Summary
本研究では、脳、心電図、筋電図、局所電界電位の同時計測と自由行動ラットの信号を呼吸するためのメソッドを紹介します。この技術は、実験のコストを削減し、データの分析を簡素化は、脳と末梢器官との間の相互作用の理解に貢献します。
Abstract
動物の感情的な課題と変化にさらされている脳コントロールで機能と内臓のリズムを体する方法に関する質問の数に対処するために必要な脳と末梢組織の生理的動態は、生活環境。一般に実験、脳や心臓など、さまざまな器官からの信号は、データ ファイルを処理するための複数の録音デバイスと異なる手順を必要とする独立した記録システムによって記録されます。本研究は、複数の脳の領域、心臓のリズムを表す心電図、目を覚ましを表す筋電図局所電界電位の数十を含む電気の生体情報を同時に監視できます新しい方法を記述/睡眠に関連する筋肉の収縮と自由行動ラットにおける信号を呼吸します。このメソッドの記録構成は皮質のローカル フィールド潜在的な記録電極の数十に対応し、これらの電極から得られる信号が 1 つに統合されている従来のマイクロ ドライブ配列に基づいてください。電気キャビネットは、動物の頭にマウント。ここでは、この記録システムの改良だったので末梢器官からの信号にも電気的インタ フェース ボードに転送。シングルの手術で電極が個別に適切な体の部分や対象脳領域に埋め込まれた最初。すべてこれらの電極のオープン エンドは、動物の頭の上の電気基板の個々 のチャンネルにはんだ付け、信号のすべてが単一の電気ボードに組み入れることができます。実験のコストを削減し、同じデータ ファイル内のすべてのデータを処理できるので、データ処理を簡素化する 1 つのデバイスにすべての信号のコレクション録音デバイスにこのボードを接続することができます。この手法は、中枢および末梢の器官間のアソシエーションの神経生理学的相関の理解に役立ちます。
Introduction
中枢神経系は様々 な環境変化に対応した身体の状態を制御し、このコントロールは、通常、心拍数、呼吸数と筋収縮の変化として表されます。ただし、いくつかの研究は、このような末梢の生理的要因が皮質活動に関連付けられている方法をテストしています。この問題を解決するには、は、中枢および末梢組織から電気の生体情報を監視するための大規模な記録方式が必要です。大脳皮質では、ローカル フィールド (LFP) シグナル細胞外皮質組織1,2,3に挿入される電極によって記録されます。ラットやマウスなどの小型哺乳類の皮質領域から複数の LFP 信号を同時に記録するには、多くの研究は、マイクロ ドライブと呼ばれる特注電極アセンブリの様々 なタイプを開発しました。従来のマイクロ ドライブは (これは通常管四極管) 電極、ネジや電極対応コア ボディと金属の穴に対応する電気的インタ フェース ボード (EIB) の中間部分に接続されている金属製のネジから成る(図 1図 2、および図 3) 電極の開いた端部を接続します。この電極アセンブリ多くの電極を数日から数週間、もちろん脳に挿入の深さをコントロールすることが可能でき、動物は様々 な挑戦として、神経活動を長期的な慢性的な記録の実施行動のタスク。末梢器官のハートビート信号はや4,エリア65,の心、周りに注入されている電極の組み合わせによって心電図 (Ecg) として記録され、骨格筋の信号を記録電極で筋電図 (筋電図) として筋組織7,8,9に挿入されました。単一ユニットの録音10,11で嗅球の電気信号と呼吸 (BR) との関係を調べた。従来の録音システムでさまざまな組織からこれらの信号によってキャプチャされた独立した録音デバイス追加実験システムが正確にこれら複数のデバイスを同期する必要があることを意味同時脳体信号の録音。このシステムは、この問題を克服するために開発されました。このシステムでは、心電図、筋電図、呼吸のリズムを反映する嗅球からの電気信号など末梢の器官から記録されたすべての電気信号が単一のマイクロ ドライブ アレイ1,2 に統合します。 ,3, ここで統合のマイクロ ドライブ アレイと呼ばれます。このシステムは 1 つだけマルチ チャンネル記録装置を必要とし、任意の従来のマイクロ ドライブの配列に適用されます。この手法の利点はそれにより信号のすべてが同じタイプのデータとして記録されるのでより便利なデータ処理のため特別なデバイスまたは複数のデバイスの録音時間に合わせてトリガー信号を必要としないことです。この手法は、中枢および末梢の器官間のアソシエーションの神経生理学的相関の理解に役立ちます。本技術に関連する手順をについて説明します、ラットから得られる代表的なデータセットを提示します。
