Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Interactome-Seq: Ett protokoll för Domainome bibliotek konstruktion, validering och urval av Phage Display och nästa generations sekvensering

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/56981
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 4, 1, 4, 5,6
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

Summary

De protokoll som beskrivs kan konstruktion, karakterisering och urval (mot målet för val) av ett ”domainome” bibliotek från någon DNA-källa. Detta uppnås genom en forskning pipeline som kombinerar olika tekniker: phage display, fällbara reporter och nästa generations sekvensering med en webb-verktyg för dataanalys.

Abstract

Fällbara reportrar är proteiner med lättidentifierbara fenotyper, såsom antibiotikaresistens, vars vikning och funktion äventyras när smält på dåligt fällbara proteiner eller slumpmässiga öppen läsning ramar. Vi har utvecklat en strategi där, genom att använda TEM-1 β-laktamas (enzymet ger ampicillin-resistens) på genomisk nivå, vi kan välja samlingar av korrekt vikta protein domäner från den kodande delen av DNA i någon intronless genomet. Protein fragment erhålls genom detta tillvägagångssätt, de så kallade ”domainome”, kommer att vara väl uttryckta och vattenlösliga, vilket gör dem lämpliga för strukturella/funktionella studier.

Genom kloning och visar den ”domainome” direkt i ett phage displaysystem, har vi visat att det är möjligt att välja specifikt protein domäner med önskad bindande egenskaper (t.ex. till andra proteiner eller antikroppar), vilket ger väsentliga experimentella uppgifter för genen anteckning eller antigen identifiering.

Identifiering av de mest berikat klonerna i en valda polyklonala population kan uppnås med hjälp av romanen nästa generations sekvensering teknik (NGS). Av dessa skäl införa vi djupsekvensering analys av själva biblioteket och urval utgångarna att ge fullständig information om mångfald, överflöd och exakt kartläggning av varje av de utvalda fragmenten. De protokoll som presenteras här visar de viktigaste stegen för bibliotek konstruktion, karakterisering och validering.

Introduction

Här beskriver vi en hög genomströmning metod för konstruktion och urval av bibliotek av vikta och lösligt protein domäner från någon genic/genomisk start källa. Metoden kombinerar tre olika tekniker: phage display, användningen av fällbara reporter och nästa generations sekvensering (NGS) med en särskild webb-verktyg för dataanalys. Metoderna kan användas i många olika sammanhang av proteinbaserade forskning, för identifiering och annotering av nya proteiner och protein domäner, karakterisering av strukturella och funktionella egenskaper av kända proteiner samt definition av protein-interaction network.

Många öppna frågor finns kvar i protein-baserad forskning och utveckling av metoder för optimal proteinproduktion är ett viktigt behov för flera fält av undersökningen. Till exempel, trots tillgång till tusentals prokaryota och eukaryota genomen1saknas en motsvarande karta över den relativa proteom med en direkt annotation kodade proteiner och peptider fortfarande för den stora majoriteten av organismer. Katalogen över komplett proteom framstår som ett utmanande mål som kräver en stor insats i form av tid och resurser. Guldmyntfoten för experimentell annotation förblir kloning av alla öppna läsning ramar (ORFs) av en genomet, bygga den så kallade ”ORFeome”. Geners funktion tilldelas vanligen baserat på homologi relaterade gener med känd aktivitet men detta tillvägagångssätt stämmer dåligt på grund av många felaktiga anteckningar i referens databaser2,3,4, 5. Dessutom även för proteiner som har identifierats och kommenterad, ytterligare studier är skyldiga att uppnå karakterisering i form av överflöd, uttrycksmönster i olika sammanhang, inklusive strukturella och funktionella egenskaper som interaktion-nätverk.

Dessutom eftersom proteiner består av olika domäner, var och en av dem visar särdrag och på olika sätt bidrar till protein funktioner, studien och den exakta definitionen av dessa domäner kan tillåta en mer heltäckande bild, både på inre gen och på nivån fullständiga genomet. All denna nödvändiga information gör protein-baserade forskning en bred och utmanande fältet.

I detta perspektiv kan ett viktigt bidrag ges av opartiska och hög genomströmning metoder för produktion av proteiner. Men bygger framgången för sådana metoder, bredvid de betydande investeringar som krävs, på förmågan att producera lösliga/stable protein konstruktioner. Detta är en stor begränsande faktor eftersom det har uppskattats att endast ca 30% av proteiner kan vara framgångsrikt uttryckt och produceras vid tillräckliga nivåer för att experimentellt användbar6,7,8. En strategi för att övervinna denna begränsning bygger på användning av slumpmässigt fragmenterade DNA för att producera olika polypeptider, som tillsammans ger överlappande fragment representation av enskilda gener. Endast en liten andel av de slumpmässigt genererade DNA-fragmenten är funktionella ORFs medan den stora majoriteten av dem är icke-funktionella (på grund av förekomst av stop kodon inuti deras sekvenser) eller koda för un-naturliga (ORF i en annan bildruta än originalet) polypeptider med ingen biologisk betydelse.

För att lösa alla dessa problem, har vår grupp utvecklat en hög genomströmning protein uttryck och interaktion analysplattform som kan användas på en genomisk skala9,10,11,12. Denna plattform integrerar följande tekniker: 1) en metod att välja samlingar av korrekt vikta protein domäner från den kodande delen av DNA från någon organism; (2) den phage display tekniken för att välja partners av interaktioner; (3) NGS helt karakterisera den hela interactome under studien och identifiera klonerna av intresse. och 4) en webbverktyg för dataanalys för användare utan bioinformatik eller programmeringskunskaper att utföra Interactome-Seq analys på ett enkelt och användarvänligt sätt.

