Summary
Questo metodo è quello di introdurre un transgene nell'endotelio delle arterie carotiche coniglio. Introduzione del transgene permette di valutare il ruolo biologico del prodotto transgene in arterie normali o modelli di malattia. Il metodo è anche utile per misurare l'attività di sequenze regolatrici del DNA.
Abstract
L'obiettivo di questo metodo è quello di introdurre un transgene nell'endotelio dei segmenti isolati di entrambe le arterie carotiche comuni di coniglio. Il metodo raggiunge focale transgenesi endoteliale selettivo, consentendo in tal modo un investigatore per determinare i ruoli biologici di transgeni endoteliale-espresso e quantificare l'attività trascrizionale in vivo delle sequenze di DNA in grande arteria cellule endoteliali. Il metodo utilizza isolamento chirurgico delle arterie carotiche comuni di coniglio e un'arteriotomia per consegnare un vettore virale che esprimono transgene interno del lume arterioso. Un periodo di incubazione breve del vettore nel lume, con successiva aspirazione del contenuto lumen, è sufficiente per realizzare efficiente e durevole espressione del transgene nell'endotelio, con nessun rilevabile trasduzione o espressione di fuori della segmento arterioso isolato. Il metodo consente la valutazione delle attività biologiche del transgene prodotti sia in arterie normali modelli di malattia vascolare umano, evitando effetti sistemici che potrebbero essere causati da targeting genico ad altri siti (ad es. il fegato) o per l'approccio alternativo di erogare costrutti genetici all'endotelio di transgenesi linea germinale. Applicazione del metodo è limitata dalla necessità di un chirurgo esperto e anestesista, una ben attrezzata sala operatoria, i costi di acquisto e alloggiamento conigli e la necessità di esperienza nella costruzione di vettore di trasferimento genico e uso. Risultati ottenuti con questo metodo includono: alterazioni relative transgene in struttura arteriosa, cellularità, matrice extracellulare o funzione vasomotore; aumenti o riduzioni di infiammazione arteriosa; alterazioni nell'apoptosi delle cellule vascolari; e progressione, ritardo o regressione di malattie come l'iperplasia intimale o aterosclerosi. Il metodo consente inoltre di misurare la capacità di nativi e sintetici sequenze regolatrici del DNA per alterare l'espressione del transgene in cellule endoteliali, fornendo risultati che includono: livelli di transgene mRNA, i livelli di proteina transgene e livelli di transgene attività enzimatica.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di introdurre un transgene nell'endotelio delle arterie carotiche comuni di coniglio. Introduzione del transgene permette di valutare il ruolo biologico del prodotto transgene sia in arterie normali modelli di coniglio della malattia arteriosa umana. La sovraespressione del transgene in modelli di malattia può rivelare se il transgene (e il suo prodotto proteico) mostrano la promessa come agenti terapeutici1,2,3,4. Inclusione di elementi regolatori cis-acting in cassetta di espressione del transgene consente la valutazione dell'attività di questi elementi nell'endotelio arterioso in vivo5,6. Conoscenza dell'attività di specifici elementi regolatori cis-agenti può essere utilizzato per progettare cassette di espressione più attivi e per sondare i meccanismi di regolazione genica in grande arteria endotelio in vivo7.
I conigli sono un modello valido per vari aspetti della fisiologia vascolare umana e malattia. Conigli condividono molte caratteristiche vascolari con gli esseri umani. Ad esempio, valori ematologici basali, regolamento emostatico e vascolare tensione longitudinale sono simili tra conigli e gli esseri umani8. Modelli di coniglio di malattie vascolari replicano le caratteristiche principali di molte malattie umane, inclusi: aneurismi (simili caratteristiche di flusso e geometrici)9, vasospasmo (simile risposta a trattamento endovascolare)10,11, e aterosclerosi (placche intimal con caratteristiche simili, tra cui un nucleo ricco di lipidi, macrofagi e cellule muscolari lisce in un cappuccio fibroso)12,13. Di conseguenza, sono stati sviluppati modelli di coniglio per molte malattie vascolari come trombosi, vasospasmo, aneurisma, diabete, stenosi vascolare dell'innesto e aterosclerosi8,13,14, 15,16.
Per i ricercatori scegliendo tra modelli animali di fisiologia vascolare e nella malattia, il coniglio ha diversi vantaggi. Rispetto ai roditori, i battelli più grandi dei conigli permettono più facile manipolazione chirurgica, uso di dispositivi endovascolari e una maggiore quantità di tessuto per le misure quantitative. I conigli sono molto più vicini filogeneticamente ai primati che sono roditori17, e la maggiore diversità genetica dei conigli nazionali meglio approssima la variabilità genetica degli esseri umani. Diversità genetica è particolarmente importante per gli studi preclinici, che-per loro natura-obiettivo di sviluppare terapie che possono essere applicate alla popolazione umana geneticamente diversa. Come con molti se non tutti gli altri specie modello, geni di coniglio sono facilmente clonati o sintetizzati perché è stato sequenziato il genoma di coniglio con alta copertura (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Rispetto ad altri modelli animali grandi (ad esempio, cani, maiali o pecore), i conigli sono relativamente poco costosi da acquistare e casa e sono più facili da allevare e gestire. Modelli specifici di malattia vascolare in conigli ogni hanno i loro vantaggi e difetti come modelli di malattia umana che esulano dall'ambito di questo manoscritto8,12,18. Un investigatore dovrebbe rivedere questi vantaggi e difetti per determinare se il coniglio è il modello migliore per rispondere ad una domanda specifica sperimentale.
Introduzione di sequenze regolatrici di acido desossiribonucleico (DNA) in cellule endoteliali in vivo consente di indagine dell'attività di queste sequenze in un ambiente fisiologico complesso. Studi in vitro in cellule trasfettate endoteliale possono essere utile per la valutazione iniziale delle sequenze regolatrici del DNA; Tuttavia, i livelli di espressione in modelli di coltura del tessuto a volte non vengono riprodotti quando gli studi sono ripetute in vivo5,19,20. Sistemi in vitro possono anche essere utili per esplorare la base delle vie di segnalazione proteica e la fisiologia endoteliale, nonché comunicazione tra cellule vascolari coltivate; Tuttavia, le vie più complesse o reti di regolazione che sono influenzati da complesse popolazioni di cellule vascolari vicine o il sistema immunitario migliore sono studiate in un in vivo sistema6,20. Il metodo descritto nel presente documento fornisce una piattaforma per esplorare la regolazione dell'espressione del transgene nell'endotelio nel contesto di una nave intatta, con o senza malattia. Il sistema in vivo permette anche indagine di crosstalk cellular fisiologiche e patologiche e l'identificazione dei contributi del sistema immunitario alla regolazione del gene espressione6.
Germe-linea transgenesi (soprattutto nei topi) sono un approccio alternativo per dirigere l'espressione del transgene alle cellule endoteliali. Questo approccio può fornire l'espressione del transgene tutta la vita, con il targeting endoteliale mediata da specifici promotore o regioni regolative21,22. Tuttavia, la generazione di topi transgenici è lungo e costoso, diverse linee transgeniche devono essere spesso testati per garantire il targeting del transgene per il tipo di cella desiderata e il raggiungimento dei livelli di espressione del transgene adeguata e sperimentale Risultati in sistemi murini possono essere ceppo-dipendente. Modelli murini transgenici con transgeni endoteliale-mirati hanno molti vantaggi: non c'è alcuna necessità di eseguire un intervento chirurgico su ogni animale sperimentale al fine di raggiungere la transgenesi, topi sperimentali possono essere allevati con numerosi altri topi transgenici disponibili in ordinare per testare interazioni genetiche e fenotipiche, e c'è una vasta selezione di anticorpi che reagiscono con le proteine murine, facilitando la caratterizzazione dei fenotipi. Tuttavia, targeting di transgeni all'endotelio tramite la linea germinale in genere comporta l'espressione del transgene in tutto il sistema vascolare,22 rende difficile determinare il sito in cui agisce il prodotto del transgene. Questo è particolarmente vero quando il prodotto del transgene è secreto, perché un transgene prodotto secernuto dalle cellule endoteliali in tutto il sistema vascolare potrebbe avere attività biologica in un numero qualsiasi di siti all'interno di un animale. Anche se il metodo descritto in questo manoscritto richiede competenze tecniche e strutture specializzate, può essere molto meno tempo e meno costoso di sviluppare una linea di topi transgenici endoteliali specifici. Esso consente la valutazione della funzione di una proteina selettivamente nelle cellule endoteliali di un segmento di grande arteria, e permette l'uso della carotide comune controlaterale come controllo appaiato (eliminando i fattori sistemici che possono variare tra sperimentale animali-ad esempio, la pressione sanguigna o livelli di colesterolo-come variabili incontrollate).
La terapia genica è un approccio promettente per il trattamento delle malattie vascolari, malattie croniche in particolare, perché una singola applicazione in grado di fornire sostenuta o forse tutta la vita l'espressione di un gene terapeutico23. La promessa terapeutica della terapia genica è stata esplorata in modelli animali di trasferimento genico somatico, spesso il fegato24,25, che è un obiettivo relativamente facile perché molti vettori virali ematica sono hepatotropic di targeting. Tuttavia, per avere un effetto sulla malattia vascolare, terapia genica mirata al fegato dovrà raggiungere sistemica iperespressione delle proteine. Ciò richiede in genere grandi dosi di vettore, che può essere tossico o addirittura mortali26. Inoltre, ha aumentato i livelli sistemici di un aumento di proteine, il rischio di effetti collaterali fuori bersaglio, che potrebbe complicare o oscurare anche interpretazione dei risultati sperimentali. Terapia genica locale targeting endotelio vascolare come descritto in questo manoscritto potrebbe evitare effetti collaterali sistemici perché il vettore infuso non è ampiamente diffusi oltre il segmento arterioso trasdotte, e gli effetti vascolari locali possono essere realizzati senza cambiamenti nei livelli di plasma sistemica della proteina. 27 inoltre, è necessaria una quantità nettamente inferiore di vettore di trasdurre un segmento arterioso in quanto è necessario per raggiungere robusto trasduzione epatica. L'espressione del transgene dal fegato è stata segnalata a diminuire nel tempo, probabilmente a causa del turnover cellulare, che richiedono dosi ripetute se l'espressione del transgene ad alto livello deve essere mantenuta. 28 al contrario, il tasso di turnover basso dell'endotelio fornisce espressione stabile per almeno 48 settimane in conigli alimentati chow e per almeno 24 settimane in lesioni aterosclerotiche dei conigli di colesterolo-federazione. 1 , 27
Per determinare se questo metodo di trasferimento del gene ad endotelio carotica comune coniglio è appropriato, i vantaggi e gli svantaggi (tabella 1) dovrebbero essere considerati nel contesto degli obiettivi specifici di ricerca. I vantaggi di questo metodo includono: conigli nazionali sono maggiormente rappresentativo della diversità genetica umana che sono topi inbred (importanti per lavoro preclinico); conigli forniscono più grandi vasi per manipolazione più facile e più tessuto per l'analisi; l'espressione del transgene mirati dell'endotelio può raggiungere il metodo molto più rapidamente di quanto non germe-linea endoteliale di targeting in topi transgenici; dose di vettore può essere facilmente regolata a livelli variabili di modello di espressione del transgene; è possibile analizzare i processi specifici di grande arteria endotelio; e transgenesi vascolare locale permette la carotide opposta nello stesso animale per essere utilizzato come controllo, eliminando i fattori sistemici come variabili incontrollate. Gli svantaggi includono: speciali strutture e competenze sono necessarie; Sfondi meno geneticamente modificati su cui sperimentare sono disponibili in conigli che nei topi; e c'è una selezione meno estesa di anticorpi di coniglio contro proteine del topo (per immunodetection di transgene proteina ed altri antigeni che possono essere importanti nell'interpretazione dei risultati sperimentali).
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'Università di Washington Office of Animal Welfare e associato istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e sono stati completati in conformità e rispetto di tutte le pertinenti normative e istituzionali linee guida.
Nota: Il trasferimento del Gene ad arterie carotiche comuni coniglio viene eseguita sui conigli da un chirurgo con l'ausilio di un anestesista o un assistente.
1. trasferimento del Gene per le arterie carotiche comuni di coniglio: pre-operazione di
- Anestetizzare il coniglio. Pesare il coniglio. È possibile combinare 30 mg/kg ketamina e 2 mg/kg xylazina in una siringa. Iniettare chetamina/xilazina intramuscolare (IM) nei muscoli paraspinali per indurre l'anestesia.
- In attesa di coniglio diventare anestetizzati, preparare la stanza della preparazione e tabelle della sala operatoria (OR).
- In camera OR preparazione: mettere la pomata oftalmica e la patch fentanil alla portata della tabella di preparazione; impostare tosatrici e un vuoto per la rasatura il coniglio collo e orecchio; mettere da parte un rilievo della preparazione dell'alcool, un catetere 24 x ¾", un foro di iniezione e nastro chirurgico per garantire la via endovenosa (IV) nella vena dell'orecchio del coniglio.
- In sala operatoria: impostare l'apparecchiatura di monitoraggio e la posizione di sonde [elettrocardiogramma (ECG), saturazione di ossigeno (SpO2), temperatura] sul tavolo OR; preparare l'ossigeno e isoflurano; legare la striscia di garza per la maschera del viso per fissarlo al coniglio e posizionare la maschera sul finale della testa della tabella.
Nota: Le strisce di garza legate sulla maschera viso dovrebbero avere 2 code di circa 45 cm. - Accendere il riscaldamento coperta di acqua sul tavolo OR. Sopra coperta di acqua, posizionare un asciugamano arrotolato per supporto collo e una piastra elettrodo dispersivo (più successivamente disposto dietro la schiena di coniglio).
- Impostare la pompa o IV con 100 mL di una soluzione salina IV sacca con un ago di 18-19G associata e impostare la portata a 10 mL/h / kg.
- Unire 1 mL di lidocaina HCl (soluzione 2%) e 1 mL di lidocaina HCl (0,5% soluzione) in una siringa, per essere usato come un analgesico locale.
- Quando il coniglio è completamente anestetizzato, preparare il coniglio per la chirurgia.
Nota: Check per la mancanza di una reflex pedale (pizzico a toe; aspetto per il ritiro dell'arto) per garantire profondità anestetica e continuare a monitorare il riflesso pedale durante la chirurgia.- Applicare unguento oftalmico per gli occhi. Rimuovere le feci dal retto del coniglio premendo con le dita guantate sull'addome inferiore anteriore (di sopra del retto) e muovendo le dita verso l'ano. Ciò consentirà per il successivo posizionamento di una sonda di temperatura rettale.
- Radere il collo anteriore dalla tacca sternal al bordo della mandibola durante l'utilizzo di un vuoto per tenere pulita la zona. Anche la barba entrambe le orecchie per il posizionamento del IV e l'allegato di patch fentanil e radere una punta centrale posteriore di sinistra per la sonda pulsossimetria.
Nota: Il protocollo presuppone che il chirurgo sia sul lato destro del coniglio per l'intera procedura. Se il programma di installazione OR inserisce il chirurgo sul lato opposto, invertire i lati in questo passaggio per tenere i fili e IV fronte del chirurgo. I lati dei passi futuri devono essere spenta anche se necessario. - Pulire l'orecchio sinistro con un tampone di alcool prep, posizionare un catetere di IV 24G nella vena orecchio sinistro, cap con il foro di iniezione e nastro il catetere all'orecchio del coniglio per fissarlo. Applicare una patch fentanil (25 µ g/h) per orecchio destro del coniglio.
- Il coniglio di trasporto in sala operatoria e posto in posizione supina sul tavolo operatorio con un asciugamano di supporto collo arrotolato sotto il collo del coniglio appena sotto la testa. Estendere delicatamente collo del coniglio fino a quando è dritto e circa orizzontale.
- Agganciare il coniglio fino alla maschera con O2 su a 1 L/min e iniziare la somministrazione di isoflurano. Fissare la maschera avvolgendo le estremità della striscia di garza legato alla maschera intorno l'asciugamano di sostegno del collo sotto il coniglio. Regolare, isoflurano (in genere 1-2%) come necessario (basata sulla frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e pedale reflex) per mantenere l'anestesia adeguata per il resto della procedura.
- Assicurarsi che la piastra elettrodo dispersivo è centrata sotto la schiena del coniglio. Posizionare le sonde di temperatura e ossimetro di impulso e applicare la EKG conduce al coniglio.
- Agganciare con soluzione salina IV alla porta catetere nell'orecchio del coniglio, avviare la pompa Salina a 10 mL/h / kg.
Nota: Dopo 1 h, la pompa Salina può essere ridotto a 5 mL/h / kg. - Trattenere le zampe anteriori del coniglio liberamente legandoli alla tabella. Facoltativamente, posizionare un tavolino di plastica sopra il coniglio per proteggere il coniglio da essere sottoposto a pressione al petto/addominale dal chirurgo che si appoggia su torace/addome di coniglio.
Nota: Il tavolino può aiutare a prevenire forzato rigurgito del contenuto addominale. - Iniettare 2 mL di lidocaina precedentemente preparata (2% delle scorte) / bupivacaina (0,5% stock) (mix 50/50) per via sottocutanea lungo la linea di incisione del collo pianificato per l'anestesia locale.
- Lasciate che l'Assistente di preparare il sito chirurgico con 3 alternando scrub di clorexidina e isopropanolo e poi una bomboletta spray con betadine. Macchia, abito e guanto, seguendo un'adeguata tecnica asettica.
Nota: Il chirurgo dovrebbe indossare lenti di ingrandimento chirurgiche per aiutare con la prima metà della chirurgia: 2x. Durante l'intervento di sopravvivenza è fondamentale per mantenere la sterilità del chirurgo e del campo chirurgico. Solo l'assistente dovrebbe gestire eventuali elementi non sterili, e materiali sterilizzati devono essere passati al chirurgo o posizionati sul tavolo drappeggiato strumento asetticamente. Asciugamani sterili possono essere utilizzati dal chirurgo per mantenere la sterilità durante la manipolazione delle attrezzature non sterili come il microscopio.
2. sopravvivenza chirurgia (trasferimento del Gene)
- Preparare gli strumenti e il campo sterile.
- Lasciate che l'Assistente di aprire la confezione del telo sterile contenente un drappo di tabella, un drappo di carta per il coniglio e molti asciugamani. Trasferire asetticamente gli elementi per il chirurgo.
- Drappo portamoduli. Inserire i 6 asciugamani sterili e la carta drappo sul tavolo drappeggiato.
- Con 4 asciugamani, drappo collo del coniglio, lasciando solo il sito chirurgico esposto (circa 4 cm x 10 cm). Posare il telo di carta sopra il coniglio.
- Lasciate che l'assistente aprire la confezione sterile strumento e posizionare in modo asettico sul tavolo per strumenti.
- Lasciate che l'assistente aprire le seguenti attrezzature e asetticamente posto sul tavolo per strumenti o mano al chirurgo: tre 1 mL siringhe (ed un ago se le siringhe non sono già caricate con gli aghi), una siringa da 20 mL, un ago 21G, un ago 19G, 3-0 poliglicolico sutura acido (PGA), sutura PGA 5-0, 7-0 suturare del polipropilene e due 24 G IV-cateteri.
- Fissare il cavo di elettrocauterizzazione per il drappeggio di coniglio usando il 7.25" Kantrowitz forcipe e quindi rilasciare la spina alla fine fuori del tavolo. Collegare il cavo all'unità elettrochirurgia e accendere l'apparecchio, lasciare che l'assistente.
- Riempire una siringa da 20 mL con soluzione salina sterile, disegnata da un sacchetto di IV o flaconcino tenuto dall'assistente. Utilizzare questa soluzione salina come necessario per mantenere il tessuto esposto umido durante la procedura.
- Preparare una siringa da 1 mL con 1 mL di Medium di Eagle per volta di Dulbecco (DMEM, per lavare l'arteria). Per ogni arteria carotica che verrà essere trasdotte, 0,35 mL di virus diluito sono necessari. Se il virus stesso viene utilizzato per entrambi i lati, è possibile preparare una siringa da 1 mL con virus diluito in DMEM a un volume di 0,7 mL. Se diversi lati stanno ricevendo diversi virus [ad esempio un controllo virus "Null" su un lato], preparare due siringhe da 1 mL, ciascuna con 0,35 mL di soluzione di virus. Per l'adenovirus helper-dipendente, la concentrazione di virus è 2 x 1011 particelle virali (vp) / mL.
Nota: Lasciare che l'Assistente di preparare il virus. Il chirurgo redige sospensione DMEM e virus in siringhe sterili. - Praticare un foro nel drappo. La dimensione del foro deve essere la stessa dimensione come il sito chirurgico sul collo del coniglio che è incorniciato dagli asciugamani al punto 2.1.3. Fissare gli angoli del foro nel drappo di carta per gli asciugamani sottostanti che sono poggiate sopra il collo del coniglio con i morsetti di asciugamano.
- Isolare le arterie carotiche comuni.
Nota: 2 x lenti di ingrandimento chirurgiche dovrebbero essere utilizzati per questa parte.- Tagliare la pelle con un elettrocauterio lungo la linea mediana che si estende circa 7-9 cm cranialmente verso la mandibola e la fascetta all'aperto di pelle con morsetti di asciugamano.
- Fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con l'elettrocauterio verso l'estremità caudale. Quindi inserire le forbici grandi nel taglio e sezionare senza mezzi termini la fascia lungo intera linea mediana. Tagliare la fascia dissecata giù la linea mediana con l'elettrocauterio.
- Con piccole forbici per dissezione, sezionare tra i muscoli a forma di V (muscolo sternocephalic) e il muscolo sternohyoid sopra la trachea, per esporre le arterie carotiche comuni, a partire dal lato destro.
- La dissezione dell'arteria carotica comune di destra libero dai tessuti, dividendo tutti i rami, dalla base del collo caudalmente fino all'incrocio del nervo pharyngeal cranialmente circostanti. Uso chirurgico silicio loop per aiutare alla retrazione dell'arteria durante la dissezione.
Nota: Si dovrebbe prestare attenzione a non disturbare il nervo vago che corre parallelo alla carotide comune o i nervi più piccoli che attraversano la carotide comune. - Lega i qualsiasi grandi rami venuta fuori l'arteria carotica comune (1-2 per lato) con i suturare di seta 5-0 prima del taglio del ramo distale per liberare un segmento di 4-5 cm della carotide. Tagliare dei rami 1-2 mm dalla cravatta in modo che la cravatta non scivolare.
- Ripetere la dissezione sul lato sinistro (punti 2.2.3 - 2.2.5).
- Infondere vettori in arterie carotiche comuni.
Nota: Un microscopio chirurgico (16x) è utilizzato come necessario per l'esecuzione di arteriotomia, l'infusione di soluzione di controllo di vettore e la riparazione di arteriotomia.- Rimuovere le lenti di ingrandimento chirurgiche dal chirurgo e spostare il microscopio operatorio in posizione, lasciare che l'assistente. Drappo un asciugamano sterile sopra il microscopio per consentire la manipolazione del microscopio senza contaminare il campo sterile.
- Iniettare l'eparina [150 unità internazionali (IU) / kg] del catetere IV e a filo con 10 mL di soluzione fisiologica.
- Ritorno alla carotide comune di destra isolata, mettere due cravatte di seta intorno la metà di-parte del segmento carotica mobilitato e cravatta un singolo nodo alla marinara su ciascuno - senza stringerle.
- Piegare l'ago 19g appena sopra la smussatura a circa 80° utilizzando il driver di grosso ago (non piegare la smussatura; Figura 1).
- Bloccare l'arteria a ciascuna estremità del segmento isolato con clip vascolari, ponendo la clip cranica in primo luogo per consentire riempimento dell'arteria e poi mettendo la clip caudale.
- L'arteria carotica comune la puntura con l'ago 19g piegato solo cranica alla caudale clip vascolari, facendo molta attenzione a non forare le pareti posteriore o laterale. Avanzare la punta dell'ago nel lumen e prelevare due volte per assicurarsi che arteriotomia attraversa completamente la parete dell'arteria. Quindi estrarre delicatamente l'ago.
Note: È importante creare un'arteriotomia che penetra tutti gli strati della parete dell'arteria in modo pulito e non sezionare la parete dell'arteria (passando assialmente attraverso il adventitia e media). A tale scopo, dovrebbe essere perforata la carotide con la punta dell'ago posizionata più vicino possibile ad un angolo di 90° contro la parete dell'arteria (Figura 1). Carotica puntura a un angolo di 90° è aiutata afferrando l'arteria di adventitia con una pinzetta e si sollevano delicatamente la superficie di arteria mentre si preme la punta dell'ago appena caudale fino al punto di sollevamento. Questa manovra riduce anche il rischio di colpire la parete posteriore (Figura 1). - Spiegare e mazzo-up diversi rilievi di garza in un nido su cui adagiare la siringa utilizzata per le infusioni. Posto il nido sul petto del coniglio caudale all'incisione.
- Mettere un catetere IV sulla siringa contenente solo DMEM (non troppo stretto) e piegare il catetere ~ 4 mm dalla punta in modo che la curva tiene a circa 75° dopo il rilascio.
- Inserire il IV-catetere nell'arteria fino al punto di curvatura e lavare tutto il sangue dall'arteria con DMEM (~ 0,25 mL x 2). Per ogni lavaggio, riempire l'arteria con DMEM e quindi rimuovere DMEM residua dal lume del vaso premendo delicatamente sull'arteria con un dito guantato, cominciando appena caudale alla clip vascolari cranici. Mantenendo la pressione delicata, far scorrere il dito da craniale a caudale. Il contenuto luminale lavare via l'arteriotomia.
- Tenere il catetere nell'arteria e scambiare la siringa DMEM per siringa contenente soluzione virus. Assicurarsi che l'aria non entra il catetere.
- Far scorrere le cravatte di seta lungo l'arteria modo che circondano l'arteria nella posizione della punta del catetere, ma non serrarle.
- Infondere 0,03 mL della soluzione di virus per spingere il restante DMEM fuori il catetere e quindi svuotare l'arteria. Comprimerlo facendo nuovamente eliminando tutti i liquidi dal lume con un dito, craniale a caudale (come passaggio 2.3.9).
- Stringere le due fascette attorno alla punta del catetere per sigillare il lume. Iniettare la soluzione di virus (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL per l'adenovirus) premendo delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando l'arteria è disteso al calibro fisiologico.
Nota: È importante che l'arteria si espande a calibro fisiologico e rimane dilatato durante l'infusione di virus. In caso contrario, il grado di trasferimento genico si riduce notevolmente. - Appoggiare delicatamente la siringa verso il basso sul nido della garza del.
- Posto una sutura in polipropilene 7-0 nel adventitia carotica comune appena caudale della clip vascolari cranici a segnare il confine cranico di trasduzione del gene
- Dopo la soluzione contenente virus è stato nel lume dell'arteria per 20 min, rimuovere la siringa contenente virus e sostituirlo con una siringa vuota. Aspirare la soluzione contenente virus delicatamente fino a quando la nave crolla e rimuovere la siringa. Tagliare o annullare le cravatte di seta e rimuovere delicatamente il catetere.
Nota: Tagliare i legami molto brevi aiuti nella rimozione di essi. Rimuovere il catetere con attenzione per evitare di causare danni all'endotelio carotica. - Utilizzando il microscopio operatorio, chiudere l'arteriotomia con polipropilene 7-0 utilizzando un modello di X (Figura 2).
- Fare un primo passaggio entra alla parte inferiore destra dell'arteriotomia ed esce la nave in fondo a sinistra. Poi attraversare l'apertura e fare un secondo passaggio da in alto a destra in alto a sinistra.
- Prima di legare giù la sutura, scovare l'arteria rilasciando molto brevemente la clip vascolare cranica. Il sangue scorrerà fuori arteriotomia quando la clip viene rilasciata, rimozione di aria e virus residuo dal lume.
- Tirare il filo di sutura per chiudere l'arteriotomia delicatamente legare una sutura con 2 nodi quadrati.
Nota: Tirare la sutura troppo stretta causerà Trefolatura del tessuto che possano disturbare il flusso, aumentando il rischio di trombosi e alterando il flusso che può essere un'importante variabile incontrollata nei modelli di malattia.
- Allentare la clip vascolare cranica e quindi la caudale clip vascolare esercitando una leggera pressione con una garza per bloccare qualsiasi emorragia. Se il sanguinamento persiste continuare la pressione per 1-2 min. Se l'arteriotomia è stato chiuso correttamente, l'emorragia si ferma sempre entro questo lasso di tempo.
- Lasciate che l'assistente iniettare buprenorfina [0,02 mg/kg; sottocutaneo (SQ)] in questo periodo per fornire analgesia postoperatoria fino a quando i livelli del plasma di fentanil diventano terapeutici.
Nota: Una seconda buprenorfina iniezione (0,02 mg/kg; SQ) può essere necessario 6 h dopo la prima iniezione per mantenere l'analgesia, fino a quando i livelli del plasma di fentanil diventano terapeutici. - Ripetere il protocollo di infusione di virus sul lato sinistro come segue 2.3.2 - 2.3.19.
- Chiusura della ferita
- Utilizzare una sutura PGA 5-0 per chiudere la fascia del midline con una sutura continua.
- Con una sutura PGA 3-0, è necessario chiudere la pelle con un reticolo intradermico utilizzando un nodo sepolto ad entrambe le estremità.
- Recupero post-operatorio e pulitura.
Nota: Il coniglio deve essere monitorato continuamente per la corretta ossigenazione e la temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia. Recupero dovrebbe avvenire in un ambiente calmo e tranquillo.- Spegnere il flusso di ossigeno e isoflurano e rimuovere la maschera da coniglio.
- Sganciare la flebo, ma lasciare il porto di IV in luogo per accesso di emergenza IV.
- Prendere il coniglio per il recupero dell'area e adagiare su un lato in una gabbia con una coperta di acqua riscaldamento acceso (o facoltativamente un riscaldatore Bair Hugger).
- Dare O2 dalla maschera fino a quando la SpO2 è stabile.
- Lasciare che il coniglio recupera in una gabbia, lanciando verso l'altro lato ogni 15 min, fino a quando il coniglio può stare seduto sulle zampe posteriori e muoversi.
- Quando il coniglio è mobile, è possibile rimuovere il IV dal suo orecchio prima di tornare alla gabbia.
Nota: Non restituiscono il coniglio per la compagnia di altri animali fino a quando non è completamente recuperato dall'anestesia.
- Smaltire tutto ciò che aveva un contatto con il vettore o nel campo operatorio, sharps e rischio biologico appropriato seguente rifiuti protocolli.
3. trasferimento Gene per le arterie carotiche comuni di coniglio: cura post-operatoria
- Valutare lo stato generale del coniglio al giorno dopo chirurgia, controllando per la guarigione della ferita, evidenza di infezione, appetito, respirazione e segni di dolore.
- Controllare la posizione dell'orecchio del coniglio (orecchie giù possono essere un segno di dolore o angoscia, soprattutto quando accoppiato con un aspetto disordinato). Controllare che il coniglio rimane attivo e mobile. Controllare il coniglio per la normale respirazione senza stridore. Controllare che la ferita è pulita, asciutta e intatta. Controllare il coniglio per una temperatura corporea normale. Se il coniglio non è mobile e attivo, con la temperatura corporea normale, un aspetto ordinato, una ferita pulita e normale respirazione, consultare servizi veterinari.
- Verifica per l'assunzione di cibo normale e le prove delle feci fresche e urina.
Nota: L'assunzione di cibo può essere diminuito dopo la chirurgia, ma dovrebbe tornare alla normalità entro 2 giorni; fornire cibo supplementare se necessario.
- Rimuovere la patch fentanil giorno postoperatorio 3.
Nota: La buprenorfina può essere somministrata come necessario per il dolore post-operatorio che non è gestito dalla patch fentanil, o nel caso in cui la patch fentanil viene rimosso all'inizio.
4. terminale raccolto chirurgia: pre-operazione di
- Anestetizzare il coniglio. Vedere sezioni 1.3 e 1.3.5 per quanto riguarda il raggiungimento e il mantenimento dell'anestesia.
- Pesare il coniglio. È possibile combinare 30 mg/kg ketamina e 2 mg/kg xylazina in una siringa. Iniettare chetamina/xilazina IM nei muscoli paraspinali per indurre l'anestesia.
- Preparare la stanza della preparazione e/o tabelle durante l'attesa per il coniglio per diventare anestetizzati.
- Nella sala di preparazione OR: installazione tosatrici e un vuoto per la rasatura del collo e dell'orecchio del coniglio.
- In sala operatoria: installazione di apparecchiature per il monitoraggio e la posizione di sonde (SpO2, temperatura) sul tavolo OR; preparare l'ossigeno e isoflurano; legare una striscia di garza per la maschera del viso per fissarlo al coniglio e posizionare la maschera sul finale della testa della tabella.
Nota: Le strisce di garza legate sulla maschera facciale dovrebbero avere 2 code di circa 45 cm. - Accendere il riscaldamento coperta di acqua sul tavolo OR. Sopra la coperta di acqua, posizionare un asciugamano arrotolato per supporto collo e una piastra elettrodo dispersivo (più successivamente disposto dietro la schiena di coniglio).
- Unire 1 mL di lidocaina HCl (2% delle scorte) e 1 mL di lidocaina HCl (0,5% stock) (mix 50/50) in una siringa come un analgesico locale.
- Quando il coniglio è completamente anestetizzato, preparare il coniglio per la chirurgia.
- Rimuovere le feci dal retto, come descritto nella 1.3.1, per consentire il successivo posizionamento di una sonda di temperatura.
- Radere il coniglio dalla tacca sternal per l'angolo della mandibola durante l'utilizzo di un vuoto per tenere pulita la zona. Radersi la punta centrale posteriore di sinistra per la sonda pulsossimetria.
Nota: Il protocollo si presuppone che il chirurgo sarà sul lato destro del coniglio. Se il setup OR sarà posto il chirurgo sul lato opposto, invertire i lati in questo passaggio a tenere i fili di fronte del chirurgo. I lati dei passi futuri devono essere spenta anche se necessario. - Il coniglio di trasporto in sala operatoria e posto in posizione supina sul tavolo operatorio con un asciugamano di supporto collo arrotolato sotto il collo del coniglio appena sotto la testa. Estendere delicatamente collo del coniglio fino a quando è dritto e circa orizzontale.
- Agganciare il coniglio fino a maschera con O2 su a 1 L/min e iniziare la somministrazione di isoflurano. Fissare la maschera avvolgendo le estremità della striscia di garza legato alla maschera intorno l'asciugamano di sostegno del collo sotto il coniglio. Regolare, isoflurano (in genere 1-2%) come necessario per mantenere l'anestesia adeguata per il resto della procedura.
- Assicurarsi che la piastra elettrodo dispersivo è centrata sotto schiena di coniglio. Posizionare le sonde di temperatura e ossimetro di impulso.
- Trattenere le zampe anteriori del coniglio liberamente legandoli alla tabella.
Nota: Inserire facoltativamente, un piccolo tavolo di plastica sopra coniglio per proteggere il coniglio da essere sottoposto a pressione al petto/addominale dal chirurgo che si appoggia su torace/addome di coniglio. L'obiettivo qui è quello di prevenire forzato rigurgito del contenuto addominale. - Iniettare 2 mL di lidocaina (2% soluzione) / bupivacaina (0,5% soluzione) (50/50 mescolare; da passaggio 2.4) per via sottocutanea lungo la linea di incisione del collo pianificato per l'anestesia locale.
- Spruzzare il sito chirurgico con betadine. Indossare guanti puliti per intervento chirurgico.
5. terminale chirurgia (nave Harvest)
- Preparare gli strumenti e il campo chirurgico.
- Aprire un pulito drappo pack contenente una tabella drappeggio e drappeggio di una carta per il coniglio. Drappo portamoduli.
- Aprire il pacchetto dello strumento, posto sul tavolo per strumenti e organizzare gli strumenti. Inserire la seguente attrezzatura sul tavolo strumento: una siringa da 20 mL e un ago 21G.
- Fissare il cavo di elettrocauterizzazione per il drappeggio di coniglio usando il Kantrowitz forcipe 7.25". Collegare la spina all'unità elettrochirurgia e accenderlo.
- Riempire una siringa da 20 mL con soluzione fisiologica sterile. Utilizzare questa soluzione salina come necessario per mantenere umido il tessuto esposto durante la procedura.
- Posizionare il telo di carta sopra il coniglio e tagliare un foro nel drappo sopra il sito chirurgico sul collo di coniglio. Fissare gli angoli del foro nel posto alla pelle del coniglio con i morsetti di asciugamano.
- Isolare le arterie carotiche comuni.
Nota: 2 x lenti di ingrandimento chirurgiche dovrebbero essere utilizzati per questa parte.- Tagliare la pelle con un elettrocauterio lungo la linea mediana che si estende circa 7-9 cm cranialmente verso la mandibola e morsetto pelle aperta con morsetti di asciugamano.
Nota: Se il raccolto è solo pochi giorni dopo l'intervento precedente, elettrocauterio non è necessario. Basta tagliare le suture e tirare delicatamente aperta l'incisione da ambulatorio precedente. - Fare un breve taglio laterale attraverso la fascia con un elettrocauterio verso l'estremità caudale. Quindi inserire il taglio forbici grandi e senza mezzi termini sezionare la fascia lungo il midline intero. Tagliare la fascia dissecata giù la linea mediana con l'elettrocauterio.
- Con piccole forbici per dissezione, sezionare tra i muscoli a forma di V (muscolo sternocephalic) e il muscolo sternohyoid sopra la trachea, per isolare le arterie carotiche comuni, a partire dal lato destro.
- Sezionare l'arteria di destra libero dai tessuti dalla base del collo caudalmente fino all'incrocio del nervo pharyngeal circostanti cranialmente. Uso chirurgico silicio loop per aiutare alla retrazione dell'arteria durante la dissezione.
- Ripetere la dissezione sul lato sinistro (passaggi 5.2.3 - 5.2.4).
- Con una sutura seta 3-0, legare l'arteria carotica comune cranica al segmento che è stato infuso con il vettore (uso sutura adventitial posizionato al primo intervento per individuare la misura cranica dell'infusione di vettore. Poi legare la carotide caudale al arteriotomia riparato.
- Asportare il segmento carotico tra le legature e lavare il lume con soluzione fisiologica. Tagliare via tessuto adventitial in eccesso dal vaso e tagliare il segmento carotico in pezzi più piccoli per le diverse analisi di endpoint (istologia, DNA, l'acido ribonucleico (RNA), proteine, explant cultura, ecc.).
- Iniettare 1 mL di Beuthanasia IV di eutanasia e confermare l'eutanasia del coniglio.
- Tagliare la pelle con un elettrocauterio lungo la linea mediana che si estende circa 7-9 cm cranialmente verso la mandibola e morsetto pelle aperta con morsetti di asciugamano.
- Smaltire tutto ciò che aveva un contatto con il vettore o nel campo operatorio, sharps e rischio biologico appropriato seguente rifiuti protocolli.
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Representative Results
Per implementare questo metodo con fiducia, esperimenti preliminari sono necessari per stabilire che l'operatore realizza trasferimento genico efficiente e riproducibili, con l'espressione del transgene principalmente in cellule endoteliali luminal. Nella nostra esperienza, questo è più facilmente valutato usando un vettore che esprime la β-galattosidasi. 5-bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-Galactopyranoside (X-gal) la macchiatura dei segmenti carotiche comune rimosso 3 giorni dopo infusione di vettore, così come misura di β-galattosidasi mRNA (RNA messaggero) con la catena della polimerasi quantitativa trascrizione inversa reazione (qRT-PCR), rivelerà l'efficienza, la riproducibilità e la posizione delle cellule trasdotte. Per gli esperimenti che studiare gli effetti dell'espressione del transgene o misurano l'attività trascrizionale elementi cis-agenti, misuriamo in genere transgene mRNA come un'indicazione iniziale di livello e riproducibilità di trasferimento genico.
Un nuovo operatore nel nostro laboratorio ha cercato di stabilire la competenza con questo metodo di trasdurre coniglio le arterie carotiche comuni con un vettore adenovirale (2 x 1011 vp/mL) che esprimono un transgene di β-galattosidasi, guidato da un citomegalovirus (CMV) promotore. Trasdotte arterie sono state raccolti 3 giorni più tardi e sono state tagliate trasversalmente in segmenti. Singoli segmenti sono stati quindi entrambi tagliati aperta assialmente o lasciato come anelli intatti. Tutti i segmenti sono stati il X-gal macchiato in microcentrifuga. Segmenti che erano stati tagliati aperti assialmente sono stati disposti su una superficie orizzontale e la superficie luminale esposti al massimo, con perni come necessario per impedire il segmento di curling. Face it immagini delle superfici luminale hanno mostrato macchiatura endoteliale robusta con il X-gal (figure 3A e 3B). Immagini assiali delle superfici luminale di anelli intatti carotica ha mostrato il X-gal macchiatura solo sulla superficie luminal (figure 3 e 3D). I segmenti che erano stata aperta assialmente erano trasformati in paraffina, sezionati e Counter-colorati con ematossilina ed eosina o nucleare veloce rossa. Immagini Visualizza il X-gal macchiatura principalmente nell'endotelio, anche se c'è una piccola quantità di macchiatura nello strato avventiziale (figure 3E e 3F). Trasduzione di cellule adventitial potrebbe verificarsi tramite perdita del vettore tramite il sito arteriotomia o tramite perdita tramite piccoli rami prossimale ai siti della legatura del ramo di lato. 29
In un esperimento separato, un nuovo operatore ha cercato di stabilire la competenza nel realizzare riproducibili livelli di espressione del transgene, come un preludio ad esperimenti volti ad indagare le attività biologiche dei transgeni. Coniglio in arterie carotiche comuni sono state trasdotte con adenovirus helper-dipendente (2 x 1011 vp/mL) contenente sia un apo A-I (HDAdApoAI) o il transgene di IL-10 (HDAdIL10), entrambi sotto il controllo di un promotore di CMV. Trasdotte arterie sono state raccolte 3 giorni dopo la trasduzione e tagliare trasversalmente in segmenti. RNA è stato Estratto da segmenti vascolari e apo A-I ed espressioni del mRNA di IL-10 hanno quantificate mediante qRT-PCR, con normalizzazione di gliceraldeide 3-fosfato-deidrogenasi (GAPDH) mRNA nella stessa estratti (Figura 4). Nelle arterie HDAdIL10 trasdotte, solo 1 su 6 arterie avevano un molto basso, ma rilevabile apo A-I segnale del mRNA. Significa espressione di apo A-I mRNA era 700-fold maggiore nei vasi trasformati con HDAdApoAI rispetto nei vasi trasformata con HDAdIL10. Bassi livelli di mRNA per IL-10 endogeni sono stati rilevati nelle arterie HDAdApoAI trasdotte, con media l'espressione aumentata di 6 volte in arterie HDAdIL10 trasdotte. Da notare, c'è una considerevole variabilità intra e inter artery in efficienza di trasduzione e l'espressione del transgene, come mostrato nelle figure 3 e 4, rispettivamente. Troviamo questa variabilità anche con operatori esperti.
Figura 1 . Arteriotomia nell'arteria carotica comune. Forcipe fine sono utilizzato per afferrare il adventitia dell'arteria carotica e applicare la trazione verso l'alto all'arteria. Questa manovra si espande lume del vaso e genera una superficie verticale in cui è inserito l'ago 19g piegato, riducendo così al minimo il rischio di perforare la parete posteriore dell'arteria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Chiusura di arteriotomia carotidea comune. L'arteriotomia viene chiusa con una sutura in polipropilene 7-0, utilizzando un modello di X. Il primo passaggio dell'ago e sutura entra il lume dell'arteria in basso a destra l'arteriotomia (sito 1) ed esce il lume in basso a sinistra (sito 2). L'ago e la sutura poi attraversare l'arteriotomia e immettere nuovamente il lume in alto a destra (sito 3). L'ago esce quindi il lume in alto a sinistra (posto 4). Lieve trazione su entrambe le estremità della sutura chiude l'arteriotomia. Le estremità della sutura (uscendo dal sito 1 e sito 4) sono legate con 2 nodi quadrati. Cerchi grigi rappresentano siti di suture passando attraverso la parete del vaso. Linee blu continue indicano le aree dove la sutura è di fuori della parete del vaso. Linee blu tratteggiate indicano le aree dove la sutura è all'interno del lume. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . L'espressione del transgene endoteliale efficiente. Le arterie carotiche comuni di coniglio sono state trasdotte con un vettore adenovirale esprimendo un transgene di β-galattosidasi e raccolti 3 giorni più tardi. Arteria trasdotte segmenti erano il X-gal macchiato come anelli intatti o dopo essere stato aperto con un taglio assiale. (A-B) Immagini di fronte it delle superfici luminale della carotide anelli che sono stati tagliati aperti assialmente. (C-D) Viste assiali nello spazio luminal di anelli carotico intatti. (E-F) X-gal macchiata, paraffina carotiche segmenti sono stati sezionati e Counter-macchiati con (E) ematossilina ed eosina o nucleare rossa veloce (F). Barra della scala = 100 µm. Io = biancheria intima; M = media; e un = adventitia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Quantificazione dell'espressione del mRNA del transgene. Le arterie carotiche comuni di coniglio sono state trasdotte con adenovirus helper-dipendente che esprimono entrambi apo A-I (HDAdApoAI) o IL-10 (HDAdIL10) sotto il controllo di un promotore di CMV. Le arterie sono state raccolte 3 giorni più tardi. l'espressione del mRNA di (A) Apo A-I e (B) IL-10 hanno quantificato mediante qRT-PCR, normalizzato di GAPDH mRNA nell'arteria stessa ed espressa in unità arbitrarie (AU). Barra indica il valore medio; Valore di P è da prova di rango-somma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Vantaggi | Svantaggi | |
| Rispetto ai modelli del roditore | Più vicini filogeneticamente ai primati | Più costosi da acquistare e casa |
| Una maggiore diversità genetica, traduzione clinica di interpolazione | Più difficili da allevare e gestire | |
| Navi più grandi consentono più facile manipolazione chirurgica e fornisce più tessuto per l'analisi quantitativa | Requisiti normativi più ampi | |
| Consente l'utilizzo di dispositivi endovascolari progettato per gli esseri umani | Sfondi gratis geneticamente meno | |
| Meno-vasto assortimento di anticorpi alle proteine del coniglio | ||
| Rispetto ai modelli più grandi animali | Relativamente poco costoso per l'acquisto e la casa | Forse meno clinicamente rilevanti rispetto ad altri grandi modelli animali per alcune malattie vascolari |
| Più facile da allevare e gestire | ||
| Rispetto alla linea germinale transgenesi | Transgene espresso solo in grande arteria; effetto del transgene in particolare al sito di interesse può essere determinato | Applicazione del metodo di celle diverso da endotelio è difficile |
| Possibile utilizzare carotide controlaterale come controllo accoppiato; Elimina parametri sistemici (ad es., pressione sanguigna, il livello di colesterolo) come variabili incontrollate | Sala operatoria e competenze chirurgiche necessarie; nucleo servizi probabilmente non disponibile | |
| Throughput più elevato per le prove di attività di regolamentazione della sequenza del DNA nell'endotelio del vaso grande | Transgene non può essere espresse nella maggior parte dei letti vascolari | |
| Potenzialmente più veloce e meno costoso | ||
| L'esposizione sistemica alla proteina transgenica improbabile — minimizza gli effetti fuori bersaglio | ||
| Rispetto ad approcci di terapia genica sistemica (per esempio. Trasduzione del fegato tramite iniezione in vena periferica) |
Espressione del transgene più stabili rispetto a terapia genica sistemica (fegato) | Consegna di vettore richiede l'intervento chirurgico |
| Transgene espresso nella parete dell'arteria, che permette la consegna locale di alti livelli di proteine transgeniche | Sala operatoria e chirurgica competenze necessarie | |
| L'esposizione sistemica alla proteina transgenica improbabile — minimizza gli effetti fuori bersaglio | Trattamento limitato alle arterie che sono destinate specificamente all'intervento; non si tratta di fattori sistemici (ad es., lipidi) | |
| Possibile utilizzare carotide controlaterale come controllo accoppiato; Elimina parametri sistemici (ad es., pressione sanguigna, il livello di colesterolo) come variabili incontrollate | ||
| Molto bassa dose di vettore richiesta |
Tabella 1. Vantaggi e svantaggi del modello trasferimento genica endoteliale selettivo dell'arteria carotica comune di coniglio.
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Discussion
Alcuni aspetti della tecnica chirurgica meritano un'attenzione particolare. Esposizione completa e mobilizzazione dell'arteria carotica comune tramite la dissezione attenta volontà facilitare gene transfer e arteriotomia riparazione. Tuttavia, durante la dissezione, manipolazione diretta dell'arteria carotica dovrebbe essere minimizzato per impedire il vasospasmo. Inoltre, qualsiasi sanguinamento adiacente all'arteria deve essere interrotto applicando una leggera pressione con una garza e sangue travasato deve essere rimossi immediatamente lavando la zona con soluzione salina. È anche importante evitare di danneggiare il nervo vago, che corre parallelo all'arteria carotica comune. Rifilatura adventitia nella zona di arteriotomia pianificato aiuterà l'operatore sia per eseguire un'arteriotomia pulito e funzionale e per riparare l'arteriotomia. Infine, l'arteria carotica comune si dirama deve essere identificato e saldamente legato per impedire la perdita del vettore dal lume carotico.
Ci sono anche aspetti critici dell'infusione di vettore e riparazione arteriotomia. Durante l'infusione di vettore, è importante distendere la carotide comune al calibro fisiologico o leggermente maggiore per raggiungere trasduzione efficiente. Quando si ripara l'arteriotomia, la sutura dovrebbe penetrare la parete del vaso più vicino possibile ai bordi dell'arteriotomia e dovrebbe in modo pulito entrare e uscire il lume piuttosto che passare assialmente attraverso la parete del vaso. Se solo gli strati più esterni della parete del vaso sono tirati insieme perché la sutura assialmente passa attraverso la parete del vaso, piuttosto che passare radialmente attraverso la parete ed entrare il lume, un divario rimarrà nel intima e aumentare il rischio di trombosi. Se le penetrazioni di sutura sono troppo distanziate tra loro, o se la sutura è serrare eccessivamente quando legato, pieghe di tessuto verranno creati sul sito di arteriotomia. Queste pieghe interrompono il flusso di sangue normale laminare, anche aumentando il rischio di trombosi. Mantenendo le caratteristiche di flusso costante è importante per gli esperimenti condotti in modelli animali di malattie (ad es., aterosclerosi) perché flusso alterato può contribuire al processo di malattia30.
Nuovi operatori incontrano spesso thrombosed arterie al momento del raccolto. La trombosi luminal è una complicazione devastante, rendendo inutilizzabili come un campione sperimentale dell'arteria. Per prevenire la trombosi, somministriamo ordinariamente eparina IV prima di trasferimento genico. Trombosi è anche impedita dalla attenta chiusura di arteriotomia, come descritto in precedenza. Il dosaggio dell'eparina potrebbe essere aumentato per prevenire la trombosi, o l'aspirina potrebbe essere dato postoperatorio. Tuttavia, una dose maggiore di eparina aumenterebbe anche il potenziale per le complicazioni di spurgo e aspirina potrebbe interferire con punti finali sperimentali, soprattutto se l'infiammazione è in fase di studio. Pertanto, è preferibile concentrarsi su una migliore tecnica chirurgica come mezzo per prevenire la trombosi.
Se manipolato troppo energicamente, arterie carotiche possono subire lo spasmo, che potrebbe anche contribuire a trombosi diminuendo il flusso. Se viene rilevato il vasospasmo, può essere alleviato dall'applicazione di papaverina d'attualità. Quando nave raccolti sono previste per più di 2-3 giorni dopo la trasduzione e la trombosi è una preoccupazione, ecografia transcutanea può essere utilizzato per valutare la pervietà del vaso non invadente. Scoperta delle arterie thrombosed può portare all'eutanasia al fine di risparmiare sulle spese di alloggio. Animali addizionali possono essere iscritti anche prontamente, per riempire i gruppi sperimentali. Peri - e post - intervention mortalità connessa con questo metodo dovrebbe essere < 1% (cioè., non diverso da mortalità connessa con altri interventi chirurgici eseguiti su conigli sani)31.
Dopo un operatore diventa confortevole con gli aspetti tecnici del protocollo chirurgico, la capacità di eseguire il trasferimento del gene efficiente ai bisogni dell'endotelio da verificare, utilizzando approcci descritti nella sezione sopra su risultati rappresentativi. Se si verificano problemi con il raggiungimento di trasferimento genico riproducibile, il colpevole è probabile che in una delle due zone. Dopo che la nave è isolata e il sangue è lavato dal lume, è importante rimuovere il tampone di lavaggio DMEM affinché la soluzione infusa vettoriale non è diluita durante la trasduzione. L'altro aspetto importante è quello di distendere la nave a calibro fisiologico o leggermente maggiore durante l'infusione di vettore. Perché, nella nostra esperienza, un'arteria carotica che non è completamente dilatata o non rimane dilatato durante l'infusione di 20 minuti in modo affidabile ha l'espressione del transgene basso, è probabile che la distensione dell'arteria per calibro fisiologico migliora la trasduzione efficienza. Tuttavia, mai questo abbiamo studiato sistematicamente. È possibile che aumentando la pressione di infusione sopra i livelli fisiologici potrebbe aumentare l'efficienza di trasduzione e consentono inoltre i livelli elevati di trasduzione delle cellule nei media vascolare. Tuttavia, rottura della barriera endoteliale sarebbe probabile danneggiare la nave e aumentare il rischio di trombosi. Se la nave non rimane dilatata per il periodo intero vettore-incubazione di 20 minuti, è probabile che il vettore è fuoriuscita dai rami dell'arteria carotica comune. Prestare attenzione durante la dissezione per identificare e legare tutti i rami per impedire la perdita del vettore dal lume carotico.
Questo metodo ha diversi limiti che riguardano l'uso dei conigli. I conigli sono meno costosi ospitare e nutrire rispetto ad altri grandi animali (cani, maiali, pecore); Tuttavia, le spese di acquisto, custodia e alimentare conigli sono considerevolmente più che per topi e ratti. Le sale operatorie e requisiti normativi per gli ambulatori di coniglio sono anche molto più estesi rispetto per i roditori. Inoltre, una notevole competenza tecnica è necessaria per eseguire il protocollo di trasferimento del gene chirurgica in modo efficace. Queste competenze possono essere acquisite dagli operatori che non hanno avuto alcuna formazione chirurgica. Almeno 2 persone nel nostro gruppo (tra cui l'autore principale di questo manoscritto) hanno imparato le tecniche chirurgiche e li ha applicati in modo produttivo. Tuttavia, una minuziosa formazione e una convalida accurata di un operatore efficienza di trasferimento del gene e riproducibilità (come descritto nella sezione risultati rappresentativi) sono necessari prima che l'operatore può iniziare a generare dati di alta qualità.
Confinamento di espressione del transgene quasi esclusivamente all'endotelio con questo metodo29,32,33,34,35,36,37 è utile in quanto permette di indagine degli effetti del transgene in cellule endoteliali e misurazione dell'attività di sequenze regolatrici del DNA di cis-acting in cellule endoteliali. Un piccolo numero di cellule adventitial o mediale può essere trasdotte; Tuttavia, l'incapacità di questo metodo di trasdurre efficientemente le cellule nonendothelial impedisce l'applicazione del metodo per lo studio di altri tipi di cellule della parete vascolare (ad esempio cellule di muscolo liscio e macrofagi). Anche se la sovraespressione di proteine secrete dalle cellule endoteliali trasdotte può permettere indagine degli effetti di queste proteine su altre cellule vascolari tipi, i ruoli delle proteine secrete non in questi altri tipi di cellule vascolari (ad es. ricevitori o proteine coinvolte nella trasduzione del segnale) non può essere studiato con questo metodo.
Come un mezzo per le prove di terapia di gene targeting per parete dell'arteria, il metodo differisce dalle altre tecniche preclinici in due modi principali. In primo luogo, il metodo utilizza un modello di coniglio per in vivo test di terapia genica piuttosto che più comunemente usati i modelli del roditore8,12,15,38,39. L'utilizzo di conigli permette la valutazione dell'espressione del transgene e il ruolo biologico del prodotto transgene in un modello animale nazionali, che è più rappresentativi della diversità genetica umana che sono roditori inbred. Il modello può essere utilizzato per valutare la terapia genica nelle arterie o coniglio normale o nelle arterie di coniglio che avere patologia arteriosa che è simile a quello trovato in arterie malate umane. Arterie di coniglio sono anche più vicina nella dimensione a arterie umane, che sono le arterie del roditore e fornire molto più tessuto per l'analisi rispetto a quella disponibile dalle arterie del roditore. La seconda differenza principale è che questo metodo utilizza un approccio chirurgico per consegnare il transgene vettoriale per l'endotelio vascolare. Terapia genica somatica è spesso trasportata sistematicamente, più frequentemente prendendo di mira il fegato con l'obiettivo di alterare i livelli del plasma del transgene proteina25,40. Prendendo di mira l'endotelio vascolare, il metodo fornisce il transgene terapeutico prodotto localmente, con la sua concentrazione di picco all'interno della parete dell'arteria, proprio dove è necessario per il trattamento di malattia vascolare. Consegnando il transgene solo localmente, il metodo elimina anche effetti collaterali sistemici del transgene prodotto. Altri gruppi stanno sviluppando metodi utilizzando peptidi, anticorpi o altre modifiche del capsid per il targeting vettori sistemica iniettati da endotelio sano o malato per fornire terapia genica vascolare locale41,42 , 43. Tuttavia, questi metodi di targeting rimangono in fase di sviluppo e ancora sono complicati dalla trasduzione sistemica notevole, soprattutto nel fegato42,43,44. Il nostro metodo chirurgico fornisce un'introduzione precisa ed efficiente di transgeni per l'endotelio vascolare con minimo - se qualsiasi - trasduzione in altre località. 1 il metodo è anche un più conveniente, efficiente e più alto-in tutto media (rispetto al germe-linea transgenesi o iniezione sistemica di vettori endoteliale targeting) per testare l'attività delle sequenze regolatrici del DNA nel vaso grande endotelio, per funzione di proteina transgene prova nella parete dell'arteria e sperimentazione di terapia genica vaso-muro-mirati.
Questo metodo consente di indagine sul ruolo biologico di qualsiasi transgene, quando essa si esprime nell'endotelio grande arteria. Se modificato ai reagenti di perdita-de-funzione come dominanti negativi recettori o short hairpin RNA, e consentirebbe di indagine dei ruoli delle proteine endogene endoteliale e vie di segnalazione. Il metodo può essere utilizzato anche per misurare l'attività trascrizionale di qualsiasi sequenza di DNA di cis-acting in grande arteria cellule endoteliali5,6,7. Inoltre, il metodo consente di testare qualsiasi tipo di vettore di trasferimento del gene per l'efficienza e la sicurezza quando recapitati localmente all'endotelio e rivelerà la capacità del vettore di espressione del transgene durevole di raggiungere. Infine, il metodo consente lo sviluppo e la sperimentazione di combinazioni di vettori e transgeni che sono progettati per fornire la terapia genica mirata a parete vascolare. Il metodo potrebbe servire come uno strumento di screening per identificare geni terapeutici che potrebbero-in futuro-consegnato all'endotelio di tutte le grandi arterie (o tutte le grandi arterie malate) da vettori di targeting per parete vascolare iniettati per via percutanea. A causa di preesistenti immunità in esseri umani per l'adenovirus tipo 545, sarà impegnativo da utilizzare vettori basati su 5 tipo di adenovirus in applicazioni cliniche. Ingegneria del capside dell'adenovirus 5, uso di alternativa dell'adenovirus sierotipi46, o uso di vettori meno immunogenico come AAV può essere richiesto di portare la terapia genica vascolare alla clinica. Come uno strumento sperimentale, tuttavia, siamo ignari di ogni vettore che può competere con helper-dependent adenovirus 5 nel raggiungimento di espressione del transgene efficienti e durevoli in vasi sanguigni1.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo AdVec, Inc., per il permesso di utilizzare reagenti HDAd, Julia Feyk per l'assistenza amministrativa e i servizi veterinari del dipartimento di medicina comparativa per consulenza chirurgica e supporto. Questo lavoro è stato supportato da HL114541 e il John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
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