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Protocol
動物を対象とする手順のすべては、ケアとの動物の使用のための NIH のガイドラインに従って行われました。
1. 統合のマイクロ ドライブ アレイの準備
- 1,2,3他の所で記述として皮質 LFP 録音用マイクロ ドライブ アレイを作成します。1.2 に従ってバイオフレックス ワイヤに接続されている心電図、筋電図、BR チャンネルとして用電極インタ フェース ボード (EIB) に少なくとも 6 のまま金属の穴を開きます。
- 長さの 5.0 cm 皮ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) を 6 個セットにバイオフレックス カットワイヤ ~5.0 mm の長さを持つすべてのワイヤー部分の両端のコーティングに各開いている金属穴 (心電図、筋電図、BR チャンネル) の 1 つにワイヤー部分の一端を接続、。 金のピンと EIB。
- 2 つの 5.0 cm 部分にエナメル線をカットします。各 EIB (図 3を参照してくださいも以前論文12,13) の地面/参照 (g ・ r) チャンネルにこれらのワイヤの一方の端をはんだ付けします。
- 心電図用電極、2 つの 16 cm 部分にバイオフレックス カットワイヤを備える。~5.0 mm 片側 (短い方の端)、もう一方の端 (長い方の端) 〜 15 mm の長さでこれらのワイヤーの部分の両端の PTFE コーティングをはがします。
- 2.0 mm の直径をワイヤー リングを形成すると、ワイヤの長い方の端を曲げ、はんだ付けによるリングの形状を修正します。
- 筋電図電極の作製、バイオフレックス ワイヤーの長さの 8 cm の皮 ~5.0 ミリメートルの長さとこれらのワイヤー部分の両端から PTFE コーティングをオフで 2 枚にカットします。
- バイオフレックス ワイヤーの長さの 6.0 cm 皮 ~5.0 の長さとこれらのワイヤーの部分の両端のエナメル コーティングをオフで 2 個に切口の BR 電極、準備の mm はんだステンレス鋼ねじ (幹径の頭にこれらのワイヤーの作品のそれぞれの一方の端計: 1.0 mm、茎の長さ: 4.0 mm)。
- (Gr) の地面/参照電極の作製、カットの長さの 6.0 cm 皮 ~5.0 ミリメートルの長さとこれらのワイヤーの部分の両端のエナメル コーティングをオフで 2 個にエナメル線半田ステンレス st の頭にこれらのワイヤーの部分のそれぞれの一方の端うなぎネジ (茎の直径: 1.4 mm、茎の長さ: 3.0 mm)。
- ガスはすべての電極とステンレス ボルトを消毒、クリーンな空間でこれらを維持します。
2. 心電図・筋電図電極の注入
メモ: は、滅菌手袋、オートクレーブ器を用いた無菌法による手術のすべての手順を実行します。切開の作成を含むすべての手順については、前に、70% エタノールで皮膚を殺菌し、手術用ドレープを使用して切開をカバーします。
- 麻酔を修正 (1.0 3.0% イソフルラン ガス) ラット フラット熱パッドの裏面。ブプレノルフィンを鎮痛薬として与えます。獣医軟膏を乾燥を防ぐためにラットの目に配置します。皮膚の表面をきれいに betadine を使用します。
- 内側胸の地域で ~2.0 cm の切開を行います。胸の筋肉を分離することによって肋間筋を公開します。肋間筋に ECG 電極のリングを縫合します。
- 熱パッドを動物の胃を修正します。背側頸部に ~1.0 cm の切開を行います。
- 胸部切開皮下心電図電極を挿入します。背側頸部に両端をスライドさせ、首の切開からそれらを引き出します。胸部切開部を縫合します。
- 筋電図電極を皮下首切開 ~2.0 センチメートルの長さのそれぞれの一方の端を挿入します。縫合によって首の筋肉の筋電図電極を修正します。
3. 統合マイクロ ドライブ アレイと BR 電極の注入
- 脳定位固定装置のラットを修正します。頸部に目の間のポイントから正中線に沿って頭の上 ~3.0 cm の切開を行います。頭蓋骨を公開します。
- 直径 0.7 〜 1.0 mm 11.0 mm 前方と 1 mm の嗅球上の 2 つの円形 craniotomies 両側に加える前高速ドリルで。インプラントの頭蓋骨の 2 BR 電極までネジ茎の先端が脳の表面に付着した.
