Summary
该方法将转基因技术引入兔颈动脉内皮细胞。转基因的引入可以评估转基因产品在正常动脉或疾病模型中的生物学作用。该方法对测定 DNA 调控序列的活性也有很重要的意义。
Abstract
该方法的目的是将转基因技术引入到兔颈总动脉孤立段的内皮细胞中。该方法实现了局灶性内皮选择性转基因, 从而使研究者能够确定内皮表达转基因的生物学作用, 并定量测定大动脉 DNA 序列的体内转录活性。内皮细胞。该方法采用手术隔离兔颈总动脉和 arteriotomy, 将转基因表达的病毒载体传递到动脉腔内。在腔内的载体的短潜伏期, 与随后的流明内容的愿望, 足以实现有效和持久的基因在内皮细胞的表达, 没有可检测的转导或表达以外的孤立的动脉段。该方法允许对正常动脉和人体血管疾病模型中的转基因产品的生物活性进行评估, 同时避免通过将基因传递定向到其他站点 (e. g) 而引起的系统性影响。肝脏) 或通过另一种途径, 通过生殖线转基因向内皮细胞提供遗传构造。这种方法的应用受限于需要熟练的外科医生和麻醉, 设备齐全的手术室, 购买和养兔的费用, 以及在基因转移载体的建设和使用方面的专门知识的需要。该方法获得的结果包括: 与转基因有关的动脉结构、细胞构成、细胞外基质或血管功能的改变;增加或减少动脉炎症;血管细胞凋亡的变化;疾病的进展, 迟缓, 或退化, 如内膜增生或动脉粥样硬化。该方法还允许测量本机和合成 DNA 调控序列在内皮细胞中改变转基因表达的能力, 提供的结果包括: 转基因 mRNA 的水平、转基因蛋白的水平和转基因的水平。酶活性。
Introduction
该方法的目的是在兔颈总动脉内皮中引入一种转基因。引入转基因可以评估转基因产品在正常动脉和兔模型的人类动脉疾病的生物学作用。在疾病模型中过度表达转基因可以揭示转基因 (及其蛋白产品) 是否显示为治疗剂1,2,3,4。纳入转基因表达式卡带中的顺式调节元素, 可以评估这些元素在动脉内皮体内5,6中的活动。了解特定的顺行调节元素的活动, 可用于设计更主动的表达盒, 并探讨在大动脉内皮细胞的基因调节机制在体内7。
家兔是人类血管生理学和疾病各个方面的重要模型。家兔与人类共有许多血管特征。例如, 基线血液学值, 止血调节和血管纵向张力是相似的兔子和人类的8。兔血管疾病模型复制了许多人类疾病的关键特征, 包括: 动脉瘤 (类似的几何和流特征)9, 血管痉挛 (类似的反应血管内治疗)10,11, 和动脉粥样硬化 (内膜斑块具有类似的功能, 包括一个核心富含脂质, 巨噬细胞, 和平滑的肌肉单元在纤维帽)12,13。因此, 兔子模型已经发展为许多血管疾病, 如血栓, 血管痉挛, 动脉瘤, 糖尿病, 血管移植狭窄, 动脉粥样硬化8,13,14, 15,16。
对于研究人员在动物模型中选择血管生理学和疾病, 兔有几个优点。与啮齿类动物相比, 较大的家兔血管允许手术操作更容易, 血管内装置的使用, 以及大量的组织进行定量测量。兔子比啮齿目动物的 phylogenetically 更接近灵长类动物17, outbred 兔的遗传多样性更接近人类的遗传变异。遗传多样性对临床前研究特别重要, 因为它们的性质-目的是开发可应用于基因多样化的人类群体的治疗方法。与许多, 如果不是所有其他模型物种, 兔子基因是容易克隆或合成, 因为兔子基因组已测序高覆盖率 (7.48x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway？db=oryCun2]。与其他大型动物模型 (如狗, 猪, 或绵羊) 相比, 兔子购买和房子相对便宜, 他们更容易繁殖和处理。家兔特定的血管疾病模型各有其自身的优势和不足, 作为人类疾病的模型, 超出了本手稿的范围8,12,18。研究人员应审查这些优点和缺点, 以确定是否兔子是回答特定实验问题的最佳模型。
将脱氧核糖核酸 (DNA) 调控序列引入内皮细胞在体内可以在复杂的生理环境中对这些序列的活动进行调查。体外对转染内皮细胞的研究有助于对 DNA 调控序列进行初步评估;但是, 当研究重复在体内5,19,20时, 组织培养模型中的表达水平有时不会重现。体外系统也可用于探索蛋白质信号和内皮生理学的基本途径以及培养的血管细胞之间的沟通;然而, 在体内系统6、20中, 最好研究由相邻血管细胞或免疫系统复杂群体影响的更复杂的通路或调节网络。本文介绍的方法提供了一个平台, 探讨在血管内皮细胞内的转基因表达调控, 无论是否有疾病。体内系统还允许对生理和病理细胞串扰进行调查, 并确定免疫系统对基因表达式6的调节作用。
细菌线转基因 (尤其是小鼠) 是一种将转基因表达定向到内皮细胞的替代方法。这种方法可以提供终生的转基因表达, 以特定的启动子或监管区域介导的内皮靶向21,22。然而, 转基因小鼠的世代是费时和昂贵的, 必须经常测试一些转基因线, 以确保转基因的靶向所需的细胞类型和取得适当的转基因表达水平, 和实验结果在小鼠系统可能是应变依赖性。具有内皮靶向转基因的小鼠转基因模型有许多优点: 没有必要对每一个实验动物进行手术, 以达到转基因, 实验鼠可以与许多其他可用的转基因小鼠一起繁殖。为了测试基因和表型的相互作用, 有广泛的选择抗体, 与小鼠的蛋白质反应, 促进表征的表型。然而, 通过细菌线将转基因定向到内皮细胞, 通常会导致整个血管的转基因表达,22使得很难确定转基因产品的作用地点。当转基因产品分泌时尤其如此, 因为在整个血管的血管内皮细胞分泌的转基因产品可能在动物体内的任意数量的部位有生物活性。虽然本手稿中描述的方法需要技术专长和专门设施, 但它的耗时和成本比开发内皮特异的转基因小鼠线要少得多。它允许在大动脉段的内皮细胞中有选择地评估蛋白质的功能, 并且它允许使用对侧的颈动脉作为配对的控制 (消除系统因素, 可以改变在实验动物-例如, 血压或胆固醇水平-作为不受控制的变量)。
