Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/56981
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 4, 1, 4, 5,6
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

Summary

De beschreven protocollen toestaan de bouw, karakterisering en selectie (tegen het doelwit) van een bibliotheek van de "domainome" gemaakt van elke bron van DNA. Dit wordt bereikt door een onderzoek-pijpleiding dat verschillende technologieën combineert: faag display, een opvouwbare verslaggever en de volgende generatie sequencing met een web-tool voor data-analyse.

Abstract

Opvouwbare verslaggevers zijn eiwitten met herkenbaar fenotypen, zoals antibioticaresistentie, waarvan vouwen en functie in gevaar komt wanneer gesmolten tot slecht het vouwen van eiwitten of willekeurige open lezing frames. Met behulp van TEM-1 β-lactamase (het enzym overdracht van resistentie tegen ampicilline) op een genomic schaal, kunnen wij waar, collecties van correct gevouwen proteïne domeinen selecteren uit het codering gedeelte van het DNA van elke intronless genoom, hebben we een strategie ontwikkeld. De fragmenten van de eiwitten verkregen door deze aanpak, de zogenaamde "domainome", zullen goed uitgedrukt en oplosbaar, waardoor ze geschikt zijn voor structurele/functionele studies.

Door klonen en het weergeven van de "domainome" rechtstreeks in een faag display systeem, hebben wij aangetoond dat het mogelijk is te selecteren van specifieke proteïne domeinen met de gewenste bindende eigenschappen (bijvoorbeeld andere proteïnen of antilichamen), waardoor essentiële experimentele informatie voor gene aantekening of antigeen identificatie.

De identificatie van de meest verrijkt klonen in een geselecteerde polyklonale populatie kan worden bereikt met behulp van nieuwe sequencing van de volgende generatie technologieën (NGS). Om deze redenen introduceren we diep sequencing analyse van de bibliotheek zelf en de selectie-uitgangen volledige informatie te verstrekken over diversiteit, overvloed en nauwkeurige toewijzing van elk van het geselecteerde fragment. De protocollen die hier gepresenteerd tonen de belangrijkste stappen voor de bouw van de bibliotheek, karakterisatie en validatie.

Introduction

Hier beschrijven we een hoge-doorvoer-methode voor de bouw en de selectie van bibliotheken van gevouwen en oplosbaar eiwit domeinen van elke genenreservoir/genomic startende bron. De aanpak combineert drie verschillende technologieën: faag display, het gebruik van een opvouwbare verslaggever en de volgende generatie sequencing (NGS) met een specifieke web-tool voor data-analyse. De methoden kunnen worden gebruikt in vele verschillende contexten van onderzoek op basis van eiwitten, voor identificatie en annotatie van nieuwe eiwitten/proteïne domeinen, karakterisering van structurele en functionele eigenschappen van bekende eiwitten, alsmede definitie van eiwit-interactie netwerk.

Veel open vragen zijn nog steeds aanwezig in onderzoek op basis van eiwitten en de ontwikkeling van methoden voor de eiwitproductie van de optimale is een belangrijke behoefte voor verschillende velden van onderzoek. Bijvoorbeeld, ondanks de beschikbaarheid van duizenden prokaryote en eukaryote genomen1ontbreekt een bijbehorende kaart van de relatieve proteomes met een directe annotatie van de gecodeerde eiwitten en peptiden nog steeds voor de overgrote meerderheid van organismen. De catalogus van volledige proteomes is in opkomst als een uitdagend doel vereist een enorme inspanning in termen van tijd en middelen. De gouden standaard voor experimentele aantekening blijft het klonen van alle Open lezing Frames (ORFs) van een genoom, bouw van de zogenaamde "ORFeome". Meestal genfuncties is toegewezen op basis van homologie aan verwante genen van bekende activiteit maar deze aanpak is slecht juist als gevolg van de aanwezigheid van veel incorrect aantekeningen in de verwijzing databases2,3,,4, 5. Bovendien, zelfs voor eiwitten die zijn geïdentificeerd en geannoteerd, aanvullend onderzoek moeten bereiken van karakterisering in termen van overvloed, expressiepatronen in verschillende contexten, met inbegrip van structurele en functionele eigenschappen, evenals interactienetwerken.

Bovendien, omdat eiwitten zijn samengesteld uit verschillende domeinen, elk van hen specifieke kenmerken tonen en anders bijdragen aan eiwitfuncties, de studie en de exacte definitie van deze domeinen kunt u een meer gedetailleerd beeld, zowel op de single gen en op het niveau van het volledige genoom. Al deze noodzakelijke informatie maakt op basis van eiwitten onderzoek een breed en uitdagend veld.

In dit perspectief, kan een belangrijke bijdrage worden gegeven door onbevooroordeelde en high-throughput methoden voor de productie van eiwitten. Het succes van dergelijke benaderingen, naast de aanzienlijke investeringen nodig zijn, is echter afhankelijk van het vermogen te produceren van oplosbare/stabiele eiwit constructies. Dit is een belangrijke beperking van factor omdat men schat dat slechts ongeveer 30% van de eiwitten met succes kan worden uitgedrukt en geproduceerd op voldoende niveau experimenteel nuttig6,7,8. Een aanpak te overwinnen van deze beperking is gebaseerd op het gebruik van willekeurig gefragmenteerde DNA te produceren verschillende polypeptiden, waarmee elkaar overlappende fragment vertegenwoordiging van afzonderlijke genen. Slechts een klein percentage van de willekeurig gegenereerde DNA-fragmenten zijn functionele ORFs terwijl de overgrote meerderheid van hen zijn niet-functionele (als gevolg van de aanwezigheid van stop codonen binnen hun sequenties) of coderen voor niet-natuurlijke (ORF in een frame dan het origineel) polypeptiden met geen biologische betekenis.

Om al deze kwesties, heeft onze fractie een high-throughput eiwit expressie en interactie analyse platform ontwikkeld die kan worden gebruikt op een genomic schaal9,10,11,12. Dit platform integreert de volgende technieken: 1) een methode te selecteren van collecties van correct gevouwen proteïne domeinen uit het codering gedeelte van DNA van een organisme; 2) de bacteriofaag display technologie voor het selecteren van de partners van interacties; 3) de NGS volledig karakteriseren de hele interactome bestudeerde en identificeren van de klonen van belang; en 4) een webtool voor data-analyse voor gebruikers zonder bioinformatics of programmeringsvaardigheden Interactome-Seq analyses uit te voeren op een eenvoudige en gebruiksvriendelijke manier.

