Summary
Diese Methode ist ein Transgen in das Endothel der Kaninchen Halsschlagadern einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt entweder normale Arterien oder Krankheitsmodelle. Die Methode eignet sich auch zur Messung der Aktivität der regulatorischen DNA-Sequenzen.
Abstract
Das Ziel dieser Methode ist, ein Transgen in das Endothel der isolierte Segmente der beiden Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern einzuführen. Die Methode erreicht fokale endotheliale selektive Transgenese, wodurch ein Ermittler um die biologische Rollen von endothelialen ausgedrückt transgenen zu ermitteln und zu quantifizieren, die in-vivo transkriptionelle Aktivität der DNA-Sequenzen in große Arterie Endothelzellen. Die Methode verwendet chirurgische Isolation von Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern und eine arteriotomie Transgen exprimierenden viralen Vektoren in das arterielle Lumen liefern. Eine kurze Inkubationszeit des Vektors in das Lumen mit nachfolgenden Aspiration des Inhalts Lumen ist ausreicht, um effizienter und langlebiger Expression des Transgens in das Endothel ohne nachweisbare Transduktion oder Ausdruck außerhalb der isolierte arterielle Segment. Die Methode erlaubt Einschätzung der biologischen Aktivitäten des Transgens Produkte sowohl in normalen Arterien Modelle menschlicher vaskulären Erkrankungen, unter Vermeidung von systemischen Wirkungen, die entweder durch gezielte gen Lieferung zu anderen Websites (zB. verursacht werden könnten der Leber) oder durch den alternativen Ansatz genetischen Konstrukte des Endothels durch Keim Linie Transgenese zu liefern. Anwendung der Methode wird durch die Notwendigkeit eines erfahrenen Chirurgen und Anästhesisten, einen gut ausgestatteten Operationssaal, die Kosten für Kauf und Gehäuse Kaninchen und den Bedarf an Fachwissen in Gentransfer Vektor Bau und die Nutzung begrenzt. Mit dieser Methode erzielten Ergebnisse gehören: Transgen-im Zusammenhang mit Veränderungen im arteriellen Struktur, zellularität, extrazelluläre Matrix oder vasomotorische Funktion; zu- oder Abschläge bei arteriellen Entzündungen; Veränderungen im Kreislauf zellapoptose; und Progression, Retardierung oder Regression von Krankheiten wie Intima-Hyperplasie oder Arteriosklerose. Die Methode erlaubt auch Maß für die Fähigkeit der native und synthetische DNA regulatorischen Sequenzen zum Ändern Transgene Ausdruck in Endothelzellen, die Ergebnisse, die zählen: Ebenen des Transgens mRNA Niveaus des Proteins Transgen und Ebenen des Transgens enzymatische Aktivität.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist, ein Transgen in das Endothel der gemeinsamen Halsschlagadern Kaninchen einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt sowohl in normalen Arterien Kaninchen Modelle der menschlichen arteriellen Verschlusskrankheit. Überexpression des Transgens in Krankheitsmodellen kann zeigen, ob das Transgen (und seine Proteinprodukt), Versprechen als Therapeutika1,2,3,4 zeigen. Einbeziehung der GUS wirkenden regulatorische Elemente in der Transgen-Expressionskassette erlaubt eine Beurteilung der Aktivität dieser Elemente im arteriellen Endothel in Vivo5,6. Kenntnisse über die Aktivität der spezifischen GUS wirkenden regulatorische Elemente kann mehr aktive Expressionskassetten gestalten und Mechanismen der Genregulation in große Arterie Endothel in Vivo7Sonde verwendet werden.
Kaninchen sind ein wertvolles Modell für die verschiedenen Aspekte der menschlichen vaskuläre Physiologie und Krankheit. Kaninchen haben viele vaskuläre Merkmale mit den Menschen. Beispielsweise ähneln hämatologischen Ausgangswerte, blutstillende Regulierung und vaskuläre Längsspannung zwischen Kaninchen und Menschen8. Kaninchen-Modelle von Gefäßerkrankungen Replizieren der wichtigsten Features von vielen menschlichen Krankheiten einschließlich: Aneurysmen (ähnliche geometrische und Fließeigenschaften)9, Vasospasmus (ähnliche Reaktion auf die endovaskuläre Behandlung)10,11, und Atherosklerose (Intima Plaketten mit ähnlichen Eigenschaften, einschließlich einen Kern reich an Lipid, Makrophagen und glatten Muskelzellen in einer fibrösen Kappe)12,13. Entsprechend, Kaninchen-Modelle wurden für viele Gefäßerkrankungen wie Thrombose, vasospasmen, Aneurysma, Diabetes, Gefäßprothese Stenose und Arteriosklerose8,13,14, 15,16.
Für die Forscher unter Tiermodellen für vaskuläre Physiologie und Krankheit zu wählen hat die Kaninchen mehrere Vorteile. Im Vergleich zu Nagern, ermöglichen größere Schiffe von Kaninchen einfachere chirurgische Manipulation, Verwendung von endovaskuläre Prothesen und eine größere Menge des Gewebes für quantitative Messungen. Kaninchen sind phylogenetisch Primaten als Nagetiere17sind viel näher, und die größere genetische Vielfalt der fremd-Kaninchen besser approximiert die genetische Variabilität des Menschen. Genetischer Vielfalt ist besonders wichtig für präklinische Studien, die-durch ihre Natur-Ziel, Therapien zu entwickeln, die genetisch vielfältigen menschlichen Bevölkerung angewendet werden können. Wie mit vielen, wenn nicht alle anderen Modell Arten Kaninchen Gene einfach geklont oder synthetisiert, weil mit hoher Abdeckung der Kaninchen-Genom sequenziert hat (7,48 X) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Im Vergleich zu anderen großen Tiermodellen (wie Hunde, Schweine oder Schafe), Kaninchen sind relativ kostengünstig zu erwerben und Haus und sie sind einfacher zu züchten und zu handhaben. Spezifische Gefäßerkrankungen Modelle bei jedem Kaninchen haben ihre eigenen vor- und Nachteile als Modelle für menschliche Krankheiten, die über den Rahmen dieses Manuskript8,12,18sind. Ein Ermittler sollten überprüfen, diese vor- und Nachteile zu ermitteln, ob das Kaninchen das beste Modell für eine spezifische experimentelle Frage zu beantworten ist.
Einführung der Desoxyribonukleinsäure (DNA) regulatorischen Sequenzen in Endothelzellen in Vivo ermöglicht die Untersuchung der Aktivität dieser Sequenzen in einem komplexen physiologischen Umfeld. In-vitro- Studien in transfizierten Endothelzellen können nützlich für die Erstbewertung von regulatorischen DNA-Sequenzen sein; jedoch sind Ausdruck Niveaus in Gewebekultur Modelle manchmal nicht wiedergegeben, wenn die Studien wiederholt in Vivo5,19,20sind. In-vitro- Systeme können auch für die Erkundung von grundlegenden Wege der Protein-Signalisierung und endotheliale Physiologie sowie Kommunikation zwischen kultivierten vaskuläre Zellen nützlich sein; jedoch sind komplexere Wege oder regulatorische Netzwerke, die durch komplexe Populationen von vaskulären Nachbarzellen oder das Immunsystem beeinflusst werden am besten in einem in Vivo System6,20studiert. Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform für die Regulierung des Transgens Ausdruck in dem Endothel im Rahmen eines intakten Schiffes, mit oder ohne Krankheit zu erforschen. Das in-Vivo -System erlaubt auch Untersuchung der physiologischen und pathologischen zellulären Übersprechen und Identifikation von Beiträgen des Immunsystems zur Regulierung der Gen-Expression-6.
Keimbahn Transgenese (vor allem bei Mäusen) ist ein alternativer Ansatz für die Leitung der Transgene Ausdruck Endothelzellen. Dieser Ansatz bieten lebenslange Transgene Ausdruck mit endothelialen targeting vermittelt durch spezifische Promoter oder regulatorischen Regionen21,22. Aber die Generation von transgenen Mäusen ist zeitaufwändig und teuer, mehrere transgene Linien müssen oft getestet werden, um sicherzustellen, Ausrichtung des Transgens auf die gewünschte Zelle Art und Leistung angemessene Transgene Ausdruck Niveaus, und experimentelle Ergebnisse in murinen Systeme können Belastung abhängig sein. Murine transgene Modelle mit endothelialen gezielt transgene haben viele Vorteile: Es gibt keine Notwendigkeit, auf jedes Versuchstier operieren, um Transgenese zu erreichen, experimentellen Mäuse gezüchtet werden können, mit zahlreichen anderen verfügbaren Transgene Mäuse in um genetische und phänotypische Interaktionen zu testen, und gibt es eine große Auswahl an Antikörpern, die mit murinen Proteinen, Erleichterung der Charakterisierung von Phänotypen zu reagieren. Ausrichtung der Transgene des Endothels über die Keimbahn in der Regel führt jedoch Transgene Ausdruck in das Gefäßsystem,22 macht es schwierig, die Website zu bestimmen, an der das Transgen-Produkt handelt. Dies gilt insbesondere wenn das Transgen Produkt abgesondert wird, weil ein Transgen Produkt sezerniert Endothelzellen in das Gefäßsystem biologischen Aktivität an vielen verschiedenen Standorten innerhalb eines Tieres haben könnte. Obwohl in diesem Manuskript beschriebene Methode Fachwissen und spezialisierte Einrichtungen erfordert, kann es weniger zeitaufwendig und weniger teuer als die Entwicklung einer endothelialen-spezifische transgene mauslinie. Es ermöglicht die Beurteilung der Funktion eines Proteins selektiv in Endothelzellen eines Segments große Arterie, und es erlaubt die Verwendung von der kontralateralen gemeinsame Halsschlagader als gekoppelte Steuerung (Beseitigung systemische Faktoren, die unter experimentellen variieren kann Tiere-zum Beispiel Blutdruck oder Cholesterinspiegel-als unkontrollierte Variablen).
