente la mesa del microscopio mientras viendo el movimiento de la rebanada a través del lente ocular confocal revela estabilidad de un sector particular. A pesar de las precauciones, deriva en la dirección Z durante la inyección o perfusión puede presentar desafíos para el análisis, por lo que es útil cargar un tinte de control, como lipofílico tintes para las membranas y las mitocondrias, para estable una estructura identificable de la célula para la etiqueta Normalización (Figura 4A, magenta). Si rebanadas deriva > 10 μm en la dirección Z no puede ser posible extraer datos utilizables de unicelulares. Moderada dispersión en la dirección X-Y puede ser corregido en post-procesamiento usando software de registro como MultiStackReg de ImageJ (RRID:SCR_002285).
En condiciones estáticas, fluorescencia de marcadores en rebanadas retinianos debe permanecer estable, aunque photobleaching puede ocurrir durante la proyección de imagen. Debe tenerse cuidado para minimizar la exposición de láser durante lapsos por parámetros como la intensidad del láser de refinación, exploración de la velocidad y velocidad de fotogramas. La proyección de imagen se recomienda utilizar para cada marcador fluorescente utilizado. Los controles incluyen inyección perfundiendo solución de Ringer sin agentes farmacológicos en experimentos separados o realizando experimentos de proyección de imagen con marcadores no biosensor que es constitutivamente fluorescente.
Según el láser confocal de excitación se utiliza, pigmentos en el RPE pueden contribuir a Autofluorescencia y aun generar calor durante la proyección de imagen, por lo que es importante eliminar la mayor parte de este tejido antes de rebanar. SIDA de animales Dark-Adapting en la eliminación del RPE minimizando el daño a la retina subyacente. Incapacidad del RPE de la imagen es una limitación de esta preparación de rebanada, aunque esto puede superarse utilizando animales albinos con un RPE transparente. Otra limitación es que las células ganglionares de la retina y los pies del final de las células de Müller pueden ser oscurecidos desde vista por el papel de filtro; como una preparación alternativa retinas pueden ser planas montados con el lado del fotorreceptor hacia abajo en el papel de filtro y luego en rodajas para proporcionar una visión más clara de la retina más íntima. También es importante tener en cuenta que proyecciones largo horizontales de algunas células, como células amacrinas de campo ancho, pueden ser roto durante la disección o corte. Una limitación final es que muchos tintes fluorescentes se acumulan un en segmentos externos del fotorreceptor, por lo de esta parte de la retina es recomendable biosensores uso genéticamente codificada en lugar de tintes de indicador.
Dado el amplio rango de reportero disponibles célula fluorescente tintes23,24 para el tejido y genéticamente codificado biosensores fluorescentes utilizados con éxito en el pez cebra2,3,4, 5, esta preparación rebanada podría utilizarse para estudiar numerosos procesos biológicos en varios tipos de células retinianas (ver ejemplos en la figura 3, figura 4). Imágenes frescas rebanadas retinianas mediante microscopía de superresolución de células vivas también podrían ofrecer emocionantes nuevas perspectivas para la función retiniana y la salud en un nivel subcelular. Además, este método puede adaptarse para ex vivo la proyección de imagen de ratón rebanadas retiniana25. Mientras la exitosa preparación de frescas rebanadas retinianas requiere práctica, es una poderosa herramienta que es útil para abordar una amplia gama de cuestiones biológicas específicas de la célula en una retina madura.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a Ralph Nelson y Daniel Possin orientación reflexiva en el desarrollo de este protocolo y Eva Ma, Ashley George y Gail Stanton para la generación de líneas de pez cebra transgénico estable. El trabajo fue apoyado por NSF GRFP 2013158531 a M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. y M.G. y EY026020 a J.H. y S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
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