Het gebruik van dit platform biedt belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve strategieën van onderzoek; de methode is vooral volledig onpartijdige, high-throughput en modulaire voor studie, variërend van een enkel gen tot een hele genoom. De eerste stap van de pijpleiding is de oprichting van een bibliotheek van willekeurig gefragmenteerde DNA bestudeerd, die vervolgens diep door NGS wordt gekenmerkt. Deze bibliotheek is gegenereerd met behulp van een gemanipuleerde vector waar genen/fragmenten van belang zijn gekloond tussen een signaal volgorde voor eiwit secretie in de periplasmatische ruimte (dat wil zeggen, een leider van de Sec) en het TEM1 β-lactamase gen. De fusieproteïne zal verlenen de ampicilline-resistentie en de mogelijkheid om te overleven onder ampicilline druk alleen als gekloonde fragmenten in-frame is met deze elementen zowel de resulterende fusieproteïne correct gevouwen10,13 ,14. Alle klonen gered na antibiotica selectie, de zogenaamde "gefilterd klonen", ORFs en een grote meerderheid van hen (meer dan 80%), zijn afgeleid van echte genen9. Bovendien ligt de kracht van deze strategie in de bevindingen dat alle klonen van de ORF gefilterd voor correct gevouwen/oplosbare eiwitten en/of domeinen15 codeert. Zoals veel klonen, aanwezig in de bibliotheek en de toewijzing in de zelfde regio/domein, hebben verschillende begin- en einddatum van de punten, hierdoor onbevooroordeelde, -voor-stapmodus identificatie van de minimale fragmenten die zouden kunnen resulteren in oplosbare producten.

Een verdere verbetering van de technologie wordt gegeven door het gebruik van NGS te karakteriseren van de bibliotheek. De combinatie van dit platform en van een specifieke web-tool voor data-analyse geeft belangrijke onbevooroordeelde informatie over de exacte nucleotidesequenties en over de locatie van geselecteerde ORFs op de verwijzing DNA bestudeerde zonder de behoefte aan verdere uitgebreide analyses of experimentele inspanning.

Domainome bibliotheken kunnen worden omgezet in een selectie-context en gebruikt als een universele instrument functionele studies te verrichten. De high-throughput eiwit expressie en interactie analyse platform dat we geïntegreerde en dat we Interactome-Seq noemden gebruik van de bacteriofaag display technologie maakt door overdracht van de gefilterde ORF in een vector van phagemid en het creëren van een bacteriofaag-ORF bibliotheek. Eenmaal opnieuw gekloond in een faag display context, eiwit domeinen worden weergegeven op het oppervlak van M13 deeltjes; op deze manier kunnen domainome bibliotheken direct worden geselecteerd voor gene fragmenten codering van domeinen met specifieke enzymatische activiteiten of bindende eigenschappen, waardoor interactome netwerken profilering. Deze aanpak werd voor het eerst beschreven door Zacchi et al. 16 en later gebruikt in verschillende andere context13,17,18.

Vergeleken met andere technologieën gebruikt bij het bestuderen van de eiwit-eiwit interactie (inclusief Gist twee hybridesysteem en massaspectrometrie19,20), is een groot voordeel de versterking van de binding-partner die tijdens de bacteriofaag optreedt weergeven meerdere rondes van de selectie. Dit verhoogt de gevoeligheid van de selectie waardoor de identificatie van lage overvloedige bindende proteïnen domeinen aanwezig in de bibliotheek. De efficiëntie van de selectie uitgevoerd met ORF-gefilterd bibliotheek is verder toegenomen als gevolg van het ontbreken van niet-functionele klonen. Ten slotte, de technologie staat de selectie moet worden uitgevoerd tegen zowel eiwitten als niet-proteïne lokaas21,22,23,24,25.

Phage selecties met behulp van de bibliotheek domainome-bacteriofaag kunnen worden uitgevoerd met behulp van antilichamen vanuit sera van patiënten met verschillende pathologische condities, zoals auto-immune ziekten13, kanker of een infectie ziekten als aas. Deze aanpak wordt gebruikt voor het verkrijgen van de zogenaamde "antilichaam handtekening" van de ziekte onder studie waardoor massaal identificeren en typeren de antigenen/epitopes specifiek erkend door de patiënten antilichamen op hetzelfde moment. Vergeleken met andere methoden het gebruik van bacteriofaag display kan de identificatie van zowel lineaire als conformationele antigene epitopes. De identificatie van een bepaalde handtekening kon potentieel belangrijke gevolgen voor begrip pathogenese, nieuwe vaccin design, identificatie van nieuwe therapeutische doelen en ontwikkelen van nieuwe en specifieke diagnostische en prognostische hulpmiddelen hebben. Bovendien, wanneer het onderzoek is gericht op besmettelijke ziekten, een groot voordeel is dat de ontdekking van immunogene eiwitten onafhankelijk van pathogen teelt is.

Onze aanpak bevestigt dat de opvouwbare verslaggevers op een genomic schaal kunnen worden gebruikt om te selecteren van de "domainome": een verzameling correct gevouwen, goed uitgedrukt, oplosbaar eiwit domeinen uit het codering gedeelte van het DNA en/of cDNA van elk organisme. Eenmaal geïsoleerd de eiwit-fragmenten zijn bruikbaar voor vele doeleinden, essentiële experimentele voorlichting voor gene aantekening alsmede wat betreft structurele studies, antilichaam epitoop toewijzing, antigeen identificatie, enz. De volledigheid van hoge-doorvoer door NGS verstrekte gegevens maakt de analyse van de zeer complexe monsters, zoals faag display bibliotheken, en heeft het potentieel om de traditionele moeizame plukken en testen van individuele faag gered klonen te omzeilen.

Op hetzelfde moment dankzij de functies van de gefilterde bibliotheek en de extreme gevoeligheid en de kracht van het NGS-analyse is het mogelijk om te identificeren van het eiwit domein verantwoordelijk voor elke interactie rechtstreeks in een eerste scherm, zonder de noodzaak te creëren extra bibliotheken voor elk gebonden eiwit. NGS kan verkrijgen van een uitgebreide definitie van het hele domainome van elke genenreservoir/genomic startende bron en de data analyse webtool kan de aanschaf van een zeer specifieke karakterisering van een kwalitatieve en kwantitatieve oogpunt van de interactome eiwitten domeinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bouw van de ORF-bibliotheek (Figuur 1)