- 前に両側の 0.7 〜 1.0 mm 以上前頭皮質 2.7 mm 前方と 2.7 mm の直径を持つ 2 つの円形 craniotomies を加えます。ネジ幹の先端が脳の表面に接続されるまでは、頭蓋骨の 2 つの g/r 電極をインプラントします。
- 周辺に大規模な開頭術 6 ~ 8 直径 1.0 mm の穴を作る。インプラント アンカーのネジ (茎の直径: 1.4 mm、茎の長さ: 3.0 mm) 頭蓋内。
- 前に二国間の 3.8 mm 後方に, と海馬の上 ~2.0 mm、2.5 mm の直径の円形開を加えます。ドライブ アレイのカニューレ先端は大きな開頭の上にあるような統合のマイクロ ドライブ アレイを配置します。
- 2 つのソリューション、すなわち~ 100 μ L とカニューレ先端と脳の表面との間のギャップ スペースを埋める。、0.5% (質量) アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウム 10% (質量)。
注: このプロセス 〜 5 分、2 つのソリューションが頭蓋骨上で混合後透明なゲルを形成します。 - カニューレ、BR 電極、g ・ r 電極をカバーし、0.5 cm. の厚さで歯科用セメント アンカーねじが注意していないこの段階でセメントを BR と g/r 電極の開いた端部をカバーします。
- EIB に以前接続されていた個別のワイヤの先端に心電図、筋電図、BR と g/r 電極の開いた端部をはんだ付け (1.2 と 1.3 の手順を参照してください)。
- 統合マイクロ ドライブ アレイと歯科用セメントとのすべての電極線の下の部分をカバーしてください。いるラット注入した後それらを傷つけることはできませんすべての電極ワイヤを完全に覆われていることを確認します。
- 胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻した後、透明なプレキシ グラス ホーム cag に動物を戻り、水や食料を無料で独自にそれを維持します。手術後、抗生物質 (ゲンタマイシン) と動物を扱います。
- 手術後に、毎日の観察と動物を監視します。正しく歩くことと彼らは、実験者はマイクロ ドライブ アレイを触れたときにないキーッか確認します。
4.生体内での録音
注: すべての信号が増幅され、2 kHz でサンプリングと帯域通過フィルター (0.1 - 500 Hz) をユニット活動 (30 kHz でサンプリングとバンドパス フィルター (500-6 kHz)) を除く。
- 統合のマイクロ ドライブ アレイの EIB を録音デバイスのパッチアンプ用アダプターに接続します。
- 手術後の数週間のネジを回して、管の四極管を進めます。管の四極管が対象脳領域に隣接する、安定した録音のための数日の期間の領域に、管の四極管を解決します。
- 動物は記録室で自由に移動しながら電気信号を監視します。
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Representative Results
このメソッドは、心拍数、呼吸のリズムと骨格筋収縮(図 1)は、脳の神経活動を表す複数の器官から生体電気信号を同時にキャプチャできます。図 4は、長方形の箱 (25 × 40 cm2) で自由に採餌は自由行動ラットからデータの代表的な記録を提供します。例のデータセットには、移動と静止状態との間の典型的な行動遷移が含まれています。パワー スペクトルは、ウェーブレット解析による海馬 LFP トレースから計算しました。嗅球の表面積から記録された BR 信号は、探索のスニッフィングの動作中に発生するものなど、周波数を呼吸の相対変化を大まかに見積もるに使用されました。