基因疗法是治疗血管疾病, 特别是慢性病的一种有希望的方法, 因为单一的应用可以提供持续或可能终生表达的治疗基因23。基因治疗在体细胞基因转移动物模型中的治疗前景已被探索, 通常针对肝脏24,25, 这是一个相对容易的目标, 因为许多血液传播的病毒载体是 hepatotropic 的。然而, 为了对血管疾病产生影响, 针对肝脏的基因治疗必须实现蛋白质的系统性过度表达。这通常需要大剂量的向量, 这可能是有毒的, 甚至是致命的26。此外, 蛋白质系统水平的提高增加了非靶向副作用的风险, 这可能使实验结果的解释复杂化甚至模糊不清。本手稿所描述的针对血管内皮的局部基因治疗可以避免系统性的副作用, 因为注入的载体没有广泛传播到转基因动脉段之外, 而且可以实现局部血管效应, 而无需系统血浆蛋白水平的变化。27此外, 传感器动脉段所需的载体数量远低于实现强健肝传导的需要。随着时间的推移, 来自肝脏的转基因表达被报告为下降, 可能是由于细胞更替, 如果要维持高水平的转基因表达, 需要反复用药。28相比之下, 内皮细胞的低更替率为喂食家兔至少48周提供稳定表达, 在胆固醇喂养家兔的动脉粥样硬化性病变中至少有24周。1,27
为了确定这种基因转移到兔颈总动脉内皮的方法是否合适, 应在特定研究目标的背景下考虑其优缺点 (表 1)。该方法的优点包括: outbred 兔比近交系小鼠更好地代表人类遗传多样性 (对前期工作很重要);兔子提供更大的血管, 便于操作和更多的组织进行分析;该方法能较快地实现转基因小鼠的血管内皮靶向转基因表达;矢量剂量可以很容易地调整为模型可变水平的转基因表达;可对大动脉内皮的特定过程进行研究;局部血管转基因允许同一动物的相对颈动脉作为一种控制, 将系统因素排除为不受控制的变量。缺点包括: 需要特殊设施和专门知识;更少的基因改良的背景, 以实验是在兔子比在小鼠;对兔子和老鼠蛋白的抗体的选择较少 (对于转基因蛋白和其他抗原的 immunodetection, 这在解释实验结果中可能是重要的)。
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Protocol
这里描述的所有方法都是由华盛顿大学动物福利和相关机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的, 并已按照和遵守所有相关的管理和机构指引。
注: 兔颈总动脉的基因转移是由外科医生在麻醉师或助手的帮助下进行的。
1. 基因转移到兔颈总动脉: 手术前
- 麻醉兔子。给兔子称重。将30毫克/千克氯胺酮和2毫克/千克甲苯噻嗪组合成注射器。注射氯胺酮/甲苯噻嗪肌 (IM) 在 paraspinous 肌肉, 以诱发麻醉。
- 在等待兔子麻醉的同时, 准备好准备室和手术室 (或) 表。
- 在或准备室: 将眼科软膏和芬太尼贴片放在准备表的伸手可及的范围内;设置发剪刀和真空剃须兔的颈部和耳朵;放置一个酒精准备垫, 一个 24G x ¾ "导管, 注射口, 和手术胶带, 以确保静脉 (IV) 在兔耳静脉。
- 在或: 设置监视设备和位置探针 [心电图 (心电图), 氧气饱和度 (2), 温度] 在或桌;制备氧和异氟醚;把纱布带到面罩上, 把它固定在兔子身上, 然后把面具放在桌子的头端。
注: 贴在面罩上的纱布条应有2尾, 每45厘米左右。 - 打开或桌子上的暖水毯。在水毯的顶部, 放置一个滚动毛巾的颈部支持和分散电极板 (后来放在兔子的背部)。
- 设置或 iv 泵与100毫升的盐水 IV 袋与18-19G 针连接, 并设置流量为10毫升/小时每公斤。
- 将1毫升盐酸利多卡因 (2% 库存溶液) 和1毫升的 bupivicaine 盐酸 (0.5% 库存溶液) 放入注射器中, 用作局部镇痛剂。
- 当兔子被完全麻醉时, 准备兔子做手术。
注: 检查是否缺少踏板反射 (捏脚趾; 寻找肢体撤退), 以确保麻醉深度, 并继续监测整个手术中的踏板反射。- 将眼膏涂抹于眼部。用戴手套的手指在下腹部 (直肠上方) 和手指向肛门移动时, 从兔子的直肠中取出大便。这将允许稍后放置直肠温度探针。
- 在使用真空保持区域清洁的同时, 将胸骨切口的前颈剃至下颌骨边缘。同时剃两只耳朵为 IV 放置和芬太尼补丁附件, 并剃须左后方中间脚趾为脉冲氧探头。
注意: 该协议假设外科医生是在兔子的右侧为整个过程。如果或设置将外科医生放在相反的一侧, 则在这个步骤中反转两侧, 以保持与外科医生的导线和 IV 相反。未来步骤的两侧也应根据需要进行切换。 - 用酒精准备垫擦拭左耳, 将 24G IV 导管放入左耳静脉, 用注射口盖上, 并将导管/端口贴在兔耳上以确保其安全。将芬太尼贴片 (25 µg/小时) 应用于兔右耳。