Användningen av denna plattform erbjuder viktiga fördelar över alternativa strategier av utredning. metoden är framförallt helt opartisk, hög genomströmning och modulära för studien som sträcker sig från en enda gen upp till en hela genomet. Det första steget av rörledningen är skapandet av ett bibliotek från slumpmässigt fragmenterade DNA under studien, som kännetecknas sedan djupt av NGS. Detta bibliotek genereras med en konstruerad vektor där gener/fragment av intresse klonade mellan en signal sekvens för protein sekretion i periplasmic utrymme (dvs, en s-ledare) och TEM1 β-laktamas gen. Proteinet fusion kommer att ge ampicillin-resistens och förmåga att överleva under ampicillin tryck endast om klonade fragment är i-frame med både dessa element och den resulterande fusionsprotein är korrekt vikta10,13 ,14. Alla kloner räddade efter antibiotika urval, den så kallade ”filtreras kloner”, ORFs och en stor majoritet av dem (mer än 80%), härrör från riktiga gener9. Dessutom ligger kraften i denna strategi i resultaten att alla ORF filtreras kloner kodning för korrekt vikta/lösliga proteiner/domäner15. Som många kloner, närvarande i biblioteket och kartläggning i samma region/domän, har olika start- och slutpunkter, tillåter detta opartisk, singel-steg identifiering av minsta fragment som sannolikt kommer att resultera i vattenlösliga produkter.

En ytterligare förbättring i tekniken ges genom användning av NGS att karakterisera biblioteket. Kombinationen av denna plattform och en särskild webb-verktyg för dataanalys ger viktig opartisk information om de exakta nukleotidsekvenser och på platsen för valda ORFs om hänvisningen DNA under studien utan behov av ytterligare omfattande analyser eller experimentella försök.

Domainome bibliotek kan överföras in i ett urval sammanhang och används som ett universellt instrument för att utföra funktionella studier. Hög genomströmning protein uttryck och interaktion analys plattformen att vi integrerat och som vi kallade Interactome-Seq tar fördel av phage displayteknik genom att överföra den filtrerade ORF i en phagemid vektor och skapa en phage-ORF bibliotek. En gång åter klonade in ett phage display sammanhang, protein domäner visas på ytan av M13 partiklar; på detta sätt kan domainome bibliotek direkt väljas för genen fragment kodning domäner med specifika enzymatiska aktiviteter eller bindande egenskaper, så att interactome networks profilering. Denna strategi beskrevs ursprungligen av Zacchi o.a. 16 och senare användas i flera andra sammanhang13,17,18.

En stor fördel jämfört med andra tekniker som används för att studera protein-protein interaktioner (inklusive jäst två hybridsystem och masspektrometri19,20), och är förstärkning av den bindande partner som uppstår under phage Visa flera rundor av urval. Detta ökar urval känsligheten således möjliggör identifiering av låg rikligt bindningsproteiner domäner finns i biblioteket. Markeringen utförs med ORF-filtrerad bibliotek effektivitet ökar ytterligare på grund av avsaknad av icke-funktionella kloner. Slutligen, tekniken gör markeringen till utföras mot både protein och icke-protein beten21,22,23,24,25.

Phage val med hjälp av domainome-phage biblioteket kan utföras med hjälp av antikroppar kommer från sera hos patienter med olika sjukdomstillstånd, t ex autoimmuna sjukdomar13, cancer eller infektion sjukdomar som bete. Denna metod används för att få den så kallade ”antikropp signaturen” sjukdomen enligt studien gör det möjligt att massivt identifiera och karaktärisera den antigener/epitoper uttryckligen erkänts av patienternas antikroppar på samma gång. Jämfört med andra metoder för användning av phage display möjliggör identifiering av både linjära och konfirmerande antigena epitoper. Identifiering av en specifik signatur kan potentiellt ha stor betydelse för förståelse patogenes, nya vaccin design, identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av nya och specifika diagnostiska och prognostiska verktyg. Dessutom när studien är inriktad på smittsamma sjukdomar, är en stor fördel att upptäckten av immunogent proteiner är oberoende från patogen odling.

Vår metod bekräftar att fällbara reportrar kan användas på genomisk nivå välja den ”domainome”: en samling av korrekt vikta, väl uttryckt, lösligt protein domäner från den kodande delen av DNA och/eller cDNA från någon organism. En gång isolerade protein fragment är användbara för många ändamål, att tillhandahålla väsentliga experimentella information för gen-kommentar samt när det gäller strukturella studier, antikropp epitop kartläggning, antigen identifiering, etc. Fullständighet i hög genomströmning som tillhandahålls av NGS möjliggör analys av komplexa prover, såsom phage display bibliotek, och har potential att kringgå traditionella mödosamma plockning och provning av individuella phage räddade kloner.

På samma gång tack vare funktionerna av filtrerade biblioteket och till extrema känslighet och kraften i NGS analysen är det möjligt att identifiera domänen protein ansvarig för varje interaktion direkt i en startskärm, utan att behöva skapa ytterligare bibliotek för varje bunden protein. NGS tillåter för att erhålla en heltäckande definition av den hela domainome av någon genic/genomisk start källa och dataanalysverktyget web obtainmenten av en mycket specifik karakterisering både från en kvalitativ och kvantitativ synvinkel av den interactome proteiner domäner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion av ORF biblioteket (figur 1)