Gentherapie ist ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von Gefäßerkrankungen, insbesondere chronische Erkrankungen, weil eine einzelne Anwendung nachhaltig oder möglicherweise lebenslange Ausdruck einer therapeutischen Gens23bieten kann. Das therapeutische Versprechen der Gentherapie ist in Tiermodellen der somatischen Gentransfer, oft gezielt die Leber24,25, ein relativ leichtes Ziel ist, weil viele Blut übertragbare virale Vektoren Hepatotropic untersucht worden. Jedoch muss um auf Gefäßerkrankungen auswirken, Gentherapie, die gezielt auf die Leber systemische Überexpression von Proteinen erreichen. Dies erfordert in der Regel große Dosen des Vektors, die giftige oder tödliche26sein kann. Darüber hinaus höhere systemische Protein erhöhen das Risiko von Nebenwirkungen, Ziel, die erschweren oder sogar verschleiern Interpretation der experimentellen Ergebnisse könnten. Lokale Gentherapie gezielt Gefäßendothels, wie in diesem Manuskript beschrieben könnte systemischen Nebenwirkungen vermeiden, denn der infundierte Vektor nicht weit über die transduced arteriellen Segment verbreitet ist und lokale vaskuläre Effekte, ohne erzielt werden Änderungen im systemischen Plasmaspiegel von Protein. 27 darüber hinaus ein weit geringer Betrag des Vektors muss eine arterielle Segment transduzieren als erforderlich, um robuste hepatische Transduktion zu erreichen. Transgene Ausdruck aus der Leber wurde berichtet, zu sinken im Laufe der Zeit wahrscheinlich aufgrund der Zellerneuerung, die wiederholter Gabe, wenn hochrangige Transgene Ausdruck soll beibehalten werden. 28 im Gegensatz dazu bietet die niedrige Fluktuationsrate des Endothels stabile Expression für mindestens 48 Wochen in Chow gefütterten Kaninchen und mindestens 24 Wochen bei atherosklerotischen Läsionen des Cholesterin-gefütterten Kaninchen. 1 , 27
Um festzustellen, ob diese Methode des Gentransfers auf gemeinsame Halsschlagader Endothel Kaninchen geeignet ist, sollten die vor- und Nachteile (Tabelle 1) im Zusammenhang mit den spezifischen Forschungsziele betrachtet werden. Vorteile dieser Methode sind unter anderem: fremd-Kaninchen sind bessere Vertreter der menschlichen genetischen Vielfalt als Inzucht Mäuse (wichtig für präklinische Arbeit); Kaninchen, größere Schiffe für einfachere Handhabung und mehr Gewebe für die Analyse bereitzustellen; die Methode kann Endothel gezielt Transgen Ausdruck erreichen sehr viel schneller als Keimbahn endotheliale targeting bei transgenen Mäusen tut; Vektor-Dosis kann leicht zu einer Variable Transgene Ausdruck Modell eingestellt werden; speziell für große Arterie Endothel Prozesse untersucht werden können; und lokale vaskuläre Transgenese ermöglicht dem gegenüberliegenden Carotis im gleichen Tier als ein Steuerelement, systemische Faktoren als unkontrollierte Variablen verwendet werden. Nachteile sind: spezielle Einrichtungen und Fachkenntnisse sind erforderlich; weniger gentechnisch veränderte Hintergründe auf dem Experimentieren gibt es bei Kaninchen als bei Mäusen; und es gibt eine weniger umfangreiche Auswahl von Antikörpern gegen Kaninchen gegen Maus-Proteine (für Immunodetection des Transgens Protein und andere Antigene, die möglicherweise wichtig bei der Interpretation der Versuchsergebnisse).
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der University of Washington Büro Tierschutz und institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) genehmigt, und abgeschlossen in Übereinstimmung und Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien.
Hinweis: Gentransfer in gemeinsamen Halsschlagadern Hase Kaninchen von einem Chirurgen mit Hilfe eines Anästhesisten oder Assistent erfolgt.
(1) Gentransfer auf gemeinsame Halsschlagadern Kaninchen: vor der Operation
- Die Kaninchen zu betäuben. Wiegen Sie die Kaninchen. 30 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Xylazin in eine Spritze zu kombinieren. Injizieren Sie Ketamin/Xylazin intramuskuläre (IM) in den Paraspinous Muskeln, Anästhesie zu induzieren.
- Während des Wartens auf Kaninchen, betäubt werden, bereiten Sie den Vorbereitungsraum und OP-Saal (OR) Tabellen.
- In den Vorbereitungsraum OR: Legen Sie die ophthalmologische Salbe und das Fentanyl-Pflaster in Reichweite der Vorbereitungstisch; Einrichten von Haarschneidemaschinen und ein Vakuum für die Rasur des Kaninchens Hals und Ohr; beiseite stellen eine Prep Alkoholtupfer, 24 x ¾" Katheter, spritzenport und chirurgische Band der intravenösen (IV) in das Kaninchen Ohr Vene zu sichern.
- Im OP: die Überwachungsgeräte einrichten und positionieren Sie die Sonden [Elektrokardiogramm (EKG), Sauerstoffsättigung (SpO2) Temperatur] auf den OP-Tisch; Sauerstoff und Isofluran vorbereiten; Gaze-Streifen an der Gesichtsmaske, befestigen Sie es an das Kaninchen und legen Sie die Maske auf das Kopfende des Tisches zu binden.
Hinweis: Die Gaze-Streifen gebunden auf die Gesichtsmaske sollte 2 Schwänzen von ca. 45 cm haben. - Schalten Sie die Erwärmung Wasser-Decke auf dem OP-Tisch. Positionieren Sie auf Wasser Decke einem gerollten Handtuch zum Nackenstütze und ein dispersives elektrodenplatte (später unter Kaninchen Rücken platziert).
- ODER IV-Pumpe mit 100 mL einer Kochsalzlösung IV-Tasche mit einem 18-19G-Nadel befestigt und Einstellen der Durchflussmenge bis 10 mL/h pro kg eingerichtet.
- 1 mL Lidocain HCl zu kombinieren (2 % Stammlösung) und 1 mL Bupivicaine HCl (0,5 % Stammlösung) in einer Spritze, als eine lokale Schmerzmittel verwendet werden.
- Wenn Kaninchen vollständig betäubt ist, bereiten Sie die Kaninchen für Chirurgie.
Hinweis: Check für den Mangel an ein Pedal Reflex (Prise pro Zehe; suchen Glied Rückzug), Narkose Tiefe zu gewährleisten, und weiterhin das Pedale Reflex während der Operation zu überwachen.- Gelten Sie ophthalmologische Salbe für Augen. Hocker aus dem Kaninchen Rektum durch Drücken mit behandschuhten Fingern am vorderen Unterbauch (über dem Rektum) und beweglichen Fingern auf den Anus zu entfernen. Dadurch wird für die spätere Platzierung eine rektale Temperatursonde.
- Rasieren Sie die vorderen Hals von der sternalen Kerbe an den Rand des Unterkiefers während der Verwendung eines Vakuums, um den Bereich sauber zu halten. Auch rasieren Sie beide Ohren für die IV-Platzierung und die Fentanyl-Pflaster-Anlage und rasieren Sie einen linken hinteren mittleren Zeh für die Pulsoximetrie Sonde zu.
Hinweis: Das Protokoll wird davon ausgegangen, dass der Chirurg das Kaninchen rechts für das gesamte Verfahren. Wenn das OR Setup auf der gegenüberliegenden Seite der Chirurg legt, umkehren Sie Seiten in diesem Schritt die Drähte und IV gegenüber des Chirurgen zu halten. Die Seiten des zukünftigen Schritte sollte auch umgeschaltet werden, je nach Bedarf. - Wischen Sie das linke Ohr mit einem Alkoholtupfer Prep, legen Sie einen 24G-IV-Katheter in die Vene der linken Ohr cap mit den spritzenport und kleben Sie den Katheter/Anschluss an das Kaninchen Ohr zu sichern. Das Kaninchen rechten Ohr ein Fentanyl-Pflaster (25 µg/h) zuweisen.