- 将兔子运入或放置在手术台上的仰卧处, 在兔子的颈部下方有一个滚动的颈部支撑毛巾。轻轻伸展兔子的脖子, 直到它是直的和近似水平。
- 将兔子与 O2在1升/分钟上的面膜挂钩, 并启动异氟醚管理。通过将纱布条的两端绑在兔子的颈部支撑巾周围的面具上来保护面罩。根据需要调整异氟醚 (通常为 1-2%) (基于心率、呼吸速率和踏板反射), 以保持手术其余部分的适当麻醉。
- 确保分散电极板在兔背上居中。放置温度和脉冲脉搏探头, 并应用心电图引导兔。
- 将 IV 盐水钩入兔耳中的导管口, 以每公斤10毫升/小时开始盐水泵。
注: 1 小时后, 盐水泵可降至每公斤5毫升/小时。 - 把兔子的前腿松散地拴在桌子上。可以选择, 在兔子上放置一个小的塑料桌子, 以保护兔子免受胸/腹的压力, 从外科医生的胸部/腹部。
注意: 小桌子可以帮助防止腹部内容的强迫性返流。 - 注射2毫升以前准备好的利多卡因 (2% 股)/布比卡因 (0.5% 股) (50/50 混合) 皮下沿计划颈部切口线进行局部麻醉。
- 让助理准备手术现场与3交替磨擦洗必泰和异丙醇, 然后喷雾与 betadine。擦洗, 长袍, 手套, 遵循适当的无菌技术。
注: 外科医生应佩戴2x 外科放大镜, 以协助手术的前半部分。在生存手术期间, 保持外科医生和外科手术的不育是至关重要的。只有助手才能处理任何无菌物品, 灭菌材料必须灌装传递给外科医生或放置在被覆盖的仪器表上。无菌毛巾可以被外科医生用来维持不孕, 同时操纵非消毒设备, 如显微镜。
2. 生存手术 (基因转移)
- 准备仪器和无菌场。
- 让助手打开一个不育的悬垂包, 里面有一张桌子的悬垂, 一张给兔子的窗帘, 还有几条毛巾。灌装把物品转移给外科医生。
- 把仪表桌挂上。把6不育的毛巾和纸悬垂在被覆盖的桌子上。
- 用4条毛巾, 披上兔子的脖子, 只留下手术部位暴露 (大约4厘米 x 10 厘米)。把纸披在兔子身上。
- 让助手打开消毒的仪器包, 把灌装放到仪表桌上。
- 让助手打开以下设备和灌装地方到仪器桌或手到外科医生: 三1毫升注射器 (和一针, 如果注射器没有已经装针), 一个20毫升注射器, 一个21G 针, 一个19G 针, 3-0羟基酸 (pga) 缝合, 5-0 PGA 缝合, 7-0 聚丙烯缝合, 和两个 24G IV 导管。
- 使用 7.25 "坎特罗威茨钳将烙电缆固定在兔子的悬垂上, 然后将插头端掉到桌子上。让助手将电缆连接到高频单元并打开电源。
- 用由助手持有的 IV 袋或小瓶, 填充20毫升的无菌生理盐水注射器。使用这种生理盐水的需要, 以保持暴露的组织湿润的过程中。
- 准备一个1毫升注射器与1毫升的 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM, 用于洗涤动脉)。对于每一个将被转基因的颈动脉, 需要0.35 毫升稀释的病毒。如果双方使用相同的病毒, 准备一个1毫升的注射器与病毒稀释在 DMEM 到0.7 毫升的体积。如果不同的边接收不同的病毒 [例如一个 "Null" 病毒控制在一侧], 准备两个1毫升注射器, 每一个与0.35 毫升的病毒解决方案。对于依赖于帮助者的腺病毒, 病毒浓度为 2 x 1011病毒粒子 (vp)/毫升。
注意: 让助手准备病毒。外科医生将 DMEM 和病毒悬浮液放入无菌注射器中。 - 在褶皱上剪个洞。孔的大小应与兔颈部的手术部位大小相同, 这是在台阶2.1.3 的毛巾框架。钳夹在纸上的孔的角落与毛巾夹在兔子的脖子上的底层毛巾。
- 隔离颈总动脉。
注: 2x 外科放大镜应用于本部。- 用烙沿中线切开皮肤, 延伸约 7-9 厘米 cranially 朝向下颌骨, 用毛巾钳夹住皮肤。
- 通过筋膜与烙在尾端进行短侧切。然后将大剪刀插入切口中, 并直截了当地解剖整个中线的筋膜。用烙切下中线的解剖筋膜。
- 用小解剖剪刀, 解剖在 V 形肌肉 (sternocephalic 肌肉) 和胸骨舌骨肌肉的气管, 以暴露出常见的颈动脉, 从右侧开始。
- 解剖右颈总动脉游离于周围组织, 划分所有分支, 从颈部 caudally 的基础到咽神经 cranially 的交叉口。使用手术硅循环, 以帮助在解剖期间缩回动脉。
注意: 应该注意不要干扰与普通颈动脉平行的迷走神经, 也不要打扰与普通颈动脉交叉的神经。 - 结扎任何大的分支从颈总动脉 (1-2 每侧) 和5-0 丝缝合之前切断分支远端, 以释放一个 4-5 厘米段的颈动脉。切断结扎分支 1-2 毫米远离领带, 使领带不脱落。
- 在左侧重复解剖 (步骤 2.2.3-2.2.5)。
- 将载体注入颈总动脉。
注: 手术显微镜 (16X) 用于执行 arteriotomy, 注入矢量/控制解决方案, arteriotomy 修复。- 让助手从外科医生那里取出手术放大镜, 将手术显微镜移到原位。在显微镜上披上一条不育的毛巾, 以便在不污染无菌的情况下操纵显微镜。
- 注射肝素 [150 国际单位 (IU)/千克] 在 IV 导管和冲洗与10毫升生理盐水。
- 返回到孤立的右颈总动脉, 把两个丝绸领带围绕在被动员的颈动脉段的中间部分, 并绑一个单一的上手结在每个-不收紧他们。
- 使用大针驱动程序 (不要弯曲斜角, 将19G 针弯曲在斜面上, 近似80°。图 1)。
- 用血管夹子夹住隔离段的每一端的动脉, 首先放置颅骨夹以允许动脉充盈, 然后放置尾部夹。
- 用弯曲的19G 针将颈总动脉穿刺至尾部血管夹, 注意不要刺穿背部或侧壁。将针尖插入腔内, 取出两次, 以确保 arteriotomy 完全穿过动脉壁。然后小心地取出针头。
注: 重要的是要创建一个 arteriotomy, 穿透所有层的动脉壁干净, 不解剖动脉壁 (通过通过轴向通过膜和媒体)。要做到这一点, 颈动脉应该被刺穿与针尖端定位尽可能接近一个90°的角度对动脉壁 (图 1)。在90°角的颈动脉穿刺是通过用细钳抓住动脉的膜, 轻轻地抬起动脉表面, 同时按下针的顶端向升力点。此操作还可降低击中后壁的风险 (图 1)。 - 把几个纱布垫放到一个窝里, 用来放置注射器用于输液。把巢放在兔子胸尾的切口上。
- 将静脉注射导管放在含有 DMEM 的注射器上 (不要太紧), 并将导管从尖端弯曲至4毫米, 以便在释放75°后, 弯曲保持在约。
- 在动脉中插入 IV 导管至折弯点, 用 DMEM (~ 0.25 毫升 x 2) 冲洗动脉中的所有血液。每次冲洗时, 用 DMEM 填满动脉, 然后用戴手套的手指轻轻按压动脉, 从血管腔中取出残余 DMEM, 开始只是尾部到颅骨血管夹。在保持温和的压力的同时, 将手指从颅骨滑向尾部。腔内的内容将通过 arteriotomy 清洗。
- 保持导管在动脉和交换 DMEM 注射器的注射器含有病毒的解决方案。确保没有空气进入导管。
- 将丝栓沿着动脉滑动, 使其在导管尖端的位置环绕动脉, 但不要收紧。
- 注入0.03 毫升的病毒溶液, 将剩余的 DMEM 从导管中推出, 然后清空动脉。再次将所有液体从流明中取出, 用手指、颅骨和尾部 (如步骤 2.3.9) 将其折叠。
- 拧紧导管尖周围的两条领带以封住流明。注入病毒溶液 (~ 0.25 毫升; 2 x 1011 vp/mL), 轻轻按压注射器柱塞, 直到动脉膨胀至生理口径。
注意: 重要的是, 动脉扩展到生理口径, 并在病毒注入期间保持扩张。如果没有, 基因转移的程度将显著下降。 - 轻轻地把注射器放在纱布的巢上。
- 将7-0 聚丙烯缝合在颈动脉膜仅尾侧的颅内血管夹子上标记基因转导的颅骨边界
- 在含有病毒的溶液在动脉腔内20分钟后, 取出含有病毒的注射器并用空注射器替换。轻轻地吸入含有病毒的溶液, 直到血管坍塌并取出注射器。切断或解开丝领带, 轻轻地取出导管。
注: 切断领带非常短的艾滋病清除。小心取出导管, 避免对颈动脉内皮造成损伤。 - 使用手术显微镜, 使用 X 模式 (图 2) 关闭 arteriotomy 与7-0 聚丙烯。
- 在 arteriotomy 的右下角输入第一个通行证, 并在左下角退出容器。然后穿过开口, 然后从右上到左上的第二个传球。
- 在缝合缝线之前, 通过非常短暂的释放颅骨血管夹来冲洗动脉。当剪辑释放时, 血液会流出 arteriotomy, 从流明中去除空气和残留病毒。
- 拉缝线, 轻轻地关闭 arteriotomy 和领带的缝合与2平方结。
注: 拉缝线过紧会引起组织的聚束, 扰乱水流, 增加血栓风险和改变流动, 这可能是疾病模型中一个重要的无控制变量。
- 释放颅骨血管夹, 然后用纱布轻压的尾部血管夹止血。如果出血持续, 持续压力为 1-2 分钟。如果 arteriotomy 被正确关闭, 出血总是在这个时间范围内停止。
- 让助手注射丁丙诺啡 [0.02 毫克/千克; 皮下 (平方)] 在大约这个时候提供术后镇痛直到芬太尼血浆水平成为治疗。
注: 第二次丁丙诺啡注射液 (0.02 毫克/千克;平方米) 可能需要6小时后, 第一次注射, 以保持镇痛, 直到芬太尼血浆水平成为治疗。 - 在左侧重复病毒输液协议, 步骤 2.3.2-2.3.19。
- 伤口闭合
- 使用 5-0 PGA 缝合闭合中线筋膜与连续缝合。
- 与 3-0 PGA 缝合, 关闭皮肤与皮模式使用一个埋葬结在两端。
- 手术后恢复和清理。
注意: 在从麻醉中恢复时, 必须对兔子进行连续监测, 以保持适当的氧合和体温。恢复应该在平静、安静的环境中进行。- 关闭异氟醚和氧气流, 从兔子身上取出面罩。
- 解离 iv 流体, 但将四个端口留在原地, 以便进入紧急 iv。
- 把兔子带到恢复区, 然后躺在笼子里, 打开一条温暖的水毯 (或者是一个贝尔拥抱加热器)。
- 通过掩码给 O2 , 直到该项的2稳定为止。
- 让兔子在笼子里恢复, 每隔15分钟就把它翻转到另一侧, 直到兔子可以坐在后腿上走动。
- 当兔子是移动的, 在返回笼子之前从它的耳朵去除 IV。
注意: 不要将兔子退回到其他动物的公司, 直到它完全从麻醉中恢复。
- 根据适当的生物危害和锐化废物协议, 处理任何与该载体接触或在操作领域的东西。
3. 基因转移到兔颈总动脉: 术后护理
- 在手术后每日评估家兔的整体状况, 检查伤口愈合情况, 感染的证据, 食欲, 呼吸和疼痛迹象。
- 检查兔子的耳朵位置 (耳朵向下可能是疼痛或窘迫的征兆, 特别是当加上凌乱的外观)。检查兔子是否保持移动和活动状态。检查家兔正常呼吸没有鸣。检查伤口是否干净、干燥、完好。检查兔子的体温是否正常。咨询兽医服务, 如果兔子是不移动和活跃的, 与正常体温, 整洁的外观, 干净的伤口, 和正常的呼吸。
- 检查正常的食物摄取量和新鲜粪便和尿液的证据。
注: 手术后进食量可减少, 但应在2天内恢复正常;根据需要提供补充食品。
- 在手术后3天取出芬太尼补丁。
注: 丁丙诺啡可根据手术后疼痛的需要进行管理, 不受芬太尼修补程序的管理, 或者在早期删除芬太尼修补程序时。
4. 终端收获手术: 手术前
- 麻醉兔子。参见1.3 节和1.3.5 关于麻醉的成就和维护。
- 给兔子称重。将30毫克/千克氯胺酮和2毫克/千克甲苯噻嗪组合成注射器。注射氯胺酮/甲苯噻嗪 IM paraspinous 肌肉诱导麻醉。
- 准备好准备室和桌子, 等待兔子麻醉。
- 在或准备房间: 设置发剪刀和一个真空剃须兔的脖子和耳朵。
- 在手术室: 设置监测设备, 并将探头 (2, 温度) 放置在或表上;制备氧和异氟醚;把纱布带到面罩上, 把它固定在兔子身上, 把面具放在桌子的头端。
注: 绑在面罩上的纱布条应有2尾, 每45厘米左右。 - 打开或桌子上的暖水毯。在水毯的顶部, 放置一个滚动的毛巾为颈部支持和分散电极板 (后来放置在兔子的背部)。
- 将1毫升的盐酸利多卡因 (2% 股) 和1毫升的 bupivicaine 盐酸 (0.5% 库存) (50/50 混合) 在注射器中作为局部镇痛剂。
- 当兔子完全麻醉后, 准备兔子做手术。
- 从直肠中取出大便, 如1.3.1 中所述, 以便以后放置温度探头。
- 将兔子从胸骨切口刮到下颌角, 同时用真空保持区域清洁。同时剃掉左后方中间脚趾为脉冲氧探针。
注意: 该协议假定外科医生将在兔子的右侧。如果或设置将外科医生在相反的一侧, 相反的两侧在这一步, 以保持导线对面的外科医生。未来步骤的两侧也应根据需要进行切换。 - 将兔子运入或放置在手术台上的仰卧处, 在兔子的颈部下方有一个滚动的颈部支撑毛巾。轻轻伸展兔子的脖子, 直到它是直的和近似水平。
- 用 O2在1升/分上钩住兔子, 然后启动异氟醚管理。通过将纱布条的两端绑在兔子的颈部支撑巾周围的面具上来保护面罩。根据需要调整异氟醚 (通常为 1-2%), 以维持手术其余部分的适当麻醉。
- 确保分散电极板在兔背上居中。放置温度和脉冲脉搏探头。
- 把兔子的前腿松散地拴在桌子上。
注: 可选, 在兔子身上放置一个小的塑料桌, 以保护兔子免受胸/腹压力的影响。这里的目的是防止腹部内容被迫回流。 - 注射2毫升利多卡因 (2% 库存溶液)/布比卡因 (0.5% 库存溶液) (50/50 混合; 从步骤 2.4) 皮下沿计划颈部切开线进行局部麻醉。
- 用 betadine 喷雾手术部位。为外科手术戴上干净的手套。
5. 末端手术 (船收获)
- 准备仪器和手术场地。
- 打开一个干净的悬垂包, 其中包含一个表悬垂和一个纸的褶皱为兔子。把仪表桌挂上。
- 打开仪器包, 放到仪表桌上, 安排仪器。将下列设备放到仪表桌上: 一个20毫升注射器和一个21G 针。
- 用 7.25 "坎特罗威茨钳" 将烙电缆固定在兔子的悬垂上。将插头连接到高频单元并打开它。
- 用无菌生理盐水填充20毫升注射器。使用此生理盐水, 以保持暴露的组织湿润的过程中。
- 把纸披在兔子上, 在兔子脖子上的手术部位的褶皱上切开一个洞。用毛巾夹钳夹住孔的角落, 使其与兔子的皮肤结合。
- 隔离颈总动脉。
注: 2x 外科放大镜应用于本部。- 用烙沿中线切开皮肤, 延伸约 7-9 厘米 cranially 朝向下颌和夹紧皮肤打开用毛巾夹子。
注: 如果在上一次手术后只有几天的收获, 烙是不需要的。只需切开缝合线, 轻轻地拉开先前手术切口。 - 在尾端用烙在筋膜上进行短侧切。然后插入大剪刀到切口, 并坦率地解剖沿整个中线筋膜。用烙切下中线的解剖筋膜。
- 用小解剖剪刀, 解剖 V 形肌肉 (sternocephalic 肌) 和胸骨舌骨肌肉在气管, 以隔离颈总动脉, 从右侧开始。
- 解剖右动脉从颈部 caudally 的周围组织到咽部神经 cranially 的交叉口。使用手术硅循环, 以帮助在解剖期间缩回动脉。
- 在左侧重复解剖 (步骤 5.2.3-5.2.4)。
- 用3-0 丝缝合, 结扎颈总动脉颅的部分注入的载体 (使用血管外膜缝合放置在第一次手术, 以确定的头颅范围的载体输液。然后结扎颈骶管到修复的 arteriotomy。
- 结扎颈动脉段, 用生理盐水冲洗腔内。从血管中修剪多余的血管外膜组织, 将颈动脉段切成小块, 用于不同端点分析 (组织学、DNA、核糖核酸 (RNA)、蛋白质、外植体培养、等)。
- 注射1毫升 Beuthanasia IV 到弄死, 并确认家兔安乐死。
- 用烙沿中线切开皮肤, 延伸约 7-9 厘米 cranially 朝向下颌和夹紧皮肤打开用毛巾夹子。
- 根据适当的生物危害和锐化废物协议, 处理任何与载体接触或在手术现场的东西。
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Representative Results
为了实现这种方法的信心, 初步实验是必要的, 以确定该操作者获得有效和可再生的基因转移, 以转基因表达主要在腔内内皮细胞。根据我们的经验, 这是最容易评估使用的向量, 表达β-乳糖酶。5-溴-4-氯-3-哚β D-galactopyranoside (X-加仑) 染色的颈总段清除后3天的载体输液, 以及测量β-乳糖酶 mRNA (信使 RNA) 与定量反向转录聚合酶链反应 (qRT PCR), 将揭示效率, 重现性和转基因细胞的位置。对于研究转基因表达的影响或测量顺式转录元素活性的实验, 我们通常将转基因 mRNA 作为基因转移的水平和重现性的初步指标来衡量。
我们实验室的一个新操作员试图通过传感兔颈总动脉与腺病毒载体 (2 x 1011 vp/mL) 来建立对这种方法的熟练程度, 表达β-乳糖酶转基因, 由巨细胞病驱动 (CMV)。促进。转基因动脉3天后被收割, 并被横切成段。各自的段然后被切开开放轴向或左作为原封圆环。所有的片段都是 X-加仑染色的离心管。经轴向切开的段被放置在水平面上, 腔面表面最大地暴露, 使用针脚以防止段卷曲。En 面部腔内表面的图像显示 X-gal (图 3A和3B) 的强健内皮染色。完整的颈动脉环内腔表面的轴向图像显示 X-gal 仅在腔内表面 (图 3C和3D) 染色。经轴向打开的段被加工成石蜡切片, 用苏木精和血红或核快红色进行反染色。尽管血管外膜层中有少量染色(图 3E和3F), 但图像在内皮中主要显示 X-gal 染色。血管外膜细胞的传导通过 arteriotomy 部位的渗漏或通过小枝的渗漏通过侧支结扎的部位而发生。29
在一个单独的实验中, 一个新的操作员试图建立熟练程度达到可再生的基因表达水平, 作为试验的前奏, 旨在调查转基因的生物活动。家兔颈总动脉的转基因与帮助依赖腺病毒 (2 x 1011 vp/毫升), 其中包括一个蛋白 A I (HDAdApoAI) 或 IL-10 (HDAdIL10) 转基因, 都在控制的巨细胞病毒启动子。转基因动脉在转导后3天内被收割, 横截成段。RNA 是从血管片段提取, 和 IL-10 mRNA 表达的 qRT PCR 量化, 与规范化的甘油 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) mrna 在同一提取物 (图 4)。在 HDAdIL10-transduced 动脉中, 只有1的6动脉有一个非常低, 但可检测到的蛋白 I mRNA 信号。转基因与 HDAdApoAI 血管转基因的血管, 其平均表达为700倍。HDAdApoAI 转基因动脉内内源性 IL-10 mRNA 水平较低, HDAdIL10-transduced 动脉平均表达增加6倍。值得注意的是, 在转导效率和转基因表达方面有相当可观的动脉内和间的变异性, 如图 3和4中所示。我们发现这种变化, 即使有经验丰富的运营商。
图 1.颈总动脉 Arteriotomy.细钳用于掌握颈动脉膜, 并将上行牵引应用于动脉。这种机动扩大了血管腔, 并产生一个垂直的表面, 其中插入弯曲的19G 针, 从而减少了刺穿动脉后壁的风险。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.颈总 arteriotomy 闭合。arteriotomy 用7-0 聚丙烯缝合闭合, 使用 X 型。针和缝合的第一个通行证进入 arteriotomy (站点 1) 右下角的动脉腔, 并退出左下角的流明 (站点 2)。针和缝线, 然后穿过 arteriotomy 和重新进入流明在右上 (网站 3)。然后, 针头从左上方的腔口流出 (4 点)。在缝合两端的温和牵引关闭 arteriotomy。缝合结束 (从站点1和站点4离开) 被栓与2平方结。灰色圆圈表示穿过容器壁的缝线的位置。实心蓝线表示在血管壁外缝合的区域。点蓝线表示缝线在腔内的区域。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.有效的内皮转基因表达.兔颈总动脉转基因与腺病毒载体表达β乳糖酶转基因和收获3天后。转基因动脉段的 X-加仑染色, 无论是完整的环或后被打开的轴向切割。(A-B)颈动脉环的腔内表面图像, 轴向切开。(C-D)对完整的颈动脉环的腔内空间进行轴向查看。(E-F)X-加仑染色, 石蜡嵌入颈动脉段切片和反染色的任何 (E) 苏木精和血红素或 (F) 核快红色。刻度条 = 100 µm。I = 内膜;M = 媒体;和 A = 膜。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.转基因 mRNA 表达的量化.家兔颈总动脉的转基因与帮助依赖腺病毒表达的是一 HDAdApoAI 或 IL-10 (HDAdIL10) 控制下的巨细胞病毒启动子。3天后, 动脉被收割。(A) IL-10 和 (B) 的 mrna 表达式由 qRT PCR 量化, 规范化为 GAPDH mRNA 在同一动脉, 并表示为任意单位 (AU)。条形指示平均值;P值来自秩和测试。请单击此处查看此图的较大版本.
| 优势 | 缺点 | |
| 与啮齿动物模型相比 | 更接近 phylogenetically 灵长类动物 | 更昂贵的购买和房子 |
| 更大的遗传多样性, 缓解临床翻译 | 更难繁殖和处理 | |
| 较大的血管允许更容易的手术操作, 并提供更多的组织进行定量分析 | 更广泛的监管要求 | |
| 允许使用为人类设计的血管内装置 | 更少的基因改造背景 | |
| 对兔蛋白抗体的不广泛选择 | ||
| 与较大的动物模型相比 | 相对便宜购买和房子 | 可能比其他大型动物模型对某些血管疾病的临床相关程度更低 |
| 易于繁殖和处理 | ||
| 与细菌线转基因相比 | 仅在大动脉中表达的转基因;转基因在兴趣点的作用可以确定 | 方法在非内皮细胞中的应用是困难的 |
| 可将对侧颈动脉作为配对对照;消除系统参数 (e. g, 血压, 胆固醇水平) 作为不受控制的变量 | 手术室和外科专业需要;核心设施可能不可用 | |
| 提高大血管内皮细胞 DNA 调控序列活性的高通量 | 转基因不能表达在大多数血管床上 | |
| 可能更快, 成本更低 | ||
| 系统暴露于转基因蛋白质不太可能-最小化目标效应 | ||
| 与系统基因治疗方法相比 (e。经外周静脉注射的肝转导) |
更稳定的转基因表达比全身 (肝) 基因治疗 | 载体传递需要手术干预 |
| 在动脉壁上表达的转基因, 允许本地提供高水平的转基因蛋白 | 手术室和外科专业需要 | |
| 系统暴露于转基因蛋白质不太可能-最小化目标效应 | 治疗限于专门针对干预的动脉;不治疗系统性因素 (e. g. 脂类) | |
| 可将对侧颈动脉作为配对对照;消除系统参数 (如血压、胆固醇水平) 为不受控制的变量 | ||
| 需要更低的矢量剂量 |
表1。兔颈总动脉内皮选择性基因转移模型的优缺点。
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Discussion
外科技术的某些方面值得特别注意。通过仔细解剖, 充分暴露和动员颈总动脉, 将促进基因转移和 arteriotomy 修复。然而, 在解剖过程中, 应尽量减少对颈动脉的直接操纵, 以防止血管痉挛。此外, 在动脉旁的任何出血应以纱布轻压停止, 淤血血液应立即清除, 用生理盐水冲洗区域。同样重要的是避免损害迷走神经, 这是平行于颈总动脉。修剪计划 arteriotomy 区域中的膜将有助于操作人员执行干净和功能 arteriotomy 并修复 arteriotomy。最后, 必须确定和安全结扎的颈总动脉分支, 以防止从颈动脉腔漏出的载体。
还有一些关键方面的载体输液和 arteriotomy 修复。在载体输液过程中, 扩张颈动脉对生理或稍大口径的作用是很重要的, 以实现有效的转导。在修复 arteriotomy 时, 缝合线应尽可能接近 arteriotomy 的边缘, 并且要干净地进入和退出腔体, 而不是通过容器壁轴向传递。如果只把血管壁的外层拉在一起, 是因为缝线通过血管壁通过轴向通过, 而不是通过壁径向穿过墙壁进入腔内, 那么在内膜中就会留下空隙, 血栓形成的风险会增加。如果缝合线的间距太大, 或者如果缝合线过紧, 在 arteriotomy 部位会产生组织褶皱。这些褶皱破坏正常的层流血流, 也增加血栓的风险。保持一致的流动特性对于实验动物模型 (g.)、动脉粥样硬化) 是很重要的, 因为改变的流动可能有助于疾病进程30。
新的操作员经常在收获时遇到血栓动脉。腔内血栓形成是一种破坏性的并发症, 使动脉无法作为实验样本。为了防止血栓形成, 我们在基因转移之前例行地管理 IV 肝素。如上文所述, arteriotomy 的仔细关闭也防止血栓形成。肝素剂量可以增加, 以防止血栓形成, 或阿司匹林可以给术后。然而, 较高剂量的肝素也会增加出血并发症的可能性, 阿司匹林可能干扰实验终点, 特别是如果炎症正在研究中。因此, 最好把重点放在改进的外科技术上, 作为预防血栓形成的手段。
如果操作过于剧烈, 颈动脉可能会痉挛, 这也可能导致血栓形成, 减少流量。如果遇到血管痉挛, 可以通过局部罂粟碱的应用来缓解。当血管的收成计划超过 2-3 天后转导, 和血栓形成是一个关注, 经皮超声可用于无创性评估血管通畅。血栓动脉的发现可能导致安乐死, 以节省住房费用。其他动物也可以迅速登记, 以填充实验组。与此方法相关的围术后和干预后死亡率应 < 1% (i. e), 与在正常家兔上进行的其他手术相关的死亡率不同, 这与死亡有关31。
在操作者对手术协议的技术方面感到满意后, 需要验证, 使用上文第节中所述的具有代表性结果的方法, 进行有效的基因转移到内皮细胞的能力。如果出现可重现基因转移的问题, 罪魁祸首可能在两个领域之一。当血管被隔离, 血液从腔内冲洗后, 去除 DMEM 洗涤缓冲器, 使注入的载体溶液在转导过程中不被稀释是很重要的。另一个重要的方面是扩张血管的生理或稍大口径的媒介输液。因为, 根据我们的经验, 在20分钟的输注过程中, 未完全扩张或不保持扩张的颈动脉有很低的转基因表达, 有可能是动脉扩张到生理口径改善转导效率。然而, 我们从未有系统地研究过这一点。在生理水平以上增加输液压力有可能提高转导效率, 同时也能使血管介质中细胞传导更高水平。然而, 血管内皮屏障的破坏可能会损害血管并增加血栓形成的风险。如果血管在整个20分钟的向量潜伏期内不保持扩张, 则可能是该载体从颈总动脉的分支处漏出。在解剖时要小心, 以识别和结扎所有分支, 以防止从颈动脉腔漏出的媒介。
