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Biology

Interactome-Seq: फेज प्रदर्शन और अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा Domainome पुस्तकालय निर्माण, सत्यापन और चयन के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/56981
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 4, 1, 4, 5,6
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

Summary

प्रोटोकॉल का वर्णन निर्माण, लक्षण वर्णन और चयन की अनुमति (पसंद के लक्ष्य के खिलाफ) एक "domainome" किसी भी डीएनए स्रोत से बना पुस्तकालय । फेज प्रदर्शन, एक तह रिपोर्टर और डेटा विश्लेषण के लिए एक वेब उपकरण के साथ अगली पीढ़ी sequencing: यह एक अनुसंधान पाइपलाइन है कि विभिन्न प्रौद्योगिकियों को जोड़ती द्वारा हासिल की है.

Abstract

तह रिपोर्टर ऐसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध, जिसकी तह और समारोह के रूप में आसानी से पहचाने phenotypes, के साथ प्रोटीन है जब खराब तह प्रोटीन या यादृच्छिक खुले पढ़ने के फ्रेम से जुड़े समझौता किया है । हम एक रणनीति विकसित की है, जहां, उनि का उपयोग करके-1 β-lactamase (एम्पीसिलीन प्रतिरोध एंजाइम) एक जीनोमिक पैमाने पर, हम सही ढंग से जोड़कर प्रोटीन डोमेन के संग्रह का चयन कर सकते हैं किसी भी intronless जीनोम के डीएनए के कोडिंग भाग से. इस दृष्टिकोण के द्वारा प्राप्त प्रोटीन टुकड़े, तथाकथित "domainome", अच्छी तरह से व्यक्त किया जाएगा और घुलनशील, उन्हें संरचनात्मक/कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाने.

क्लोनिंग और प्रदर्शित करके "domainome" सीधे एक फेज प्रदर्शन प्रणाली में, हमने दिखाया है कि यह वांछित बाध्यकारी गुणों के साथ विशिष्ट प्रोटीन डोमेन का चयन करने के लिए संभव है (जैसे, अंय प्रोटीन या एंटीबॉडी के लिए), इस प्रकार आवश्यक प्रदान जीन एनोटेशन या प्रतिजन पहचान के लिए प्रयोगात्मक जानकारी।

एक चयनित polyclonal जनसंख्या में सबसे समृद्ध क्लोन की पहचान उपंयास अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों (NGS) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, हम ही पुस्तकालय और चयन outputs के गहरे अनुक्रमण विश्लेषण परिचय विविधता, बहुतायत और चयनित टुकड़ा में से प्रत्येक की सटीक मानचित्रण पर पूरी जानकारी प्रदान करने के लिए । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पुस्तकालय निर्माण, लक्षण वर्णन, और सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण कदम दिखा ।

Introduction

यहां, हम निर्माण और किसी भी genic/जीनोमिक प्रारंभिक स्रोत से जोड़ और घुलनशील प्रोटीन डोमेन के पुस्तकालयों के चयन के लिए एक उच्च प्रवाह विधि का वर्णन । फेज प्रदर्शन, डेटा विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट वेब उपकरण के साथ एक तह रिपोर्टर और अगली पीढ़ी sequencing (NGS) का उपयोग: दृष्टिकोण तीन विभिन्न प्रौद्योगिकियों को जोड़ती है. तरीकों की पहचान और नए प्रोटीन/प्रोटीन डोमेन, ज्ञात प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों के लक्षण वर्णन के रूप में अच्छी तरह से परिभाषा के लिए प्रोटीन आधारित अनुसंधान के कई अलग संदर्भों में इस्तेमाल किया जा सकता प्रोटीन-इंटरेक्शन नेटवर्क ।

कई खुले सवाल अभी भी प्रोटीन आधारित अनुसंधान में मौजूद है और इष्टतम प्रोटीन उत्पादन के लिए तरीकों के विकास की जांच के कई क्षेत्रों के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । उदाहरण के लिए, prokaryotic और eukaryotic जीनोम के हजारों की उपलब्धता के बावजूद1, कोडित प्रोटीन और पेप्टाइड्स का एक सीधा एनोटेशन के साथ रिश्तेदार proteomes के एक इसी नक्शे जीवों के महान बहुमत के लिए अभी भी याद आ रही है । पूरा proteomes की सूची एक चुनौतीपूर्ण समय और संसाधनों के संदर्भ में एक विशाल प्रयास की आवश्यकता के लक्ष्य के रूप में उभर रहा है । प्रयोगात्मक एनोटेशन के लिए स्वर्ण मानक सभी खुले पढ़ने के फ्रेम (ORFs) के एक जीनोम के क्लोनिंग, तथाकथित "ORFeome" के निर्माण रहता है । आमतौर पर जीन समारोह ज्ञात गतिविधि के संबंधित जीन के लिए समरूपता के आधार पर सौंपा है, लेकिन इस दृष्टिकोण खराब संदर्भ डेटाबेस में कई गलत एनोटेशन की उपस्थिति के कारण सटीक है2,3,4, 5. इसके अलावा, भी प्रोटीन है कि पहचान की गई है और व्याख्या के लिए, अतिरिक्त अध्ययन के लिए बहुतायत के संदर्भ में लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, अलग संदर्भों में अभिव्यक्ति पैटर्न, संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण सहित के रूप में अच्छी तरह के रूप में संपर्क नेटवर्क ।

इसके अलावा, के बाद से प्रोटीन अलग डोमेन से बना रहे हैं, उनमें से प्रत्येक विशिष्ट सुविधाओं और अलग प्रोटीन कार्यों के लिए योगदान दिखा रहा है, अध्ययन और इन डोमेन की सटीक परिभाषा एक और अधिक व्यापक चित्र, दोनों में एक की अनुमति कर सकते है जीन और पूर्ण जीनोम के स्तर पर । यह सभी आवश्यक जानकारी प्रोटीन आधारित अनुसंधान एक व्यापक और चुनौतीपूर्ण क्षेत्र बनाता है ।

इस परिप्रेक्ष्य में, एक महत्वपूर्ण योगदान निष्पक्ष और प्रोटीन उत्पादन के लिए उच्च प्रवाह तरीकों द्वारा दिया जा सकता है । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण की सफलता, काफी आवश्यक निवेश के बगल में, में घुलनशील उत्पादन की क्षमता पर निर्भर करता है/ यह एक प्रमुख सीमित कारक है क्योंकि यह अनुमान लगाया गया है कि केवल के बारे में 30% प्रोटीन सफलतापूर्वक व्यक्त किया जा सकता है और पर्याप्त स्तर पर उत्पादन के लिए उपयोगी6,7,8। एक दृष्टिकोण इस सीमा को दूर करने के लिए बेतरतीब ढंग से खंडित डीएनए के उपयोग के लिए अलग polypeptides, जो एक साथ व्यक्तिगत जीन का टुकड़ा प्रतिनिधित्व अतिव्यापी उपलब्ध कराने के उत्पादन पर आधारित है । केवल बेतरतीब ढंग से उत्पंन डीएनए अंशों का एक छोटा सा प्रतिशत कार्यात्मक ORFs है whilst उनमें से महान बहुमत गैर कार्यात्मक है (उनके दृश्यों के अंदर बंद करो codons की उपस्थिति के कारण) या संयुक्त राष्ट्र के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना-प्राकृतिक (एक फ्रेम में अंय मूल के अलावा ओआरएफ) कोई जैविक अर्थ के साथ polypeptides ।

इन सभी मुद्दों को हल करने के लिए, हमारे समूह एक उच्च प्रवाह प्रोटीन अभिव्यक्ति और संपर्क विश्लेषण मंच है कि एक जीनोमिक स्केल9,10,11,12पर इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित की है । यह मंच निम्नलिखित तकनीकों को एकीकृत करता है: 1) किसी भी जीव से डीएनए के कोडिंग भाग से सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन डोमेन के संग्रह का चयन करने के लिए एक विधि; 2) फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी बातचीत के भागीदारों के चयन के लिए; 3) NGS पूरी तरह से अध्ययन के तहत पूरी interactome की विशेषता और ब्याज के क्लोन की पहचान; और 4) एक आसान और उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से Interactome-Seq विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए किसी भी bioinformatics या प्रोग्रामिंग कौशल के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए डेटा विश्लेषण के लिए एक वेब उपकरण.