- Transportieren Sie die Kaninchen in den OP und Rückenlage auf dem OP-Tisch mit einem gerollten Hals Unterstützung Handtuch unter das Kaninchen Hals knapp unterhalb des Kopfes. Erweitern Sie sanft das Kaninchen Hals bis es gerade und ungefähr horizontal ist.
- Haken Sie die Kaninchen bis die Gesichtsmaske mit O2 auf 1 L/min, und starten Sie Isofluran-Verwaltung. Sichern Sie die Maske durch das Einwickeln von der Ends der Gaze-Streifen gebunden an die Maske um den Hals Unterstützung Handtuch unter den Hasen. Passen Sie Isofluran (in der Regel 1-2 % an) nach (basierend auf Herzfrequenz, Atemfrequenz und Pedal Reflex) weiterhin eine ordnungsgemäße Betäubung für den Rest des Verfahrens Bedarf.
- Sicherzustellen Sie, dass die dispersive elektrodenplatte unter das Kaninchen Rücken zentriert ist. Legen Sie die Temperatur und Pulsoximeter Sonden und gelten Sie die EKG-Kabel für das Kaninchen.
- Haken Sie, IV Kochsalzlösung mit dem Katheter Anschluss des Kaninchens ins Ohr: Starten der Salinen Pumpe auf 10 mL/h pro kg.
Hinweis: Nach 1 h, kann die Kochsalzlösung Pumpe auf 5 mL/h pro kg reduziert werden. - Zurückhalten des Kaninchens Vorderbeine durch lose binden sie an den Tisch. Optional, platzieren Sie einen kleinen Kunststoff-Tisch über das Kaninchen, die Kaninchen zu schützen, vom Chirurgen stützte sich auf Kaninchen Brust/Bauch, Brust/Bauchpresse unterworfen.
Hinweis: Der kleine Tisch kann helfen erzwungene Regurgitation des Abdominal-Inhalts zu verhindern. - Spritzen 2 mL vorbereitete Lidocain (2 % bestand) / Bupivacain (0,5 % bestand) (50/50 Mischung) subkutan entlang der geplanten Hals Schnittführung für die lokale Anästhesie.
- Lassen Sie den Assistenten der Operationsstelle mit 3 abwechselnd Peelings von Chlorhexidin und Isopropanol, und dann ein Spray mit Betadine vorzubereiten. Peeling, Kleid und Handschuh, korrekte aseptische Technik nach.
Hinweis: Der Chirurg sollte 2 x chirurgischen Lupen mit der ersten Hälfte der Operation das tragen. Während der Operation Überleben ist es wichtig, die Sterilität des Chirurgen und OP-Feld zu erhalten. Nur der Assistent sollte nicht steriler Gegenstände behandeln, und sterilisierte Materialien aseptisch übergeben, der Chirurg oder auf dem Instrumententisch drapiert gestellt werden müssen. Sterile Handtücher können durch den Chirurgen verwendet werden, um Sterilität zu erhalten und nicht-steriler Ausrüstung wie z. B. dem Mikroskop zu manipulieren.
(2) überleben Chirurgie (Gentransfer)
- Bereiten Sie Instrumente und sterilen Bereich.
- Lassen Sie den Assistenten öffnen der sterilen Tuch-Packung enthält eine Tabelle drapieren, ein Papier-Tuch für das Kaninchen und mehrere Handtücher. Aseptisch übertragen Sie die Elemente für den Chirurgen.
- Drapieren Sie der Instrumententisch. Statt der 6 sterile Handtücher und das Papier drapieren auf dem Tisch drapiert.
- Drapieren Sie das Kaninchen Hals, so dass nur der Operationsstelle ausgesetzt (ca. 4 cm x 10 cm) mit 4 Handtücher. Legen Sie das Papier drapieren über das Kaninchen.
- Lassen Sie den Assistenten öffnen die sterilisierten Instrumententafel und aseptisch auf dem Instrumententisch.
- Lassen Sie den Assistenten öffnen die folgende Ausstattung und aseptisch auf dem Instrumententisch legen oder die hand für den Chirurgen: drei 1-mL-Spritzen (und einer Nadel, wenn die Spritzen mit Nadeln nicht bereits geladen sind), eine 20 mL Spritze, eine Nadel 21G, eine Nadel 19G, 3-0 Polyglycolic Acid (PGA) Naht, 5-0 PGA Naht, 7-0 Polypropylen Naht und zwei 24 G IV-Katheter.
- Sichern Sie das elektrokauter Kabel zu den Kaninchen Faltenwurf mit 7,25" Kantrowitz Zange und dann Drop den Stecker aus der Tabelle zu beenden. Lassen Sie den Assistenten schließen Sie das Kabel an die Elektrochirurgie-Gerät und das Gerät einschalten.
- Füllen Sie eine 20 mL Spritze mit steriler Kochsalzlösung, gezeichnet von einem IV-Beutel oder Fläschchen statt durch den Assistenten. Verwenden Sie diese Kochsalzlösung Bedarf, um exponierte Gewebe feucht zu halten während des Verfahrens.
- Bereiten Sie eine 1 mL Spritze mit 1 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM, zum Waschen der Arterie). Für jede Arteria carotis, die ausgestrahlt wird, werden 0,35 mL verdünnten Virus benötigt. Wenn das gleiche Virus für beide Seiten verwendet wird, bereiten Sie eine 1 mL Spritze mit Virus in DMEM mit einem Volumen von 0,7 mL verdünnt. Wenn verschiedene Seiten verschiedene Viren [z. B. eine "Null" Virus-Steuerelement auf einer Seite] empfangen, bereiten Sie zwei 1 mL Spritzen, jeweils mit 0,35 mL Virus-Lösung. Der Viruskonzentration ist für Helfer-abhängige Adenovirus, 2 x 1011 Viruspartikel (vp) / mL.
Hinweis: Lassen Sie den Assistenten das Virus vorbereiten. Der Operateur zieht DMEM und Virus Suspension in sterile Spritzen. - Schneiden Sie ein Loch in den Faltenwurf. Die Größe des Lochs sollte die gleiche Größe wie der Operationsstelle auf das Kaninchen Hals, die von den Handtüchern im Schritt 2.1.3 umrahmt ist. Klemmen Sie die Ecken des Lochs in der Papier-Faltenwurf, die zugrunde liegenden Handtücher, die mit den Klemmen Handtuch über das Kaninchen Hals drapiert sind.
- Isolieren Sie die gemeinsamen Halsschlagadern.
Hinweis: für diesen Teil sollte 2 x chirurgischen Lupen verwendet werden.- Schneiden Sie die Haut mit einem elektrokauter entlang der Mittellinie Verlängerung ca. 7-9 cm cranially gegenüber den Unterkiefer und die Haut offen mit Handtuch Klemmen.
- Machen Sie einen kurzen seitlichen Schnitt durch die Faszie mit dem elektrokauter am kaudalen Ende. Legen Sie dann die große Schere in den Schnitt und unverblümt sezieren Sie die Faszie entlang der gesamten Mittellinie zu. Schneiden Sie die sezierte Faszie hinunter die Mittellinie mit elektrokauter.
- Sezieren Sie mit einer kleinen Schere sezierenden zwischen den v-förmigen Muskeln (Sternocephalic Muskel) und der Sternohyoid Muskel über die Luftröhre, um den gemeinsamen Halsschlagadern, beginnend auf der rechten Seite verfügbar zu machen.
- Frei von umgebenden Gewebe, teilen alle Zweige, vom Halsansatz kaudal bis zur Kreuzung des pharyngealen Nervus cranially rechts gemeinsame Halsschlagader zu sezieren. Verwendung chirurgischen Silikon Schleifen um Hilfe bei der Retraktion der Arterie während der Präparation.
Hinweis: Darauf sollte geachtet werden, um nicht zu stören, den Nervus Vagus, der parallel zu dem gemeinsamen Carotis verläuft, oder die kleinere Nerven, die die gemeinsame Halsschlagader überqueren. - Verbinden Sie jede große Äste kommen aus der gemeinsame Halsschlagader (1-2 pro Seite) mit 5: 0 Seide Nähte vor dem Schneiden des Zweiges nach distal um ein 4-5 cm Segment der Karotiden zu befreien. Schneiden Sie aufgespaltenen Äste 1-2 mm entfernt von der Krawatte, so dass die Krawatte nicht Weg rutscht.
- Wiederholen Sie die Präparation auf der linken Seite (Steps 2.2.3 - 2.2.5).
- Die Infusion von Vektoren in gemeinsamen Halsschlagadern.
Hinweis: Ein Operationsmikroskop (16 X) wird verwendet, für die Durchführung von arteriotomie, Infusion Vektor/Kontroll-Lösung und arteriotomie Reparatur Bedarf.- Lassen Sie den Assistenten entfernt der Chirurg die chirurgischen Lupen und bewegen Sie das Operationsmikroskop in Stellung. Drapieren Sie ein steriles Tuch über das Mikroskop zur Bearbeitung des Mikroskops zu ermöglichen, ohne Kontamination der sterilen Bereich.
- Heparin [150 internationalen Einheiten (IE) schnitzelfleisch] in der IV-Katheter zu injizieren und mit 10 mL Kochsalzlösung spülen.
- Rückkehr in die isolierte rechts gemeinsame Karotis, legte zwei Seidenkrawatten um den mittleren Teil des Segments mobilisiert Karotis und einen einzigen Overhand Knoten auf jeder - ohne festziehen.
- Biegen Sie die 19G Nadel oberhalb der Abschrägung auf ca. 80° mit dem großen Nadel-Treiber (nicht knicken die Fase; ( Abbildung 1).
- Klemmen Sie die Arterie an beiden Enden des Segments isoliert mit vaskulären Clips, Platzierung des kranialen Clips Arterie füllen zuerst zu und setzen dann den kaudalen Clip.
- Durchstechen Sie die gemeinsame Halsschlagader mit der gebogenen 19G Nadel nur kranialen kaudalen vaskulären Clip, tolle Betreuung, nicht die Rück- oder Seitenwand Wände durchbohren. Voraus die Nadelspitze in das Lumen und entzieht sie zweimal, um sicherzustellen, dass arteriotomie komplett durchquert die Arterienwand. Dann vorsichtig zurückziehen der Nadelöhrs.
Hinweise: Es ist wichtig, eine arteriotomie schaffen, dringt in alle Schichten der Arterienwand sauber und nicht sezieren die Arterienwand (indem man Axial durch die Adventitia und Medien). Um dies zu erreichen, sollte der Halsschlagader mit der Spitze der Nadel positioniert so nah wie möglich in einem 90° Winkel gegen die Arterienwand (Abbildung 1) punktiert werden. Carotis Punktion in einem 90°-Winkel wird unterstützt durch greifen der Arterie durch die Adventitia mit feinen Zangen und leichtes Anheben der Arterie Oberfläche drücken Sie die Spitze der Nadel nur kaudalen auf den Aufzug Punkt. Dieses Manöver verringert auch das Risiko des Schlagens der Rückwand (Abbildung 1). - Nicht entfalten Sie und Bündel-Up mehrere Gaze-Pads in einem Nest auf, um die Spritze verwendet für die Infusionen legen. Legen Sie das Nest auf dem Kaninchen Brust kaudalen, der Schnitt.
- Die Spritze, die enthält einen IV-Katheter aufgesetzt nur DMEM (nicht zu fest) und den Katheter ~ 4 mm von der Spitze biegen, so dass die Biegung bei ca. 75 ° c hält, nachdem es freigegeben wird.
- IV-Katheter in die Arterie bis zu dem Punkt der Kurve einfügen und alles Blut aus der Arterie mit DMEM Auswaschen (~ 0,25 mL x 2). Füllen Sie für jedes waschen die Arterie mit DMEM, und dann entfernen Sie verbleibende DMEM aus dem Gefäß Lumen durch leichtes Drücken auf die Arterie mit einem behandschuhten Finger, beginnend am kranialen vaskulären Clip nur kaudalen. Und gleichzeitig sanften Druck, schieben Sie die Finger von cranial nach kaudalen. Der luminalen Inhalt werden über die arteriotomie auswaschen.
- Halten Sie den Katheter in die Arterie und den Austausch der DMEM-Spritze für die Spritze mit Virus-Lösung. Stellen Sie sicher, dass kein Lufteintritt in den Katheter.
- Schieben Sie Seidenkrawatten, die Arterie, so dass sie die Arterie an der Position der Katheterspitze umgeben, aber nicht festziehen.
- Die Infusion 0,03 mL der Lösung Virus schieben Sie die restlichen DMEM aus dem Katheter und dann entleeren der Arterie. Reduzieren Sie, indem Sie wieder alle Flüssigkeit aus dem Lumen mit einem Finger, cranial, Caudale (wie in Schritt 2.3.9).
- Ziehen Sie die zwei Riegel um Katheterspitze, das Lumen zu versiegeln. Die Virenschutzlösung die Infusion (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL für Adenoviren) durch den Spritzenkolben sanft drücken, bis die Arterie zu physiologischen Kaliber aufgebläht ist.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Arterie zu physiologischen Kaliber erweitert und während der Virus Infusion aufgetrieben bleibt. Ist dies nicht der Fall, wird der Grad der Gentransfer wird deutlich sinken. - Legen Sie sanft die Spritze auf das Nest der Gaze.
- Platz 7: 0 Polypropylen Naht in die gemeinsame Halsschlagader Adventitia des kranialen vaskuläre Clips nur kaudalen anlässlich die kraniale Begrenzung des Gens Transduktion
- Nachdem die Virus-haltige Lösung in das Lumen der Arterie für 20 min wurde, entfernen Sie die Virus-haltigen Spritze und ersetzen Sie ihn durch eine leere Spritze. Aspirieren Sie die Virus-haltige Lösung sanft, bis das Schiff bricht zusammen und ziehen Sie die Spritze. Schneiden Sie aus oder rückgängig machen Sie die Seidenkrawatten und entfernen Sie den Katheter vorsichtig.
Hinweis: Die Bande Schneiden sehr kurz Aids herausnehmen. Entfernen Sie den Katheter vorsichtig um zu vermeiden, was zu Schäden an der Halsschlagader Endothel. - Mit dem Operationsmikroskop, schließen Sie die arteriotomie mit 7: 0 Polypropylen mit einem X-Muster (Abbildung 2).
- Machen Sie einen ersten Durchgang rechts unten auf die arteriotomie betreten und verlassen des Schiffes an der unteren linken Ecke. Dann überqueren Sie die Öffnung und machen Sie einen zweiten Durchlauf von oben rechts zu Links oben.
- Spülen Sie vor der Naht Verzurren die Arterie durch ganz kurz Loslassen des kranialen vaskuläre Clips. Blut wird aus der arteriotomie fließen, wenn der Clip freigegeben wird, Entfernen von Luft und passives Virus aus dem Lumen.
- Ziehen Sie den Faden vorsichtig schließen die arteriotomie und eine Naht mit 2 Quadrat Knoten zu binden.
Hinweis: Die Naht zu eng ziehen bewirkt Wölbung des Gewebes, die Strömung stören wird, erhöhen das Thrombose-Risiko und Änderung von Strömung, die eine wichtige unkontrollierte Variable in Krankheitsmodellen sein kann.
- Lassen Sie den kranialen vaskulären Clip, und dann der kaudalen vaskulären Clip mit leichtem Druck mit Gaze, um Blutung zu stoppen. Wenn die Blutung anhält, weiter Druck für 1-2 min. Wenn die arteriotomie ordnungsgemäß geschlossen wurde, stoppt die Blutung immer innerhalb dieses Zeitrahmens.
- Lassen Sie den Assistenten Buprenorphin [0,02 mg/kg; subkutane (SQ)] an zu injizieren, um diese Zeit zu postoperativen Analgesie bis Fentanyl-Plasmaspiegel therapeutische geworden.
Hinweis: Eine zweite Buprenorphin Injektion (0,02 mg/kg; SQ) kann nach der ersten Injektion 6 h erforderlich sein, Analgesie beizubehalten, bis Fentanyl-Plasmaspiegel therapeutische geworden. - Wiederholen Sie Virus-Infusion-Protokoll auf linken Seite folgende Schritte 2.3.2 - 2.3.19.
- Wundverschluss
- Verwenden Sie eine 5-0-PGA-Naht die Mittellinie Faszie mit einer kontinuierlichen Naht schließen.
- Schließen Sie mit einer 3: 0-PGA-Naht die Haut mit einem intradermale Muster mit einem vergrabenen Knoten an beiden Enden.
- Postoperative Erholung und Aufräumarbeiten.
Hinweis: Die Kaninchen müssen ständig für richtige Sauerstoffversorgung und die Körpertemperatur überwacht werden während der Genesung von Anästhesie. Erholung sollte in einer ruhigen Umgebung stattfinden.- Isofluran und Sauerstoff Strom schalten Sie aus und entfernen Sie die Gesichtsmaske von Kaninchen.
- Haken Sie Infusionen aber verlassen Sie den IV-Hafen im Ort für Notfälle IV.
- Nehmen Sie die Kaninchen auf die Recovery-Bereich und legen auf die Seite in einem Käfig mit einer wärmenden Wasser Decke eingeschaltet (oder optional ein Bair Hugger-Heizung).
- Geben Sie O2 Maske, bis der SpO2 stabil ist.