  1. Voorbereiding van invoegen DNA
    1. Bereiding op basis van synthetische of genomic DNA fragmenten
      1. Uittreksel/zuiveren met behulp van standaardmethoden26DNA.
      2. Het fragment van DNA met het ultrasoonapparaat. Als met behulp van een standaard ultrasoonapparaat, als een algemene suggestie start met 30 s pulsen op 100% uitgangsvermogen.
        Opmerking: Pilot experimenten moeten gebeuren met verschillende macht en ultrasoonapparaat tijden de optimale voorwaarden voor de bereiding van DNA vast te stellen. Bepaal de grootte van de fragmenten van DNA door agarose gelelektroforese na iedere test.
      3. Het laden van het sonicated DNA op 1,5% agarose gel, samen met een 100 bp DNA-ladder. Voer een korte elektroforese draaien op 5 V/cm gedurende 15 minuten en snijd het gedeelte van de gel met het uitstrijkje van de gefragmenteerde DNA.
      4. Zuiveren van het DNA invoegen met een kolom gebaseerde gel extractie kit en meten van de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer.
        Opmerking: ten minste 500 ng van gezuiverde tussenvoegsels moet worden verkregen na deze stap, om te worden afgebonden met 1 µg verteerd vector, zoals beschreven in stap 1.3. Kwaliteit van fragmenten voorbereiding controleren door de beoordeling van een260nm/A280nm en een260nm/A230nm ratio aangezien lage kwaliteit van het monster gevolgen voor de efficiëntie van de afbinding hebben zal.
      5. Behandelen maximaal 5 μg van de tussenvoegsels met 1 μL van de snelle afstomping Kit enzym mix, volgens de instructies van de fabrikant. Inactivering van enzymen door verhitting bij 70 ° C voor 10 min. monsters kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C tot gebruik.
    2. Bereiding op basis van cDNA fragmenten
      1. Uittreksel RNA met standaardmethoden (bijvoorbeeld met behulp van TRizol of soortgelijke reagentia).
      2. Fragment mRNA door te verwarmen voordat u omgekeerde transcriptie uitvoert. De laatste DNA fragment lengte wordt gecontroleerd door de mRNA kokend tijd en concentratie van de willekeurige primer. Bijvoorbeeld warmte monster voor 6 min bij 95 ° C.
      3. Bereiden van cDNA willekeurige inleidingen met elke beschikbare kit volgens protocol van de fabrikant.
      4. CDNA van poly-dT staarten uitputten door kruising met biotinyleerd poly-dA gedurende 3 uur bij 37 ° C, en scheiden op daar magnetische kralen, zoals beschreven door Carninci et al. 13
      5. Niet-afhankelijke materiaal herstellen en zuiveren met een kolom gebaseerde DNA zuivering kit na instructies van de fabrikant. Het meten van de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer. Zie opmerking in stap 1.1.1.4.
  2. Voorbereiding van de filter vector
    1. Digest 5 µg gezuiverde klonen vector pFILTER312 met 10 U van EcoRV restrictie-enzym, volgende fabrikant protocol.
    2. Laden 2 µL (200 ng) van de verteerd vector, samen met 100 ng van de onverteerd vectoren en 1 k bp moleculaire marker, op een 1% agarose gel, om te controleren voor een goede spijsvertering. Warmte inactivering van het beperkingsenzym.
    3. Voeg 1/10 volume van 10 x fosfatase buffer en 1 µL (5 U) van fosfatase en Incubeer bij 37 ° C voor de inactivering van 15 min. warmte gedurende 5 minuten bij 65 ° C.
    4. Verteerd plasmide zuiveren door extractie uit agarose gel en meten van de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot gebruik.
  3. Afbinding en transformatie
    1. Uitvoeren van afbinding als volgt: voor 1 µg verteerd plasmide toevoegen 400 ng van gefosforyleerd tussenvoegsels (plasmide: invoegen molaire verhouding 1:5), 10 µL van 10 x Buffer voor T4 DNA Ligase, 2 µL van hoge concentratie T4 DNA ligase in een eindvolume van 100 µL. Incubeer de reactie bij 16 ° C overni GHT. De inactivering van warmte bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Neerslag van de afbinding product door toevoeging van 1/10 volume van natrium acetaat oplossing (3 M, pH 5.2) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Meng en bevriezen bij-80 ° C gedurende 20 min.
    3. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    4. 500 µL van koude 70% ethanol toevoegen aan de pellet en centrifuge op maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    5. Lucht drogen de pellet. Resuspendeer de geprecipiteerde DNA in 10 µL van water.
    6. Bacteriële cel electroporation uitvoeren
      Opmerking: Het gebruik van hoogrenderende cellen (boven 5 x 109 transformants per µg DNA) is vereist. Wij raden u aan Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) geproduceerd in eigen huis of gekocht van verschillende fabrikanten.
      1. Juiste aantal microcentrifuge buizen en 0,1 cm-electroporation cuvettes plaatsen op ijs. Voeg 1 µL van gezuiverde afbinding oplossing (in DI water) naar 25 µL van de cellen en flick de buis een paar keer.
      2. Het DNA-cel mengsel overbrengen in de koude cuvette, kraan op het aanrecht 2 x, veeg van water vanaf de buitenkant van de meetcel, plaats in de electroporation module en druk op de pols.
      3. Electroporation uitvoeren met een standaard electroporator machine met 25 µF, 200 Ω en 1.8 kV. Tijdconstante moet 4-5 ms.
    7. Onmiddellijk Voeg 1 mL van vloeibare 2xYT medium zonder elk antibioticum, overbrengen in een tube 10 mL en laat groeien bij 37 ° C, schudden bij 220 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur.
    8. Plaat getransformeerd DH5αF' op 15 cm 2xYT agar platen aangevuld met 34 µg/mL chlooramfenicol (pFILTER weerstand) en 25 µg Mo/mL ampicilline (selectieve marker voor ORFs) en na een nacht bebroeden bij 30 ° C.
    9. Plaat verdunningen van de bibliotheek op 10 cm 2xYT agar platen aangevuld met chlooramfenicol + ampicilline en chlooramfenicol alleen, voor het uitvoeren van bibliotheek titratie. Na een nacht bebroeden bij 30 ° C.
  4. pFILTER-ORF bibliotheek validatie
    1. Test 15-20 kolonies van zowel chlooramfenicol en chlooramfenicol/ampicilline platen te schatten de verdeling van de grootte van de invoegen. Kies één kolonies met een tip en vul hen afzonderlijk in 100 µL 2xYT medium zonder antibiotica. Gebruik 0.5 µL van deze oplossing als DNA sjabloon voor een PCR-reactie, met een standaard TaqDNA polymerase volgens protocol van de fabrikant.
    2. Uitvoeren van 25 cycli van versterking met behulp van een T gloeien van 55 ° C en een extensie tijd van 40 s bij 72 ° C. Primer sequenties vindt u in de Tabel van materialen.
    3. Laden van de PCR producten op 1,5% agarose gel, samen met een 100 bp DNA ladder en uitvoeren.
  5. de collectie van de bibliotheek van de pFILTER-ORF
    1. Bacteriën van de 150 mm platen verzamelen door toevoeging van 3 mL van verse 2xYT medium en oogst ze met een steriele schraper, meng, aanvullen met 20% steriele glycerol en opslaan bij-80 ° C in kleine porties.
    2. Plasmide DNA uit een aliquoot gedeelte van de bibliotheek (vóór de toevoeging van glycerol) zuiveren met behulp van een kolom gebaseerde plasmide extractie kit, volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Het meten van de concentratie met de UV spectrofotometer. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot worden gebruikt voor phagemid bibliotheek voorbereiding en/of karakterisering door NGS.