这种方法有几个与兔子使用有关的限制。兔子比其他大动物 (狗, 猪, 绵羊) 更便宜的房子和饲料;然而, 购买、住宿和喂养兔子的费用比老鼠和老鼠要大得多。手术室设施和对兔子手术的管理要求也远比啮齿目动物更广泛。此外, 有效执行手术基因转移协议需要大量的技术专长。这些专门知识可以由没有正式外科训练的操作员获得。我们小组中至少有2人 (包括本手稿的主要作者) 已经学会了手术技巧并有效地应用了这些技术。然而, 在操作员能够开始生成高质量数据之前, 需要细致的训练和对操作员的基因转移效率和重现性 (如代表性结果部分所述) 进行仔细的验证。
转基因表达的禁闭几乎完全与内皮与此方法29,32,33,34,35,36,37是有用的, 它允许调查内皮细胞中的转基因效应, 以及测量内皮细胞中顺式作用的 DNA 调控序列的活性。少量的血管外膜或内侧细胞可能转基因;然而, 这种方法无法有效地传感器 nonendothelial 细胞, 阻碍了该方法在其他类型的血管壁细胞 (如平滑肌细胞和巨噬细胞) 的研究中的应用。虽然转基因内皮细胞分泌蛋白的过度表达可以允许调查这些蛋白质对其他血管细胞类型的影响, 但非分泌蛋白在其他血管细胞类型中的作用 (e. g. 受体或涉及信号传导的蛋白质) 不能用这种方法来研究。
作为检测动脉壁靶向基因治疗的手段, 该方法与其他临床前方法有两种主要的不同。首先, 该方法利用兔子模型进行基因治疗的体内测试, 而不是使用更常用的啮齿动物模型8,12,15,38,39。使用家兔可以评估转基因的表达和转基因产品在 outbred 动物模型中的生物学作用, 这比近亲交配啮齿动物更能代表人类遗传多样性。该模型可用于评估正常家兔动脉或兔动脉中的基因治疗, 其动脉病理与病变的人动脉相似。兔动脉比啮齿动物动脉更接近人动脉, 并提供比啮齿动物动脉更大的分析组织。第二个主要区别是, 该方法采用手术方法将转基因载体传递到血管内皮。体细胞基因治疗往往是系统地提供, 最频繁的目标是肝脏的目的是改变血浆水平的转基因蛋白25,40。该方法以血管内皮为靶点, 在局部提供治疗性转基因产品, 其峰值浓度集中在动脉壁内, 正是血管疾病治疗所需要的。通过在本地提供转基因, 该方法也消除了转基因产品的系统性副作用。其他组正在开发方法, 使用肽, 抗体, 或其他衣壳修改, 以系统地注入的媒介, 以健康或病变的内皮, 提供局部血管基因治疗41,42,43. 然而, 这些目标方法仍在开发中, 而且由于大量的系统转导而变得复杂, 特别是在肝脏42、43、44。我们的手术方法提供了一个精确和有效的介绍转基因血管内皮与最小, 如果任何转导在其他地方。1该方法还是一种更方便、更高效、更高的全平均 (与细菌线转基因或系统注射内皮靶向载体相比), 用于检测大血管中 DNA 调控序列的活性。内皮, 用于检测动脉壁的转基因蛋白功能, 以及用于检测血管壁靶向基因治疗。
这种方法允许调查任何转基因的生物学作用, 当它在大动脉内皮表达。如果修改以表达功能损失的试剂, 如显性负受体或短发夹 RNA, 它将允许调查内源性内皮蛋白和信号通路的作用。该方法还可用于测量大动脉内皮细胞中任何顺作用 DNA 序列的转录活性5,6,7。此外, 该方法允许检测任何类型的基因转移载体, 以提高效率和安全性时, 在当地提供给内皮, 并将揭示的能力, 以实现持久的转基因表达。最后, 该方法允许开发和测试的载体和转基因的组合, 旨在提供血管壁靶向基因治疗。该方法可以作为筛选工具, 以确定可能的治疗基因-未来-将交付到所有大动脉内皮 (或所有病变的大动脉) 通过经皮注射血管壁靶向载体。由于人类对腺病毒5型45的预先存在免疫, 在临床应用中使用腺病毒型5的载体将具有挑战性。腺病毒5衣壳的工程, 使用替代腺病毒血清型46, 或使用不免疫的载体, 如 AAV 可能需要把血管基因治疗的临床。然而, 作为一个实验工具, 我们不知道任何媒介, 可以竞争与帮助者依赖腺病毒5在实现有效和持久的转基因表达血管1。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 AdVec, 公司允许使用 HDAd 试剂, 朱莉娅 Feyk 为行政协助, 和比较医学兽医服务部的外科咨询和支持。这项工作得到了 HL114541 和小约翰. 洛克慈善信托基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
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