- Lassen Sie die Kaninchen erholen Sie sich in einem Käfig, drehen Sie ihn auf die andere Seite alle 15 min, bis die Kaninchen auf den Hinterbeinen sitzen und bewegen können.
- Wenn die Kaninchen mobil ist, entfernen Sie die IV aus den Kopf vor der Rückkehr in den Käfig.
Hinweis: Nicht die Kaninchen an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig aus der Narkose erholt ist.
- Entsorgen Sie alles, was hatte Kontakt mit dem Vektor oder im operativen Bereich war, folgende geeignete Biohazard und Kleie Abfälle Protokolle.
(3) Gentransfer auf gemeinsame Halsschlagadern Kaninchen: Post-Operative Betreuung
- Bewerten Sie das Kaninchen Gesamtzustand täglich nach Chirurgie, Überprüfung für die Wundheilung, Nachweis der Infektion, Appetit, Atmung und Anzeichen von Schmerzen.
- Überprüfen Sie das Kaninchen Ohr Position (Ohren nach unten können ein Zeichen von Schmerzen oder Stress, sein, besonders wenn Sie mit einem unordentlich aussehen verbunden). Überprüfen Sie, dass die Kaninchen Mobil und aktiv bleibt. Überprüfen Sie die Kaninchen für normale Atmung ohne Stridor. Überprüfen Sie, dass die Wunde sauber, trocken und intakt ist. Überprüfen Sie die Kaninchen für eine normale Körpertemperatur. Veterinärdienste zu konsultieren, wenn das Kaninchen nicht mobil und aktiv, mit normalen Körpertemperatur, ein sauberes Aussehen, eine saubere Wunde und normale Atmung ist.
- Normale Nahrungsaufnahme und Nachweis der frischen Stuhl und Urin kontrollieren.
Hinweis: Nahrungsaufnahme kann nach der Operation verringert werden, aber sollte innerhalb von 2 Tagen wieder zur Normalität zurückkehren; Stellen Sie Ergänzungsfuttermittel Bedarf zur Verfügung.
- Ziehen Sie das Fentanyl-Pflaster am 3. postoperativen Tag.
Hinweis: Buprenorphin kann verabreicht werden, bei Bedarf für postoperative Schmerzen, die nicht durch das Fentanyl-Pflaster verwaltet wird, oder für den Fall, dass das Fentanyl-Pflaster früh entfernt ist.
4. Terminal ernten Chirurgie: vor der Operation
- Die Kaninchen zu betäuben. Siehe Abschnitt 1.3 und 1.3.5 zur Erreichung und Aufrechterhaltung der Narkose.
- Wiegen Sie die Kaninchen. 30 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Xylazin in eine Spritze zu kombinieren. Injizieren Sie Ketamin/Xylazin-ich bin in der Paraspinous Muskulatur, Anästhesie zu induzieren.
- Bereiten Sie den Vorbereitungsraum oder Tabellen während des Wartens auf das Kaninchen, betäubt werden.
- In den Vorbereitungsraum OR: setup Haarschneidemaschinen und ein Vakuum für die Rasur des Kaninchens Hals und Ohr.
- Im OP-Saal: setup-Überwachungsgeräte und positionieren Sie die Sonden (SpO2, Temperatur) auf den OP-Tisch; Sauerstoff und Isofluran vorbereiten; Binden Sie einen Gaze-Streifen an der Gesichtsmaske, befestigen Sie es an das Kaninchen und legen Sie die Maske auf das Kopfende des Tisches.
Hinweis: Die Gaze-Streifen gebunden auf die Gesichtsmaske sollte 2 Schwänzen von ca. 45 cm haben. - Schalten Sie ein wärmendes Wasser Decke auf den OP-Tisch. Positionieren Sie auf dem Wasser-Decke einem gerollten Handtuch zum Nackenstütze und ein dispersives elektrodenplatte (später unter Kaninchen Rücken platziert).
- 1 mL Lidocain HCl zu kombinieren (2 % bestand) und 1 mL Bupivicaine HCl (0,5 % bestand) (50/50 Mischung) in einer Spritze als ein lokales Schmerzmittel.
- Wenn die Kaninchen vollständig betäubt ist, bereiten Sie die Kaninchen für Chirurgie.
- Bauen Sie Stuhl aus dem Enddarm, wie im 1.3.1, um für die spätere Platzierung von einem Temperaturfühler ermöglichen.
- Rasieren Sie die Kaninchen von der sternalen Kerbe auf den Winkel des Unterkiefers während der Verwendung eines Vakuums, um den Bereich sauber zu halten. Auch rasieren der linken hinteren mittleren Zeh für die Pulsoximetrie Sonde.
Hinweis: Das Protokoll wird davon ausgegangen, dass der Chirurg auf das Kaninchen rechts werden. Wenn das Setup OR Chirurg auf der gegenüberliegenden Seite findet, umkehren Sie Seiten in diesem Schritt die Drähte gegenüber des Chirurgen zu halten. Die Seiten des zukünftigen Schritte sollte auch umgeschaltet werden, je nach Bedarf. - Transportieren Sie die Kaninchen in den OP und Rückenlage auf dem OP-Tisch mit einem gerollten Hals Unterstützung Handtuch unter das Kaninchen Hals knapp unterhalb des Kopfes. Erweitern Sie sanft das Kaninchen Hals bis es gerade und ungefähr horizontal ist.
- Haken Sie die Kaninchen bis zur Gesichtsmaske mit O2 auf 1 L/min, und starten Sie Isofluran-Verwaltung. Sichern Sie die Maske durch das Einwickeln von der Ends der Gaze-Streifen gebunden an die Maske um den Hals Unterstützung Handtuch unter den Hasen. Passen Sie Isofluran (in der Regel 1-2 % an) nach Bedarf geeignete Anästhesie für den Rest des Verfahrens weiterhin.
- Sicherstellen Sie, dass die dispersive elektrodenplatte unter Hasenpfote hin zentriert ist. Temperatur und Pulsoximeter Sonden zu platzieren.
- Zurückhalten des Kaninchens Vorderbeine durch lose binden sie an den Tisch.
Hinweis: Platzieren Sie optional ein kleiner Plastiktisch über Kaninchen, die Kaninchen zu schützen, vom Chirurgen stützte sich auf Kaninchen Brust/Bauch, Brust/Bauchpresse unterworfen. Das Ziel hier ist, erzwungene Regurgitation des Abdominal-Inhalts zu verhindern. - Spritzen 2 mL Lidocain (2 % Stammlösung) / Bupivacain (0,5 % Stammlösung) (50/50 mix; ab Schritt 2.4) subkutan entlang der geplanten Hals Schnittführung für die lokale Anästhesie.
- Besprühen Sie der Operationsstelle mit Betadine. Setzen Sie auf saubere Handschuhe für chirurgische Verfahren.
5. terminal Chirurgie (Schiff Ernte)
- Bereiten Sie Instrumente und OP-Feld.
- Öffnen Sie ein sauberes Tuch-Pack enthält einen Tisch drapiert und ein Papier Tuch für das Kaninchen. Drapieren Sie der Instrumententisch.
- Öffnen Sie die Instrumententafel, legen Sie auf dem Instrumententisch und arrangieren Sie Instrumente zu. Legen Sie die folgende Geräte auf dem Instrumententisch: eine 20 mL Spritze und eine Nadel 21G.
- Befestigen Sie elektrokauter Leitung zu den Kaninchen Faltenwurf mit 7,25" Kantrowitz Zange. Den Stecker an der Elektrochirurgie-Gerät anschließen und einschalten.
- Füllen Sie eine 20 mL Spritze mit steriler Kochsalzlösung. Verwenden Sie diese Kochsalzlösung Bedarf, um die exponierte Gewebe feucht zu halten während des Verfahrens.
- Legen Sie das Papier Tuch über das Kaninchen und schneiden Sie ein Loch in den Faltenwurf über der Operationsstelle am Hals des Kaninchens. Klemmen Sie die Ecken des Lochs im Ort, um das Kaninchen Haut mit dem Handtuch Klemmen.
- Gemeinsamen Halsschlagadern zu isolieren.
Hinweis: für diesen Teil sollte 2 x chirurgischen Lupen verwendet werden.- Schneiden Sie die Haut mit einem elektrokauter entlang der Mittellinie Verlängerung ca. 7-9 cm cranially in Richtung der Unterkiefer und Klemme Haut offen mit Handtuch Klemmen.
Hinweis: Wenn die Ernte ist nur ein paar Tage nach voroperationen, elektrokauter ist nicht erforderlich. Schneiden Sie die Fäden und ziehen Sie vorsichtig öffnen die Inzision von früheren Operationen. - Machen Sie einen kurzen seitlichen Schnitt durch die Faszie mit einem elektrokauter am kaudalen Ende. Legen Sie große Schere in den Schnitt und sezieren Sie die Faszie entlang der gesamten Mittellinie unverblümt zu. Schneiden Sie die sezierte Faszie ab der Mittellinie mit dem elektrokauter.
- Sezieren Sie mit einer kleinen Schere sezierenden zwischen den v-förmigen Muskeln (Sternocephalic Muskel) und der Sternohyoid Muskel über die Luftröhre, um den gemeinsamen Halsschlagadern, beginnend auf der rechten Seite zu isolieren.
- Die richtige Arterie frei von umgebenden Gewebe vom Halsansatz kaudal bis zur Kreuzung des pharyngealen Nervus cranially zu sezieren. Verwendung chirurgischen Silikon Schleifen um Hilfe bei der Retraktion der Arterie während der Präparation.
- Wiederholen Sie die Präparation auf der linken Seite (Steps 5.2.3 - 5.2.4).
- Verbinden Sie mit einer 3: 0 Seide Naht die gemeinsame Halsschlagader cranial auf das Segment, das durchdrungen war der Vektor (Einsatz adventitial Naht bei der ersten Operation Auffinden der kraniale Ausmaß der Vektor Infusion gelegt. Dann verbinden Sie um die reparierten arteriotomie kaudalen Carotis.
- Verbrauchsteuern Sie die Halsschlagader Segment zwischen den grundsätzlich, und spülen Sie das Lumen mit Kochsalzlösung. Trim entfernt überschüssiges adventitial Gewebe aus dem Gefäß und schneiden die Karotis-Segment in kleinere Stücke für die verschiedenen Endpunkt Analysen (Histologie, DNA, Ribonukleinsäure (RNA), Protein, explant Kultur, etc..).
- Spritzen Sie 1 mL Beuthanasia IV, einzuschläfern, und bestätigen Sie Euthanasie des Kaninchens zu.
- Schneiden Sie die Haut mit einem elektrokauter entlang der Mittellinie Verlängerung ca. 7-9 cm cranially in Richtung der Unterkiefer und Klemme Haut offen mit Handtuch Klemmen.
- Entsorgen Sie alles, was hatte Kontakt mit Vektor oder im operativen Bereich war, folgende geeignete Biohazard und Kleie Abfälle Protokolle.
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Representative Results
Zur Umsetzung dieser Methode vertrauensvoll sind Vorversuchen notwendig, um festzustellen, ob der Betreiber effiziente und reproduzierbare Gentransfer mit Transgene Ausdruck vor allem in der luminalen endothelial Zellen erreicht. Nach unserer Erfahrung ist dies am einfachsten anhand eines Vektors, das β-Galaktosidase ausdrückt. 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) Färbung der gemeinsame Halsschlagader Segmente entfernt 3 Tage nach Vektor Infusion sowie Messung der β-Galaktosidase mRNA (Messenger RNA) mit quantitativen reversen Transkription Polymerase chain Reaktion (qRT-PCR) wird zeigen, Effizienz, Reproduzierbarkeit und Lage der transduced Zellen. Für Experimente, die untersuchen die Auswirkungen der Transgene Ausdruck oder die Aktivität der GUS wirkenden transkriptionelle Elemente messen, messen wir in der Regel Transgen mRNA als einen ersten Hinweis auf Ebene und Reproduzierbarkeit der Gentransfer.
Ein neuer Betreiber in unserem Labor gesucht, können mit dieser Methode zu etablieren, indem transducing Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern mit einem adenoviralen Vektor (2 x 1011 vp/mL) mit dem Ausdruck einer β-Galaktosidase Transgen, angetrieben von einem Cytomegalovirus (CMV) Promotor. Arterien ausgestrahlt wurden 3 Tage später geerntet und quer in Segmente geschnitten wurden. Einzelnen Segmente wurden dann entweder aufgeschnitten Axial oder als intakt Ringe. Alle Segmente waren X-gal in Mikrozentrifugenröhrchen gebeizt. Segmente, die Axial aufgeschnitten worden waren wurden auf einer horizontalen Fläche und der luminalen Oberfläche maximal ausgesetzt, mit Hilfe der Pins nach Bedarf um zu verhindern, dass das Segment Eisstockschießen platziert. En Face Bilder der luminalen Oberflächen zeigten robuste endotheliale Färbung mit X-gal (Abbildungen 3A und 3 b). Axiale Bilder der luminalen Oberflächen des intakten Karotis Ringe zeigte X-gal-Färbung nur auf der luminalen Oberfläche (Abbildungen 3 und 3D). Die Segmente, die Axial eröffnet worden waren zu Paraffin verarbeitet, geschnitten und Counter mit Hämatoxylin und Eosin oder nuklearen schnell rot gefärbt. Bilder zeigen X-gal Färbung in erster Linie in das Endothel, zwar gibt es eine kleine Menge der Färbung in der adventitial Schicht (Zahlen 3E und 3F). Transduktion von adventitial Zellen kann durch Leckage des Vektors durch die arteriotomie Site oder durch Leckage über kleine Zweige proximal zu den Standorten der Seite Zweig Ligatur auftreten. 29
In einem separaten Experiment versucht ein neuer Betreiber, Leistungsfähigkeit erreichen reproduzierbare Ebenen des Transgens Ausdrucks, als Auftakt für Experimente zur Untersuchung von biologischer Aktivitäten der Transgene herzustellen. Kaninchen, die gemeinsame Halsschlagadern wurden mit Helfer-abhängige Adenovirus (2 x 1011 vp/mL) enthält entweder eine Apo A ausgestrahlt-ich (HDAdApoAI) oder IL-10 (HDAdIL10) Transgen, beide unter Kontrolle eines CMV-Promotors. Arterien ausgestrahlt wurden geerntet 3 Tage nach Transduktion und quer in Segmente geschnitten. RNA wurde extrahiert aus dem Schiff Segmente und Apo A-I und IL-10 mRNA Ausdrücke wurden durch qRT-PCR quantifiziert, mit Normierung auf Glyceraldehyde-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) mRNA in der gleichen extrahiert (Abbildung 4). In den Arterien HDAdIL10 ausgestrahlt, hatte nur 1 von 6 Arterien eine sehr niedrig, aber nachweisbar Apo A-ich mRNA Signal. Ausdruck der Apo A bedeuten-ich mRNA in den Gefäßen mit HDAdApoAI als in Gefäßen mit HDAdIL10 ausgestrahlt ausgestrahlt 700-fold größer war. Niedrige Konzentrationen von endogenen IL-10 mRNA erkannt wurden, in HDAdApoAI ausgestrahlt Arterien, mit Mittelwert Ausdruck 6-fold in HDAdIL10 ausgestrahlt Arterien erhöht. Der Hinweis gibt es beträchtliche Intra - und inter - artery Variabilität in Transduktion Effizienz und Transgene Ausdruck, wie in den Abbildungen 3 und 4, jeweils dargestellt. Wir finden diese Variabilität auch mit erfahrenem Personal.
Abbildung 1 . Arteriotomie in gemeinsame Halsschlagader. Feinere Zangen werden verwendet, um die Halsschlagader Adventitia fassen und nach oben Traktion auf die Arterie anwenden. Dieses Manöver erweitert das Gefäß Lumen und erzeugt eine vertikale Oberfläche, in die die gebogen 19G Nadel eingeführt wird, damit Minimierung des Risikos der Durchbohrung der hinteren Wand der Arterie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Schließung des gemeinsamen Halsschlagader arteriotomie. Die arteriotomie ist mit einer 7-0 Polypropylen Naht, mit einer X-Muster verschlossen. Im ersten Durchgang der Nadel und Faden das Lumen der Arterie am unteren rechten Ecke des arteriotomie (Standort 1) betritt und verlässt das Lumen unten links (Seite 2). Nadel und Faden dann überqueren Sie die arteriotomie und geben das Lumen rechts oben (Seite 3). Die Nadel wird dann das Lumen oben links (Seite 4) beendet. Sanfte Traktion auf beide Enden des Nahtmaterials schließt die arteriotomie. Die Fadenenden (Ausstieg aus der Seite 1 und Seite 4) sind mit 2 Quadrat Knoten gebunden. Graue Kreise stellen Standorte der Nähte durch die Gefäßwand. Durchgezogenen blauen Linien zeigen Bereiche, wo die Naht außerhalb der Gefäßwand. Gepunktete blauen Linien zeigen Bereiche, wo die Naht in das Lumen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Effiziente endotheliale Transgene Ausdruck. Gemeinsamen Halsschlagadern Kaninchen wurden mit einem adenoviralen Vektor mit dem Ausdruck einer β-Galaktosidase Transgen und geernteten 3 Tage später ausgestrahlt. Ausgestrahlt Arterie Segmente waren X-gal gebeizt als intakt Ringe oder nach dem Öffnen mit einem axialen Schnitt. (A-B) De Gesichtsbilder der luminalen Oberflächen der Halsschlagader Ringe, die Axial aufgeschnitten wurden. (C-D) Axiale Ansichten in den luminalen Raum des intakten Karotis Ringe. (E-F) X-gal gebeizt, Paraffin-eingebetteten Karotis Segmente geschnitten und Counter mit (E) Hämatoxylin und Eosin oder (F) nukleare schnell rot gefärbt waren. Maßstabsleiste = 100 µm. Ich = Intima; M = Medien; und eine Adventitia =. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Quantifizierung des Transgens mRNA Ausdruck. Gemeinsamen Halsschlagadern Kaninchen wurden ausgestrahlt mit Helfer-abhängige Adenovirus auszudrücken entweder Apo A-I (HDAdApoAI) oder IL-10 (HDAdIL10) unter Kontrolle eines CMV-Promotors. Arterien wurden 3 Tage später geerntet. mRNA Expression von (A) Apo A-I und IL-10 (B) wurden durch qRT-PCR quantifiziert, normiert auf GAPDH mRNA in der gleichen Ader und ausgedrückt als willkürliche Einheiten (AE). Balken zeigt Mittelwert; P -Wert liegt zwischen Rang-Sum-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Vorteile | Nachteile | |
| Im Vergleich zu Nager-Modelle | Primaten phylogenetisch näher | Teurer zu kaufen und zu Haus |
| Größere genetische Vielfalt, Lockerung Übersetzung klinischen | Schwieriger zu züchten und zu handhaben | |
| Größere Schiffe können leichter chirurgische Manipulation und bietet mehr Gewebe für die Quantitative Analyse | Weitergehende Vorschriften | |
| Ermöglicht den Einsatz von endovaskuläre Prothesen für Menschen konzipiert | Weniger gentechnisch veränderte Hintergründe | |
| Weniger umfangreiche Auswahl an Antikörpern gegen Kaninchen Proteine | ||
| Im Vergleich zu größeren Tiermodellen | Relativ kostengünstig zu erwerben und Haus | Möglicherweise weniger klinisch relevanter als andere große Tiermodelle für einige Gefäßerkrankungen |
| Einfacher zu züchten und zu handhaben | ||
| Im Vergleich zur Keimbahn Transgenese | Transgen nur in großen Arterie ausgedrückt; Einfluss des Transgens speziell am Standort von Interesse kann ermittelt werden | Anwendung der Methode auf Zellen außer Endothel ist schwierig |
| Kontralateralen a. carotis können als gekoppelte Steuerung; eliminiert systemischen Parameter (zB., Blutdruck, Cholesterinspiegel) als unkontrollierte Variablen | OP-Saal und chirurgischem Know-how erforderlich; Zentrale Einrichtungen wahrscheinlich nicht verfügbar | |
| Höheren Durchsatz in grosses Gefäss Endothelium zu Testzwecken DNA regulatorischen Sequence-Aktivität | In den meisten vaskulären Betten kann nicht Transgen ausgedrückt werden | |
| Möglicherweise schneller und kostengünstiger | ||
| Systemischen Exposition gegenüber transgenen Proteinen unwahrscheinlich – Ziel Effekte minimiert | ||
| Im Vergleich zu systemischen Gentherapie Ansätzen (z.B.. Leber Transduktion über periphere Vene Injektion) |
Mehr-Stall Transgene Ausdruck als systemische (Leber) Gentherapie | Vektor-Lieferung erfordert chirurgische intervention |
| Transgen ausgedrückt in der Arterienwand, so dass lokale Übermittlung mit hohem Maß an transgenen Proteinen | OP-Saal und chirurgischem Know-how erforderlich | |
| Systemischen Exposition gegenüber transgenen Proteinen unwahrscheinlich – Ziel Effekte minimiert | Behandlung beschränkt auf Arterien, die speziell für die Intervention ausgerichtet sind; behandelt nicht systemische Faktoren (zB., Lipide) | |
| Kontralateralen a. carotis können als gekoppelte Steuerung; systemischen Parameter (z. B. Blutdruck, Cholesterinspiegel) eliminiert als unkontrollierte Variablen | ||
| Weit niedrigeren Vektor-Dosis erforderlich |
Tabelle 1. Vor- und Nachteile der Kaninchen gemeinsame Halsschlagader endotheliale selektive gen Übertragung Modell.
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Discussion
Bestimmte Aspekte der Operationstechnik verdienen besondere Aufmerksamkeit. Volle Belichtung und Mobilisierung der gemeinsame Halsschlagader über sorgfältige Dissektion wird gen-Transfer und arteriotomie Reparatur zu erleichtern. Allerdings sollten während der Dissektion, direkte Manipulation der Halsschlagader minimiert werden, um Vasospasmus zu verhindern. Darüber hinaus eine Blutung angrenzend an die Arterie angehalten werden sollte, durch leichte Druckmassage mit Gaze und extravasierten Blut bereinigt werden sollte sofort durch die Fläche mit normalen Kochsalzlösung spülen. Es ist auch wichtig zur Vermeidung von Schäden den Nervus Vagus, der parallel zu der gemeinsamen Halsschlagader läuft. Trimmen der Adventitia im Bereich der geplanten arteriotomie hilft dem Bediener, sauber und funktionell arteriotomie durchzuführen und die arteriotomie reparieren. Schließlich müssen zweigt die gemeinsame Halsschlagader identifiziert und sicher ligiert um Austreten des Vektors aus dem Karotis Lumen zu vermeiden.
Es gibt auch kritische Aspekte des Vektor-Infusion und arteriotomie Reparatur. Während der Infusion Vektor ist es wichtig, die gemeinsame Halsschlagader, physiologischen oder etwas größere Kaliber, effizienten Transduktion zu erreichen ausdehnen. Bei der Reparatur der arteriotomie sollte die Naht dringen in die Gefäßwand so nah wie möglich an den Rändern des arteriotomie, und sollten sauber eingeben und beenden das Lumen anstatt Axial durch die Gefäßwand passieren. Wenn nur die äußeren Schichten der Gefäßwand zusammen gezogen sind, weil die Naht Axial durch die Gefäßwand geht, anstatt radial durch die Wand und Eintritt in das Lumen, eine Lücke in der Intima bleibt und sich das Risiko einer Thrombose erhöht. Die Naht Einbrüche zu weit auseinander sind, ob die Naht stark angezogen ist, wenn Sie gebunden, werden Gewebe Falten am arteriotomie Standort erstellt. Diese Falten stören normalen laminar Blutfluss, auch Thrombose-Risiko erhöht. Konsequente Fließverhalten ist wichtig für Experimente in Tiermodellen der Krankheiten (zB., Arteriosklerose) weil veränderte Strömung dazu, die Krankheit Prozess30 beitragen kann.
Neue Betreiber begegnen oft thrombosierten Arterien bei der Ernte. Luminalen Thrombose ist eine verheerende Komplikation, die Arterie als eine experimentelle Probe unbrauchbar. Zur Vermeidung von Thrombosen verabreichen wir routinemäßig IV Heparin vor Gentransfer. Thrombose ist auch durch sorgfältige Schließung der arteriotomie verhindert, wie oben beschrieben. Die Heparin-Dosis gesteigert werden, um Thrombose zu verhindern, oder Aspirin könnte nach der Operation gegeben werden. Jedoch eine höhere Dosis von Heparin würde auch das Potenzial für Blutungen Komplikationen erhöhen, und Aspirin könnte experimentellen Ende Punkte stören, vor allem wenn Entzündungen untersucht wird. Daher empfiehlt es sich, sich auf verbesserte Operationstechnik als ein Mittel zur Verhinderung von Thrombosen.
Wenn zu heftig bearbeitet, können Halsschlagadern Krampf, unterziehen, die auch zur Thrombose beitragen könnte, durch eine Verringerung der Strömung. Wenn Vasospasmus angetroffen wird, kann es durch die Anwendung von topischen Papaverine entlastet werden. Wenn Schiff Ernten für mehr als 2 bis 3 Tage nach Transduktion geplant sind und Thrombose ein Anliegen ist, kann Transkutane Ultraschall verwendet werden, nicht-invasiv Schiff Durchgängigkeit einzuschätzen. Entdeckung der thrombosierten Arterien führen zu Sterbehilfe um Wohnkosten sparen. Zusätzliche Tiere können auch prompt, eingeschrieben sein, um Versuchsgruppen zu füllen. Peri und post intervention Sterblichkeit verbunden mit dieser Methode sollte < 1 % (IE., unterscheidet sich nicht von Sterblichkeit verbunden mit anderen Operationen an gesunden Kaninchen)31.