2. subcloning van gefilterde ORFs in een Vector Phagemid (Figuur 2)

  1. Voorbereiding van ORF gefilterd DNA-fragmenten
    1. Restrictie-enzym vertering van 5 µg van gezuiverde vector instellen van de pFILTER-ORF bibliotheek vector toevoegen 10 U van BssHII en broeden volgens protocol van de fabrikant. Inactivering van de enzymen en het verteren met 10 U van NheI.
    2. Laad het verteerd DNA op 1,5% agarose gel, samen met een 100 bp DNA-ladder. Voer een korte elektroforese draaien op 5 V/cm gedurende 15 minuten of net genoeg te onderscheiden van de uitstrijkjes van verwijderde fragmenten en snijd het gedeelte van de gel met hen.
    3. Zuiveren van het DNA invoegen met een kolom-base gel extractie kit en meten van de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer.
  2. Voorbereiding van phagemid DNA
    1. Restrictie-enzym vertering van 5 µg gezuiverde pDAN527 wat betreft de inserts instellen.
    2. Zuiveren van verteerd plasmide door lopende verteerd DNA op een 0,75% agarose gel en uittreksel uit gel met een kolom gebaseerde kit.
    3. Het meten van de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot gebruik.
  3. Bibliotheek afbinding, transformatie en collectie
    1. Het uitvoeren van afbinding en transformatie als beschreven voor het pFILTER vector.
    2. Plaat getransformeerd DH5αF' op 150 mm 2xYT agar platen aangevuld met 100 µg/mL ampicilline en na een nacht bebroeden bij 30 ° C.
    3. Plaat verdunningen van de bibliotheek op 100 mm 2xYT agar platen aangevuld met 100 µg/mL ampicilline om te bepalen van de grootte van de bibliotheek.
    4. Validatie van de bibliotheek door PCR van willekeurig geplukte klonen uitvoeren zoals beschreven in stap 1.4.
    5. Verzamelen van de phagemid-ORF-bibliotheek door bacteriën van 150 mm platen te oogsten, meng, aanvullen met 20% steriele glycerol en winkel bij-80 ° C in kleine porties.
    6. Zuiveren plasmide DNA uit een aliquoot gedeelte van de bibliotheek met behulp van een kolom gebaseerde plasmide extractie kit, volgens de instructies van de fabrikant.
    7. De concentratie op de UV spectrofotometer meten. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot worden gebruikt voor de karakterisering door NGS.

3. phage bibliotheek voorbereiding en selectieprocedure

  1. Phage productie
    1. Verdun een voorraad aliquoot deel van de phagemid-bibliotheek in 10 mL vloeibare Bouillon 2xYT aangevuld met 100 µg/mL ampicilline om een OD600nm = 0,05.
    2. Groeien de verdunde bibliotheek in een steriele kolf 5 - 10 keer groter dan het oorspronkelijke volume, bij 37 ° C met het schudden van 220 toeren per minuut totdat bereikt OD600nm = 0,5.
    3. Bacteriën met helper faag (bijvoorbeeld M13K07) op een veelheid van infectie 20:1 te infecteren. Laat bij 37 ° C gedurende 45 minuten met occasionele agitatie (elke 10 min).
    4. Centrifugeer bacteriën bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vloeistof wordt weggeworpen en resuspendeer de pellet bacteriën in 40 mL vloeibare Bouillon 2xYT aangevuld met 100 µg/mL ampicilline en 50 µg Mo/mL kanamycine groeien bij 28 ° C met het schudden van 220 toeren per minuut voor overnachting.
    5. Overmorgen, centrifuge bacteriën bij 4000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof met bacteriofagen verzamelen.
  2. PEG-neerslag van bacteriofagen.
    1. Voeg 1/5-volume een 0,22 µm gefilterd PEG/NaCl-oplossing (20% w/v PEG 6000, 2,5 M NaCl) voor de gewiste bacteriofagen en incubeer op ijs voor 30-60 min.
      Opmerking: Oplossing werd rokerige na paar minuten, waarin de neerslag van een succesvolle phage. De bewolking van de oplossing zal toenemen in de incubatietijd.
    2. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Een witte kleine pellet van bacteriofagen zullen vormen.
    3. Resuspendeer het in 1 mL steriele PBS. Transfer naar 1,5 mL tube samen en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten op maximale snelheid te verwijderen verontreinigingen bacteriën. Een bruin pellet zullen vormen.
    4. Supernatant met bacteriofagen overbrengen in een nieuwe buis. Houd bacteriofagen op ijs voor opeenvolgende titratie en phage selectie.
  3. Phage titratie
    1. Maak seriële verdunningen van de bacteriofaag oplossing. Zet 10 µL van de bacteriofaag oplossing in 990 µL van PBS 10-2 -verdunning te verkrijgen. Verdun opnieuw dit preparaat te maken 10-4 en hieruit te krijgen een 10-6 -verdunning.
    2. DH5αF groeien ' bacteriën cellen 2xYT opgietvloeistof bij 37 ° C met schudden tot OD600nm = 0,5 is bereikt. 1 mL van de bereid bacteriën overboeken naar 1,5 mL tube en onmiddellijk infecteren met 1 µL van de verdunning van de bacteriofaag 10-4 . Incubeer zonder schudden bij 37 ° C gedurende 45 min. Herhaal dezelfde procedure als voor de 10-6 -verdunning.
    3. Plaat verdunningen van de besmette bacteriën in 100 mm 2xYT plaat. Zet de plaat bij 30 ° C's nachts.
    4. Plaat 100 µL van niet geïnfecteerde DH5αF' op een 2xYT agarplaat aangevuld met 100 µg/mL ampicilline om te controleren op de afwezigheid van besmetting bij de voorbereiding.
    5. Overmorgen tellen het aantal kolonies en de titer van de bacteriofaag te berekenen. Express titer als aantal bacteriofagen/mL. Verwachte titer is 1012-13 bacteriofagen/mL.
  4. Phage selectie
    1. Phage selectie gebruiken als aas gezuiverd antilichamen
      1. Verzadig bacteriofagen door verdunnen 200 µL van phage voorbereiding naar een gelijk volume van PBS - 4% magere melk en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in langzame rotatie. Deze stap kan blokkeren van bacteriofagen voor aspecifieke bindend. 30 µL van eiwit-G gecoate magnetische kralen overbrengen in een 1,5 mL-buis.
      2. Wassen twee keer als volgt: Voeg 500 µL van PBS, incubeer op een wiel in langzame rotatie voor 2 minuten bij kamertemperatuur, trekken de kralen aan de ene kant van de buis met behulp van een magneet en verwijder de bovendrijvende substantie.
      3. Incubeer verzadigde bacteriofagen met gewassen kralen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met langzame draaiing.
      4. Trekken de kralen aan de ene kant met behulp van een magnetisch veld. Het verzamelen van de bovendrijvende substantie met bacteriofagen moet worden gebruikt voor de selectie stap.
      5. Magnetische kralen voor te bereiden tijdens het uitvoeren van de vorige stap, door conjugating van de gezuiverde antilichamen. Wassen 30 µL van eiwit-G gecoate magnetische kralen zoals hierboven beschreven. Verdun 10 µg van gezuiverde antilichamen in 500 µL van PBS, toevoegen aan de gewassen kralen en incubeer in langzame rotatie bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten wassen tweemaal met PBS.
        Opmerking: Twee verschillende bereidingen van magnetische kralen uitvoeren: één met antilichamen van belang en één met controle antilichamen, bijvoorbeeld antilichamen gezuiverd van gezonde donoren. De volgorde van antigenen met controle antilichamen zijn afgetrokken tijdens de stap van de analyse van de uitgangen geselecteerd. Als alternatief, magnetische kralen geladen met controle antilichamen kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van een pre-ontruimt stap van de bacteriofagen (volg het protocol voor de incubatie met un-geconjugeerd kralen).
      6. Phage selectie: tekenen van kralen aan de ene kant van de buis met behulp van een magneet, verwijderen van de laatste wasbeurt, bacteriofagen toevoegen en incubeer met langzame rotatie bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten wassen 5 keer met 500 µL van PBS-0.1% Tween-20 en 5 keer met PBS.
      7. Elueer afhankelijke bacteriofagen, vertegenwoordigen de output van de selectie, door de kralen te vermengen met 1 mL van DH5αF' cellen geteeld op OD600 = 0,5. Incubeer bacteriën met kralen gedurende 45 minuten bij 37 ° C, met af en toe schudden (elke 10 min). Plaat van de uitvoer op een 150 mm 2xYT agarplaat aangevuld met 100 µg/mL ampicilline.
      8. Plaat 100 µL van onverdunde en verschillende verdunningen van de output (10-1 op 10-5) voor het uitvoeren van de titratie. Overmorgen verzamelen van bacteriën aan de 150 mm platen door toevoeging van 3 mL van verse 2xYT medium en oogst ze met een steriele schraper, meng, aanvullen met 20% steriele glycerol en opslaan bij-80 ° C in kleine porties.
      9. Groeien één aliquot om opnieuw uit te voeren van een tweede ronde van de selectie. Herhaal alle de panning procedure zoals hierboven beschreven met uitzondering van de voorwaarden van wassen. In dit geval wassen 10 keer met PBS - 1% Tween-20 (giet de oplossing in de buis en opnieuw onmiddellijk uitstorten). Dan Voeg 500 µL van PBS en incubeer op rotatie bij kamertemperatuur voor 10 min. uitvoeren andere 10 wasbeurten met PBS. Ga verder met de elutie stap voor de eerste ronde van de selectie.
      10. Pak plasmide DNA uit een aliquoot gedeelte van de uitvoer met behulp van een kolom gebaseerde kit, instructies van de fabrikanten. Plasmide bij-20 ° C worden opgeslagen totdat het zal worden gebruikt voor het diepe rangschikken.
    2. Phage selectie gebruiken als aas recombinante eiwitten
      1. Verzadig bacteriofagen door verdunnen 200 µL van phage voorbereiding naar een gelijk volume van PBS - 4% magere melk en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in langzame rotatie.
      2. Voeg 100 µL van daar magnetische kralen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te selecteren van streptavidine-bindende bacteriofagen. Verwijder de bacteriofagen daar-gebonden door de kralen aan de ene kant met behulp van een magneet. Nemen supernatant in de vorige stap en voeg biotinyleerd proteïne (in een concentratie van 100-550 nM) en broeden op een rotor bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot 1 uur.
      3. Magnetische kralen bereiden: tijdens het uitvoeren van de vorige stap, wassen 100 µL streptavidine-magnetische kralen met PBS, resuspendeer in PBS 2% magere melk en incubeer met rotatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot 1 uur.
      4. Phage selectie: tekenen van kralen aan de ene kant van de buis met behulp van een magneet, verwijderen van PBS - 2% melk en resuspendeer kralen met faag-eiwit mix. Incubeer met langzame rotatie bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten.
      5. Tekenen van kralen aan de ene kant van de buis met behulp van een magneet, verwijder het supernatant en hen zorgvuldig wassen vijfmaal met 500 µL van PBS 0,1% Tween-20. Voert elutie zoals beschreven in de vorige sessie.

4. phage bibliotheek diepe Sequencing Platform (Figuur 3)

  1. DNA voegt de terugwinning van pFILTER-ORF-bibliotheek, pDAN5-ORF-library of geselecteerd-faag-libraries
    1. Ontdooien van een aliquoot deel van de bibliotheek, het kwantificeren met behulp van een spectrofotometer, herstellen van DNA inzetstukken door versterking met specifieke primers.
      Opmerking: De inleidingen gebruikt om te redden van de inserts zijn gekoppeld aan hun einde 5' aan adapters sequenties, waardoor de opeenvolgende indexering van de zwembaden van de amplicon verkregen en de directe het rangschikken van de DNA-inserts hersteld met behulp van de sequencers. Hun volgorde is in de Tabel van materialen. De adapters zijn aangegeven in vet, en de specifieke primers zijn in cursief aangegeven.
    2. 2.5 µL van de bibliotheek (pFILTER/phagemid/geselecteerd-faag) als DNA sjabloon gebruiken voor een PCR-reactie.
    3. Gebruik het volgende programma: 95 ° C gedurende 3 min; 25 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 5 min. Hold bij 4 ° C.
      Opmerking: op dit punt is het aanbevolen om 1 µL van het PCR-product worden uitgevoerd op een Bioanalyzer of het TapeStation om te controleren of de grootte van de waarbij en controleren dat zij zich in het juiste bereik.
  2. PCR-opschonen
    1. Breng de magnetische kralen (bijvoorbeeld AMPure) op kamertemperatuur. Het volledige PCR-product van de PCR-buis tot een 1,5 mL koker overbrengen. Vortex de magnetische kralen voor 30 s om ervoor te zorgen dat de kralen gelijkmatig verspreid zijn. Voeg 20 µL van magnetische kralen aan elke buis met het PCR-product, Meng door zachtjes pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur zonder schudden voor 5 min.
    2. Plaats de plaat op een magnetische staan gedurende 2 minuten, of totdat het supernatans heeft uitgeschakeld. Met de PCR producten op de magnetische stand, verwijderen en verwijder het supernatant.
    3. Wassen van de kralen met vers bereide 80% ethanol, met de PCR producten op de magnetische voet, als volgt: 200 µL van vers bereide 80% ethanol toevoegen aan elk monster goed; Incubeer de plaat op de magnetische stand voor 3 s; Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant.
    4. Uitvoeren van een tweede ethanol wassen, met de PCR producten op de magnetische stand; aan het einde van de tweede wasbeurt Verwijder voorzichtig alle de ethanol en het toestaan van de kralen op het voor 10 min. drogen.
    5. De PCR producten te verwijderen uit de magnetische stand, 17,5 µL van 10 mM Tris pH 8,5 toevoegen aan elke buis, zachtjes Pipetteer omhoog en omlaag 10 keer, zorg ervoor dat kralen zijn volledig geresuspendeerde. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    6. Plaats de buis op de magnetische stand gedurende 2 minuten of totdat het supernatans heeft uitgeschakeld, zorgvuldig Breng 15 µL van het supernatans bevattende gezuiverde PCR producten tot een nieuwe 1,5 mL koker. Bewaar de gezuiverde PCR producten bij-15 ° C tot-25 ° C voor maximaal een week als je niet direct verder naar Index PCR.
  3. Index PCR
    Opmerking: Nadat de PCR schoon te maken, voert u Index PCR. Gebruik de volgende XT Index kit; zo is het mogelijk om de volgorde van de resulterende dubbele geïndexeerde bibliotheken binnen multiplexed Illumina loopt.
    1. Overdracht van al de 15 μL met elk product gezuiverd in een nieuwe PCR-buis en het opzetten van de volgende reactie bevat: 15 µL van gezuiverde amplicon product, 5 µL van Index Primer 1 en 5 µL van Index Primer 2, 25 µL van 2 x PCR mix; eindvolume van 50 µL.
    2. Uitvoeren van PCR op een thermische cycler met behulp van het volgende programma: 95 ° C gedurende 3 min, 8 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72° C gedurende 5 min, houd vervolgens bij 4 ° C.
  4. PCR-opschonen 2
    1. Volg hetzelfde protocol beschreven in de sectie 4.2 voor PCR opschonen met de volgende wijzigingen: in de eerste stap toevoegen 56 µL van magnetische kralen aan elke 50 µL van het PCR-product.
    2. Resuspendeer de kralen in 27.5 µL van 10 mM Tris pH 8,5 in de laatste stap van zuivering en 25 µL overbrengen in een nieuwe buis (dit is de gezuiverde definitieve bibliotheek klaar voor kwantificering en vervolgens sequencing).
    3. Bewaar de plaat bij-15 ° C tot-25 ° C voor maximaal een week als geen vooruitgang wordt geboekt naar de kwantificering van de bibliotheek.
  5. Kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van de sequencing-bibliotheek
    1. Na zuivering, uitgevoerd 1 µL van een 1:10 verdunning van de definitieve bibliotheek op een bioanalyzer om te controleren de grootte en het selecteren van de regio van de definitieve bibliotheek trace kwantificeren.
    2. In parallel uitgevoerd door de kwantificering van de bibliotheek door Real Time PCR met behulp van een bibliotheek kwantificering kit per fabrikant protocol.
  6. Bibliotheken rangschikken
    1. Zwembad de dual geïndexeerde bibliotheken geproduceerd samen met andere bibliotheken dual geïndexeerde volgorde. Dit soort bibliotheek door het genereren van lange leest, reeks ten minste 250 bp gepaarde einde met behulp van zowel de Hiseq2500 of de MiSeq instrumenten te verkrijgen in het eerste geval 250bp PE leest en in het tweede geval 300 bp PE leest.