इस मंच का उपयोग जांच की वैकल्पिक रणनीतियों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है; सभी विधि से ऊपर पूरी तरह से निष्पक्ष, उच्च प्रवाह है, और एक पूरे जीनोम के लिए एक भी जीन से लेकर अध्ययन के लिए मॉड्यूलर । पाइपलाइन का पहला कदम अध्ययन के तहत बेतरतीब खंडित डीएनए से एक पुस्तकालय के निर्माण, जो तब NGS द्वारा गहराई से विशेषता है । इस पुस्तकालय के एक इंजीनियर सदिश का उपयोग कर उत्पंन होता है जहां जीन/टुकड़े ब्याज के periplasmic अंतरिक्ष में प्रोटीन स्राव के लिए एक संकेत अनुक्रम के बीच क्लोन कर रहे है (यानी, एक एसईसी नेता) और TEM1 β-lactamase जीन । फ्यूजन प्रोटीन एम्पीसिलीन प्रतिरोध और एम्पीसिलीन दबाव के तहत जीवित रहने की क्षमता प्रदान करेगा केवल अगर क्लोन टुकड़े इन दोनों तत्वों और जिसके परिणामस्वरूप फ्यूजन प्रोटीन के साथ फ्रेम कर रहे हैं सही ढंग से जोड़ रहा है10,13 ,14. सभी क्लोनों एंटीबायोटिक चयन के बाद बचाया, तथाकथित "फ़िल्टर क्लोन", ORFs और कर रहे हैं, उनमें से एक महान बहुमत (अधिक से अधिक ८०%), असली जीन9से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, इस रणनीति की शक्ति निष्कर्षों में निहित है कि सभी ओआरएफ फ़िल्टर किए गए क्लोन सही ढंग से तह/घुलनशील प्रोटीन के लिएएंकोडिंग/ के रूप में कई क्लोन, पुस्तकालय में मौजूद है और एक ही क्षेत्र/डोमेन में मानचित्रण, अलग शुरू और अंत अंक है, यह निष्पक्ष, एकल-ंयूनतम टुकड़े कि घुलनशील उत्पादों में परिणाम होने की संभावना है की एक कदम पहचान की अनुमति देता है ।

प्रौद्योगिकी में एक और सुधार NGS के उपयोग के लिए पुस्तकालय की विशेषताएं द्वारा दिया जाता है । इस मंच का संयोजन और डेटा विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट वेब उपकरण के सटीक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पर महत्वपूर्ण निष्पक्ष जानकारी देता है और आगे व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता के बिना अध्ययन के तहत संदर्भ डीएनए पर चयनित ORFs के स्थान पर या प्रायोगिक प्रयास ।

Domainome पुस्तकालयों एक चयन के संदर्भ में स्थानांतरित किया जा सकता है और कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए एक सार्वभौमिक साधन के रूप में इस्तेमाल किया । उच्च प्रवाह प्रोटीन अभिव्यक्ति और संपर्क विश्लेषण मंच है कि हम एकीकृत और है कि हम Interactome बुलाया Seq एक phagemid वेक्टर में फ़िल्टर ओआरएफ स्थानांतरित करके फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है और एक फेज-ओआरएफ बनाने लायब्रेरी. एक बार फिर से एक फेज प्रदर्शन संदर्भ में क्लोन, प्रोटीन डोमेन M13 कणों की सतह पर प्रदर्शित कर रहे हैं; इस तरह domainome पुस्तकालयों सीधे जीन टुकड़े विशिष्ट एंजाइमी गतिविधियों या बाध्यकारी गुणों के साथ डोमेन एंकोडिंग के लिए चुना जा सकता है, की अनुमति interactome नेटवर्क की रूपरेखा । यह दृष्टिकोण शुरू में Zacchi एट अल द्वारा वर्णित किया गया था । 16 और बाद में कई अन्य प्रसंगों में प्रयुक्त13,17,18.

अंय प्रौद्योगिकियों प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया (सहित खमीर दो संकर प्रणाली और मास19स्पेक्ट्रोमेट्री,20), एक प्रमुख लाभ बाध्यकारी भागीदार है कि फेज के दौरान होता है के प्रवर्धन है की तुलना में चयन के कई राउंड प्रदर्शित करें । यह चयन संवेदनशीलता इस प्रकार कम प्रचुर मात्रा में बाध्यकारी प्रोटीन ' डोमेन पुस्तकालय में मौजूद की पहचान की अनुमति बढ़ जाती है । ओआरएफ-फ़िल्टर्ड पुस्तकालय के साथ प्रदर्शन के चयन की दक्षता और गैर कार्यात्मक क्लोन के अभाव की वजह से वृद्धि हुई है । अंत में, प्रौद्योगिकी चयन दोनों प्रोटीन और गैर प्रोटीन चारा21,22,23,24,25के खिलाफ प्रदर्शन करने की अनुमति देता है ।

domainome-फेज पुस्तकालय का उपयोग फेज सिलेक्शन विभिन्न रोग की स्थिति के साथ रोगियों के सीरा से आ रही एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, जैसे स्व-प्रतिरक्षित रोग13, चारा के रूप में कैंसर या संक्रमण रोगों. इस दृष्टिकोण को तथाकथित "एंटीबॉडी हस्ताक्षर" के अध्ययन के तहत रोग के बड़े पैमाने पर पहचान करने के लिए अनुमति देने और प्रतिजनों/epitopes विशेष रूप से एक ही समय में रोगियों के एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अंय तरीकों की तुलना में फेज प्रदर्शन का उपयोग दोनों रैखिक और संरचना प्रतिजनी epitopes की पहचान की अनुमति देता है । एक विशिष्ट हस्ताक्षर की पहचान संभावित रोगजनन, नई वैक्सीन डिजाइन, नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और नए और विशिष्ट नैदानिक और शकुन उपकरणों के विकास को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । इसके अलावा, जब अध्ययन संक्रामक रोगों पर ध्यान केंद्रित किया है, एक प्रमुख लाभ यह है कि immunogenic प्रोटीन की खोज रोगज़नक़ खेती से स्वतंत्र है ।

हमारे दृष्टिकोण पुष्टि की है कि तह पत्रकारों को एक जीनोमिक पैमाने पर इस्तेमाल किया जा सकता है "domainome" का चयन करें: सही ढंग से तह का संग्रह, अच्छी तरह से व्यक्त की, घुलनशील प्रोटीन डोमेन से डीएनए और/ एक बार अलग प्रोटीन टुकड़े कई प्रयोजनों के लिए उपयोगी होते हैं, जीन एनोटेशन के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक जानकारी प्रदान करने के साथ ही संरचनात्मक अध्ययन के लिए, एंटीबॉडी epitope मानचित्रण, प्रतिजन पहचान, आदि उच्च प्रवाह NGS द्वारा उपलब्ध कराए गए आंकड़ों की पूर्णता ऐसे फेज प्रदर्शन पुस्तकालयों के रूप में अत्यधिक जटिल नमूनों, के विश्लेषण में सक्षम बनाता है, और करने के लिए पारंपरिक श्रमसाध्य उठा और व्यक्तिगत फेज बचाया क्लोन के परीक्षण को दरकिनार क्षमता रखती है ।

एक ही समय में फ़िल्टर पुस्तकालय की सुविधाओं के लिए धंयवाद और चरम संवेदनशीलता और NGS विश्लेषण की शक्ति के लिए, यह प्रोटीन एक प्रारंभिक स्क्रीन में सीधे प्रत्येक संपर्क के जिंमेदार डोमेन की पहचान संभव है, बनाने की आवश्यकता के बिना प्रत्येक सीमित प्रोटीन के लिए अतिरिक्त पुस्तकालयों । NGS किसी भी genic के पूरे domainome की एक व्यापक परिभाषा प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है/जीनोमिक शुरू स्रोत और डेटा विश्लेषण वेब उपकरण दोनों के एक गुणात्मक और मात्रात्मक दृष्टि से एक उच्च विशिष्ट लक्षण वर्णन के प्राप्यता सक्षम बनाता है interactome प्रोटीन्स ' गरिन्छ ।

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Protocol

1. ओआरएफ पुस्तकालय का निर्माण (चित्रा 1)

  1. डीएनए डालने की तैयारी
    1. सिंथेटिक या जीनोमिक डीएनए से तैयारी टुकड़े
      1. निकालें/शुद्ध डीएनए मानक तरीकों का उपयोग कर26.
      2. sonication द्वारा डीएनए टुकड़ा । यदि एक मानक sonicator का उपयोग कर, एक सामांय सुझाव के रूप में १००% बिजली उत्पादन में 30 एस दालों के साथ शुरू करते हैं ।
        नोट: पायलट प्रयोगों अलग शक्ति और sonication के समय के साथ किया जाना चाहिए डीएनए तैयार करने के लिए इष्टतम स्थिति निर्धारित करने के लिए । के बाद प्रत्येक परीक्षण agarose जेल ट्रो द्वारा डीएनए टुकड़े के आकार का निर्धारण ।
      3. १.५% agarose जेल पर sonicated डीएनए लोड, एक साथ एक १०० बीपी डीएनए सीढ़ी के साथ । 15 मिनट के लिए 5 वी/सेमी पर एक छोटी ट्रो चलाने के लिए और खंडित डीएनए के धब्बा युक्त जेल के हिस्से में कटौती करते हैं ।
      4. एक कॉलम आधारित जेल निष्कर्षण किट के साथ डालें डीएनए शुद्ध और एकाग्रता एक यूवी spectrophotometer का उपयोग कर उपाय ।
        नोट: इस चरण के बाद, १.३ चरण में वर्णित के रूप में 1 µ g के साथ ligated किया जा करने के लिए शुद्ध सम्मिलित करता है की कम से कम ५०० एनजी प्राप्त किया जाना चाहिए । नमूने की कम गुणवत्ता के बाद से एक260nm/280nm और एक260nm/230nm अनुपात मूल्यांकन द्वारा तैयारी टुकड़े की गुणवत्ता की जांच बंधाव दक्षता को प्रभावित करेगा ।
      5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार त्वरित कुंद किट एंजाइम मिश्रण के 1 μL के साथ आवेषण के 5 μg तक इलाज । 10 मिनट के लिए ७० ° c पर हीटिंग से एंजाइमों निष्क्रिय. नमूनों का उपयोग करने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. सीडीएनए से तैयार हो रहे टुकड़े
      1. मानक तरीकों के साथ आरएनए निकालें (जैसे, TRizol या इसी तरह के रिएजेंट का उपयोग करके).
      2. रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करने से पहले हीटिंग द्वारा टुकड़ा mRNA । अंतिम डीएनए टुकड़ा लंबाई mRNA उबलते समय और यादृच्छिक प्राइमर एकाग्रता द्वारा नियंत्रित किया जाता है । उदाहरण के लिए, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए हीट सैंपल ।
      3. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद किसी भी उपलब्ध किट के साथ यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग कर सीडीएनए तैयार करें ।
      4. biotinylated पाली के साथ संकरण द्वारा पाली-डीटी पूंछ के सीडीएनए चूस-३७ ° c पर 3 ज के लिए दा, और Carninci एट अल द्वारा वर्णित के रूप में streptavidin चुंबकीय मोतियों पर अलग । 13
      5. असीम सामग्री की वसूली और एक कॉलम आधारित डीएनए शुद्धि किट के साथ शुद्ध निर्माता के निर्देशों का पालन । एक यूवी spectrophotometer का उपयोग कर एकाग्रता को मापने । चरण 1.1.1.4 में नोट देखें ।
  2. फ़िल्टरिंग वेक्टर की तैयारी
    1. डाइजेस्ट 5 µ के जी शुद्ध क्लोनिंग वेक्टर pFILTER312 EcoRV प्रतिबंध एंजाइम के 10 यू के साथ, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ।
    2. लोड 2 µ l (२०० एनजी) पचा वेक्टर के १०० एनजी के साथ एक साथ, एक 1% agarose जेल पर, अपच वेक्टर और एक से अधिक बीपी आणविक मार्कर, उचित पाचन के लिए जांच करने के लिए । हीट प्रतिबंध एंजाइम निष्क्रिय ।
    3. 10x फॉस्फेट बफर और 1 µ एल के 1/10 खंड जोड़ें (5 U) के लिए ३७ ° c पर फॉस्फेट और मशीन 15 min. Heat निष्क्रिय के लिए 5 मिनट में ६५ ° c ।
    4. agarose जेल से निष्कर्षण द्वारा पचा प्लाज्मिड शुद्ध, और एक यूवी spectrophotometer का उपयोग कर एकाग्रता को मापने । नमूने में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c उपयोग तक ।
  3. बंधाव और परिवर्तन
    1. प्रदर्शन बंधाव निम्नानुसार: के लिए 1 µ जी के पच प्लाज्मिड जोड़ें ४०० एनजी के phosphorylated आवेषण (प्लाज्मिड: दाढ़ अनुपात 1:5 डालें), टी-4 डीएनए Ligase के लिए 10x बफर के 10 µ एल, उच्च एकाग्रता की एक अंतिम मात्रा में टी-4 डीएनए Ligase के 2 µ एल के १०० µ एल पर प्रतिक्रिया की मशीन 16 ° c overni चाई. हीट 10 मिनट के लिए ६५ ° c पर निष्क्रिय ।
    2. 1/10 सोडियम एसीटेट समाधान की मात्रा (3 एम, पीएच ५.२) और १००% इथेनॉल के २.५ संस्करणों को जोड़कर बंधाव उत्पाद हाला । मिश्रण और 20 मिनट के लिए-८० ° c पर फ्रीज ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अधिकतम गति से केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    4. गोली को ठंडा ७०% इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अधिकतम गति से केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    5. हवा गोली सूखी । पानी की 10 µ एल में उपजी डीएनए resuspend.
    6. बैक्टीरियल सेल electroporation प्रदर्शन ।
      नोट: उच्च दक्षता कोशिकाओं (डीएनए के µ जी प्रति 5x109 transformants) के ऊपर का उपयोग की आवश्यकता है । हम ई कोलाई DH5αF का उपयोग सुझाव ' (एफ '/endA1 hsd17 (आरके − mK +) supE44 थी-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 देओर (F80dlacD-(lacZ) M15) घर में उत्पादित या कई निर्माताओं से खरीदा है ।
      1. बर्फ पर microcentrifuge ट्यूबों और ०.१ सेमी-electroporation cuvettes की उपयुक्त संख्या रखें । शुद्ध बंधाव समाधान के 1 µ एल जोड़ें (DI पानी में) कोशिकाओं के 25 µ एल करने के लिए और ट्यूब कई बार झटका ।
      2. शीत cuvette के लिए डीएनए-सेल मिश्रण स्थानांतरण, countertop 2x पर नल, cuvette के बाहरी से पानी पोंछ, electroporation मॉड्यूल और प्रेस पल्स में जगह है ।
      3. एक मानक electroporator 25 µF, २०० Ω और १.८ केवी का उपयोग मशीन के साथ electroporation प्रदर्शन । समय स्थिरांक 4-5 ms होना आवश्यक है ।
    7. तुरंत किसी भी एंटीबायोटिक के बिना तरल 2xYT मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने, एक 10 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण और ३७ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति, 1 ज के लिए २२० rpm पर मिलाते हुए ।
    8. प्लेट बदल DH5αF ' पर 15 सेमी 2xYT आगर प्लेट्स ३४ µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल (pFILTER प्रतिरोध) और 25 µ जी/एमएल एम्पीसिलीन (ORFs के लिए चयनित मार्कर) के साथ पूरक और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    9. क्लॉरॅंफेनिकोल + एम्पीसिलीन के साथ और क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ पूरक प्लेट 10 सेमी 2xYT पर पुस्तकालय की प्लेट कमजोर पड़ने, पुस्तकालय अनुमापन करने के लिए. 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  4. pFILTER-ओआरएफ पुस्तकालय मांयता
    1. क्लॉरॅंफेनिकोल और क्लॉरॅंफेनिकोल/एम्पीसिलीन प्लेटों दोनों से 15-20 कालोनियों का परीक्षण करें आकार वितरण का अनुमान लगाने के लिए । एक टिप के साथ एकल कॉलोनियों उठाओ और उन्हें अलग से १०० µ एल में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 2xYT माध्यम से पतला । एक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस समाधान के ०.५ µ एल का उपयोग करें, किसी भी मानक TaqDNA पोलीमरेज़ के बाद निर्माता के प्रोटोकॉल के साथ.
    2. ५५ डिग्री सेल्सियस के एक टी एनीलिंग का उपयोग कर प्रवर्धन के 25 चक्र और ४० एस के ७२ डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तार समय प्रदर्शन । प्राइमरी जुगाड़ सामग्री की तालिकामें दिए गए हैं ।
    3. १.५% agarose जेल, एक साथ एक १०० बीपी डीएनए सीढ़ी और चलाने पर पीसीआर उत्पादों लोड ।
  5. pFILTER-ओआरएफ पुस्तकालय संग्रह
    1. ताजा 2xYT मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़कर और उन्हें एक बाँझ खुरचनी के साथ कटाई, अच्छी तरह से मिश्रण, उन्हें 20% बाँझ ग्लिसरॉल के साथ पूरक और छोटे aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के द्वारा १५० मिमी प्लेटों से बैक्टीरिया ले लीजिए ।
    2. पुस्तकालय के एक aliquot से प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध (ग्लिसरॉल के अलावा से पहले) एक कॉलम आधारित प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों का पालन ।
    3. यूवी spectrophotometer के साथ एकाग्रता को मापने । नमूने NGS द्वारा phagemid पुस्तकालय की तैयारी और/या लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. एक Phagemid वेक्टर में फ़िल्टर्ड ORFs का उपक्लोनिंग (चित्रा 2)

  1. ओआरएफ फ़िल्टर्ड डीएनए अंशों की तैयारी
    1. pFILTER से शुद्ध वेक्टर के 5 µ जी के प्रतिबंध एंजाइम पाचन सेट-ओआरएफ पुस्तकालय वेक्टर BssHII के 10 यू जोड़ने और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मशीन । NheI के 10 यू के साथ एंजाइम और डाइजेस्ट निष्क्रिय ।
    2. १.५% agarose जेल पर पचा डीएनए लोड, एक साथ एक १०० बीपी डीएनए सीढ़ी के साथ । 15 मिनट के लिए 5 वी/सेमी पर एक छोटी ट्रो चलाने के लिए या सिर्फ पर्याप्त उत्पाद के टुकड़े के धब्बा भेद और उंहें युक्त जेल के हिस्से में कटौती करने के लिए ।
    3. एक कॉलम के साथ डालें डीएनए शुद्ध-बेस जेल निष्कर्षण किट और एक यूवी spectrophotometer का उपयोग एकाग्रता उपाय ।
  2. phagemid डीएनए की तैयारी
    1. प्रतिबंध एंजाइम पाचन की स्थापना 5 शुद्ध pDAN5 के µ जी27 आवेषण के लिए के रूप में ।
    2. एक ०.७५% agarose जेल पर पचा डीएनए चल रहा है और एक कॉलम आधारित किट के साथ जेल से निकालने के द्वारा पचा प्लाज्मिड शुद्ध ।
    3. एक यूवी spectrophotometer का उपयोग कर एकाग्रता को मापने । नमूने में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c उपयोग तक ।
  3. पुस्तकालय बंधाव, परिवर्तन और संग्रह
    1. बंधाव और pFILTER वेक्टर के लिए वर्णित के रूप में परिवर्तन करते हैं ।
    2. प्लेट बदल DH5αF ' पर १५० mm 2xYT आगार प्लेटों १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी ।
    3. १०० mm 2xYT आगार प्लेटों पर पुस्तकालय की प्लेट कमजोरियां १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक पुस्तकालय आकार निर्धारित करने के लिए ।
    4. चरण १.४ में वर्णित के रूप में बेतरतीब ढंग से उठाया क्लोन के पीसीआर द्वारा पुस्तकालय सत्यापन करते हैं ।
    5. १५० mm प्लेट्स से बैक्टीरिया की कटाई से phagemid-ओआरएफ पुस्तकालय लीजिए, अच्छी तरह से मिश्रण, उंहें 20% बाँझ ग्लिसरॉल के साथ पूरक और छोटे aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    6. एक कॉलम आधारित प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग कर पुस्तकालय के एक aliquot से प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध, निर्माता के निर्देशों का पालन ।
    7. यूवी spectrophotometer पर एकाग्रता को मापने । नमूने NGS द्वारा लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. फेज पुस्तकालय की तैयारी और चयन प्रक्रिया

  1. फेज उत्पादन
    1. 2xYT तरल शोरबा के 10 मिलीलीटर में phagemid पुस्तकालय के शेयर aliquot को पतला १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक के क्रम में एक आयुध डिपो600nm = ०.०५ है ।
    2. एक बाँझ कुप्पी में पतला पुस्तकालय बढ़ने 5-10 बार मूल मात्रा से बड़ा, २२० rpm पर झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर जब तक पहुंच आयुध डिपो600nm = ०.५ ।
    3. 20:1 संक्रमण की बहुलता पर सहायक फेज (उदा. M13K07) के साथ बैक्टीरिया संक्रमित । सामयिक आंदोलन के साथ ४५ मिनट के लिए ३७ ° c पर छोड़ दो (हर 10 मिनट) ।
    4. ४००० x g पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैक्टीरिया केंद्रापसारक । supernatant त्यागें, 2xYT तरल शोरबा के ४० मिलीलीटर में फिर से निलंबित बैक्टीरिया गोली १०० µ जी के साथ पूरक/एमएल एम्पीसिलीन और ५० µ जी/एमएल कनमीसिन और रात के लिए २२० rpm पर मिलाते के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर हो जाना ।
    5. दिन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ४००० x g पर बैक्टीरिया केंद्रापसारक । phages युक्त supernatant लीजिए.
  2. phages के खूंटी-वर्षण ।
    1. जोड़ें 1/5 एक ०.२२ µm फ़िल्टर खूंटी/NaCl समाधान (20% डब्ल्यू/वी खूंटी ६०००, २.५ एम NaCl) की मात्रा को मंजूरी दे दी phages के लिए और बर्फ पर मशीन 30-60 मिनट के लिए ।
      नोट: समाधान कुछ ही मिनटों के बाद शक्की बन गया, एक सफल फेज वर्षण का संकेत है । समाधान की बादल की मशीन समय के साथ वृद्धि होगी ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४००० x g पर केंद्रापसारक । phages की एक सफेद छोटी गोली बनेगी ।
    3. बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में इसे पुनर्निलंबित । १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और contaminant बैक्टीरिया को दूर करने के लिए अधिकतम गति पर 10 मिनट के लिए 4 ° c पर केंद्रापसारक । एक भूरे रंग की गोली फार्म जाएगा ।
    4. स्थानांतरण supernatant युक्त phages एक नई ट्यूब के लिए । लगातार अनुमापन और फेज चयन के लिए बर्फ पर phages रखें ।
  3. फेज अनुमापन
    1. फेज समाधान के धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । 10-2 कमजोरियां प्राप्त करने के लिए पंजाब के ९९० µ एल में फेज सॉल्यूशन के 10 µ l डालिये । पुनः पतला इस तैयारी 10-4 बनाने के लिए और इस से एक 10-6 कमजोर पड़ने प्राप्त करते हैं ।
    2. 2xYT तरल माध्यम में DH5αF ' बैक्टीरिया कोशिकाओं बढ़ने के साथ ३७ ° c जब तक आयुध डिपो600nm = ०.५ तक पहुंच गया है । १.५ मिलीलीटर ट्यूब में तैयार बैक्टीरिया के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और तुरंत 10-4 फेज कमजोर पड़ने के 1 µ एल के साथ संक्रमित । ४५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए बिना मशीन 10-6 कमजोर पड़ने के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    3. १०० mm 2xYT प्लेट में संक्रमित बैक्टीरिया की प्लेट कमजोर पड़ने । रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली रखो ।
    4. प्लेट १०० संक्रमित DH5αF के µ एल ' एक 2xYT आगर प्लेट पर १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक की तैयारी में संदूषण के अभाव की जांच करने के लिए ।
    5. दिन के बाद कालोनियों की संख्या गिनती और फेज titer की गणना । phages/एमएल की संख्या के रूप में एक्सप्रेस titer । अवस्थापना titer 1012-13 phages/एमएल.
  4. फेज चयन
    1. फेज चयन के रूप में चारा शुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग
      1. फेज तैयारी के कमजोर २०० µ एल द्वारा संतृप्त phages पंजाब के एक बराबर मात्रा में-4% स्किम दूध और धीमी गति से रोटेशन में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन । इस चरण के लिए विशिष्ट बाइंडिंग phages की ब्लॉकिंग की अनुमति देता है । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रोटीन जी लेपित चुंबकीय मोतियों की 30 µ एल हस्तांतरण ।
      2. धो दो बार के रूप में इस प्रकार है: पंजाब के ५०० µ एल जोड़ें, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए धीमी गति से रोटेशन में एक पहिया पर मशीन, एक चुंबक का उपयोग कर ट्यूब के एक तरफ मोती आकर्षित और supernatant को दूर ।
      3. गर्मी धीमी गति से रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए धोया मोतियों के साथ phages संतृप्त ।
      4. एक तरफ एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करने के लिए मोती ड्रा । चयन चरण के लिए उपयोग की जाने वाली phages युक्त supernatant को एकत्र करें ।
      5. चुंबकीय मोती तैयार है, जबकि पिछले कदम प्रदर्शन, शुद्ध एंटीबॉडी conjugating द्वारा । ऊपर वर्णित के रूप में प्रोटीन जी लेपित चुंबकीय मोतियों की 30 µ एल धो लें । ५०० पंजाब के µ एल में शुद्ध एंटीबॉडी के 10 µ जी पतला, धोया मोती में जोड़ें और ४५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीमी गति से रोटेशन में मशीन । पंजाबियों के साथ दो बार धोएं ।
        नोट: चुंबकीय मोतियों की दो अलग तैयारी प्रदर्शन: ब्याज की एंटीबॉडी के साथ एक और नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ एक, जैसे, एंटीबॉडी स्वस्थ दाताओं से शुद्ध. नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ चयनित एंटीजन के अनुक्रम outputs के विश्लेषण कदम के दौरान घटाया जाता है. वैकल्पिक रूप से, चुंबकीय मोतियों नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ भरी हुई phages के एक पूर्व समाशोधन कदम प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (संयुक्त राष्ट्र के साथ मशीन के लिए प्रोटोकॉल का पालन-संयुग्मित मोतियों).
      6. फेज चयन: एक चुंबक का उपयोग कर ट्यूब के एक तरफ के लिए मोती ड्रा, पिछले धोने को हटाने, phages जोड़ने और ९० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीमी गति से रोटेशन के साथ मशीन को धोने-पंजाब के ५०० µ एल के साथ 5 बार-०.१% के बीच-20 और 5 बार पंजाबियों के साथ ।
      7. Elute बाध्य phages, चयन के उत्पादन का प्रतिनिधित्व, DH5αF ' कोशिकाओं की 1 मिलीलीटर के साथ मोतियों को मिलाकर आयुध डिपो६०० = ०.५ पर हो । सामयिक झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए मोतियों की मशीन के साथ बैक्टीरिया (हर 10 मिनट) । एक १५० mm 2xYT आगर प्लेट पर उत्पादन १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक प्लेट ।
      8. प्लेट १०० µ एल के पतला और उत्पादन के विभिन्न कमजोर पड़ने की (10-1 करने के लिए 10-5) अनुमापन प्रदर्शन करने के लिए. दिन के बाद ताजा 2xYT मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़कर और उंहें एक बाँझ खुरचनी के साथ कटाई से १५० mm प्लेटों से बैक्टीरिया इकट्ठा, अच्छी तरह से मिश्रण, उंहें 20% बाँझ ग्लिसरॉल के साथ पूरक और छोटे aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
      9. एक aliquot फिर से विकसित करने के लिए चयन के एक दूसरे दौर प्रदर्शन । सभी panning प्रक्रिया को दोहराने के रूप में धोने की स्थिति के लिए छोड़कर ऊपर वर्णित है । इस मामले में पंजाब के साथ 10 बार धो-1% के बीच-20 (ट्यूब में समाधान डालो और बाहर फिर से तुरंत डालना) । फिर पंजाब के ५०० µ एल जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रोटेशन पर मशीन । पंजाबियों के साथ अन्य 10 बहाकर प्रदर्शन । चयन के पहले दौर के लिए के रूप में रेफरेंस कदम के साथ आगे बढ़ें ।
      10. एक कॉलम का उपयोग कर उत्पादन की एक aliquot से प्लाज्मिड डीएनए निकालें-किट आधारित, निर्माताओं के निर्देशों का पालन । जब तक यह गहरी अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा-20 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मिड स्टोर ।
    2. चारा रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के रूप में प्रयोग फेज चयन
      1. फेज तैयारी के कमजोर २०० µ एल द्वारा संतृप्त phages पंजाब के एक बराबर मात्रा में-4% स्किम दूध और धीमी गति से रोटेशन में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
      2. streptavidin चुंबकीय मोतियों की १०० µ एल जोड़ें । streptavidin-बाध्यकारी phages का चयन करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन । एक चुंबक का उपयोग कर एक पक्ष को मोतियों ड्राइंग द्वारा streptavidin बाध्य phages निकालें । पिछले कदम से supernatant ले लो और biotinylated प्रोटीन जोड़ें (100-550 एनएम की एकाग्रता में) और 1 घंटे के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटर पर मशीन ।
      3. चुंबकीय मोती तैयार: पिछले कदम प्रदर्शन करते हुए, streptavidin-पंजाबियों के साथ चुंबकीय मोतियों की १०० µ एल धो, पंजाब में पुनर्निलंबित 2% स्किम दूध और 30 मिनट के लिए 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर रोटेशन के साथ मशीन ।
      4. फेज चयन: एक चुंबक का उपयोग कर ट्यूब के एक तरफ के लिए मोती ड्रा, पंजाबियों को हटाने-2% दूध और फेज-प्रोटीन मिश्रण के साथ मोती resuspend । ९० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीमी गति से रोटेशन के साथ मशीन ।
      5. एक चुंबक का उपयोग कर ट्यूब के एक तरफ के लिए मोती ड्रा, supernatant त्यागें और उन्हें ध्यान से धो पांच बार ५०० µ एल के साथ पंजाब ०.१% के बीच-20. पिछले सत्र में बताए अनुसार रेफरेंस का प्रदर्शन करें ।

4. फेज पुस्तकालय गहरी अनुक्रमण मंच (चित्रा 3)

  1. डीएनए आवेषण pFILTER से वसूली-ओआरएफ-पुस्तकालय, pDAN5-ओआरएफ-पुस्तकालय या चयनित-फेज-पुस्तकालयों
    1. गल एक पुस्तकालय के aliquot, यह एक spectrophotometer का उपयोग करके मात्रा, विशिष्ट प्राइमरों के साथ प्रवर्धन द्वारा डीएनए आवेषण की वसूली ।
      नोट: आवेषण बचाव करने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों अपने 5 ' अंत में अनुकूलक दृश्यों के लिए लिंक कर रहे हैं, इस प्रकार amplicon पूल के क्रमिक अनुक्रमण प्राप्त की अनुमति और डीएनए आवेषण sequencers का उपयोग करके बरामद की प्रत्यक्ष अनुक्रमण । उनके अनुक्रम सामग्री की तालिकामें है । एडेप्टर बोल्ड में इंगित किए गए हैं, और विशिष्ट प्राइमर इटैलिक्स में इंगित किए गए हैं ।
    2. एक पीसीआर रिएक्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में (pFILTER/phagemid/चयनित-फेज) लाइब्रेरी के २.५ µ l का उपयोग करें ।
    3. निंनलिखित कार्यक्रम का प्रयोग करें: 3 मिनट के लिए ९५ ° c; 30 एस के लिए ९५ ° c के 25 चक्र, 30 एस के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस, ७२ ° c 30 s के लिए; 5 min. 4 ° c पर पकड़ के लिए ७२ ° c ।
      नोट: इस बिंदु पर यह पीसीआर उत्पाद के 1 µ एल चलाने के लिए सिफारिश की है एक विश्लेषक या TapeStation पर amplicons के आकार की पुष्टि करने के लिए और जांच करें कि वे सही श्रेणी में हैं ।
  2. पीसीआर ने साफ-सफाई की
    1. चुंबकीय मोती लाओ (जैसे, AMPure) कमरे के तापमान के लिए । पीसीआर ट्यूब से पूरे पीसीआर प्रोडक्ट को १.५ एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें । भंवर 30 एस के लिए चुंबकीय मोती यकीन है कि मोती समान रूप से फैला रहे है बनाने के लिए । एक पीसीआर उत्पाद युक्त ट्यूब को चुंबकीय मोतियों की 20 µ एल जोड़ें, धीरे से pipetting द्वारा मिश्रण । 5 मिनट के लिए मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर मशीन ।
    2. एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट 2 मिनट के लिए या supernatant मंजूरी दे दी है जब तक प्लेस । चुंबकीय स्टैंड पर पीसीआर उत्पादों के साथ, निकालें और supernatant को त्यागें ।
    3. नए सिरे से तैयार ८०% इथेनॉल के साथ मोतियों को धोने, चुंबकीय स्टैंड पर पीसीआर उत्पादों के साथ, इस प्रकार है: प्रत्येक नमूने अच्छी तरह से तैयार नए सिरे से ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें; 3 एस के लिए चुंबकीय स्टैंड पर थाली मशीन; supernatant को सावधानीपूर्वक निकालें और छोड़ें ।
    4. एक दूसरा इथेनॉल धोने प्रदर्शन, चुंबकीय स्टैंड पर पीसीआर उत्पादों के साथ; दूसरा धोने के अंत में ध्यान से सभी इथेनॉल को दूर करने और 10 मिनट के लिए हवा सूखी मोतियों की अनुमति ।
    5. चुंबकीय स्टैंड से पीसीआर उत्पादों को हटा दें, प्रत्येक ट्यूब के लिए 10 मिमी Tris पीएच ८.५ के १७.५ µ एल जोड़ें, धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट 10 बार, सुनिश्चित करें कि मोतियों को पूरी तरह से resuspend कर रहे हैं । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    6. 2 मिनट के लिए या supernatant मंजूरी दे दी है जब तक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस, ध्यान से एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए शुद्ध पीसीआर उत्पादों युक्त supernatant के 15 µ एल स्थानांतरण । -15 डिग्री सेल्सियस से 25 ° c करने के लिए एक सप्ताह के लिए अगर आप तुरंत सूचकांक पीसीआर के लिए आगे नहीं है शुद्ध पीसीआर उत्पादों की दुकान ।
  3. इंडेक्स पीसीआर
    नोट: पीसीआर को साफ करने के बाद इंडेक्स पीसीआर का प्रदर्शन करते हैं । Nextera एक्सटी इंडेक्स किट का उपयोग करें; इस प्रकार मल्टीप्लेक्स Illumina रनों के भीतर परिणामी दोहरे अनुक्रमणित पुस्तकालयों का अनुक्रम संभव हो सकेगा.
    1. सभी 15 μL प्रत्येक उत्पाद एक नई पीसीआर ट्यूब में शुद्ध युक्त स्थानांतरण और निंनलिखित प्रतिक्रिया की स्थापना की है जिसमें शामिल: 15 µ शुद्ध amplicon उत्पाद के एल, 5 µ एल के सूचकांक प्राइमर 1 और 5 µ एल के सूचकांक प्राइमर 2, 2x पीसीआर मिश्रण के 25 µ एल; फाइनल का वॉल्यूम ५० µ l
    2. एक थर्मल साइकिल चालक पर पीसीआर प्रदर्शन निंनलिखित प्रोग्राम का उपयोग: ९५ ° c 3 मिनट के लिए, ९५ ° c के लिए 30 s, ५५ ° c 30 s के लिए, ७२ ° c के लिए 30 s; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
  4. पीसीआर क्लीन-अप 2
    1. पीसीआर के लिए धारा ४.२ में वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें निंनलिखित परिवर्तनों के साथ साफ: पहले चरण में, पीसीआर उत्पाद के प्रत्येक ५० µ l को चुंबकीय मोतियों की ५६ µ एल जोड़ें ।
    2. 10 मिमी Tris पीएच ८.५ के २७.५ µ एल में मोतियों की शुद्धि के अंतिम चरण में resuspend और एक नई ट्यूब के लिए 25 µ l हस्तांतरण (यह शुद्ध अंतिम ठहराव के लिए तैयार है और फिर अनुक्रमण) पुस्तकालय है ।
    3. एक सप्ताह तक के लिए-15 डिग्री सेल्सियस से-25 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेट की दुकान अगर पुस्तकालय ठहराव के लिए आगे बढ़ने नहीं है ।
  5. अनुक्रमण लाइब्रेरी का गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन
    1. शुद्धि के बाद, एक 1:10 कमजोर पड़ने के एक µ पर अंतिम पुस्तकालय के लिए 1 एल चलाने के लिए आकार को सत्यापित करने और यह यों तो अंतिम पुस्तकालय का पता लगाने के क्षेत्र का चयन ।
    2. समानांतर में निर्माता के प्रोटोकॉल के प्रति एक पुस्तकालय ठहराव किट का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर द्वारा ठहराव पुस्तकालय प्रदर्शन करते हैं ।
  6. लायब्रेरीज़ अनुक्रमणित
    1. दोहरी अनुक्रमित पुस्तकालयों अंय दोहरी अनुक्रमित अनुक्रमण पुस्तकालयों के साथ मिलकर उत्पादित पूल । अनुक्रम लंबी पुस्तकें जनरेट कर रहा है लायब्रेरी के इस प्रकार, कम २५० bp युग्मित अंत Hiseq2500 या MiSeq उपकरण का उपयोग कर पहले मामले में प्राप्त करने के लिए 250bp pe पढ़ता है और दूसरे मामले में ३०० bp pe पढ़ता है ।

5. Bioinformatic Interactome-Seq वेब उपकरण का उपयोग करके डेटा विश्लेषण

  1. Interactome-seq डेटा विश्लेषण पाइपलाइन के साथ pFILTER/phagemid/चयनित-फेज लाइब्रेरी sequencing से उत्पन्न पढ़ता का विश्लेषण करें । वेब उपकरण निंनलिखित पते पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

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Representative Results

फ़िल्टरिंग approach आरेख 1में schematized है । हर तरह के intronless डीएनए का इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 1a में फ़िल्टरिंग दृष्टिकोण के पहले भाग का प्रतिनिधित्व किया है: एक agarose जेल या एक विश्लेषक पर लोड करने के बाद, ब्याज के डीएनए का एक अच्छा विखंडन 150-750 बीपी के वांछित आकार में एक लंबाई वितरण के साथ टुकड़े के एक धब्बा के रूप में प्रकट होता है । खंडित डीएनए प्राप्त की एक प्रतिनिधि आभासी जेल छवि दी जाती है । agarose जेल पर लोड टुकड़े तो बरामद कर रहे हैं, अंत की मरंमत और phosphorylated, और फिर एक पहले कुंद pFILTER वेक्टर में क्लोन यादृच्छिक डीएनए टुकड़े की एक पुस्तकालय बनाने के लिए । इष्टतम स्थितियों के तहत क्लोनिंग प्रक्रिया के प्रत्येक कदम प्रदर्शन अध्ययन के तहत डीएनए की कुल कवरेज के साथ अच्छी गुणवत्ता पुस्तकालय प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

चित्रा 1b में फ़िल्टरिंग दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व किया है: पुस्तकालय क्लॉरॅंफेनिकोल की उपस्थिति में उगाया जाता है (pFILTER का निर्वाह) अकेले या क्लॉरॅंफेनिकोल और एम्पीसिलीन के लिए चयन करने के लिए ओआरएफ युक्त कालोनियों । केवल एक डीएनए के लिए इसी खंडित कालोनी कर एक ओआरएफ एक कार्यात्मक β-lactamase उत्पादन और जब एंटीबायोटिक चयन मौजूद है जीवित रहते हैं । चित्रा 1C दिखाता है कैसे बढ़ती चयनात्मक दबाव अच्छा फ़ोल्डर ORFs बनाम गरीब फ़ोल्डर वालों के चयन की अनुमति देता है । अपेक्षित परिणाम के बारे में 20-गुना के पुस्तकालय आकार की कमी है । जीवित क्लोनों की उच्च संख्या अपर्याप्त चयनात्मक दबाव इंगित करता है ।

ओआरएफ टुकड़े आसानी से बाद में आवेदन के लिए फ़िल्टर्ड पुस्तकालय से बरामद किया जा सकता है; बातचीत के अध्ययन के लिए हमारी रणनीति फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है । चित्रा 2में, फेज पुस्तकालय निर्माण के प्रमुख कदम का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं: एक पर्याप्त पुस्तकालय pFILTER वेक्टर से फ़िल्टर टुकड़े काटने से तैयार किया जाता है और फिर से करने के लिए अनुक्रम कोडिंग के साथ फ्यूजन में एक phagemid प्लाज्मिड में क्लोनिंग फेज capside प्रोटीन g3p. एक बार सहायक फेज के साथ संक्रमित, बैक्टीरिया की कोशिकाओं में वेक्टर की उपस्थिति फेज उनके सतह पर इस प्रकार फ़िल्टर लायब्रेरी फेज प्रदर्शन चयन और आगे के लिए उपलब्ध बनाने के लिए ओआरएफ-g3p संलयन उत्पादों को प्रदर्शित कणों के उत्पादन की अनुमति देता है विश्लेषण.

सभी पुस्तकालयों गहराई से NGS द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं, साथ ही फेज चयन के outputs, के रूप में चित्रा 3के दूसरे भाग में दिखाया गया है । डीएनए अंशों प्लाज्मिड रीढ़ पर विशिष्ट oligonucleotides एनीलिंग के साथ पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए विशेष एडाप्टर ले जाने के द्वारा कालोनियों बढ़ से बचाया जाता है । NGS किया जाता है और पढ़ता है तब Interactome-Seq डेटा विश्लेषण वेब उपकरण के साथ विश्लेषण ।

चित्रा 4 में हम एक ओआरएफ फ़िल्टर्ड फेज प्रदर्शन पुस्तकालय के चयन की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व की सूचना दी । इस उदाहरण में चयन विभिन्न विकृतियों (यानी संक्रामक विकृतियों, स्व-प्रतिरक्षित विकृतियों, कैंसर) से प्रभावित रोगियों से सीरा में मौजूद एंटीबॉडी का उपयोग करके किया जाता है । इस मामले में फेज पुस्तकालय सीधे मरीजों के सीरा में मौजूद एंटीबॉडी के साथ इंटरैक्ट करता है और इस तरह से ख्यात विशिष्ट एंटीजन को समृद्ध किया जा सकता है क्योंकि वे रोग विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. प्रयोग के इस प्रकार में, आम तौर पर पुस्तकालय भी स्वस्थ रोगियों से नियंत्रण सीरा का उपयोग करने के क्रम में एक पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए उत्तराधिकारी तुलना और सामांय प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा चुना है ।

चयन आमतौर पर विभिंन पूल में एक साथ समूहीकृत करने के लिए, सीरा एंटीबॉडी titer की अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए रोगियों के एक ही प्रकार से सीरा का उपयोग किया जाता है । प्रत्येक पूल स्वतंत्र रूप से चयन के लगातार दो से तीन दौर के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रतिरक्षा के लिए पुस्तकालय को समृद्ध प्रतिक्रियाशील क्लोन अध्ययन के तहत विकृति के लिए विशिष्ट । परीक्षण सेट एंटीबॉडी पुस्तकालय phages के साथ तैयार कर रहे हैं, प्रतिरक्षा-परिसरों प्रोटीन द्वारा बरामद कर रहे हैं एक लेपित आकर्षणविद्या-मोतियों और बंधे phages मानक प्रक्रियाओं द्वारा eluted हैं । चयन चक्र धुलाई और बाध्यकारी stringency बढ़ाने के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं ।

NGS द्वारा उत्पंन पढ़ता Interactome-Seq वेब विशेष रूप से डेटा के इस तरह के प्रबंधन के लिए विकसित उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । Interactome-Seq डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो चार क्रमिक चरणों से बना है जो, अपुष्ट sequencing पढ़ता से प्रारंभ कर रहा है, जीनोमिक एनोटेशन (चित्र 5) के साथ ख्यात डोमेन की सूची जनरेट करता है । पहले चरण में इनपुट (चित्र 5 -लाल बॉक्स), Interactome-Seq इनपुट फ़ाइलें (अपुष्ट पढ़ता, संदर्भ जीनोम अनुक्रम, एनोटेशन सूची) ठीक से स्वरूपित हैं, तो जाँच करता है । दूसरे चरण में पहले से प्रक्रिया (चित्रा 5 -नारंगी बॉक्स), कम गुणवत्ता sequencing डेटा पहली Cutadapt28 का उपयोग कर गुणवत्ता स्कोर के आधार पर छंटनी कर रहे हैं और लंबाई में १०० से कम ठिकानों के साथ पढ़ता है छोड़ दिया जाता है । क्रमिक पठन संरेखण चरण (चित्र 5-हरा बॉक्स) में, शेष पढ़ता blastn29 से बेमेल के 5% तक की अनुमति जीनोम अनुक्रम के साथ संरेखित होते हैं । एक SAM फ़ाइल जनरेट किया गया है और केवल 30 से अधिक गुणवत्ता स्कोर के साथ पढ़ता है (Q > 30) SAMtools30 का उपयोग कर संसाधित किए जाते हैं और BAM फ़ाइल में कनवर्ट किया जाता है । संरेखण के बाद, Interactome-Seq डोमेन डिटेक्शन (चित्र 5 -नीला बॉक्स) निष्पादित करता है, Bedtools31 को फ़िल्टर करने के लिए ओवरलैपिंग पढ़ता है जो उनकी लंबाई के ८०% के अंदर टेप के लिए होता है; कवरेज, अधिकतम गहराई और ध्यान मूल्यों तो प्रत्येक ओआरएफ मानचित्रण द्वारा कवर भाग के लिए गणना कर रहे है पढ़ता है । कवरेज एक जीन को सौंपा पढ़ता की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करता है; गहराई एक विशिष्ट genic भाग को कवर पढ़ता की अधिकतम संख्या है; फोकस अधिकतम गहराई और कवरेज के बीच अनुपात से प्राप्त सूचकांक है, और यह 0 और 1 के बीच रेंज कर सकते हैं । जब फ़ोकस ०.८ से अधिक है और कवरेज BAM फ़ाइल में सभी मैपिंग क्षेत्रों के लिए स्वीकार्य औसत कवरेज से अधिक है, तो CDS भाग एक ख्यात डोमेन/epitope के रूप में वर्गीकृत किया गया है । Interactome-Seq पाइपलाइन का अंतिम चरण है आउटपुट (चित्र 5 -वायलेट बॉक्स), ख्यात डोमेन की एक सूची तालिका अलग स्वरूप में उत्पन्न होता है । Interactome-Seq पाइपलाइन एक वेब उपकरण में शामिल किया गया है किसी भी bioinformatics या प्रोग्रामिंग कौशल के बिना उपयोगकर्ताओं को सक्षम करने के लिए चित्रमय अंतरफलक के माध्यम से Interactome-Seq विश्लेषण प्रदर्शन और एक आसान और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रारूप में उनके परिणाम प्राप्त करते हैं । चित्रा 5Bमें दिखाया गया है, एक विश्लेषण के उत्पादन परिणाम दृश्य और अन्वेषण को सक्षम करने के लिए JBrowse३२ का उपयोग कर प्रदर्शित कर रहे हैं. Interactome-Seq ख्यात डोमेन के लिए इसी जीनोम ब्राउज़र में पटरियों का पता चलता है उत्पन्न करता है और विभिन्न चयन प्रयोगों में उदाहरण के लिए समृद्ध आम ख्यात डोमेन के बीच चौराहों को दिखाने के लिए भी शास्त्रीय वेन आरेख प्रदान करता है.

Figure 1
चित्रा 1: ओआरएफ के निर्माण के लिए मुख्य कदम के योजनाबद्ध सिंहावलोकन-पुस्तकालय फ़िल्टरिंग
एक) अलग स्रोत से डीएनए sonicated है और 150-750 बीपी लंबाई के यादृच्छिक टुकड़ों में खंडित । टुकड़े जेल से बरामद कर रहे है और pFILTER वेक्टर में कुंद के रूप में क्लोन; ख) एक तह रिपोर्टर के रूप में β-lactamase का उपयोग कर कदम फ़िल्टरिंग । सदिश युक्त नहीं ओआरएफ टुकड़े नकारात्मक एम्पीसिलीन पर चयनित हैं, जबकि ओआरएफ क्लोन टुकड़े कालोनियों को विकसित करने की अनुमति; ग) एक बढ़ती चयनात्मक दबाव के आवेदन (ठोस विकास मीडिया में एम्पीसिलीन एकाग्रता से 0 में > 100 μg/बेहतर तह टुकड़े के चयन की अनुमति दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फेज पुस्तकालय के निर्माण के लिए मुख्य चरणों का योजनाबद्ध सिंहावलोकन
एक) ओआरएफ-फ़िल्टर टुकड़े फ़िल्टर वेक्टर विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर से काट रहे हैं । वसूली और शुद्धि के बाद, टुकड़े phagemid वेक्टर में क्लोन और बदल रहे हैं; ख) phagemid बैक्टीरियल पुस्तकालय सहायक फेज से संक्रमित है और, रात के विकास के बाद, phages खूंटी-उपजी और एकत्र कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ओआरएफ पुस्तकालयों अनुक्रमण
अनुक्रमण दोनों मूल ओआरएफ चयनित पुस्तकालय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फेज प्रदर्शन पुस्तकालय पर किया जाता है; 1) दोनों मामलों में उगाई गई कालोनियों को बरामद और डीएनए निकाले जाते हैं; 2) डीएनए अंशों प्रवर्धन द्वारा अनुक्रमण के लिए एडेप्टर से जुड़े विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर बरामद कर रहे हैं; 3-4) टुकड़े बरामद कर रहे है और NGS का उपयोग कर गहरी अनुक्रम; 5) डेटा Interactome-Seq पाइपलाइन का उपयोग करके विश्लेषण कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पुस्तकालय चयन के योजनाबद्ध सिंहावलोकन मरीजों के एंटीबॉडी का उपयोग
फेज पुस्तकालय मरीजों के सीरा से एंटीबॉडी के खिलाफ चयन के लिए प्रयोग किया जाता है । एंटीबॉडी चुंबकीय मोतियों पर मैटीरियल कर रहे हैं, फेज पुस्तकालय पर कब्जा/चयन किया जाता है, धो के तीन चक्रों प्रदर्शन कर रहे है और बाद में चयनित phages बरामद कर रहे है और फिर से संक्रमित ई. कोलाई का इस्तेमाल किया । पुनः संक्रमित ई. कोलाई कोशिकाओं चयनात्मक दबाव में चढ़ाया जाता है (एम्पीसिलीन १०० μg/एमएल) । ओआरएफ टुकड़े प्रवर्धन और amplicon पूल द्वारा बरामद कर रहे है तो NGS द्वारा अनुक्रम हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पुस्तकालय विश्लेषण के योजनाबद्ध सिंहावलोकन
क) डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व, रॉ FASTQ फ़ाइलों से अंतिम व्याख्या डोमेन सूची में शुरू; ख) इनपुट और Interactome-Seq वेब उपकरण के outputs के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक उच्च गुणवत्ता अत्यधिक विविध ORFs फ़िल्टर पुस्तकालय के निर्माण के बाद से यह सभी पाइपलाइन के बाद के चरणों को प्रभावित करेगा पूरी प्रक्रिया में पहली महत्वपूर्ण कदम है ।

हमारे विधि का एक महत्वपूर्ण लाभप्रद विशेषता यह है कि (intronless) डीएनए (सीडीएनए, जीनोमिक डीएनए, पीसीआर व्युत्पंन या सिंथेटिक डीएनए) के किसी भी स्रोत पुस्तकालय निर्माण के लिए उपयुक्त है । पहले पैरामीटर है कि खाते में लिया जाना चाहिए यह है कि डीएनए pFILTER वेक्टर में क्लोन टुकड़े की लंबाई एक जीनोम या एक transcriptome, तथाकथित "domainome" के डोमेन के पूरे संग्रह का प्रतिनिधित्व प्रदान करना चाहिए । हमने दिखा दिया है कि प्रोटीन डोमेन सफलतापूर्वक क्लोन किया जा सकता है, चयनित और अंत में एक लंबाई १५० से ७५० बीपी३३,३४से फैले वितरण के साथ डीएनए टुकड़े से शुरू की पहचान की है, और यह क्या में बताया है के साथ लाइन में है दिखा रहा है कि सबसे अधिक प्रोटीन डोमेन १०० ए. ए. लंबाई के है साहित्य (५० से २०० एए के लिए एक सीमा के साथ)15।

डीएनए शुरू सामग्री की पसंद के आकार रेंज में खंडित किया जाना चाहिए और बाद में फ़िल्टरिंग (pFILTER)12 वेक्टर में क्लोन । इन कदमों के दौरान, संभावित पूर्वाग्रह प्रोटोकॉल में शामिल सभी क्लोनिंग कदम प्रतिक्रियाओं की दक्षता को अधिकतम करने से बचा जा सकता है, विशेष रूप से टुकड़ा अंत में मरंमत और फास्फारिलीकरण । वेक्टर तैयारी चुनौतीपूर्ण है और इष्टतम शर्तों के तहत किया जाना चाहिए के रूप में अच्छी तरह से, दोनों प्लाज्मिड क्षरण से बचने के लिए और/

एक बार पुस्तकालय बनाया गया है, यह "फ़िल्टर" होना चाहिए ताकि केवल ORFs तह टुकड़े बनाए रखने के लिए । इस कदम को मिलाना करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर चयनात्मक वांछित के stringency के अनुसार संशोधित किया जा सकता है कि लागू किए गए दबाव है । चयन एम्पीसिलीन का उपयोग किया जाता है: उच्च एकाग्रता का इस्तेमाल किया, रूपांतरित बैक्टीरिया कालोनियों जीवित करने में सक्षम की संख्या कम है । यह फ़िल्टरिंग विधि की क्षमता के लिए अच्छे बनाम गरीब-फ़ोल्डर ORFs३४का चयन करने के लिए दर्शाता है । क्लोनों की संख्या में यह कमी चयनित अंशों के तह गुणों में वृद्धि से संतुलित होती है. आमतौर पर, एम्पीसिलीन एकाग्रता के बारे में 1/20 उन है कि केवल क्लॉरॅंफेनिकोल पर पुस्तकालय बढ़ प्राप्त किया जा सकता है के संबंध में बैक्टीरियल कालोनियों की संख्या को कम करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।

पुस्तकालय सत्यापन आमतौर पर बेतरतीब ढंग से उठाया कालोनियों और उनके अनुक्रमण के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा किया जाता है । कुछ कालोनियों के पीसीआर प्रवर्धन के लिए पुस्तकालय की गुणवत्ता का एक त्वरित अनुमान है में सुझाव दिया है: आवेषण की लंबाई 150-750 बीपी की उंमीद की सीमा में होना चाहिए और विभिंन कॉलोनियों के विभिंन आकार के साथ आवेषण मौजूद होना चाहिए संकेत अच्छा परिवर्तनशीलता के कार्यकाल में पुस्तकालय की तैयारी । स्क्रीनिंग के इस पारंपरिक रणनीति है, जब पुस्तकालय सत्यापन के लिए ही विधि के रूप में लागू है, व्यापक नहीं है और समय लगता है, की अनुमति केवल कालोनियों के एक सीमित संख्या के विश्लेषण और महत्वपूर्ण क्लोनों के सबसे लापता होने का एक उच्च मौका रहा । हमारे दृष्टिकोण पुस्तकालय के गहरे अनुक्रमण पर आधारित है, यह पुस्तकालय विविधता और बहुतायत और चयनित टुकड़ों में से प्रत्येक की सटीक मानचित्रण पर पूरी जानकारी प्रदान करता है ।

फ़िल्टरिंग दृष्टिकोण के साथ NGS प्रौद्योगिकी के कार्यांवयन के परिमाण के कई आदेशों से विश्लेषण की गहराई बढ़ जाती है । हाल ही में, हम Illumina मंच का उपयोग कर ओआरएफ पुस्तकालयों अनुक्रमण के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित है, और डेटा विश्लेषण है कि किसी भी bioinformatics प्रोग्रामिंग कौशल के बिना हर उपयोगकर्ता के लिए डेटा के इन प्रकार का विश्लेषण करता है के लिए एक विशिष्ट वेब उपकरण विकसित की है ।

पुस्तकालय "प्रति एसई" एक "सार्वभौमिक साधन" है और प्रोटीन अभिव्यक्ति और/या चयन के लिए अलग संदर्भों में शोषण किया जा सकता है । हमारे methodological दृष्टिकोण एक फेज प्रदर्शन के संदर्भ में उत्पादित ORFeome के हस्तांतरण पर आधारित है । प्रोटीन टुकड़े फेज सतह पर व्यक्त कर रहे है और बाद में चयन के लिए उपयुक्त हो गया ।

यह विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइमों और फिर से उंहें एक संगत phagemid वेक्टर फेज प्रोटीन g3p के साथ उनके संलयन की अनुमति में क्लोनिंग के साथ पाचन द्वारा pFILTER पुस्तकालय से फ़िल्टर्ड ORFs बचाव द्वारा किया जाता है ।

phagemid-ओआरएफ पुस्तकालय के बाद बनाया गया है, यह अलग लक्ष्य के खिलाफ चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे एक ख्यात बाध्यकारी प्रोटीन10 या शुद्ध एंटीबॉडी३५,३६ के रूप में यहां वर्णित है । चूंकि फेज कणों उनकी सतह फ़िल्टर्ड ORFs पर प्रदर्शित करेगा, एक बहुत अधिक प्रभावी चयन गैर के अभाव के कारण प्रक्रिया में यह परिणाम-क्लोन है कि आम तौर पर इसे आगे निकल प्रदर्शित ।

फेज प्रदर्शन ओआरएफ पुस्तकालय के चयन के बाद, उत्पादन क्लोन अनुक्रम और एक ही पाइप लाइन के साथ विश्लेषण किया जा सकता है । NGS सबसे अक्सर चयनित ORFs की एक पूरी और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण रैंकिंग प्रदान कर सकते है और यह ज्यादातर इस्तेमाल चारा के साथ बातचीत प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है । प्रत्येक डोमेन के कई विभिंन संस्करणों की उपस्थिति को देखते हुए कुछ एमिनो एसिड से भिंन है, अलग अनुक्रम क्लोनों के बीच ओवरलैप भी ंयूनतम टुकड़ा की पहचान करता है/ अंत में, फेज पुस्तकालय में जीनोटाइप और phenotype जानकारी के युग्मन के लिए धंयवाद, एक बार पसंद के डोमेन की पहचान की गई है, डीएनए अनुक्रम आसानी से आगे की पढ़ाई के लिए पुस्तकालय से बचाया जा सकता है, इन विट्रो में और vivo में मांयता और लक्षण वर्णन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए शिक्षा और विश्वविद्यालय के इतालवी मंत्रालय (2010P3S8BR_002 से सीपी) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer Bandelin HD2070 or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321 or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific SM0311 or equivalent
Molecular Biology Agarose BioRad 161-3102 or equivalent
Green Gel Plus Fisher Molecular Biology FS-GEL01 or equivalent
6x DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611 or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 or equivalent
Quick Blunting Kit New England Biolabs E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368813
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S or equivalent
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 or equivalent
EcoRV New England Biolabs R0195L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289S
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2 general lab supplier
Ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
DH5aF' bacteria cells Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes general lab supplier
1,5 ml tubes general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes Biosigma 4905020
Electroporator 2510 Eppendorf
2x YT medium Sigma-Aldrich Y1003
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
DreamTaq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
150 mm plates general lab supplier
100 mm plates general lab supplier
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
BssHII New England Biolabs R0199L
NheI New England Biolabs R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 or equivalent
M13KO7 Helper Phage GE Healthcare Life Sciences 27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K1377
Polyethylene glycol (PEG) Sigma-Aldrich P5413
Sodium Cloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
PBS general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10003D or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack Thermo Fisher Scientific CS15000 or equivalent
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Nonfat dried milk powder EuroClone EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix  Kapa Biosystems, Fisher Scientific 7958935001
AMPure XP beads Agencourt, Beckman Coulter A63881
Nextera XT dual Index Primers Illumina FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500 Illumina
Spectrophotomer Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation Agilent
Forward PCR primer general lab supplier 5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer general lab supplier 5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS general lab supplier 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS general lab supplier 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

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References

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Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda,… More

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda, G., Grillo, G., Licciulli, V. F., Consiglio, A., Edomi, P., Santoro, C., Sblattero, D., Peano, C. Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e56981, doi:10.3791/56981 (2018).

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