図 1: 自由行動ラットからの信号は複数の脳と体を監視録画システムの図。すべての生体電気信号 (LFP、心電図、脳波、BR 信号) 自由行動ラットから頭に取り付ける統合マイクロ ドライブ アレイに収集されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 統合マイクロ ドライブ配列。矢印で示されているように、すべての先進党、心電図、脳波と BR の信号は EIB の穴に送信されます。点線は右側のパネルで拡大し、管四極管マイクロ ドライブ アレイから突き出ている脳組織に挿入されるのいくつかを表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: EIB の平面図。EIB には 24 皮質 LFP (LFP) チャンネル、管の四極管に接続されている 2 の ECG チャンネル、2 筋、2 BR チャンネル、2 の地面 (Gr) チャンネルが含まれています。LFP チャンネルに接続されている以外のすべてのチャネルは絶縁電線です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 生体信号の同時多チャンネル録画の例。
(上から下)体性感覚野における LFP 信号 (スケール バー: 250 μ V)。海馬 ca1 における LFP 信号 (スケール バー: 500 μ V)。海馬の LFP トレースの色分けされたパワー スペクトル。心電図信号 (20-200 Hz でフィルター帯域通過スケール バー: 500 μ V)。EMG 信号 (100-500 Hz でフィルター帯域通過スケール バー: 100 μ V)。BR 信号 (スケール バー: 500 μ V)。BR 信号の色分けされたパワー スペクトル呼吸数の一時的な増加によって定義されている動作をスニッフィングを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
周辺のアクティビティ レベルと副の脳の変調を理解するため、逆に、大規模な複数の部位から電気の生体情報を同時にキャプチャする方法を記録が必要です。本研究の説明、手術は、脳の局所電界電位、心拍数、筋肉構造とに使用される記録システムに改善されてきた呼吸率の大きさを監視記録システム脳組織の細胞外の録音。このシステムは、統合マイクロ ドライブ配列の単一 EIB に脳と末梢器官からの電気信号を収集します。いくつかの時間がかかると統合マイクロ ドライブ アレイの準備には術前に少なくともいくつかの時間を開始してください。ここでは、ドライブ アレイに脳局所電界電位を記録するため管四極管が含まれていますが、これらの電極の両端は、正しくはんだ付けする場合、EIB を他の種類の金属の電極は、プラチナ、タングステン電極などを取り付けることが。次のプロトコルで手術、経験豊富な実験者は 2-3 時間以内のすべての手順を完了することができるされています。
このプロトコルの中で重要なステップは、筋電図と心電図の電極では特に組織に電極の配置です。いくつかのトレーニングの繰り返しは、安定した録音を取得する必要があります。日には、すべて録音されている安定した手術後少なくとも 1 ヶ月。実験者は、記録データの信号対雑音比が低いなら、この問題は、地面/参照電極の緩い注視やワイヤ、Eib またはの他の端間の終了の十分なはんだ付けのため、よく、注意してください。ワイヤー。いくつかの独立したデバイスを使用して従来の電気生理学的記録と比べると、この方法の利点は、(1) それが技術的に簡単に行うには、数回を訓練されている場合、同期通信システムが不要 (2)録音デバイスの 1 つだけが必要であり、(4) をすべて記録したデータ ファイルは同じ処理法とデータ分析の効率を高め、プログラムで処理できるよう、複数のデバイス (3) it 実験全体のコストを削減します。さらに、方法論的概念は、複数の脳領域と末梢器官、呼吸器系、循環器系、自律神経系などの多くの組み合わせに適用されます。また、任意の市販の電気録音デバイスに適用されます。全身の生理的活動パターンの監視同時このメソッドを使用しての参考となる外部感覚の変調、感情的な課題に対して様々 な生理学的な状態で神経細胞の活動パターンを解明し、病理組織学的疾患、脳体協会の基礎となる生物学的メカニズムの高められた理解に 。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、研こんにちはによって支えられた (17 H 05939; 17 H 05551)、中富財団とスズケン記念財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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