Nach ein Operator wird komfortabel mit den technischen Aspekten des chirurgischen Protokolls, die Fähigkeit, effiziente Gentransfer in das Endothel muss überprüft werden, mit Ansätzen auf repräsentative Ergebnisse im Abschnitt oben beschrieben durchführen. Bei Problemen mit der Erreichung reproduzierbare Gentransfer dürfte der Täter in einem der beiden Bereiche. Nachdem das Schiff isoliert ist und das Blut wird aus dem Lumen gewaschen, ist es wichtig, die DMEM Waschpuffer zu entfernen, so dass die Lösung infundiert Vektor während Transduktion nicht verdünnt wird. Der andere wichtige Aspekt ist es, das Schiff zu physiologischen oder etwas größere Kaliber während der Vektor Infusion ausdehnen. Da nach unserer Erfahrung eine Halsschlagader, die nicht vollständig aufgebläht oder bleibt nicht aufgetrieben während der 20-minütige Infusion zuverlässig niedrige Transgene Ausdruck hat, ist es wahrscheinlich, dass Distension der Arterie zur physiologischen Kaliber der Transduktion verbessert Effizienz. Allerdings haben wir dies nie systematisch untersucht. Es ist möglich, die Druckerhöhung Infusion über den physiologischen Werten könnte Transduktion Effizienzsteigerung und ermöglichen darüber hinaus höhere Transduktion von Zellen in den Kreislauf Medien. Jedoch Störungen der endotheliale Barriere wahrscheinlich beschädigt das Schiff und erhöhen das Risiko einer Thrombose. Wenn das Schiff nicht aufgetrieben für die gesamte 20-minütige Vektor-Inkubationszeit bleibt, ist es wahrscheinlich, dass der Vektor aus Zweigen der gemeinsame Halsschlagader undicht ist. Seien Sie vorsichtig bei Dissektion zu identifizieren und verbinden alle Zweige zum Auslaufen des Vektors aus dem Karotis Lumen zu verhindern.
Diese Methode hat mehrere Einschränkungen, die auf die Verwendung von Kaninchen beziehen. Kaninchen sind weniger teuer zu beherbergen und zu ernähren als andere große Tiere (Hunde, Schweine, Schafe); Allerdings sind Kosten für den Erwerb, Unterbringung, und Fütterung von Kaninchen deutlich mehr als bei Mäusen und Ratten. Die OP-Einrichtungen und regulatorischen Anforderungen für Kaninchen-Operationen sind auch weitaus umfangreicher als für Nager. Darüber hinaus ist erhebliches technische Know-how benötigt, um die chirurgische gen Übertragungsprotokoll effektiv durchzuführen. Dieses Know-how kann von den Betreibern, die keine formale chirurgische Ausbildung gehabt haben. Mindestens 2 Personen in unserer Gruppe (einschließlich der Hauptautor dieser Handschrift) haben die chirurgischen Techniken gelernt und sie produktiv angewendet. Dennoch sind sorgfältige Ausbildung und sorgfältige Überprüfung des Betreibers gen auftragswirkungsgrad und Reproduzierbarkeit (wie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse beschrieben) erforderlich, bevor der Bediener kann qualitativ hochwertige Daten generieren.
Einschluss des Transgens Ausdruck fast ausschließlich auf das Endothel mit dieser Methode29,32,33,34,35,36,37 ist nützlich, dass es ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Transgen in Endothelzellen und Messung der Aktivität der GUS wirkenden DNA regulatorischen Sequenzen in Endothelzellen. Eine kleine Anzahl von adventitial oder medial Zellen ausgestrahlt werden kann; die Unfähigkeit dieser Methode effizient Nonendothelial Zellen transduzieren verhindert jedoch die Anwendung der Methode für die Untersuchung von anderen Arten von Zellen der Gefäßwand (z. B. glatten Muskelzellen und Makrophagen). Obwohl Überexpression des sekretierten Proteine aus ausgestrahlt Endothelzellen kann Untersuchung der Auswirkungen dieser Proteine auf andere vaskuläre Zelle eingibt, die Rollen nicht sezerniert Proteine in dieser vaskulären Zelltypen (zB. Rezeptoren oder Proteine in der Signaltransduktion beteiligt) kann nicht mit dieser Methode untersucht werden.
Als Mittel für die Prüfung der Arterie Wand-bezogene Gentherapie die Methode unterscheidet sich von anderen präklinischen Methoden in zwei wesentlichen Punkten. Erstens nutzt die Methode ein Kaninchen-Modell für in Vivo Tests der Gentherapie statt Nager-Modelle8,12,15,38,39häufiger verwendet. Die Verwendung von Kaninchen ermöglicht Bewertung der Transgene Ausdruck und die biologische Funktion des Transgens Produktes in einem outbred Tiermodell, das ist mehr Vertreter der menschlichen genetischen Vielfalt als Inzucht Nagetiere sind. Das Modell lässt sich beurteilen, Gentherapie in Arterien entweder normale Kaninchen oder Kaninchen Arterien mit arteriellen Pathologie, die ähnlich wie in krankem menschlichen Arterien ist. Kaninchen-Arterien sind auch näher in der Größe an menschlichen Arterien als Nagetiere Arterien und weit mehr Gewebe für die Analyse bieten als Nagetier Arterien vorliegt. Der zweite wesentliche Unterschied ist, dass diese Methode ein chirurgisches Vorgehen verwendet Transgen Vektor an das vaskuläre Endothel liefern. Somatische Gentherapie ist oft systemisch, am häufigsten geliefert durch die Ausrichtung auf die Leber mit dem Ziel der Veränderung der Plasmaspiegel des Transgens Protein25,40. Durch gezielte Gefäßendothels, liefert die Methode der therapeutischen Transgen Produkt vor Ort, mit seiner Peak-Konzentration in der Arterienwand, genau, wo es für die Behandlung von Gefäßerkrankungen gebraucht wird. Durch die Bereitstellung des Transgens nur lokal, entfällt die Methode auch systemischen Nebenwirkungen des Transgens Produkts. Andere Gruppen entwickeln Methoden mit Peptide, Antikörper oder andere Kapsid Modifikationen für die Zielgruppenadressierung systemisch injizierten Vektoren gesund oder krank Endothels bieten lokale vaskuläre Gen Therapie41,42 , 43. diese Ausrichtungsmethoden bleiben jedoch in der Entwicklung, und sind immer noch kompliziert durch erhebliche systemische Transduktion, vor allem in der Leber42,43,44. Unsere op-Methode bietet eine präzise und effiziente Einführung von transgenen in der vaskulären Endothel mit minimal - wenn überhaupt - Transduktion an anderen Standorten. 1 die Methode ist auch ein bequemer, effizient und höher-in der gesamten (im Vergleich zu Keimbahn Transgenese oder systemische Injektion von endothelialen ausgerichtete Vektoren) für die Prüfung der Tätigkeit der regulatorischen DNA-Sequenzen im großen Behälter Endothel, für Testfunktion Transgen Protein in der Arterienwand und Schiff-Wand-gezielte Gentherapie zu Testzwecken.
Diese Methode ermöglicht Untersuchung der biologischen Rolle der Transgen, wenn es in die große Arterie Endothel zum Ausdruck kommt. Wenn express Verlustfunktion Reagenzien wie dominant negativen Rezeptoren oder kurze Hairpin RNA geändert, würde es erlauben, Untersuchung der Rolle von endogenen endotheliale Proteine und Signalwege. Die Methode kann auch verwendet werden, um die transkriptionelle Aktivität Cis wirkenden DNA-Sequenz in große Arterie Endothelzellen5,6,7messen. Darüber hinaus wird die Methode ermöglicht die Prüfung von jeder Art von Gen Übertragung Vektor für Effizienz und Sicherheit im Auslieferungszustand lokal Endothels und zeigen die Fähigkeit des Vektors, langlebige Transgene Ausdruck zu erreichen. Schließlich erlaubt die Methode Entwicklung und Erprobung von Kombinationen von Vektoren und Transgene, die entworfen sind, um vaskulären Wand-bezogene Gentherapie liefern. Die Methode könnte dienen als Screening-Instrument, therapeutische Gene zu identifizieren, die Macht-in die Zukunft-durch perkutan injizierten vaskulären Wand ausgerichtete Vektoren des Endothels alle großen Arterien (oder alle erkrankten großen Arterien) geliefert werden. Wegen der bereits bestehenden Immunität beim Menschen zu Adenovirus Typ 545wird es schwierig, um Adenovirus Typ 5-basierte Vektoren in klinische Anwendungen zu verwenden. Das Adenovirus 5-Kapsid Engineering, Verwendung von alternativen Adenovirus Serotypen46oder Verwendung von weniger immunogen Vektoren wie AAV möglicherweise erforderlich, vaskuläre Gentherapie in die Klinik zu bringen. Als ein experimentelles Werkzeug sind wir jedoch nicht bewusst jeden Vektor, die Helfer-abhängige Adenovirus 5 dabei, effizienter und langlebiger Transgene Ausdruck in den Blutgefäßen1mithalten kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei AdVec, Inc. für die Erlaubnis zur Nutzung ADHD Reagenzien, Julia Feyk für die Amtshilfe und die Abteilung für vergleichende Medizin Veterinärdienste für chirurgische Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch HL114541 und die John L. Locke, Jr. Charitable Trust unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
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