5. Bioinformatic Data-analyse met behulp van de Interactome-Seq webtool

  1. Het luidt dat afkomstig is van pFILTER/phagemid/geselecteerd-faag bibliotheek sequencing met de Interactome-seq pijpleiding voor de analyse van de gegevens te analyseren. De webtool is vrij beschikbaar op het volgende adres: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De filtering aanpak is geschematiseerde in Figuur 1. Elke soort intronless DNA kan worden gebruikt. In figuur 1A is het eerste deel van de filter aanpak vertegenwoordigd: na het laden op een agarose gel of een bioanalyzer, een goede fragmentatie van DNA van belang wordt weergegeven als een uitstrijkje van fragmenten met een verdeling van de lengte in de gewenste grootte van de 150-750 bp. Een representatieve virtuele gel-beeld van de gefragmenteerde DNA verkregen wordt gegeven. Fragmenten geladen op de agarose gel zijn herstelde zich, einde herstelde phosphorylated en vervolgens gekloond in een vector eerder afgestompte pFILTER een bibliotheek van willekeurige DNA-fragmenten maken. Het uitvoeren van elke stap van de klonen procedure onder optimale omstandigheden is vereist voor het verkrijgen van goede kwaliteit bibliotheek met een volledige dekking van het DNA bestudeerde.

In figuur 1B de filtering aanpak is vertegenwoordigd: de bibliotheek wordt gekweekt in aanwezigheid van chlooramfenicol (pFILTER weerstand) alleen of chlooramfenicol en ampicilline te selecteren voor de ORF-bevattende kolonies. Enige kolonies met een DNA-fragment dat overeenkomt met een ORF produceren een functionele β-lactamase en overleven wanneer antibiotica selectie aanwezig is. Figuur 1 c toont hoe selectie van goede map ORFs versus slechte map die toenemende selectieve druk toestaat. Het verwachte resultaat is een afname van de grootte van de bibliotheek van ongeveer 20-fold. Hoger aantal overlevende klonen geeft onvoldoende selectieve druk.

ORF fragmenten kunnen gemakkelijk worden hersteld vanuit de gefilterde bibliotheek voor latere toepassing; voor interactie studies maakt onze strategie gebruik van de technologie van de vertoning van de phage. In Figuur 2, de belangrijkste stappen van phage bibliotheek bouw vertegenwoordigd zijn: een voldoende bibliotheek wordt bereid door uitsnijden van gefilterde fragmenten uit de pFILTER-vector en opnieuw klonen in een plasmide phagemid in fusie met de codering van de volgorde voor de Phage capside eiwit g3p. Eenmaal besmet met helper bacteriofaag, kan de aanwezigheid van de vector in cellen van de bacteriën de productie van phage deeltjes ORF-g3p fusion producten weer te geven op hun oppervlak waardoor de gefilterde bibliotheek beschikbaar voor faag weergave selectie en verdere analyse.

Alle bibliotheken zijn diep geanalyseerd door NGS, alsmede de uitgangen van de bacteriofaag selecties, zoals in het tweede deel van Figuur 3. DNA-fragmenten zijn gered uit kolonies groeien door PCR versterking met specifieke oligonucleotides gloeien op de plasmide backbone en uitvoering van specifieke adapters voor de sequencing. NGS wordt uitgevoerd en leest worden vervolgens geanalyseerd met de Interactome-Seq data analyse webtool.

In Figuur 4 meldden wij een schematische voorstelling van de selectieprocedure van een ORF gefilterde faag display bibliotheek. De selectie in dit voorbeeld wordt uitgevoerd met behulp van antilichamen aanwezig in de sera van patiënten beïnvloed door verschillende pathologieën (d.w.z. infectieuse pathologie, auto-immune aandoeningen, kanker). In dit geval communiceert de bacteriofaag bibliotheek rechtstreeks met de antilichamen aanwezig in de patiënten sera en op deze manier vermeende specifieke antigenen kunnen worden verrijkt, omdat ze worden herkend door ziekte specifieke antilichamen. In dit soort experimenten, meestal de bibliotheek ook geselecteerd met behulp van controlesera van gezonde patiënten om een signaal van de achtergrond moet worden gebruikt voor opeenvolgende vergelijking en normalisatie procedures.

Selecties worden uitgevoerd met behulp van sera van hetzelfde type van patiënten meestal gegroepeerd in verschillende zwembaden om te verminderen tussen individuele variabiliteit van sera antilichaam titer. Elke groep wordt het zelfstandig gebruikt voor twee tot drie opeenvolgende ronden van selectie, te verrijken van de bibliotheek voor immuun-reactieve klonen specifiek voor de pathologie bestudeerde. Test set antilichamen worden geïncubeerd met bibliotheek bacteriofagen, immuun-complexen worden teruggevorderd door eiwit A gecoat magnetics-kralen en afhankelijke bacteriofagen door standaardprocedures worden geëlueerd. De selectie cycli worden uitgevoerd met toenemende wassen en bindende striktheid.

Het luidt als volgt gegenereerd door NGS kunnen worden geanalyseerd met behulp van de Interactome-Seq webtool, speciaal ontwikkeld voor het beheer van dit soort gegevens. Interactome-Seq data analyse werkstroom bestaat uit vier opeenvolgende stappen die, vanaf rauwe sequencing leest, genereert de lijst van vermeende domeinen met genomic annotaties (figuur 5A). In de eerste stap INPUT (figuur 5A - rood vak), Interactome-Seq gecontroleerd als de inputdossiers (ruwe leest, referentie genoom, aantekening lijst) correct zijn opgemaakt. In de tweede stap VOORBEWERKEN (figuur 5A - oranje doos), lage kwaliteit sequencing gegevens zijn eerst bijgesneden met behulp van Cutadapt,28 , afhankelijk van de kwaliteitsscore en leest met minder dan 100 honken in de lengte worden verwijderd. In een latere stap van lezen uitlijning (figuur 5A - groene vak), zijn de resterende leest blastn29 tot en met het genoom waardoor tot 5% van incongruenties afgestemd. Een SAM-bestand wordt gegenereerd en alleen leest met kwaliteitsscore groter is dan 30 (Q > 30) worden verwerkt met behulp van SAMtools30 en omgezet in een bestand van BAM. Na uitlijning, Interactome-Seq voert de domeinen detectie (figuur 5A - blauw vak), beroep te doen op Bedtools31 te filteren leest overlappende ten minste 80% van hun lengte binnen transcripten; de dekking, max diepte en focus waarden worden vervolgens berekend voor elk gedeelte van de ORF vallende leest in kaart te brengen. De dekking Hiermee geeft u het totale aantal leest die is toegewezen aan een gen; de diepte is het maximum aantal leest die betrekking hebben op een specifiek gedeelte van de genenreservoir; de focus is een index die de verhouding tussen max diepte en dekking verkregen en kan variëren tussen 0 en 1. Wanneer de focus hoger dan 0.8 is en de dekking hoger dan de gemiddelde dekking waargenomen voor alle gebieden van de toewijzing in het BAM-bestand is, wordt het gedeelte van de cd's is geclassificeerd als een vermeende domein/epitoop. De laatste stap van de pijpleiding Interactome-Seq is de OUTPUT (figuur 5A - violet vak), een lijst van vermeende domeinen wordt gegenereerd in tabelvorm gescheiden. De pijpleiding Interactome-Seq is opgenomen in een web-tool om gebruikers zonder bioinformatics of programmeringsvaardigheden om Interactome-Seq analyse via de grafische interface te voeren en om hun resultaten in een eenvoudige en gebruiksvriendelijke indeling te verkrijgen. Zoals blijkt uit figuur 5B, worden de uitvoerresultaten van een analyse weergegeven met behulp van JBrowse32 om visualisatie en exploratie. Interactome-Seq nummers genereert in de browser van de genoom overeenkomt met vermeende domeinen gedetecteerd en biedt ook klassieke Venn-diagrammen om aan te tonen van de snijpunten tussen vermeende domeinen verrijkt bijvoorbeeld in verschillende selecties experimenten.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de belangrijkste stappen voor de bouw van de bibliotheek ORF-filteren
A) DNA van verschillende bron is sonicated en gefragmenteerd in willekeurige fragmenten van 150-750 bp lengte. Fragmenten zijn hersteld van gel en gekloond als botte in de vector pFILTER; B) filterprocedure met behulp van β-lactamase als een opvouwbare verslaggever. Vector niet ORF fragmenten met negatief zijn geselecteerd op ampicilline terwijl ORF gekloonde fragmenten toestaan kolonies groeien; C) toepassing van een toenemende selectieve druk (ampicilline concentratie in de media van de solide groei van 0 tot > 100 μg/mL) selectie toestaan van beter gevouwen fragmenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch overzicht van de belangrijkste stappen voor de bouw van de bacteriofaag bibliotheek
A) ORF-gefilterd fragmenten worden uitgesneden uit de gefilterde vector met behulp van specifieke enzymen van de beperking. Na herstel en reiniging, zijn fragmenten gekloond in phagemid vector en omgevormd; B) phagemid bacteriële bibliotheek is geïnfecteerd door helper faag en, na overnachting groei, bacteriofagen zijn PEG-neergeslagen en verzameld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: ORF Bibliotheken rangschikken
Sequencing wordt uitgevoerd op zowel de oorspronkelijke ORF geselecteerde bibliotheek en op de bacteriofaag display bibliotheek; 1) op beide gevallen kolonies gegroeid zijn hersteld en DNA geëxtraheerd; 2) DNA-fragmenten worden teruggekregen door versterking met behulp van specifieke primers gekoppeld aan adapters voor het rangschikken; 3-4) fragmenten worden teruggekregen en diep sequenced met behulp van NGS; 5) gegevens worden geanalyseerd met behulp van de Interactome-Seq-pijpleiding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Schematisch overzicht van de selectie van de bibliotheek met behulp van de patiënten antilichamen
Phage bibliotheek wordt gebruikt voor selectie tegen antilichamen van patiëntenverenigingen sera. Antilichamen zijn geïmmobiliseerd op magnetische kralen, de bacteriofaag bibliotheek capture/selectie wordt uitgevoerd, drie cycli van wast worden uitgevoerd en daarna de geselecteerde bacteriofagen worden hersteld en opnieuw infecteren gewend E. coli. Opnieuw besmet E. coli cellen zijn verguld in selectieve druk (ampicilline 100 μg/mL). ORF fragmenten worden teruggekregen door versterking en amplicon zwembaden zijn vervolgens sequenced door NGS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Schematisch overzicht van de analyse van de bibliotheek
A) representatie van de data analyse workflow, raw FASTQ-bestanden vanaf de definitieve geannoteerde domeinen lijsten; B) Schematische weergave van de in- en uitgangen van de Interactome-Seq webtool. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De oprichting van een hoge kwaliteit zeer uiteenlopende ORFs gefilterde bibliotheek is de eerste cruciale stap in de hele procedure, aangezien het gevolgen voor alle latere stappen van de pijpleiding hebben zal.

Een belangrijk voordeel kenmerk van onze methode is dat elke bron (intronless) DNA (cDNA, genomic DNA, PCR afgeleid of synthetisch DNA) geschikt voor de bouw van de bibliotheek is. De eerste parameter waarmee rekening moet worden gehouden is dat de lengte van de DNA-fragmenten in de vector pFILTER gekloond in een vertegenwoordiging van de gehele collectie van de domeinen van een genoom- of een transcriptome, de zogenaamde "domainome voorzien moet". We hebben aangetoond dat eiwitten domeinen met succes kunnen worden gekloond, geselecteerd en ten slotte geïdentificeerd vanaf DNA-fragmenten met een lengte distributie variërend van 150 tot en met 750 bp33,34, en dit in overeenstemming met hetgeen is vermeld is in de literatuur waaruit blijkt dat de meeste eiwit domeinen van 100 aa lengte (met een bereik van 50 tot 200 aa)15.

DNA grondstof moet worden gefragmenteerd in de groottewaaier van keuze en later gekloonde in de filter (pFILTER)12 vector. Tijdens deze stappen, kan potentiële bias vermeden worden voor het maximaliseren van de efficiëntie van alle reacties die zijn opgenomen in het protocol, in het bijzonder fragment einde-repareren en fosforylering het klonen stappen. De voorbereiding van de vector is uitdagend en dient te geschieden onder optimale omstandigheden, om te voorkomen dat zowel plasmide afbraak en/of besmetting door onverteerd vector.

Als de bibliotheek eenmaal is gemaakt, moet het worden "gefilterd" om te behouden alleen ORFs gevouwen fragmenten. Een belangrijke parameter voor het moduleren van deze stap is de selectieve druk uitgeoefend, die kan worden gewijzigd volgens de striktheid van het filteren gewenst. Selectie wordt uitgevoerd met behulp van ampicilline: hoe hoger de concentratie gebruikt, hoe lager het aantal getransformeerde bacteriën kolonies kunnen overleven. Dit weerspiegelt de mogelijkheid van de filtermethode te kiezen voor goede-versus armen-map ORFs34. Deze vermindering van het aantal clonen is gecompenseerd door de stijging van de eigenschappen van de geselecteerde fragmenten vouwen. Meestal moet de ampicilline-concentratie genoeg te beperken tot ongeveer 1/20 het aantal bacteriële kolonies met betrekking tot die groeien van de bibliotheek op chlooramfenicol alleen kan worden verkregen.

Bibliotheek validatie gebeurt meestal door PCR versterking van willekeurig geplukte koloniën en hun volgorde. PCR versterking van sommige kolonies wordt voorgesteld om een snelle schatting van de kwaliteit van de bibliotheek: de lengte van de inserts moet in het verwachte bereik van 150-750 bp en verschillende kolonies moeten huidige inzetstukken met verschillende grootte met de vermelding goed de voorbereiding van de bibliotheek in termen van variabiliteit. Deze conventionele strategie van screening, wanneer toegepast als de enige methode voor bibliotheek validatie, is niet volledig en is tijdrovend, zodat de analyse van slechts een beperkt aantal kolonies en met een hoge kans op het missen van de meeste van de belangrijke klonen. Onze aanpak is gebaseerd op diep sequencing van de bibliotheek, dit biedt volledige informatie over bibliotheek diversiteit en overvloed en nauwkeurige toewijzing van elk van de geselecteerde fragmenten.

De implementatie van NGS technologie met de filtering aanpak verhoogt de diepte van de analyse door verschillende ordes van grootte. Onlangs hebben wij het protocol voor de ORF Bibliotheken rangschikken met behulp van het platform Illumina geoptimaliseerd, en ontwikkelde een specifieke web-tool voor data-analyse, dat maakt de analyse van dit soort gegevens voor elke gebruiker zonder enige programmering vaardigheden bioinformatics.

De bibliotheek is een "universele"instrument "per se" en kan worden misbruikt in verschillende contexten voor eiwit expressie en/of selectie. Onze methodologische benadering is gebaseerd op het overbrengen van de geproduceerde ORFeome in de context van een bacteriofaag display. Eiwit fragmenten worden uitgedrukt op het oppervlak van de bacteriofaag en geschikt voor de volgende selectie werd.

Dit wordt gemaakt door de gefilterde ORFs uit de pFILTER-bibliotheek door vertering met de enzymen van de beperking van de specifieke reddings- en opnieuw het klonen van hen in een compatibele phagemid vector waardoor hun fusie met de bacteriofaag eiwit g3p.

Nadat de phagemid-ORF-bibliotheek is gemaakt, kan het worden gebruikt voor de selectie tegen verschillende doelen, zoals een vermeende bindende eiwit10 of gezuiverde antilichamen35,36 zoals hier beschreven. Aangezien de phage deeltjes worden weergegeven op hun oppervlak de gefilterde ORFs, dit resulteert in een veel effectiever selectieprocedure als gevolg van het ontbreken van niet-weergave klonen dat gewoonlijk inhalen het.

Na de selectie van de bacteriofaag display ORF bibliotheek, kunnen de uitvoer klonen worden sequenced en geanalyseerd met dezelfde pijpleiding. NGS kan bieden een complete en statistisch significant ranking van de meest vaak geselecteerd ORFs en dit maakt de identificatie van de eiwitten die meestal interactie met het aas gebruikt. Gezien de aanwezigheid van vele verschillende versies van elk domein verschilt door enkele aminozuren, geeft de overlap tussen verschillende gesequenceerd klonen ook het minimale fragment/domein weergegeven: bindende eigenschappen. Ten slotte, dankzij de koppeling van genotype en fenotype-informatie in de bibliotheek van de bacteriofaag, zodra de domeinen van keuze zijn geïdentificeerd, de opeenvolging van DNA kan worden gemakkelijk gered uit de bibliotheek voor verdere studies, in vitro en in vivo validatie en karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het Italiaanse ministerie van onderwijs en de Universiteit (2010P3S8BR_002 naar CP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer Bandelin HD2070 or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321 or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific SM0311 or equivalent
Molecular Biology Agarose BioRad 161-3102 or equivalent
Green Gel Plus Fisher Molecular Biology FS-GEL01 or equivalent
6x DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611 or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 or equivalent
Quick Blunting Kit New England Biolabs E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368813
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S or equivalent
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 or equivalent
EcoRV New England Biolabs R0195L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289S
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2 general lab supplier
Ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
DH5aF' bacteria cells Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes general lab supplier
1,5 ml tubes general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes Biosigma 4905020
Electroporator 2510 Eppendorf
2x YT medium Sigma-Aldrich Y1003
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
DreamTaq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
150 mm plates general lab supplier
100 mm plates general lab supplier
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
BssHII New England Biolabs R0199L
NheI New England Biolabs R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 or equivalent
M13KO7 Helper Phage GE Healthcare Life Sciences 27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K1377
Polyethylene glycol (PEG) Sigma-Aldrich P5413
Sodium Cloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
PBS general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10003D or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack Thermo Fisher Scientific CS15000 or equivalent
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Nonfat dried milk powder EuroClone EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix  Kapa Biosystems, Fisher Scientific 7958935001
AMPure XP beads Agencourt, Beckman Coulter A63881
Nextera XT dual Index Primers Illumina FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500 Illumina
Spectrophotomer Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation Agilent
Forward PCR primer general lab supplier 5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer general lab supplier 5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS general lab supplier 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS general lab supplier 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Tags

Biologie kwestie 140 Phage weergeven Next Generation Sequencing Interactome eiwit domein webtool opvouwbare verslaggever eiwitstructuur.
Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda,… More

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda, G., Grillo, G., Licciulli, V. F., Consiglio, A., Edomi, P., Santoro, C., Sblattero, D., Peano, C. Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e56981, doi:10.3791/56981 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter