Summary
שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל עורקי התרדמה ארנב. הקדמה של transgene מאפשר את ההערכה של תפקיד ביולוגי של המוצר transgene העורקים נורמלי או מחלת מודלים. השיטה שימושית גם למדידת פעילות של רצפי DNA תקינה.
Abstract
המטרה של שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל של שני בעורקים ארנב נפוצות מקטעי מבודד. השיטה משיגה מוקד transgenesis אנדותל סלקטיבית, ובכך לאפשר חוקר כדי לקבוע את התפקידים הביולוגיים של אנדותל הביע transgenes וכדי לכמת את הפעילות תעתיק ויוו של רצפי DNA בעורק גדול תאי אנדותל. השיטה משתמשת בידוד כירורגי של עורק נפוצות ארנב, arteriotomy כדי לספק וקטור ויראלי לבטא transgene לתוך לומן עורקי. תקופת דגירה קצרה וקטור בלומן, עם השאיפה עוקבות של התכנים לומן, מספיקה להשיג ביטוי עמיד ויעיל transgene ב אנדותל, ללא לזיהוי התמרה חושית או מחוץ לביטוי פלח עורקי מבודד. השיטה מאפשרת הערכה של הפעילות הביולוגית של מוצרים transgene עורקים רגילים והן במודלים של מחלת כלי דם אנושי, תוך הימנעות תופעות מערכתיות יכולה להיגרם גם על ידי מיקוד המסירה הגן לאתרים אחרים (למשל. הכבד) או על ידי הגישה החלופית של אספקת מבנים גנטיים אנדותל מאת נבט קו transgenesis. היישום של השיטה הוא מוגבל על ידי הצורך מנתח מנוסה, כמו כן, חדר הפעלה המאובזר, את העלויות של רכישת דיור ארנבים, והצורך מומחיות העברה גנטית וקטור בנייה ושימוש. התוצאות המתקבלות בשיטה זו כוללים: שינויים הקשורים transgene מבנה עורקי, cellularity, מטריצה חוץ-תאית או פונקציית עושות; עליות או הפחתות דלקת עורקים; שינויים תא וסקולרית אפופטוזיס; התקדמות, פיגור או רגרסיה של מחלות כגון היפרפלזיה intimal או טרשת עורקים. השיטה מאפשרת מדידה של היכולת של רצפי רגולטוריות DNA יליד וסינתטיים לשנות את הביטוי transgene בתאי האנדותל, מתן תוצאות הכוללות: רמות של transgene ה-mRNA, רמות החלבון transgene, רמות של transgene פעילות אנזימטיות.
Introduction
המטרה של שיטה זו היא להציג את transgene לתוך אנדותל עורקי התרדמה נפוצות ארנב. הקדמה של transgene מאפשר את ההערכה של תפקיד ביולוגי של המוצר transgene עורקים רגילים והן במודלים הארנב של מחלת עורקים אנושי. ביטוי של transgene המחלה במודלים יכול לחשוף אם את transgene (ואת מוצריו חלבון) להראות הבטחה כמו סוכני טיפולית-1-2,,3,-4. הכללת רכיבים רגולטוריות cis אקטינג בקלטת ביטוי transgene מאפשר הערכת הפעילות של רכיבים אלה אנדותל עורקי ויוו5,6. הידע הפעילות של רכיבים ספציפיים של הרגולציה cis אקטינג יכול לשמש כדי לעצב ביטוי פעיל יותר קלטות וכדי לחקור מנגנונים של הכונה אנדותל ויוועורק גדול7.
ארנבים הם מודל ערך עבור היבטים שונים של פיזיולוגיה אנושית וסקולרית ומחלות. ארנבים חולקים תכונות כלי דם רבות עם בני אדם. לדוגמה, ערכים של תוכנית בסיסית hematological, תקנה hemostatic, ו למתח האורך כלי הדם דומים בין הארנבים ובני8. ארנב מודלים של מחלות לב וכלי דם לשכפל את תכונות מפתח של מחלות רבות, כולל: מפרצות (דומה גיאומטריים, מאפייני הזרימה)9, vasospasm (תגובה דומה לטיפול endovascular)10,11, ו טרשת עורקים (intimal הפלאק עם תכונות דומות, כולל את ליבה של עתיר השומנים, מקרופאגים, ותאי שריר חלק כיפה סיבית)12,13. בהתאם לכך, פותחו מודלים ארנב למחלות כלי דם רבות כגון פקקת, vasospasm, מפרצת, סוכרת, היצרות כלי הדם שתל טרשת עורקים8,13,14, 15,16.
לחוקרים בחירה בין מודלים חייתיים של פיזיולוגיה וסקולרית ומחלות, הארנב יש מספר יתרונות. כלי גדול יותר של ארנבים לעומת מכרסמים, לאפשר קל כירורגי מניפולציה, שימוש של endovascular התקנים בהם כמות גדולה של רקמות עבור מדידות כמותיים. ארנבים הם קרובים יותר phylogenetically פרימטים מאשר הם מכרסמים17, מגוון גנטי גדול ארנבים outbred קירוב טוב יותר ההשתנות גנטי של בני אדם. מגוון גנטי חשוב במיוחד ללימודים פרה, אשר-על-ידי שלהם בטבע-aim לפתח טיפולים שניתן להחיל באוכלוסייה אנושית מגוונת מבחינה גנטית. כמו עם מינים רבים, אם לא כל שאר מודל, ארנב גנים בקלות לשכפל או מסונתז כי יש כבר וסודרו הגנום ארנב עם כיסוי גבוה (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. לעומת דגמים בעלי חיים גדולים אחרים (כגון כלבים, חזירים או כבשים), ארנבים הם זולים יחסית וניתן לרכוש, הבית וכל אלה קל יותר לגדל ולטפל. מחלת כלי דם ספציפית הדגמים בארנבים כל יש משלהם יתרונות, חסרונות כמו מודלים של מחלות אנושיות כי הם מעבר להיקף זה כתב היד8,12,18. חוקר לעיין אלה יתרונות, חסרונות כדי לקבוע אם הארנב הוא המודל הטוב ביותר בשביל לענות על שאלה ספציפית ניסיוני.
הקדמה של רצפי רגולטוריות חומצה deoxyribonucleic (DNA) לתוך תאי אנדותל ויוו מאפשר חקירה של הפעילות של רצפי אלה בסביבה הפיזיולוגיות מורכבת. מחקרים במבחנה בתאי האנדותל transfected יכול להיות שימושי עבור הערכה ראשונית של רצפי DNA תקינה; עם זאת, רמות הביטוי במודלים תרביות רקמה הם לפעמים לא לשכפל כאשר המחקרים חוזרים ונשנים ויוו5,19,20. מערכות במבחנה ניתן גם שימושי עבור חקר מסלולים בסיסיים של חלבון איתות, פיזיולוגיה אנדותל כמו גם תקשורת בין תאים בתרבית כלי דם; עם זאת, מורכבת יותר מסלולים או רשתות רגולטוריות מושפעים אוכלוסיות מורכבות של התאים הסמוכים כלי הדם או המערכת החיסונית נלמדים בצורה הטובה ביותר אין ויוו מערכת6,20. השיטה המתוארת במסמך זה מספק פלטפורמה עבור חקר רגולציה של ביטוי transgene אנדותל בתוך ההקשר של כלי שלם, עם או בלי מחלות. המערכת ויוו מאפשרת גם חקירת crosstalk הסלולר פיזיולוגיים ופתולוגיים וזיהוי של תרומות של המערכת החיסונית כדי ויסות של ביטוי גנים6.
נבט-קו transgenesis (בעיקר בעכברים) היא גישה חלופית להכוונת transgene ביטוי לתאי אנדותל. גישה זו יכולים לספק ביטוי transgene חיים ארוך, אנדותל מיקוד מתווכת על ידי יזם ספציפי או אזורים רגולטוריות21,22. עם זאת, הדור של העכברים הטרנסגניים היא יקרה ועתירת, מספר קווי הטרנסגניים חייב להיבדק לעתים קרובות כדי להבטיח פילוח של transgene סוג התא הרצוי, ההישג של רמות ביטוי הולם transgene, וניסויים תוצאות מאתר מערכות יכול להיות תלויי-מתח. מודלים מהונדס מאתר עם transgenes אנדותל במיקוד יש יתרונות רבים: אין צורך לבצע ניתוח על כל חיה ניסיוני על מנת להשיג transgenesis, ניתן לגדל עכברים ניסיוני עם רבים אחרים זמינים העכברים הטרנסגניים ב כדי לבדוק אינטראקציות הגנטי פנוטיפי ו, ויש מבחר רחב של נוגדנים כי מגיבים עם מאתר חלבונים, דבר המקל על אפיון של פנוטיפים. עם זאת, פילוח של transgenes אנדותל דרך קו נבט בדרך כלל תוצאות בביטוי transgene ברחבי להערכת,22 ולכן קשה לקבוע את האתר שבו פועלת המוצר transgene. זה נכון במיוחד כאשר המוצר transgene מופרש, כי מוצר transgene מופרש על ידי תאי אנדותל ברחבי להערכת יכול להיות פעילות ביולוגית-כל מספר של האתרים שבתוך חיה. למרות השיטה המתוארת בכתב יד זה דורש מומחיות טכנית ומתקנים מיוחדים, זה יכול להיות פחות זמן רב ויקרים פחות לפתח קו העכבר הטרנסגניים אנדותל ספציפיים. זה מאפשר ההערכה של הפונקציה של חלבון באופן בררני בתאי האנדותל של קטע של עורק גדול, הוא מאפשר שימוש contralateral שחתך את עורק הצוואר כפקד לזווג (סילוק גורמים מערכתית יכולה להשתנות בין ניסיוני בעלי חיים-למשל, לחץ דם או רמות כולסטרול-כמשתנים בלתי מבוקרת).
ריפוי גנטי היא גישה מבטיחה לטיפול של מחלות לב וכלי דם, מחלות כרוניות במיוחד, כי יישום יחיד יכול לספק מתמשכת או חיים ארוך יכול להיות ביטוי של גנים טיפוליים23. ההבטחה טיפולית של טיפול גנטי יש נחקרו במודלים חייתיים של העברה גנטית הסומטית, לעיתים קרובות מיקוד כבד24,25, המהווה מטרה קלה יחסית מכיוון וקטורים ויראלי נישא בדם רבים hepatotropic. עם זאת, יש השפעה על מחלת כלי דם, ריפוי גנטי כמטרה בכבד חייב להשיג מערכתית ביטוי של חלבונים. פעולה זו דורשת בדרך כלל מינונים גבוהים של וקטור, אשר יכול להיות רעילים או אפילו קטלני26. יתר על כן, מערכתית רמות גבוהות של העלאה חלבון הסיכון של תופעות לוואי המטרה, אשר יכול לסבך או אפילו לטשטש פרשנות של תוצאות הניסוי. ריפוי גנטי המקומי מיקוד אנדותל כלי הדם כמתואר בכתב יד זה יכול למנוע תופעות לוואי מערכתית מכיוון הווקטור חדורים לא המופץ נרחב מעבר המקטע העורקים transduced, אפקטים וסקולרית מקומית יכולה להיות מושגת ללא שינויים ברמות הפלסמה מערכתית של חלבון. 27 . בנוסף, סכום נמוך בהרבה של וקטור יש צורך מגלי מקטע עורקי ממה הוא צריך להשיג התמרה חושית הכבד חזקים. Transgene ביטוי מן הכבד דווח לרדת לאורך זמן, כנראה בגלל מחזור התא, הדורש מינון חוזרות אם הביטוי transgene ברמה גבוהה היא תישמר. 28 , לעומת זאת, שיעור תחלופה נמוכה אנדותל מספק הביטוי יציבה לפחות 48 שבועות בארנבים צ'או-fed לפחות 24 שבועות בנגעים טרשת עורקים כולסטרול-fed ארנבים. 1 , 27
כדי לקבוע אם שיטה זו של העברה גנטית כדי אנדותל לעורק הצוואר נפוץ ארנב מתאים, היתרונות והחסרונות (טבלה 1) להתייחס בהקשר של מטרות מחקר ספציפי. היתרונות של שיטה זו כוללים: outbred הארנבים נציגה טובה יותר של מגוון גנטי אנושי מאשר עכברים המפגרים (חשוב לעבודה פרה); ארנבים לספק כלי גדול יותר עבור מניפולציה קל יותר רקמות לצורך ניתוח; השיטה ניתן להשיג transgene, ממוקדות אנדותל ביטוי הרבה יותר מהר מאשר נבט-קו אנדותל פילוח העכברים הטרנסגניים; מינון וקטור ניתן להתאים בקלות לרמות משתנה דגם של ביטוי transgene; תהליכים ספציפיים אנדותל בעורק גדול יכול ייחקרו; transgenesis וסקולרית מקומית מאפשרת בעורק מול אותה חיה כדי לשמש פקד, סילוק גורמים מערכתית כמשתנים בלתי מבוקרת. החסרונות כוללים: שירותים מיוחדים ומומחיות נדרשים; רקעים מהונדסים פחות שעליו להתנסות זמינים ב ארנבים מאשר עכברים; ויש מבחר פחות נרחב של נוגדנים הארנב לעומת עכבר חלבונים (עבור immunodetection של חלבונים transgene, אנטיגנים אחרים שעשויים להיות חשוב לפרש תוצאות ניסויית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת וושינגטון למשרד של צער המשויכים טיפול בעלי חיים מוסדיים ואת השימוש הוועדה (IACUC), הושלמו בשנת בהתאם ותאימות עם כל רלוונטיות רגולטוריות ומוסדיים הנחיות.
הערה: העברה גנטית כדי ארנב נפוצות עורק מתבצע על הארנבים על-ידי מנתח בסיועם של המרדים או העוזרת.
1. ג'ין להעברת בעורקים נפוצות ארנב: פעולת-קדם
- עזים ומתנגד הארנב. שוקלים את הארנב. לשלב 30 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 2 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מזרק. להזריק קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים שרירית (IM) בשרירי paraspinous לזירוז הרדמה.
- בעת שחיכה הארנב כדי להיות מורדם, להכין את חדר ההכנה ושולחנות חדר הניתוח (או אר).
- בחדר הכנה או: המשחה אופטלמולוגיות ואת התיקון פנטניל והממוקם השולחן הכנה; בצע כיוונון קוצץ שיער שואב אבק עבור גילוח של הארנב הצוואר ואת האוזן; להפריש כרית ההכנה אלכוהול, קטטר 24G x ¾", הזרקת יציאה והדבקה כדי לאבטח ורידית (IV) בתוהו האוזניים של הארנב.
- בחדר הניתוח: להתקין את ציוד ניטור ולמקם את הגששים [רל (ג), רווית חמצן (SpO2), טמפרטורה] על השולחן או; להכין חמצן, איזופלוריין; לקשור רצועת גזה מסיכת הפנים כדי לאבטח הארנב ומניחים את המסכה על הקצה של הראש של טבלה.
הערה: רצועות גזה קושרים את מסיכת הפנים צריך 2 זנבות של כ 45 ס מ כל אחד. - הפעל את השמיכה מחממת מים על השולחן או. על גבי מים שמיכה, מקמו מגבת מגולגלת כוסמת, צלחת אלקטרודה ואנליזת (מאוחר יותר ממוקם תחת בחזרה של הארנב).
- הרכבתי את המשאבה או הרביעי עם 100 מ של שקית IV saline עם מחט 18-19G מצורף והגדר את קצב הזרימה h 10 מ לכל ק ג.
- לשלב 1 מ"ל של לידוקאין HCl (פתרון 2% מניות) ו 1 מ"ל של bupivicaine HCl (פתרון 0.5% מניות) של מזרק, כדי לשמש משכך כאבים מקומי.
- כאשר הארנב הוא מורדם לחלוטין, להכין את הארנב לניתוח.
הערה: בדוק אם יש חוסר רפלקס פדלים (קמצוץ הבוהן; לחפש איבר נסיגה) כדי להבטיח עומק הרדמה, ולהמשיך לעקוב אחר את רפלקס לדווש לאורך כל הניתוח.- משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים. הסר צואה בחלחולת של הארנב על-ידי הקשת עם האצבעות בכפפה על הבטן הקדמי התחתון (מעל הרקטום) ואצבעות נע לכיוון פי הטבעת. זה יאפשר השמה מאוחר יותר של בדיקה טמפרטורה רקטלית.
- לגלח בצוואר הקדמי של החריץ בחזה ובצלעות לקצה של הלסת התחתונה תוך שימוש ואקום כדי להקפיד על ניקיון האזור. גם לגלח בשתי האוזניים עבור המיקום הרביעי ואת הקובץ המצורף תיקון של פנטניל, לגלח בוהן שמאל באמצע אחורי עבור המכשיר אוקסימטר.
הערה: הפרוטוקול מניחה כי המנתח הוא בצד הימני של הארנב במהלך כל התהליך. אם ההגדרה או מקומות המנתח בצד הנגדי, להפוך הצדדים בשלב זה כדי לשמור את החוטים ועל הרביעי מול של המנתח. צריך גם הוחלפו בצדדים של צעדים עתידיים לפי הצורך. - לנגב האוזן השמאלית עם כרית ההכנה אלכוהול, למקם צנתר הרביעי של 24G לווריד אוזן שמאל, קאפ עם יציאת הזרקה, להקליט את הנמל/הקטטר לאוזן של הארנב לאבטח אותו. להחיל תיקון פנטניל (25 µg/h) אוזן ימין של הארנב.
- להעביר את הארנב לחדר הניתוח, במקום פרקדן על שולחן הניתוחים עם מגבת תמיכה לצוואר התגלגל תחת של הארנב הצוואר, ממש מתחת לראש. בעדינות הארך הצוואר של הארנב ישר ואופקי בקירוב.
- לחבר את הארנב עד מסכת פנים עם O2 -ב-1 ליטר/דקה, ולהתחיל איזופלוריין המינהל. אבטח את המסכה על ידי ליפוף את הקצוות של רצועת גזה קשורים המסיכה סביב המגבת תמיכה לצוואר תחת הארנב. התאם איזופלוריין (בדרך כלל 1-2%) לפי הצורך (בהתבסס על קצב הלב, קצב נשימה, רפלקס פדלים) כדי לשמור על הרדמה. ראויה עד לתום ההליך.
- ודא כי צלחת אלקטרודה ואנליזת ממורכזת מתחת הגב של הארנב. המקום טמפרטורה, אוקסימטר רגשים ולהחיל האק ג מוביל הארנב.
- להתחבר IV saline אל יציאת הצנתר באוזן של הארנב, מתחיל את המשאבה מלוחים-h 10 מ לכל ק ג.
הערה: לאחר 1 h, המשאבה מלוחים יכול להיות מופחת ש מ לכל ק ג. - לרסן את רגליו הקדמיות של הארנב קשירה אותם באופן רופף על הטבלה. באופן אופציונלי, למקם שולחן פלסטיק קטן על הארנב כדי להגן על הארנב מפני נתון ללחץ החזה/בטן של המנתח נשען על החזה/הבטן הארנב.
הערה: השולחן הקטן עשוי לסייע במניעת פליטות מרובות כפויה של תוכן הבטן. - הכנס 2 מ של לידוקאין בעבר מוכן (2% מניות) / נמשך (0.5% מניות) (50-50 mix) subcutaneously לאורך קו החתך המתוכנן הצוואר של הרדמה מקומית.
- תן המסייע להכין באתר כירורגית עם 3 לסירוגין קרצוף של chlorhexidine אלכוהול איזופרופיל, ולאחר מכן תרסיס עם betadine. סקראב חלוק, הכפפות, בעקבות טכניקה נכונה aseptic.
הערה: המנתח צריך לשים 2 x כירורגי זכוכיות מגדלת כדי לסייע עם החצי הראשון של הניתוח. במהלך הניתוח הישרדות היא חיונית כדי לשמור על עקרות של המנתח ואת השדה הכירורגי. שרק העוזרת צריכה להתמודד עם כל הפריטים שאינו סטרילי, חייב להיות עברה לידי המנתח או על שולחן כלי הצרה גילוח ורחיצה כירורגית חומרים מעוקר. מגבות סטריליות ניתן על ידי המנתח כדי לשמור על עקרות זמן מניפולציה ציוד שאינו סטרילי כגון המיקרוסקופ.
2. הישרדות ניתוח (העברה גנטית)
- להכין כלי נגינה שדה סטרילי.
- תן המסייע לפתוח חבילת בד סטרילי המכיל תלוי טבלה, מאסו נייר אחד על הארנב, כמה מגבות. גילוח ורחיצה כירורגית להעביר את הפריטים המנתח.
- לעטוף את הטבלה כלי. מקום 6 סטרילי מגבות הנייר לעטוף על השולחן הצרה.
- 4 מגבות, לעטוף את הצוואר של הארנב, עוזב רק באתר כירורגית חשופים (כ 4 ס"מ x 10 ס"מ). להניח את הכיסוי ותאבטחי נייר על הארנב.
- תן המסייע לפתוח חבילת כלי סטיריליים ומניחים גילוח ורחיצה כירורגית על השולחן כלי נגינה.
- תן המסייע לפתוח את הציוד הבא: גילוח ורחיצה כירורגית מקום על השולחן כלי או יד על המנתח: שלושה מזרקים 1-mL (ו מחט אחת אם תארגן את הדברים לא נטענים כבר עם מחטים), אחת 20 מ"ל מזרק, המחט 21 גרם אחד, אחד מחט 19 ז, 3-0 polyglycolic חומצה (PGA) תפירה, תפירה PGA 5-0, 7-0 בתפר פוליפרופילן, ושניים הרביעי G 24-קטטרים....
- אבטח את כבל electrocautery הכיסוי ותאבטחי ארנב באמצעות 7.25" Kantrowitz מלקחיים ושחרור לאחר מכן התקע לסיים את הטבלה. תן המסייע לחבר את הכבל ליחידה במכשיר צריבה עם ראש והפעלת הכוח.
- ממלאים מזרק 20 מ עם מלח סטרילית, נמשך מתוך שקית האינפוזיה או בקבוקון שהוחזקו על-ידי המסייע. להשתמש זו תמיסת מלח לפי הצורך כדי לשמור על לחות לרקמות חשופות במהלך ההליך.
- להכין מזרק אחד 1 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיום נשר שונה של Dulbecco (DMEM, בשביל לשטוף את העורק). עבור כל העורק הראשי זה להיות transduced נדרשים 0.35 מ של וירוס מדולל. אם וירוס זהה לשני הצדדים, להכין מזרק 1 מ"ל אחד עם וירוס מעורבבת עם DMEM לאמצעי אחסון של 0.7 מ. אם צדדים שונים מקבלים נגיפים שונים [לדוגמה פקד וירוס "Null" בצד אחד], להכין שני מזרקים 1 מ"ל, כל אחד עם 0.35 מ של וירוס פתרון. עבור המסייע תלוית אדנו, ריכוז וירוס הוא עונה 2 פרק 1011 חלקיקים נגיפיים (סמנכ ל) / mL.
הערה: תן המסייע להכין את הוירוס. המנתח מצייר את הבולם DMEM ווירוסים לתוך מזרקים סטרילי. - חותכים חור הכיסוי ותאבטחי. גודל החור צריך להיות באותו גודל כמו באתר כירורגית על הצוואר של הארנב את זה ממוסגר על ידי המגבות בשלב 2.1.3. תהדק את הפינות של החור הכיסוי ותאבטחי נייר המגבות הבסיסית כי הם עטוף מעל הצוואר של הארנב עם המלחצות מגבת.
- לבודד את עורק נפוצות.
הערה: 2 x זכוכיות מגדלת כירורגי אמור לשמש עבור חלק זה.- לחתוך את העור electrocautery לאורך הקו האמצעי הרחבת כ 7-9 ס מ cranially לכיוון הלסת התחתונה, תהדק את העור חשוף עם מגבת מלחציים.
- לעשות חתך לרוחב קצר דרך fascia עם electrocautery בסוף סימטרית. ואז להוסיף את המספריים גדולים לתוך החתך ומנתחים בלשון בוטה fascia לאורך קו האמצע כולה. חותכים fascia גזור את האמצע עם electrocautery.
- עם מספריים ויבתר קטנות, לנתח בין השרירים בצורת V (שריר sternocephalic) השריר sternohyoid מעל קנה הנשימה, לחשוף נפוצות בעורקים, מתחיל בצד ימין.
- לנתח את. עורק תרדמני חופשי סביב רקמות, חלוקת כל הענפים, מבסיס הצוואר. הקליפה למעבר של עצב לועי cranially. השתמש הסיליקון כירורגי לולאות כדי לסייע פותחים את העורק במהלך ניתוח.
הערה: כדאי לשים לב כדי לא להפריע את העצב התועה שעובר במקביל שחתך את עורק הצוואר או העצבים קטן לחצות שחתך את עורק הצוואר. - מאתרים ומפסיקים את כל ענפים גדולים יורד את עורק תרדמני (1-2 בכל צד) בתפרים משי 5-0 לפני חיתוך הסניף יש לשחרר את מקטע 4-5 ס מ של בעורק. חותכים הסניפים מחוברים 1-2 מ מ בלבד העניבה כך העניבה לא להחליק.
- חזור על ניתוח בצד שמאל (שלבים 2.2.3 - 2.2.5).
- להשרות וקטורים לתוך עורק נפוצות.
הערה: מיקרוסקופ כירורגי (16 X) משמש לצורך ביצוע arteriotomy, החדרת פתרון וקטור/בקרה ותיקון arteriotomy.- תן המסייע להסיר את זכוכיות מגדלת כירורגי של המנתח, יושינו, מיקרוסקופ כירורגי. לעטוף מגבת נקיה מעל מיקרוסקופ כדי לאפשר מניפולציה של המיקרוסקופ בלי לזהם את שדה סטרילי.
- להזריק הפארין [150 יחידות הבינלאומי (IU) /kg] הקטטר IV ויש לשטוף עם 10 מ"ל של תמיסת מלח.
- חוזרים שוב ושוב אל מבודדים נכון שחתך את עורק הצוואר, לשים שני קשרים משי סביב החלק האמצעי של המקטע העורק גויסו, לקשור קשר עם יד אחת על כל אחד - ללא הידוק אותם.
- לכופף את המחט 19 ז מעל המסגרת המשופעת כ 80 ° משתמש במנהל ההתקן מחט גדולה (לא לכופף את השיקוע; איור 1).
- תהדק את העורק בסוף כל מקטע מבודד עם תפסים, הצבת את הקליפ הגולגולת הראשונה כדי לאפשר את העורק מילוי, ולאחר מכן מציבים את הקליפ סימטרית.
- לנקב את עורק תרדמני עם מחט 19 ז כפוף רק הגולגולת אל הסרטון וסקולרית סימטרית, לוקח כדי לא לנקב את הקירות אחורי או צדדי. לקדם את מחט לתוך לומן, מסירים אותה פעמיים כדי לוודא arteriotomy לחלוטין שחוצה את דופן עורק. ואז מסירים בזהירות את המחט.
הערות: חשוב ליצירת של arteriotomy החודר את כל השכבות של קיר העורק נקיה, לא לנתח את דופן עורק (על-ידי העברת axially דרך adventitia מדיה). כדי לעשות זאת, כדאי מנוקבת בעורק עם קצה המחט ממוקם קרוב ככל האפשר לזווית 90 מעלות בקיר העורק (איור 1). ניקוב העורק בזווית של 90° מסתייעת תופס את העורק על ידי adventitia עם מלקחיים בסדר, בעדינות הרמת המשטח עורק תוך כדי לחיצה על הקצה של מחט סימטרית רק עד לנקודה מעלית. תמרון זה גם מפחית את הסיכון לפגיעה הקיר האחורי (איור 1). - להתפתח, חבורה להמציא כמה תחבושות גזה לתוך קן אשר עליו תטיל את המזרק משמש את חליטות. מניחים את הקן על החזה של הארנב סימטרית על החתך.
- לשים את צנתר הרביעי של המזרק המכיל DMEM בלבד (לא חזק מדי) לכופף את הצנתר ~ 4 מ מ מהקצה כך העיקול מחזיק כ 75° לאחר הפצתו.
- הכנס הרביעי-הצנתר בעורק עד לנקודה בנד. ולשטוף את כל הדם של העורק עם DMEM (~ 0.25 מ ל x 2). עבור כל כביסה, למלא את העורק DMEM ולאחר מכן הסר DMEM שיורית של לומן כלי בהקשת בעדינות על העורק עם אצבע בכפפה, מתחיל רק סימטרית בפריט כלי הדם לגולגולת. תוך שמירה על לחץ עדין, החליקו את האצבע של הגולגולת סימטרית. התכנים luminal תישטף דרך arteriotomy.
- לשמור את הצנתר בעורק, להחליף את המזרק DMEM על המזרק המכיל וירוס פתרון. ודא כי אין אוויר מזין את הקטטר.
- החלק של קשרים משי למטה העורק כך הם מקיפים את העורק במיקום של קצה הקטטר, אבל אין לחזק אותם.
- להשרות mL 0.03 נקודות של הפתרון וירוס לדחוף את DMEM שנותרו מחוץ הקטטר ולרוקן את העורק. לכווץ את זה על-ידי הסרת שוב כל נוזל לומן עם האצבע, הגולגולת כדי סימטרית (כמו שלב 2.3.9).
- הדק את שני קשרים סביב קצה הצנתר לאטום לומן. להשרות את הפתרון וירוס (~ 0.25 mL; 2 x 1011 סמנכ ל/mL עבור אדנו) על ידי לחיצה על הבוכנה מזרק בעדינות עד העורק נפוחה עד קוטר פיזיולוגיים.
הערה: חשוב כי העורק מתרחבת לקליבר פיזיולוגיים ונשארה נפוחה במהלך וירוס אינפוזיה. אם לא, מידת העברה גנטית יורידו באופן משמעותי. - בעדינות נשכב המזרק על הקן של הגזה.
- מקום suture פוליפרופילן 7-0 ב- adventitia לעורק הצוואר נפוץ רק סימטרית של הסרטון כלי הדם לגולגולת כדי לסמן גבול הגולגולת של ג'ין התמרה חושית
- לאחר לומן עורק כעשרים דקות היה הפתרון המכיל וירוס, להסיר את המזרק המכיל וירוס ולהחליף אותו עם מזרק ריק. האחות הפתרון המכיל וירוס בעדינות עד הכלי כיווץ ולהסיר את המזרק. לחתוך או לבטל את קשרים משי, להסיר בעדינות את הצנתר.
הערה: חיתוך הקשרים מסייע מאוד קצר הסרתם. הסר את הצנתר בקפידה כדי למנוע גרימת נזק אנדותל העורק. - באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, סגור את arteriotomy עם 7-0 פוליפרופילן באמצעות תבנית X (איור 2).
- להתחיל הראשון הזנת בפינה הימנית התחתונה של arteriotomy והיוצאים את כלי הקיבול בפינה השמאלית התחתונה. לאחר מכן לחצות את הפתיחה, להתחיל השני מקצה עליון ימני ל השמאלית העליונה.
- לפני קשירת למטה את התפר, לשטוף את העורק על ידי שחרור מאוד בקצרה את הקליפ כלי הדם לגולגולת. דם יזרום arteriotomy הקליפ ישוחרר, הסרת וירוס שיורית והאוויר לומן.
- משוך את התפר כדי לסגור את arteriotomy ועניבה בתפר עם 2 קשרים כיכר בעדינות.
הערה: מושך את התפר חזק מדי יגרום אגידה של רקמת כי יפריע זרימה, הגדלת הסיכון פקקת ושינוי זרימה אשר יכול להיות משתנה בלתי מבוקרת חשוב במודלים של המחלה.
- שחרר את הקליפ כלי הדם לגולגולת, ולאחר מכן הסרטון וסקולרית סימטרית באמצעות לחץ קל עם גזה כדי לעצור דימום. אם הדימום נמשך, המשך לחץ למשך 1-2 דקות. אם arteriotomy היה סגור כראוי, עוצר הדימום תמיד בתוך פרק הזמן.
- תן המסייע להזריק הבופרנורפין [0.02 נקודות מ"ג/ק"ג; תת עורית (SQ)] בערך באותו זמן לספק שיכוך כאבים לאחר הניתוח עד פנטניל פלזמה רמות הופכים טיפולית.
הערה: השנייה הבופרנורפין זריקה (0.02 נקודות מ"ג/ק"ג; SQ) עשוי להיות נחוץ 6 שעות לאחר הזריקה הראשונה כדי לשמור על שיכוך כאבים עד פנטניל פלזמה רמות הופכים טיפולית. - חזור על וירוס פרוטוקול אינפוזיה בצד שמאל, בצע את הפעולות 2.3.2 - 2.3.19.
- סגירת הפצע
- להשתמש בתפר PGA 5-0 כדי לסגור fascia קו האמצע בתפר רצוף.
- בתפר PGA 3-0, לסגור את העור עם דפוס intradermal באמצעות קשר קבור בשני קצותיו.
- ניקוי ושחזור לאחר הניתוח.
הערה: הארנב חייב לפקח באופן רציף על טמפרטורת הגוף, חמצון נאות בעת התאוששות מהרדמה. שחזור צריך לקחת את המקום באווירה רגועה, שקטה.- לבטל את הזרימה איזופלוריין וחמצן, להסיר את מסיכת הפנים של הארנב.
- שחרר עירוי נוזלים אך להשאיר את היציאה הרביעי במקום עבור עירוי חירום.
- לקחת את הארנב לאזור התאוששות ולהניח בצד שלה בתוך כלוב עם שמיכה התחממות המים מופעל (או לחלופין תנור באיר מחבק).
- להעניק O2 על-ידי המסיכה עד SpO2 תהיה יציבה.
- תן שהארנב לשחזר בכלוב, היפוך זה לצד השני כל 15 דקות, עד הארנב יכול לשבת על רגליו האחוריות, לנוע.
- כאשר הארנב הוא נייד, הסר את העירוי האוזן. לפני החזרה לכלוב.
הערה: לא תחזיר את הארנב לחברה של בעלי חיים אחרים עד זה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
- להיפטר כל דבר היה קשר עם וקטור או היתה בשטח פעיל, הביולוגי המתאים הבאים ו שרפ לבזבז פרוטוקולים.
3. העברה גנטית כדי בעורקים נפוצות ארנב: אכפת לי שלאחר הניתוח
- להעריך את מצבו הכללי של הארנב מדי יום לאחר הניתוח, בדיקת ריפוי הפצע, עדות לזיהום, תיאבון, נשימה, ולא סימנים של כאב.
- בדוק תפקיד האוזן של הארנב (אוזניים למטה יכול להיות סימן של כאב או מצוקה, במיוחד כאשר משולב עם מראה מסודר). בדוק כי הארנב נשאר נייד ופעיל. בדוק את הארנב נשימה רגילה ללא סטרידור. בדוק הפצע נקי, יבש ללא פגע. בדוק את הארנב על טמפרטורת גוף נורמלית. להתייעץ עם השירותים הוטרינריים אם הארנב הוא לא נייד פעיל, עם טמפרטורת גוף נורמלית, מראה מסודר, פצע נקי, והוא רגיל נשימה.
- בדוק אם צריכת מזון רגיל או ראיות של טרי צואה ושתן.
הערה: צריכת המזון עשוי להיות ירד לאחר הניתוח, אך יחזור להיות נורמאלי בתוך 2 ימי; לספק מזון משלים לפי הצורך.
- הסר את התיקון פנטניל ביום שלאחר הניתוח השלישי.
הערה: הבופרנורפין יכול להינתן לפי הצורך עבור הכאב שאינו מנוהל על-ידי התיקון פנטניל, או למקרה התיקון פנטניל הוסר מוקדם.
4. מסוף קציר ניתוח: פעולת-קדם
- עזים ומתנגד הארנב. ראה סעיפים 1.3 ו 1.3.5 לגבי ההישג ותחזוקה של הרדמה.
- שוקלים את הארנב. לשלב 30 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 2 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מזרק. להזריק קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים IM בשרירי paraspinous לזירוז הרדמה.
- להכין חדר ההכנה וגם או טבלאות בעת המתנה הארנב להיות מורדם.
- בחדר הכנה או: התקנה קוצץ שיער, שואב אבק עבור גילוח של הארנב צוואר ואוזניים.
- בחדר הניתוח: התקנת ציוד ניטור ומקם את הגששים (SpO2, טמפרטורה) על השולחן או; להכין חמצן, איזופלוריין; לקשור רצועת גזה מסיכת הפנים כדי לאבטח הארנב ומניחים את המסכה על הקצה של הראש של טבלה.
הערה: רצועות גזה קושרים את facemask צריך 2 זנבות של כ 45 ס מ כל אחד. - הפעל את השמיכה מחממת מים על השולחן או. על השמיכה מים, מקמו מגבת מגולגלת כוסמת, צלחת אלקטרודה ואנליזת (מאוחר יותר ממוקם תחת בחזרה של הארנב).
- לשלב 1 מ"ל של לידוקאין HCl (2% מניות) ו 1 מ"ל של bupivicaine HCl (0.5% מניות) (50-50 mix) במזרק כמו משכך כאבים מקומי.
- כאשר הארנב הוא מורדם לחלוטין, להכין את הארנב לניתוח.
- הסר צואה של הרקטום, כפי שמתואר 1.3.1, כדי לאפשר מיקום מאוחר יותר של בדיקה טמפרטורה.
- לגלח את הארנב של החריץ בחזה ובצלעות לזווית של הלסת התחתונה תוך שימוש ואקום כדי להקפיד על ניקיון האזור. גם לגלח את אצבע אמצעית האחורי השמאלי עבור המכשיר אוקסימטר.
הערה: הפרוטוקול מבוסס על ההנחה כי המנתח יהיה בצד ימין של הארנב. אם ההגדרה או יהיה מקום מנתח בצד הנגדי, להפוך הצדדים בשלב זה כדי לשמור את החוטים מול של המנתח. צריך גם הוחלפו בצדדים של צעדים עתידיים לפי הצורך. - להעביר את הארנב לחדר הניתוח, במקום פרקדן על שולחן הניתוחים עם מגבת תמיכה לצוואר התגלגל תחת של הארנב הצוואר, ממש מתחת לראש. בעדינות הארך הצוואר של הארנב ישר ואופקי בקירוב.
- לחבר את הארנב עד מסכת פנים עם O2 -ב-1 ליטר/דקה, ולהתחיל איזופלוריין המינהל. אבטח את המסכה על ידי ליפוף את הקצוות של רצועת גזה קשורים המסיכה סביב המגבת תמיכה לצוואר תחת הארנב. התאם איזופלוריין (בדרך כלל 1-2%) לפי הצורך, כדי לשמור על הרדמה. ראויה עד לתום ההליך.
- להבטיח שהצלחת אלקטרודה ואנליזת ממורכזת מתחת בחזרה הארנב. במקום טמפרטורה, אוקסימטר הגששים.
- לרסן את רגליו הקדמיות של הארנב קשירה אותם באופן רופף על הטבלה.
הערה: לחלופין, הצב שולחן פלסטיק קטן מעל ארנב על הארנב מפני נתון ללחץ החזה/בטן של המנתח נשען על החזה/הבטן הארנב. . המטרה היא למנוע regurgitation כפויה של תוכן הבטן. - הכנס 2 מ של לידוקאין (פתרון 2% מניות) / נמשך (פתרון 0.5% מניות) (חצי לערבב; מ. צעד 2.4) subcutaneously לאורך קו החתך המתוכנן הצוואר של הרדמה מקומית.
- תרסיס באתר כירורגית עם betadine. לבשתי כפפות נקיות עבור הליך כירורגי.
5. מסוף ניתוח (כלי קציר)
- להכין כלי נגינה דימומים.
- פתח את חבילת מאסו נקי המכיל מאסו טבלה עם נייר אחת תלויה על הארנב. לעטוף את הטבלה כלי.
- פתח את חבילת כלי, מניחים על השולחן כלי וסידור מכשירים. מקם את הציוד הבא: על השולחן כלי: אחת 20 מ"ל מזרק, ואת המחט 21 גרם אחד.
- אבטח את כבל electrocautery הכיסוי ותאבטחי ארנב באמצעות של 7.25" Kantrowitz מלקחיים. חבר את התקע ליחידה במכשיר צריבה עם ראש והפעל אותו.
- ממלאים מזרק 20 מ ל תמיסת מלח סטרילית. השתמש זו תמיסת מלח לפי הצורך כדי לשמור על לחות הרקמה חשופה במהלך ההליך.
- הצב את הכיסוי ותאבטחי נייר על הארנב ואחתוך חור הכיסוי ותאבטחי באתר כירורגית על הצוואר של הארנב. תהדק את הפינות של חור במקום כדי עורו של הארנב עם המלחצות מגבת.
- לבודד בעורקים נפוצות.
הערה: 2 x זכוכיות מגדלת כירורגי אמור לשמש עבור חלק זה.- לחתוך את העור electrocautery לאורך האמצע הרחבת כ 7-9 ס מ cranially לכיוון העור הלסת התחתונה, מהדק פתוח עם מגבת מלחציים.
הערה: אם הקציר הוא רק כמה ימים לאחר הניתוח הקודם, electrocautery לא נחוצה. . תחתכי את התפרים ומשוך בעדינות פתח את החתך מהניתוח הקודם. - לעשות חתך לרוחב קצר דרך fascia עם electrocautery בסוף סימטרית. ואז להוסיף מספריים גדולים לתוך החתך ומנתחים בלשון בוטה fascia לאורך הקו האמצעי כולו. חותכים fascia גזור את האמצע עם electrocautery.
- עם מספריים ויבתר קטנות, לנתח בין השרירים בצורת V (שריר sternocephalic) השריר sternohyoid מעל קנה הנשימה, כדי לבודד נפוצות בעורקים, מתחיל בצד ימין.
- לנתח את העורק נכון חופשי סביב רקמות מבסיס הצוואר. הקליפה למעבר של עצב לועי cranially. השתמש הסיליקון כירורגי לולאות כדי לסייע פותחים את העורק במהלך ניתוח.
- חזור על ניתוח בצד שמאל (שלבים 5.2.3 - 5.2.4).
- בתפר משי 3-0, מאתרים ומפסיקים את עורק תרדמני הגולגולת את פלח זה היה רווי וקטור (שימוש adventitial תפר במקום הניתוח הראשון כדי לאתר את היקף הגולגולת וקטור אינפוזיה. ואז מאתרים ומפסיקים בעורק סימטרית arteriotomy לתיקון.
- בלו על קטע העורק בין ligations, ריקון לומן עם תמיסת מלח. לקצץ משם עודף רקמת adventitial מכלי הקיבול. ולחתוך על קטע העורק לחלקים קטנים יותר עבור השונות הקצה של ניתוחים (היסטולוגיה, ה-DNA, חומצה ריבונוקלאית (RNA), חלבון, explant תרבות, וכו '.).
- להזריק 1 מ"ל של Beuthanasia הרביעי לצורך המתת חסד, ואשר על המתת חסד של הארנב.
- לחתוך את העור electrocautery לאורך האמצע הרחבת כ 7-9 ס מ cranially לכיוון העור הלסת התחתונה, מהדק פתוח עם מגבת מלחציים.
- להיפטר כל דבר היה קשר עם וקטור או היתה בשטח פעיל, הביולוגי המתאים הבאים ו שרפ לבזבז פרוטוקולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי ליישם שיטה זו בביטחון, ניסויים מוקדמים נחוצים לבסס האופרטור משיגה העברה גנטית לשחזור ויעילה, עם transgene ביטוי בעיקר בתאי האנדותל luminal. מניסיוננו, זה בקלות הרבה ביותר שקובעת באמצעות וקטור המבטאת β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) צביעת מקטעי לעורק הצוואר נפוץ הוסר 3 ימים לאחר אינפוזיה וקטור, כמו גם מדידה של β-galactosidase mRNA (messenger RNA) עם שרשרת של פולימראז כמותיים שעתוק במהופך התגובה (לרביעיית-PCR), תחשוף יעילות, הפארמצבטית ומיקום של תאי transduced. לניסויים לחקור את ההשפעות של הביטוי transgene או למדוד את הפעילות של אלמנטים תעתיק cis אקטינג, אנו בדרך כלל מודדים transgene mRNA וגם אינדיקציה ראשונית של רמת הפארמצבטית של העברה גנטית.
מפעיל חדש במעבדה שלנו ביקשה להקים מיומנות בשיטה זו על-ידי transducing הארנב נפוצות עורק עם וקטור adenoviral (2 x 1011 סמנכ ל/mL) לבטא את transgene β-galactosidase, מונע על ידי cytomegalovirus (CMV) יזם. העורקים transduced שנקטפו 3 ימים לאחר מכן, נחתכו באופן רוחבי למקטעים. מקטעים בודדים היו אז גם החלק הפתוח axially או שמאלה כמו טבעות ללא פגע. כל המקטעים היו X-גל צבעונית microcentrifuge צינורות. חלקי נחתכו פתוח axially הונחו על משטח אופקי ועל פני השטח luminal מקסימאלית נחשף, באמצעות סיכות לפי הצורך כדי למנוע על הקטע של תבוסתנות. תמונות פנים en של משטחים luminal הראה מכתים אנדותל חזקים עם X-גל (דמויות 3A ו- 3B). תמונות ההדמיה של משטחים luminal של טבעות לעורק הצוואר ללא פגע הראה X-גל להכתים רק על פני השטח luminal (דמויות 3C ו- 3D). הקטעים זה נפתחה axially היו מעובד פרפין, למחלקה, נגד מוכתם או hematoxylin ואאוזין או הגרעין האדום מהר. תמונות הצג X-גל מכתים בעיקר בתחום אנדותל, למרות שיש כמות קטנה של צביעת שכבה adventitial (דמויות 3E , 3F). התמרה חושית של תאים adventitial יכול להתרחש באמצעות דליפה של וקטור דרך האתר arteriotomy או על ידי דליפה באמצעות סניפים קטן proximal לאתרים של צד סניף מצדו. 29
בניסוי נפרדים, מפעיל חדש ביקשה להקים מיומנות בהשגת רמות לשחזור ביטוי transgene, כהקדמה ניסויים שמטרתם לחקור פעילות ביולוגית של transgenes. ארנב בעורקים הנפוצים היו transduced עם העוזר תלוית אדנו (2 x 1011 סמנכ ל/mL) המכיל גם אפו של A-I (HDAdApoAI) או transgene IL-10 (HDAdIL10), שניהם תחת שליטה של מקדם CMV. העורקים transduced היו שנקטפו 3 ימים לאחר התמרה חושית וחותכים באופן רוחבי למקטעים. RNA שהופק מתוך כלי השיט מקטעים ולאחר apo א- ו -IL-10 mRNA ביטויים היו לכמת על ידי לרביעיית-PCR, עם נורמליזציה כדי גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) mRNA של אותה תמציות (איור 4). ב- HDAdIL10-transduced העורקים, רק 1 מתוך 6 העורקים היה נמוך מאוד, אבל לזיהוי apo A-אני אות ה-mRNA. כלומר הביטוי של apo A-אני mRNA היה גדול 700-fold של כלי transduced עם HDAdApoAI יותר בכלי transduced עם HDAdIL10. רמות נמוכות של mRNA IL-10 אנדוגני אותרו העורקים HDAdApoAI-transduced, עם ממוצע ביטוי מוגבר 6-fold בתוך העורקים HDAdIL10-transduced. ראוי לציין, אין ניכר artery אינטרה בין השתנות התמרה חושית ויעילות ביטוי transgene, כפי שמוצג דמויות 3 ו- 4, בהתאמה. אנו מוצאים ההשתנות אפילו עם נהגים מנוסים.
איור 1 . Arteriotomy של עורק תרדמני. מלקחיים בסדר משמשים כדי לתפוס את העורק הראשי adventitia ולהחיל גרירה כלפי מעלה על העורק. זה תמרון מרחיבה את כלי השיט לומן ומייצר משטח אנכי שלתוכו כפופות 19 ז המחט מוחדרת, ובכך מפחיתים את הסיכון של תקר הקיר האחורי של העורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . סגירת arteriotomy תרדמני נפוצות. Arteriotomy נסגר בתפר פוליפרופילן 7-0, באמצעות X-דוגמת מילוי. המעבר הראשון של המחט, תפר נכנס לומן עורק בתחתית נכון arteriotomy (אתר 1) ויוצא לומן בפינה השמאלית התחתונה (אתר 2). מחט תפר לחצות את arteriotomy ואת הזן מחדש לומן בפינה הימנית העליונה (אתר 3). המחט ואז ייסגר לומן בפינה השמאלית העליונה (אתר 4). המתיחה עדין בשני קצוות התפר סוגר את arteriotomy. הקצוות תפר (יציאה מן האתר 1 והאתר 4) קשורות עם 2 קשרים כיכר. עיגולים אפורים מייצגים באתרים של התפרים עובר דרך הקיר כלי. כקווים כחולים מלאים מציינים אזורים מחוץ הקיר כלי איפה התפר. קווים כחולים מנוקדים מציינים אזורים איפה התפר בתוך לומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . הביטוי transgene אנדותל יעיל. ארנב נפוצות עורק היו transduced עם וקטור adenoviral לבטא transgene β-galactosidase ושנקטפו 3 ימים מאוחר יותר. עורק transduced מקטעים היו מוכתמים טבעות שלם או לאחר שנפתח עם החתך צירית X-גל. (A-B) En תמונות פנים של משטחים luminal של טבעות העורק נחתכו פתוח axially. (C-D) תצוגות מפוח לחלל luminal של טבעות לעורק הצוואר ללא פגע. (E-F) X-גל צבעונית, פרפין-מוטבע מקטעי העורק היו למחלקה, נגד מוכתם או hematoxylin (E) ואאוזין או אדום מהיר גרעינית (F). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אני = אינטימה; M = מדיה; ו- A = adventitia. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . כימות של הביטוי mRNA transgene. ארנב נפוצות עורק היו transduced עם אדנו תלויי-המסייע לבטא גם apo A-I (HDAdApoAI) או IL-10 (HDAdIL10) תחת שליטה של מקדם CMV. העורקים נקטפו שלושה ימים לאחר מכן. הביטוי mRNA של A Apo (A)-אני ואת (B) IL-10 היו לכמת על ידי לרביעיית-PCR מנורמל ל mRNA GAPDH בעורק אותו, המבוטא ביחידות שרירותי (AU). בר מציין הערך הממוצע; ערך P הוא סכום-דרגה במבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| יתרונות | חסרונות | |
| לעומת מודלים מכרסמים | קרוב phylogenetically פרימטים | יקר יותר לרכוש בית |
| מגוון גנטי גדול, הקלות תרגום קליני | יותר קשה לגדל ולטפל | |
| ספינות גדולות יותר לאפשר מניפולציה כירורגי קל ומספקת יותר רקמות עבור ניתוח כמותי | דרישות רגולטוריות מקיפה יותר | |
| מאפשר שימוש של endovascular התקנים שנועדו עבור בני אדם | רקעים מהונדסים פחות | |
| מבחר פחות-נרחב של נוגדנים ארנב חלבונים | ||
| לעומת דגמים בעלי חיים גדולים | זול יחסית לרכוש בית | יכול להיות רלוונטי פחות קלינית מאשר דגמים אחרים בעלי חיים גדולים עבור כמה מחלות כלי דם |
| קל יותר לגדל ולטפל | ||
| בהשוואה נבט-קו Transgenesis | Transgene באה לידי ביטוי רק בעורק גדול; ההשפעה של transgene במיוחד באתר עניין יכול להיקבע | יישום השיטה לתאים חוץ אנדותל קשה |
| באפשרותך להשתמש בעורק contralateral כפקד מזווג; מבטל פרמטרים מערכתית (למשל., לחץ דם, רמת כולסטרול) כמשתנים בלתי מבוקרת | חדר הניתוח ומומחיות כירורגי חובה; ליבה של מתקנים סביר לא זמין | |
| תפוקה גבוהה יותר עבור בדיקות DNA רצף רגולטורי פעילות אנדותל קיבול גדול | Transgene לא יכול להתבטא רוב המיטות כלי דם | |
| שעשויות להיות מהיר יותר ויקרים פחות | ||
| חשיפה מערכתית לא סביר הטרנסגניים חלבון – מזעור תופעות את המטרה | ||
| לעומת גישות ריפוי גנטי מערכתית (למשל. התמרה חושית הכבד דרך הווריד היקפיים הזרקה) |
הביטוי transgene היציבה יותר מאשר טיפול מערכתי גנטי (כבד) | וקטור, משלוחים דורשים התערבות כירורגית |
| Transgene הביע בדופן העורק, המאפשר משלוח מקומי של רמות גבוהות של חלבון מהונדס | חדר הניתוח ומומחיות כירורגי נדרש | |
| חשיפה מערכתית לא סביר הטרנסגניים חלבון – מזעור תופעות את המטרה | הטיפול מוגבל העורקים המיועדים באופן ספציפי עבור התערבות; אינה מתייחסת גורמים מערכתית (למשל., שומנים) | |
| באפשרותך להשתמש בעורק contralateral כפקד מזווג; מבטל פרמטרים מערכתית (למשל, לחץ דם, רמת כולסטרול) כמשתנים בלתי מבוקרת | ||
| נמוך בהרבה וקטור במינון הנדרש |
טבלה 1. יתרונות וחסרונות של הארנב העורק נפוצות ג'ין אנדותל סלקטיבית העברה מודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היבטים מסוימים של טכניקה כירורגית ראויות תשומת לב מיוחדת. חשיפה מלאה והתגייסות של עורק תרדמני באמצעות ניתוח זהיר הרצון להקל על העברת גנים ותיקון arteriotomy. עם זאת, בזמן, טפלול ישיר של העורק הראשי צריך להיות ממוזער כדי למנוע vasospasm. בנוסף, דימום צמוד העורק להפסיקו על ידי הפעלת לחץ קל עם גזה, דם extravasated לנקותם באופן מיידי על ידי שטיפה באזור עם תמיסת מלח. זה חשוב גם למנוע נזק התועה, אשר פועל במקביל עורק תרדמני. זמירה את adventitia באזור של arteriotomy המתוכנן יעזור באופרטור כדי לבצע arteriotomy נקיים ופונקציונליים והן כדי לתקן את arteriotomy. לבסוף מתפצל עורק תרדמני חייב להיות מזוהה, מאתרים באופן מאובטח כדי למנוע דליפה של וקטור של לומן העורק.
ישנם גם היבטים קריטיים וקטור אינפוזיה ותיקון arteriotomy. במהלך וקטור אינפוזיה, חשוב distend שחתך את עורק הצוואר כדי קליבר פיזיולוגיים או מעט גדול יותר כדי להשיג התמרה חושית יעילה. בעת תיקון של arteriotomy, התפר צריך לחדור את הקיר כלי קרוב ככל האפשר את הקצוות של arteriotomy, ולא צריך נקיה הזן ועל יציאה לומן ולא לעבור axially דרך הקיר כלי. אם רק השכבות החיצוניות של הקיר כלי נמשכים ביחד כי התפר עובר axially דרך הקיר כלי ולא עובר בצורה רדיאלית דרך הקיר והזנת לומן, פער יישארו ב- אינטימה, הסיכון לפקקת יגדל. אם חדירות תפר ירווחו באופן נרחב מדי, או אם התפר הוא הידקו יתר כאשר קשורות, קפלי רקמה תיווצר באתר arteriotomy. קיפולים אלה לשבש את זרימת הדם למינריות נורמלי, גם הגדלת הסיכון פקקת. שמירה על מאפייני הזרימה עקביים חשוב עבור ניסויים שבוצעו במודלים חייתיים של מחלות (למשל., טרשת עורקים) כי הזרימה שינו יכול לתרום תהליך המחלה30.
אופרטורים חדשים בדרך כלל נתקלים thrombosed העורקים-קציר. פקקת luminal הוא סיבוך הרסנית, עיבוד העורק שמיש בתור דוגמה ניסיוני. למניעת פקקת, אנחנו מפקחים באופן שגרתי הפארין הרביעי לפני העברה גנטית. פקקת גם נמנעת באמצעות סגירת זהיר arteriotomy, כפי שתואר לעיל. המינון הפארין יכול להיות מוגברת למניעת פקקת, או אספירין יכול להינתן במשככי. עם זאת, מינון גבוה יותר של הפארין גם להגדיל את פוטנציאל סיבוכים דימום, אספירין יכול להפריע נקודות הקצה ניסיוני, במיוחד אם הוא נחקר דלקת. לכן, עדיף להתמקד בטכניקה כירורגית משופרת, כאמצעי למניעת פקקת.
אם מניפולציה גם נמרצות, עורק עלול לעבור עווית, יכול לתרום גם פקקת על ידי הפחתת זרימה. אם הוא נתקל vasospasm, זה ניתן להקל על-ידי יישום של papaverine אקטואלי. כאשר כלי הקציר מתוכננים עבור יותר מ 2-3 ימים לאחר התמרה חושית, פקקת היא דאגה, אולטרסאונד transcutaneous ניתן להעריך noninvasively כלי patency. גילוי thrombosed העורקים עשויה להוביל המתת חסד כדי לחסוך עלויות הדיור. בעלי חיים נוספים יכול גם להיות רשום, למלא קבוצות הניסוי. פרי - ו פוסט - intervention התמותה שכרוכות בשיטה זו צריכה להיות < 1% (כלומר., לא שונה התמותה המשויך ניתוחים אחרים מתבצע על ארנבים בריא)31.
לאחר אופרטור הופך נוח עם ההיבטים הטכניים של פרוטוקול כירורגי, היכולת לבצע העברה גנטית יעיל לצרכים אנדותל, לאימות באמצעות הגישות המתוארות בסעיף לעיל על תוצאות נציג. אם מתעוררות בעיות עם השגת העברה גנטית לשחזור, האשם סביר באחד בשני תחומים. אחרי הספינה הוא מבודד הדם נשטף של לומן, חשוב להסיר את המאגר לשטוף DMEM כך הפתרון חדורים וקטור הוא לא מדולל במהלך התמרה חושית. היבט חשוב אחר הוא distend את הכלי כדי קליבר פיזיולוגיים או מעט גדול יותר במהלך וקטור אינפוזיה. בגלל, מניסיוננו, עורק הצוואר לא נפוחה באופן מלא או לא להישאר נפוחה במהלך העירוי 20 דקות אמין יש ביטוי transgene נמוך, סביר להניח כי התנפחות של העורק כדי קליבר הפיזיולוגיות משפר את התמרה חושית יעילות. עם זאת, יש מעולם לא למדנו את זה באופן שיטתי. זה אפשרי כי הגדלת הלחץ אינפוזיה מעל רמות פיזיולוגיים יכול להגביר את היעילות התמרה חושית, ולאפשר גם רמות גבוהות יותר של התמרה חושית של תאים בתקשורת כלי הדם. אולם, שיבוש של המכשול אנדותל ככל הנראה נזק את כלי הקיבול, להגדיל את הסיכון לפקקת. אם הכלי לא נותר נפוחה במשך תקופת כל 20 דקות וקטור-הדגירה, סביר להניח כי וקטור דולף של ענפי עורק תרדמני. להיות זהיר במהלך ניתוח כדי לזהות מאתרים ומפסיקים את כל הענפים כדי למנוע דליפה של וקטור של לומן העורק.
בשיטה זו יש מספר מגבלות הקשורות לשימוש של ארנבים. ארנבים יקרים פחות בית ולהאכיל יותר חיות גדולות אחרות (כלבים, חזירים, כבשים); עם זאת, העלויות של רכישת, דיור, מאכיל ארנבים הם במידה ניכרת יותר עבור עכברים וחולדות. מתקני חדר הניתוח ודרישות רגולטוריות לניתוח הארנב הם גם הרבה יותר נרחב מאשר למכרסמים. בנוסף, ניכרת מומחיות טכנית יש צורך לבצע ביעילות את פרוטוקול העברת הגן כירורגית. מומחיות זו ניתן לרכוש באמצעות מפעילי שעברו אין תרגולי רשמית. לפחות 2 אנשים בקבוצה שלנו (כולל המחבר הראשי של כתב יד זה) יש ללמוד את טכניקות ניתוחיות, להחיל אותם באופן פרודוקטיבי. למרות זאת, אימונים קפדני ובדיקת זהיר של יעילות העברת גנים של אופרטור הפארמצבטית (כמתואר בסעיף התוצאות נציג) נדרשים לפני האופרטור להתחיל להפיק נתונים באיכות גבוהה.
ההסגר של ביטוי transgene באופן כמעט בלעדי אנדותל עם שיטת29,32,33,34,הזה35,36,37 אפשרות זו שימושית בכך שהיא מאפשרת חקירת תופעות transgene בתאי האנדותל ומדידה של פעילות של חבר העמים אקטינג רצפי DNA תקינה בתאי האנדותל. יכול להיות transduced מספר קטן של תאים adventitial או המדיאלי; אולם, היכולת של שיטה זו יעילה מגלי תאים nonendothelial מונע את היישום של השיטה במחקר של סוגים אחרים של תאים קיר כלי הדם (כגון תאי שריר חלק, מקרופאגים). למרות ביטוי של חלבונים המופרש מתאי אנדותל transduced יכול לאפשר חקירת ההשפעות של חלבונים אלו על אחרים תא וסקולרית יקליד, התפקידים של חלבונים שאינם מופרש אלה סוגי תאים כלי דם אחרים (למשל-קולטנים או חלבונים המעורבים אותות) לא ייחקר בשיטה זו.
כאמצעי לבדיקת הטיפול הגנטי, ממוקדות קיר העורק, השיטה שונה משיטות אחרות פרה בשתי דרכים עיקריות. ראשית, השיטה משתמשת מודל ארנב עבור ויוו בדיקות של טיפול גנטי ולא יותר נפוץ מודלים מכרסמים8,12,15,38,39. השימוש של ארנבים מאפשרת הערכה של הביטוי transgene ואת התפקיד הביולוגי של המוצר transgene במודל חיה outbred, אשר מייצג יותר של מגוון גנטי אנושי מאשר הם מכרסמים המפגרים. המודל יכול לשמש כדי להעריך ריפוי גנטי או העורקים רגילה או בכל העורקים ארנב שיש פתולוגיה עורקי הדומה לזה שנמצא העורקים אדם חולה. ארנב העורקים גם קרובים יותר בגודל של העורקים האנושית מאשר העורקים מכרסמים ומספקים רקמות הרבה יותר לניתוח יותר זמין של העורקים מכרסמים. ההבדל השני הוא כי שיטה זו משתמשת בגישה כירורגית כדי לספק transgene וקטור אנדותל כלי הדם. ריפוי גנטי סומאטית לעיתים קרובות מועבר מערכתית, לעתים קרובות על ידי מיקוד הכבד עם המטרה של שינוי פלזמה רמות של transgene חלבון25,40. על ידי מיקוד אנדותל כלי הדם, השיטה מספקת המוצר transgene טיפולית באופן מקומי, עם ריכוז שיא שלה בתוך קיר העורק, בדיוק איפה הוא נחוץ לטיפול מחלת כלי דם. על ידי מסירת את transgene רק באופן מקומי, השיטה מבטלת גם תופעות לוואי מערכתית של המוצר transgene. קבוצות אחרות מפתחים שיטות באמצעות פפטידים, נוגדנים או שינויים אחרים capsid הכוונת וקטורי מערכתית מוזרק אנדותל בריא או חולה לספק ג'ין וסקולרית מקומית טיפול41,42 , 43. עם זאת, בהן מיקוד שיטות להישאר תחת פיתוח, הם עדיין מסובך התמרה חושית מערכתית משמעותי, במיוחד ב-43,הכבד42,44. שיטה כירורגית שלנו מספקת מדויק ויעיל הקדמה של transgenes אנדותל כלי הדם עם מינימלית - אם בכלל - התמרה חושית במקומות אחרים. 1 השיטה הוא גם יותר נוח, יעיל, ו גבוה יותר-לכל אורך ממוצע (לעומת transgenesis נבט-קו או הזרקת מערכתית של וקטורים אנדותל במיקוד) לבדיקת הפעילות של רצפי DNA תקינה כלי גדול אנדותל, לתפקוד החלבון transgene הבדיקה בקיר העורק ולאחר בדיקה ריפוי גנטי כלי-קיר-ממוקד.
שיטה זו מאפשרת חקירה התפקיד הביולוגי של כל transgene, כאשר זה מתבטא אנדותל עורק גדול. אם שינוי כדי לבטא אובדן-של-פונקציה ריאגנטים כגון קולטנים שליליים דומיננטי או סיכת ראש קצר RNA, זה מאפשר חקירה של התפקידים של חלבונים אנדותל אנדוגני, איתות המסלולים. השיטה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הפעילות תעתיק של כל רצף ה-DNA cis אקטינג בעורק הראשי תאי אנדותל5,6,7. בנוסף, השיטה מאפשרת בדיקה של כל סוג של גן וקטור העברה יעילות ובטיחות כאשר נמסר באופן מקומי אנדותל, תחשוף את היכולת של וקטור להשיג ביטוי transgene עמיד. לבסוף, השיטה מאפשרת פיתוח ובדיקות של שילובים של וקטורים, transgenes שנועדו לספק טיפול גנטי, ממוקדות קיר כלי הדם. השיטה יכול לשמש ככלי מיון לזיהוי גנים טיפוליים, זה אולי-בעתיד-ניתן להעביר את אנדותל של כל העורקים הראשיים (או כל חולה עורקים גדולים) מאת percutaneously מוזרק וקטורים, ממוקדות קיר כלי הדם. בגלל חסינות קיימים בבני אדם אדנו סוג 545, זה להיות מאתגר להשתמש אדנו סוג מבוסס-5 וקטורים ביישומים קליניים. הנדסה של capsid אדנו 5, שימוש אדנו חלופי אשר נגרמו מהזנים אליהם46, או השימוש וקטורים פחות-immunogenic כגון AAV העשויים להידרש להביא ריפוי גנטי וסקולרית למרפאה. כלי ניסיוני, עם זאת, אנחנו מודעים לכל וקטור יכול להתחרות עם אדנו תלויי-helper 5 בהשגת transgene עמיד ויעיל ביטוי כלי הדם1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים AdVec, inc. רשות להשתמש HDAd ריאגנטים, ג'וליה Feyk לסיוע מינהלי, ואת המחלקה לרפואה השוואתי הוטרינריים לייעוץ כירורגי ותמיכה. עבודה זו נתמכה על ידי HL114541, קרן צדקה של ג'ון לוק, ג ' ל'.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
- Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
- Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
- Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
- Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
- Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
- Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
- Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
- Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
- Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J. Experimental atherosclerosis in rabbits. Arq Bras Cardiol. 95 (2), 272-278 (2010).
- Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
- Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
- Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
- Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
- Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
- Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
- Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
- Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
- Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
- Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
- Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
- Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A. Endothelium-specific in vivo gene transfer. Circ Res. 77, 475-485 (1995).
- Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
- Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
- Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
- Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
- Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
- Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
- Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
- Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
- Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
- Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
- White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
- Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
- Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
- Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).