  1. Beredning av Infoga DNA
    1. Fragment förberedelse från syntetiska eller genomisk DNA
      1. Utdrag/rena DNA med hjälp av standardmetoder26.
      2. DNA-fragment av ultraljudsbehandling. Om använder en standard någon sonikator, allmänna förslag till att börja med 30 s pulser på 100% effekt.
        Obs: Pilot experiment bör göras med olika kraft och ultraljudsbehandling gånger ställa de optimala förutsättningarna för DNA beredning. Efter varje test bestämma storleken på DNA fragmenten genom agarosgelelektrofores gelelektrofores.
      3. Ladda den sonicated DNA på 1,5% agarosgel, tillsammans med en 100 bp DNA stege. Utföra en kort elektrofores kör på 5 V/cm för 15 min och skär del av gel som innehåller utstryket av fragmenterade DNA.
      4. Rena infoga DNA med en kolumn-baserade gel extraction kit och mäta koncentrationen med en UV-spektrofotometer.
        Obs: minst 500 ng av renat skär bör erhållas efter detta steg, att vara sammanskrivna med 1 µg av smält vektor, som beskrivs i steg 1.3. Kontrollera kvaliteten på fragment förberedelser genom att utvärdera en260nm/A280nm och en260nm/A230nm nyckeltal eftersom låg kvalitet av provet kommer att påverka ligering effektivitet.
      5. Behandla upp till 5 μg av mellanläggen med 1 μL av snabb avtrubbning Kit enzym mixen, enligt tillverkarens instruktioner. Inaktivera enzymer av värme vid 70 ° C för 10 min. prover kan förvaras vid-20 ° C fram till användning.
    2. Fragment förberedelse från cDNA
      1. Extrahera RNA med standardmetoder (t.ex. använda TRizol eller liknande reagenser).
      2. Fragmentet mRNA genom uppvärmning innan du utför omvänd Transkription. Den slutliga DNA fragment längden styrs av mRNA kokande tid och slumpmässiga primer koncentration. Till exempel värme prov för 6 min vid 95 ° C.
      3. Förbereda cDNA med slumpmässiga grundfärger med alla tillgängliga kit följande tillverkarens protokoll.
      4. Tär cDNA av poly-dT svansar av hybridisering med biotinylerade poly-dA för 3 h vid 37 ° C, och skilja på streptividin magnetiska pärlor som beskrivs av Carninci et al. 13
      5. Återställa obundet material och rena med ett kolumnbaserade DNA rening kit följa tillverkarens instruktioner. Mätning av koncentrationen med en UV-spektrofotometer. Se not i steg 1.1.1.4.
  2. Beredning av filtrering vektorn
    1. Digest 5 µg renat kloning vektor pFILTER312 med 10 U av EcoRV restriktionsenzym, följande tillverkarens protokollet.
    2. Ladda 2 µL (200 ng) smält vektorns tillsammans med 100 ng av osmält vektorn och 1 k bp molekylär markör, på en 1% agarosgel, att kontrollera för god uppslutning. Värme inaktivera restriktionsenzym.
    3. Tillsätt 1/10 volym 10 x fosfatas buffert och 1 µL (5 U) fosfatas och inkubera vid 37 ° C för 15 min. värme inaktivera för 5 min vid 65 ° C.
    4. Rena smält plasmid genom extraktion från agarosgel och mäta koncentrationen med en UV-spektrofotometer. Prover kan förvaras vid-20 ° C fram till användning.
  3. Ligatur och omvandling
    1. Utföra ligatur enligt följande: för 1 µg av smält plasmiden lägger 400 ng fosforyleras skär (plasmid: Infoga molar förhållandet 1:5), 10 x 10 µL buffert för T4 DNA-Ligase, 2 µL av hög koncentration T4 DNA-ligase i en slutlig volym av 100 µL. Inkubera reaktionen vid 16 ° C overni GHT. Värme inaktivera vid 65 ° C i 10 min.
    2. Fällningen ligering produkten genom att lägga till 1/10 volym natriumacetatlösning (3 M, pH 5.2) och 2,5 volymer av 100% etanol. Blanda och frysa vid-80 ° C i 20 min.
    3. Centrifugera vid högsta hastighet under 20 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    4. Tillsätt 500 µL kallt 70% etanol till pellet och centrifugera vid maxhastighet under 20 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    5. Luften torr pelleten. Återsuspendera utfällda DNA till 10 µL av vatten.
    6. Utföra bakteriecell elektroporation.
      Obs: Användning av högeffektiva celler (över 5 x 109 transformants per µg av DNA) krävs. Vi föreslår att du använder Escherichia coli DH5αF' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) tillverkas i hus eller köpt från flera tillverkare.
      1. Placera lämpligt antal mikrocentrifugrör och 0.1 cm-elektroporation kyvetter på is. Tillsätt 1 µL av renat ligering lösning (i DI-vatten) till 25 µL av cellerna och svep röret några gånger.
      2. Överföra DNA-cell blandningen till den kalla kyvetten, tryck på bänkskivan 2 x, torka vatten från utsidan av kyvetten, placera i elektroporation modul och tryck på pulsen.
      3. Utföra elektroporation med en standard electroporator maskin med 25 µF, 200 Ω och 1,8 kV. Tidskonstant måste vara 4-5 ms.
    7. Omedelbart tillsätt 1 mL flytande 2xYT medium utan någon antibiotika, överföra till en 10 mL röret och tillåta för att växa vid 37 ° C, skaka på 220 rpm för 1 h.
    8. Tallrik förvandlas DH5αF' på 15 cm 2xYT agarplattor kompletteras med 34 µg/mL kloramfenikol (pFILTER motstånd) och 25 µg/mL ampicillin (selektiv markör för ORFs) och inkubera över natten vid 30 ° C.
    9. Tallrik utspädningar av biblioteket på 10 cm 2xYT agarplattor kompletteras med kloramfenikol + ampicillin och kloramfenikol endast, att utföra bibliotek titrering. Inkubera över natten vid 30 ° C.
  4. pFILTER-ORF bibliotek validering
    1. Testa 15-20 kolonier från både kloramfenikol och kloramfenikol/ampicillin plattor att uppskatta infoga storleksfördelning. Plocka enstaka kolonier med spets och späd dem separat i 100 µL av 2xYT medium utan antibiotika. Använd 0,5 µL av denna lösning som DNA-mall för en PCR-reaktion, med alla standard TaqDNA polymeras efter tillverkarens protokollet.
    2. Utföra 25 cykler av förstärkning med en T glödgning av 55 ° C och en förlängning av 40 s vid 72 ° C. Primer sekvenser finns i Tabell för material.
    3. Ladda PCR-produkter på 1,5% agarosgel, tillsammans med en 100 bp DNA stege och köra.
  5. pFILTER-ORF bibliotek
    1. Samla in bakterierna från 150 mm plattorna genom att tillföra 3 mL färsk 2xYT medium och skörda dem med en steril skrapa, blanda, komplettera dem med 20% steril glycerol och förvaras vid-80 ° C i små portioner.
    2. Rena plasmid DNA från en alikvot av biblioteket (före tillsats av glycerol) använda ett kolumnbaserade plasmid utvinning kit, följa tillverkarens instruktioner.
    3. Mätning av koncentrationen med UV spektrofotometer. Prover kan förvaras vid-20 ° C tills användas för phagemid bibliotek beredning och/eller karakterisering av NGS.

2. subkloning av filtrerade ORFs i en Phagemid Vector (figur 2)

  1. Beredning av ORF filtreras DNA-fragment
    1. Ställa in restriktionsenzym rötning av 5 µg av renat vektor från pFILTER-ORF bibliotek vektorn lägga till 10 U av BssHII och ruvning enligt tillverkarens protokoll. Inaktivera det enzym- och sammanfattad med 10 U i NheI.
    2. Ladda smält DNA på 1,5% agarosgel, tillsammans med en 100 bp DNA stege. Utföra en kort elektrofores kör på 5 V/cm för 15 min eller precis tillräckligt för att skilja utstryket av exciderad fragment och skär del av gel som innehåller dessa.
    3. Rena infoga DNA med en kolumn-base gel extraction kit och mäta koncentrationen med en UV-spektrofotometer.
  2. Beredning av phagemid DNA
    1. Ställa in restriktionsenzym rötning av 5 µg av renat pDAN527 när det gäller skären.
    2. Rena smält plasmid genom rinnande smält DNA på en 0,75% agarosgel och extrahera från gel med en kolumnbaserade kit.
    3. Mätning av koncentrationen med en UV-spektrofotometer. Prover kan förvaras vid-20 ° C fram till användning.
  3. Bibliotek ligatur, omvandling och samling
    1. Utföra ligatur och transformation som beskrivs för pFILTER vektor.
    2. Tallrik förvandlas DH5αF' på 150 mm 2xYT agarplattor kompletteras med 100 µg/mL ampicillin och inkubera över natten vid 30 ° C.
    3. Tallrik utspädningar av biblioteket på 100 mm 2xYT agarplattor kompletteras med 100 µg/mL ampicillin att bestämma storleken på biblioteket.
    4. Utför bibliotek validering av PCR av slumpmässigt plockade kloner som beskrivs i steg 1.4.
    5. Samla phagemid-ORF biblioteket genom att skörda bakterier från 150 mm plattor, blanda, komplettera dem med 20% steril glycerol och förvaras vid-80 ° C i små portioner.
    6. Rena plasmid DNA från en alikvot av biblioteket använder ett kolumnbaserade plasmid utvinning kit, följa tillverkarens instruktioner.
    7. Mätning av koncentrationen på den UV-spektrofotometern. Prover kan förvaras vid-20 ° C tills användas för karakterisering av NGS.

3. phage bibliotek förberedelse och urvalsförfarande

  1. Phage produktion
    1. Späd en lager alikvot av phagemid biblioteket i 10 mL 2xYT flytande buljong kompletteras med 100 µg/mL ampicillin för att ha en OD600nm = 0,05.
    2. Växer det utspädda biblioteket i en steril kolv 5 - 10 gånger större än den ursprungliga volymen, vid 37 ° C med skakningar vid 220 rpm tills når OD600nm = 0,5.
    3. Infektera bakterier med helper phage (t.ex. M13K07) på en multiplicity av infektion 20:1. Lämna vid 37 ° C i 45 min med enstaka agitation (varje 10 min).
    4. Centrifugera bakterier vid 4000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten, återsuspendering bakterier pelleten i 40 mL 2xYT flytande buljong kompletteras med 100 µg/mL ampicillin och 50 µg/mL kanamycin och växa vid 28 ° C med skakningar vid 220 rpm för övernattning.
    5. Dagen efter, centrifug bakterier vid 4000 x g i 20 min vid 4 ° C. Samla in supernatanten innehållande Fager.
  2. PEG-utfällning av Fager.
    1. Tillsätt 1/5-volym på en 0,22 µm filtreras PEG/NaCl-lösning (20% w/v PEG 6000, 2,5 M NaCl) till de rensade fagocyt och inkubera på is för 30-60 min.
      Obs: Lösning blev rökig efter några minuter, som anger en lyckad phage nederbörd. Grumlighet av lösningen kommer att öka under inkubationstiden.
    2. Centrifugera vid 4000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. En vit liten pellet av fagocyt bildar.
    3. Återsuspendera det i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Transfer till 1,5 mL rör och centrifugera vid 4 ° C i 10 min på högsta hastighet till avlägsna främmande bakterier. En brun pellet bildar.
    4. Överför supernatanten innehållande fagocyt till en ny tub. Hålla Fager på is för efterföljande titrering och phage urval.
  3. Phage titrering
    1. Bered seriella utspädningar av phage lösningen. Lägg 10 µL phage lösningen i 990 µL av PBS att erhålla 10-2 utspädning. Späd igen detta preparat att göra 10-4 och få en 10-6 utspädning från detta.
    2. Växa DH5αF' bakterieceller i 2xYT flytande medium vid 37 ° C under skakning tills OD600nm = 0,5 uppnås. Överför 1 mL av de förberedda bakterierna i 1,5 mL rör och omedelbart infektera med 1 µL 10-4 phage utspädning. Inkubera utan skakningar vid 37 ° C i 45 min. Upprepa samma procedur för 10-6 utspädning.
    3. Plattan utspädningar av infekterade bakterier i 100 mm 2xYT plattan. Placera plattan vid 30 ° C över natten.
    4. Plåt 100 µL av oinfekterade DH5αF' på en 2xYT agarplatta kompletteras med 100 µg/mL ampicillin att kontrollera frånvaron av kontamination i preparatet.
    5. Dagen efter räkna antalet kolonier och beräkna phage titern. Express titer som antal Fager/mL. Förväntade titer är 1012-13 Fager/mL.
  4. Phage urval
    1. Phage urval använder som bete renat antikroppar
      1. Mätta fagocyt genom att späda 200 µL phage beredning till en lika stor volym av PBS - 4% skummjölk och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i långsam rotation. Detta steg kan blockering av fagocyt för ospecifik bindning. Överföra 30 µL av protein-G bestruket magnetiska pärlor till en 1,5 mL tub.
      2. Tvätta två gånger enligt följande: Tillsätt 500 µL av PBS, inkubera i ett hjul i långsam rotation i 2 min i rumstemperatur, rita pärlorna på ena sidan av röret med hjälp av en magnet och avlägsna supernatanten.
      3. Inkubera mättade fagocyt med tvättade pärlor i 30 min i rumstemperatur med långsam rotation.
      4. Fästa pärlorna på ena sidan med hjälp av ett magnetfält. Samla in supernatanten innehållande Fager att användas för urval steg.
      5. Förbereda magnetiska pärlor medan du utför föregående steg, av konjugera renat antikropparna. Tvätta 30 µL av protein-G bestruket magnetiska pärlor som beskrivs ovan. Späd 10 µg av renat antikroppar i 500 µL av PBS, Lägg till de tvättade pärlorna och inkubera i långsam rotation i rumstemperatur i 45 min. Tvätta två gånger med PBS.
        Obs: Utföra två olika preparat av magnetiska pärlor: en med antikroppar av intresse och en med kontroll antikroppar, t ex antikroppar renats från friska donatorer. Sekvensen av antigener markerade med kontroll antikroppar dras under analys steg av utgångarna. Magnetiska pärlor laddas med kontroll antikroppar kan alternativt användas för att utföra ett före röjningen steg av de Fager (följa protokollet för inkubering med un-konjugerade pärlor).
      6. Phage urval: Rita pärlor på ena sidan av röret med hjälp av en magnet, ta bort den sista tvättningen, lägga till Fager och inkubera med långsam rotation vid rumstemperatur för 90 min. Tvätta 5 gånger med 500 µL av PBS-0.1% Tween-20 och 5 gånger med PBS.
      7. Eluera bundna fagocyt, som representerar resultatet av valet, genom att blanda pärlor med 1 mL av DH5αF' celler odlas på OD600 = 0,5. Inkubera bakterier med pärlor för 45 min vid 37 ° C med enstaka skakar (varje 10 min). Tallrik utgången på en 150 mm 2xYT agarplatta kompletteras med 100 µg/mL ampicillin.
      8. Tallrik 100 µL av outspädd och olika spädningar av produktionen (10-1 till 10-5) för att utföra titrering. Dagen efter samla bakterier från 150 mm plattorna genom att tillföra 3 mL färsk 2xYT medium och skörda dem med en steril skrapa, blanda, komplettera dem med 20% steril glycerol och förvaras vid-80 ° C i små portioner.
      9. Växer en alikvot igen för att utföra en andra runda av urval. Upprepa alla panorering proceduren som beskrivs ovan med undantag av villkor som tvätt. I detta fall tvätta 10 gånger med PBS - 1% Tween-20 (Häll lösningen i röret och utgjuta igen omedelbart). Tillsätt 500 µL av PBS och inkubera i rotation vid rumstemperatur för 10 min. utföra andra 10 tvättar med PBS. Fortsätt med eluering steg när det gäller den första omgången av urval.
      10. Extrahera plasmid DNA från en alikvot av ut med ett kolumnbaserade kit, följa tillverkarnas instruktioner. Lagra plasmid vid-20 ° C tills det ska användas för djupsekvensering.
    2. Phage urval använder som bete rekombinanta proteiner
      1. Mätta fagocyt genom att späda 200 µL phage beredning till en lika stor volym av PBS - 4% skummjölk och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i långsam rotation.
      2. Tillsätt 100 µL av streptividin magnetiska pärlor. Inkubera i 1 h i rumstemperatur att välja streptividin-bindande Fager. Ta bort de streptividin-bundna fagocyt genom att rita pärlor åt sidan med hjälp av en magnet. Ta supernatant från föregående steg och lägga till biotinylerade protein (i en koncentration på 100-550 nM) och inkubera i en rotor i rumstemperatur i 30 min till 1 h.
      3. Förbereda magnetiska pärlor: medan du utför föregående steg, tvätta 100 µL av streptividin-magnetiska pärlor med PBS, Återsuspendera i PBS 2% skummjölk och inkubera med rotation i rumstemperatur i 30 min till 1 h.
      4. Phage urval: Rita pärlor på ena sidan av röret med hjälp av en magnet, ta bort PBS - 2%-mjölk och resuspendera pärlor med phage-protein mix. Inkubera med långsam rotation i rumstemperatur i 90 min.
      5. Fästa pärlor på ena sidan av röret med hjälp av en magnet, avlägsna supernatanten och tvätta dem noggrant fem gånger med 500 µL av PBS 0,1% Tween-20. Utför eluering som beskrivs i föregående session.

4. phage bibliotek djupsekvensering plattform (figur 3)

  1. DNA infogar återhämtning från pFILTER-ORF-library, pDAN5-ORF-bibliotek eller valt-phage-bibliotek
    1. Tina en alikvot av biblioteket, kvantifiera det med hjälp av en spektrofotometer, återställa DNA skär genom förstärkning med specifika primers.
      Obs: Primers används för att rädda skären är kopplade sin 5' slutet till adaptrar sekvenser, vilket möjliggör successiva indexeringen av amplikon poolerna erhållits och direkt sekvensering av DNA skären återvinns med hjälp av sequencersna. Deras ordningsföljd är i Tabellen för material. Adaptrar anges i fetstil, och specifika primers anges i kursiv stil.
    2. Använda 2,5 µL (pFILTER/phagemid/valt-phage) biblioteket som DNA mall för en PCR-reaktion.
    3. Använda följande program: 95 ° C i 3 min. 25 cykler av 95 ° C under 30 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C under 30 s; 72 ° C under 5 min. Håll vid 4 ° C.
      Obs: på denna punkt är det rekommenderat att köra 1 µL av PCR-produkten på en Bioanalyzer eller TapeStation för att kontrollera storleken på amplikoner och kontrollera att de är i rätt intervall.
  2. PCR-sanering
    1. Placera de magnetiska pärlorna (t.ex. AMPure) i rumstemperatur. Överföra hela PCR-produkten från PCR-röret till en 1,5 mL tub. Vortex magnetiska pärlor för 30 s för att kontrollera att pärlorna är jämnt spridda. Tillsätt 20 µL av magnetiska pärlor i varje rör innehållande PCR-produkten, mix av försiktigt pipettering. Odla i rumstemperatur utan att skaka i 5 min.
    2. Placera plattan på en magnetisk stå 2 min eller tills supernatanten har rensat. Med PCR-produkter på det magnetiska stativet, avlägsna och Kassera supernatanten.
    3. Tvätta pärlorna med nylagade 80% etanol, med PCR-produkter i magnetiska montern, enligt följande: Tillsätt 200 µL nylagade 80% etanol i varje prov väl; Inkubera plattan på magnetiska står för 3 s; försiktigt bort och Kassera supernatanten.
    4. Utföra en andra etanol tvätt, med PCR-produkter på det magnetiska stativet; i slutet av andra tvätta försiktigt bort alla etanol och låt pärlor för att lufttorka i 10 min.
    5. Ta bort de PCR produkterna från magnetiska stativet, tillsätt 17,5 µL 10 mM Tris pH 8.5 i varje rör, försiktigt Pipettera upp och ner 10 gånger, se till att pärlor är fullt resuspended. Odla i rumstemperatur i 2 min.
    6. Placera röret i magnetiska montern för 2 min eller tills supernatanten har rensat, noggrant överföra 15 µL av supernatanten innehållande renat PCR-produkter till en ny 1,5 mL tub. Lagra de renade PCR-produkterna vid-15 ° C till-25 ° C i upp till en vecka om du inte Fullfölj omedelbart till Index PCR.
  3. Index PCR
    Obs: När PCR städa upp, utföra Index PCR. Använd Nextera XT Index kit; Således kommer det vara möjligt att sekvensera de resulterande dubbla indexerade bibliotek inom multiplexade Illumina körningar.
    1. Överföra alla de 15 μL som innehåller varje produkt renas i en ny PCR-röret och ställa in den följande reaktion som innehåller: 15 µL av renat amplikon produkt, 5 µL Index Primer 1 och 5 µL Index Primer 2, 25 µL av 2 x PCR mix; slutvolymen av 50 µL.
    2. Utföra PCR på en termocykel med följande program: 95 ° C i 3 min, 8 cykler av 95 ° C under 30 s, 55 ° C för 30 s, 72 ° C under 30 s; 72° C i 5 min, håll sedan vid 4 ° C.
  4. PCR-ren-upp 2
    1. Följa samma protokoll som beskrivs i avsnitt 4.2 för PCR städa upp med följande ändringar: i ett första steg lägga till 56 µL av magnetiska pärlor i varje 50 µL av PCR-produkten.
    2. Återsuspendera pärlorna i 27,5 µL 10 mM Tris pH 8.5 i det sista steget av rening och överföra 25 µL till en ny tub (detta är renat slutliga biblioteket redo för kvantifiering och då sekvensering).
    3. Förvara plattan vid-15 ° C till-25 ° C i upp till en vecka om du inte går till biblioteket kvantifiering.
  5. Kvalitativ och kvantitativ utvärdering av sekvensering biblioteket
    1. Efter rening, kör 1 µL av en 1:10 utspädning av slutliga biblioteket på en bioanalyzer att kontrollera storlek och kvantifiera det välja regionen av den slutliga bibliotek tracen.
    2. Parallellt utföra bibliotek kvantifiering av Real Time PCR med hjälp av ett bibliotek kvantifiering kit per tillverkarens protokollet.
  6. Bibliotek sekvensering
    1. Pool, dubbla indexerade bibliotek tillsammans med andra dubbla indexerade sekvensering bibliotek. Sekvens som denna typ av bibliotek genom att generera läser länge, minst 250 bp Parade slutet genom att använda både Hiseq2500 eller MiSeq instrument för att få i de första fallet 250bp PE läsningar och i andra fall 300 bp PE läser.

5. bioinformatisk analys med hjälp av Interactome-Seq Web

  1. Analysera den läser härstammar från pFILTER/phagemid/valt-phage bibliotek sekvensering med rörledningen Interactome-seq data analys. Webbverktyget är fritt tillgänglig på följande adress: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden med filtrering är schematized i figur 1. Varje typ av intronless DNA kan användas. Den första delen av metoden filtrering representeras i figur 1A : efter lastning på en agarosgel eller en bioanalyzer, en bra fragmentering av DNA av intresse visas som ett utstryk av fragment med en längd fördelning i önskad storlek av 150-750 bp. En representativ virtuella gel bild av fragmenterade DNA erhålls ges. Fragment som lastas på agarosgel är sedan inkasseras, slutet-repareras och fosforyleras och sedan klonade in ett tidigare trubbiga pFILTER vector att skapa ett bibliotek av slumpmässiga DNA-fragment. Genomför varje steg av förfarandet kloning under optimala förhållanden krävs för att få bra kvalitet bibliotek med en total täckning av DNA under studien.

Metoden med filtrering representeras i figur 1B : biblioteket odlas i närvaro av kloramfenikol (pFILTER motstånd) ensam eller kloramfenikol och ampicillin välja för ORF-innehållande kolonier. Enda kolonier med en DNA-fragment som motsvarar en ORF producera en funktionella β-laktamas och överleva när antibiotika urval är närvarande. Figur 1 c visar hur ökar selektionstryck kan urval av bra mapp ORFs kontra dålig mapp och kära. Det förväntade resultatet är en minskning med bibliotek storlek ca 20-fold. Högre antal överlevande kloner indikerar otillräcklig selektionstryck.

ORF fragment kan återställas enkelt från den filtrerade biblioteken för efterföljande ansökan; för interaktionsstudier utnyttjar vår strategi phage displayteknik. I figur 2, de viktigaste stegen i phage bibliotek konstruktion är representerade: en adekvat bibliotek förbereds genom att skära ut filtrerade fragment från pFILTER vektorn och åter kloning in i en phagemid plasmid i fusion med den sekvens som kodar för den phage capside protein g3p. När smittade med helper phage, kan närvaron av vektorn i bakterieceller produktionen av phage partiklar visar ORF-g3p fusion produkter på deras yta vilket gör det filtrerade biblioteket phage display väljas och ytterligare analys.

Alla bibliotek analyseras djupt av NGS, liksom resultaten av de phage val, som visas i den andra delen av figur 3. DNA-fragment räddas från att växa kolonier av PCR-amplifiering med specifika oligonukleotider glödgning på plasmid ryggrad och bära särskilda adaptrar för sekvensering. NGS utförs och läser sedan analyseras med Interactome-Seq web dataanalysverktyget.

I figur 4 rapporterade vi en schematisk representation av urvalsförfarandet av ett ORF filtrerade phage display bibliotek. Urvalet i detta exempel utförs med hjälp av antikroppar som är närvarande i sera från patienter som drabbas av olika sjukdomar (dvs infektiös patologier, autoimmuna sjukdomar, cancer). I detta fall interagerar phage biblioteket direkt med antikropparna som är närvarande i patienternas sera och därigenom förmodade specifika antigener kan berikas eftersom de identifieras av specifika antikroppar mot. I denna typ av experiment markeras vanligtvis biblioteket också med kontrollsera från friska patienter för att ha en bakgrund signal användas för successiva förfaranden för jämförelse och normalisering.

Val utförs med sera från samma typ av patienter vanligtvis grupperade tillsammans i olika pooler för att minska interindividuell variabilitet av sera antikropp titer. Varje pool används självständigt för två till tre på varandra följande rundorna av urval, för att berika biblioteket för immun-reaktivt kloner specifika för patologin studeras. Test set antikroppar inkuberas med bibliotek fagocyt, immun-komplex återvinns av protein A belagda magnetics-pärlor och bundna fagocyt elueras av standardprocedurer. De urval cyklerna utförs med ökande tvätt och bindande stringens.

Den läser som genereras av NGS kan analyseras med hjälp av verktyget Interactome-Seq web speciellt utvecklade för att hantera denna typ av data. Interactome-Seq data analys arbetsflöde består av fyra sekventiella steg som, start från raw sekvensering läsningar, genererar en lista av förmodad domäner med genomiska anteckningar (figur 5A). I det första steget indata (figur 5A - röd ruta) kontrollerar Interactome-Seq om indatafilerna (raw-läsningar, referens genomsekvens, annotering lista) är korrekt formaterade. I det andra steget förbehandling (figur 5A - orange box), låg kvalitet sekvensering data trimmas först använda Cutadapt28 beroende på kvalitetsresultat och läser med mindre än 100 baser i längd ignoreras. I en efterföljande Läs justering steg (figur 5A - gröna rutan), är den återstående läser i linje med blastn29 till den genomsekvens som tillåter upp till 5% oförenligheter. En SAM fil genereras och läser endast med kvalitet Poäng större än 30 (Q > 30) bearbetas med SAMtools30 och omvandlas till en BAM-fil. Efter justering, Interactome-Seq utför domäner detektion (figur 5A - blå rutan), åberopar Bedtools31 att filtrera läser överlappande minst 80% av sin längd inuti avskrifter; täckning, max djup och fokus värden beräknas sedan för varje ORF del omfattas av mappning läsningar. Täckningen representerar det totala antalet läsningar som tilldelats en gen; djupet är det maximala antalet läsningar som täcker en viss genic del; fokus är ett index som erhållits från förhållandet mellan max djup och täckning, och det kan variera mellan 0 och 1. När fokus är högre än 0,8 och täckningen är högre än den genomsnittliga täckningen observerades för alla mappning regioner i filen BAM, är CD-skivor portion klassad som en förmodad domän/epitop. Det sista steget i Interactome-Seq rörledningen är utdata (figur 5A - Violetta rutan), en lista med förmodad domäner genereras i separerade tabellformat. Interactome-Seq rörledningen har inkluderats i ett webb-verktyg för att aktivera användare utan bioinformatik eller programmeringskunskaper att utföra Interactome-Seq analys genom det grafiska gränssnittet och för att få sina resultat i ett lätt och användarvänligt format. Som visas i figur 5B, visas utdata resultaten av en analys med JBrowse32 att visualisering och utforskning. Interactome-Seq genererar spår i genomet webbläsaren motsvarar förmodad domäner upptäcks och ger också klassiskt Venn-diagram för att Visa korsningar mellan gemensamma förmodad domäner berikad till exempel i olika urval experiment.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över de viktigaste stegen för byggandet av ORF-filtrering biblioteket
(A) DNA från annan källa är sonicated och fragmenterad i slumpmässiga fragment av 150-750 bp längd. Fragmenten är återhämtat sig från gel och klonade som trubbigt in pFILTER vektorn; (B) filtrering steg med hjälp av β-laktamas som fällbara reporter. Vektor som innehåller inte ORF fragment väljs negativt på ampicillin samtidigt ORF klonade fragment tillåta kolonier växa; (C) tillämpningen av en ökande selektionstryck (ampicillin koncentration i solid tillväxt medier från 0 till > 100 μg/mL) tillåter val av bättre vikta fragment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt över de viktigaste stegen för byggandet av phage biblioteket
(A) ORF-filtrerad fragment skärs ut från den filtrerade vector med specifika restriktionsenzym. Efter återvinning och rening, är fragment klonade in phagemid vektor och förvandlat; (B) phagemid bakteriell bibliotek är infekterad med helper phage och efter övernattning tillväxt, Fager är PEG-fällt och insamlade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: ORF bibliotek sekvensering
Sekvensering utförs på både det ursprungliga ORF valda biblioteket samt phage display biblioteket. (1) på båda fallen kolonier vuxit återvinns och DNA extraheras; (2) DNA fragment återvinns genom förstärkning med specifika primers kopplade till adaptrar för sekvensering; 3-4) fragment är återvunna och djupa sekvenserade använder NGS; (5) data analyseras med hjälp av Interactome-Seq rörledningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Schematisk översikt över bibliotek markeringen med patienters antikroppar
Phage biblioteket används för urval mot antikroppar från patienternas sera. Antikroppar är orörlig på magnetiska pärlor, phage bibliotek capture/markeringen utförs, tre cykler tvättar utförs och efteråt valda Fager är återvinns och används för att åter infektera E. coli. Nytt smittas E. coli celler är klädd i selektionstryck (ampicillin 100 μg/mL). ORF fragment återvinns genom förstärkning och amplikon pooler är sedan sekvenserade av NGS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Schematisk översikt över bibliotek analys
(A) representation av data analys arbetsflödet, start från FASTQ råfiler till listorna slutliga kommenterad domäner; (B) Schematisk bild av ingångarna och utgångarna av Interactome-Seq webbverktyget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skapandet av en hög kvalitet mycket skiftande ORFs filtrerade bibliotek är ett första viktigt steg i hela förfarandet eftersom det kommer att påverka alla efterföljande steg i rörledningen.

Ett viktigt fördelaktiga inslag i vår metod är att någon källa (intronless) DNA (cDNA, genomiskt DNA, PCR härrör eller syntetiskt DNA) är lämplig för bibliotek konstruktion. Den första parameter som bör beaktas är att längden på de DNA-fragment som klonade in pFILTER vektorn bör ge en representation av hela samlingen av områden med en arvsmassa eller en transkriptom, den så kallade ”domainome”. Vi har visat att protein domäner kan klonas framgångsrikt, valt och slutligen identifierade start från DNA-fragment med en längd distribution som sträcker sig från 150 till 750 bp33,34, och detta är i linje med vad redovisas i litteraturen visar att de flesta protein domäner är 100 aa längd (med ett intervall från 50 till 200 aa)15.

DNA som utgångsmaterial måste vara uppdelad i storleksintervallet val och senare klonade in filtrering (pFILTER)12 vektorn. Under dessa steg, kunde potentiella bias undvikas maximera effektiviteten i alla kloning steg reaktioner som ingår i protokollet, särskilt fragmentet slut-reparera och fosforylering. Vector preparatet är utmanande och bör göras under optimala förhållanden samt, att undvika både plasmid nedbrytning och/eller kontaminering av osmält vektor.

När biblioteket har skapats, bör det ”filtreras” för att behålla endast ORFs vikta fragment. En viktig parameter att modulera detta steg är den selektiva påtryckningar som kan modifieras enligt striktheten hos filtrering önskas. Urval sker med hjälp av ampicillin: ju högre koncentration används, ju lägre antal transformerade bakterier kolonier kunna överleva. Detta återspeglar filtreringsmetod förmåga att markera för bra-kontra fattiga-mappen ORFs34. Denna minskning av antalet kloner balanseras av ökningen av fällbara boenden valda fragment. Vanligtvis, bör ampicillin koncentrationen vara tillräckligt för att minska till ca 1/20 antalet bakteriekolonier med avseende på de som kunde erhållas växande biblioteket på kloramfenikol endast.

Bibliotek validering sker vanligtvis genom PCR-amplifiering av slumpmässigt plockade kolonier och deras sekvensering. PCR-amplifiering av några kolonier föreslås för att få en snabb uppskattning av kvaliteten på biblioteket: längden av mellanläggen bör vara i det förväntade intervallet av 150-750 bp och olika kolonierna bör förevarande skär med olika storlek indikerar bra bibliotek förberedelse i termen av variabilitet. Denna konventionella strategi för screening, då tillämpas som den enda metoden för validering av bibliotek, är inte heltäckande och är tidskrävande, vilket gör att analysen av endast ett begränsat antal kolonier och att ha en hög chans av saknas de flesta av de viktiga klonerna. Vår metod är baserad på djupsekvensering av biblioteket, detta ger fullständig information på bibliotek mångfald och överflöd och exakt kartläggning av varje av de utvalda fragment.

Genomförandet av NGS teknik med metoden filtrering ökar djup analys av flera storleksordningar. Vi har nyligen optimerad protokollet för sekvensering ORF biblioteken genom att använda Illumina plattformen och utvecklat en särskild webb-verktyg för dataanalys som gör analysen av dessa slags uppgifter för varje användare utan någon bioinformatik programmeringskunskaper.

Biblioteket ”per se” är ett ”universellt instrument” och kan utnyttjas i olika sammanhang för proteinuttryck eller urval. Med vårt metodiska tillvägagångssätt bygger på överföring av den producerade ORFeome in i ett phage display sammanhang. Protein fragment uttrycks på phage ytan och blev lämpar sig för efterföljande urval.

Detta görs genom att rädda de filtrerade ORFs från pFILTER biblioteket genom rötning med specifika restriktionsenzym och åter kloning dem in i en kompatibel phagemid vektor så att deras fusion med den phage protein g3p.

Efter phagemid-ORF biblioteket skapas, kan det användas för urval mot olika mål, till exempel en förmodad bindande protein10 eller renat antikroppar35,36 som beskrivs här. Eftersom phage partiklar visas på deras yta de filtrerade ORFs, detta resulterar i en mycket mer effektiv urvalsförfarande på grund av avsaknad av icke-förevisande kloner som vanligtvis passerar förbi den.

Efter valet av phage display ORF biblioteket, kan utgång klonerna sekvenseras och analyseras med samma rörledning. NGS kan ge en komplett och statistiskt signifikant ranking av mest ofta valt ORFs och detta möjliggör identifiering av de proteiner som mestadels interagerar med betet används. Med tanke på förekomsten av många olika versioner av varje domän som skiljer sig genom några aminosyror, identifierar överlappningen mellan olika sekvenserade kloner också de minsta fragment eller domän visar bindande egenskaper. Slutligen, tack vare kopplingen av genotyp och fenotyp information in i phage biblioteket, när domänerna val har identifierats, DNA-sekvensen kan enkelt räddas från biblioteket för ytterligare studier, in vitro och in vivo validering och karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av ett bidrag från italienska ministeriet för utbildning och universitet (2010P3S8BR_002 till CP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sonopuls ultrasonic homogenizer Bandelin HD2070 or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321 or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific SM0311 or equivalent
Molecular Biology Agarose BioRad 161-3102 or equivalent
Green Gel Plus Fisher Molecular Biology FS-GEL01 or equivalent
6x DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611 or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 or equivalent
Quick Blunting Kit New England Biolabs E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368813
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S or equivalent
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 or equivalent
EcoRV New England Biolabs R0195L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289S
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2 general lab supplier
Ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
DH5aF' bacteria cells Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes general lab supplier
1,5 ml tubes general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes Biosigma 4905020
Electroporator 2510 Eppendorf
2x YT medium Sigma-Aldrich Y1003
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
DreamTaq DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
150 mm plates general lab supplier
100 mm plates general lab supplier
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
BssHII New England Biolabs R0199L
NheI New England Biolabs R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 or equivalent
M13KO7 Helper Phage GE Healthcare Life Sciences 27-1524-01 
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K1377
Polyethylene glycol (PEG) Sigma-Aldrich P5413
Sodium Cloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
PBS general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10003D or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack Thermo Fisher Scientific CS15000 or equivalent
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Nonfat dried milk powder EuroClone EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix  Kapa Biosystems, Fisher Scientific 7958935001
AMPure XP beads Agencourt, Beckman Coulter A63881
Nextera XT dual Index Primers Illumina FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500 Illumina
Spectrophotomer Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation Agilent
Forward PCR primer general lab supplier 5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer general lab supplier 5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS general lab supplier 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS general lab supplier 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Tags

Biologi fråga 140 Phage display nästa generations sekvensering Interactome Protein domän webbverktyg fällbara reporter proteinstruktur.
Interactome-Seq: Ett protokoll för Domainome bibliotek konstruktion, validering och urval av Phage Display och nästa generations sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda,… More

Soluri, M. F., Puccio, S., Caredda, G., Grillo, G., Licciulli, V. F., Consiglio, A., Edomi, P., Santoro, C., Sblattero, D., Peano, C. Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e56981, doi:10.3791/56981 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter