Summary
Este método é introduzir um transgene no endotélio de artérias carótidas de coelho. Introdução do transgene permite a avaliação da função biológica do produto do transgene em artérias normais ou modelos de doença. O método também é útil para medir a atividade de sequências reguladoras de DNA.
Abstract
O objetivo desse método é introduzir um transgene no endotélio de segmentos isolados de ambas as artérias carótidas comuns do coelho. O método alcança focal transgênese endotelial-seletivo, permitindo assim que um investigador para determinar as funções biológicas de transgenes endotelial-expresso e quantificar a actividade transcricional in vivo de sequências de DNA em grande artéria células endoteliais. O método usa isolamento cirúrgico das artérias carótidas comuns de coelho e uma arteriotomia para entregar um vetor viral do transgene-expressando no lúmen arterial. Um período de incubação curto do vetor no lúmen, com subsequente aspiração do conteúdo do lúmen, é suficiente para alcançar expressão eficiente e durável do transgene no endotélio, sem transdução detectável ou expressão fora da segmento arterial isolado. O método permite avaliação das atividades biológicas dos produtos do transgene em artérias normais e em modelos de doenças humanas e vascular, evitando efeitos sistêmicos que possam ser causados ou mediante a entrega do gene para outros sites (por exemplo. o fígado) ou pela abordagem alternativa de entregar o endotélio por germe linha transgênese construções genéticas. Aplicação do método é limitada pela necessidade de um cirurgião e anestesista, uma bem equipada sala de operações, os custos de aquisição e coelhos de habitação e a necessidade de experiência em construção de vetor de transferência de genes e uso. Resultados obtidos com este método incluem: transgene relacionadas a alterações na estrutura arterial, celularidade, matriz extracelular ou função vasomotora; aumentos ou reduções na inflamação arterial; alterações na apoptose celular vascular; e progressão, retardo ou regressão de doenças como a hiperplasia da íntima ou aterosclerose. O método também permite que a medição da capacidade nativas e sintéticas normativas de sequências de ADN para alterar a expressão do transgene em células endoteliais, fornecendo resultados que incluem: níveis de transgene mRNA, níveis de proteína do transgene e níveis de transgene atividade enzimática.
Introduction
O objetivo desse método é introduzir um transgene no endotélio das artérias carótidas comuns de coelho. Introdução do transgene permite a avaliação da função biológica do produto do transgene em artérias normais e em modelos de coelho de doença arterial humana. Superexpressão do transgene em modelos de doença pode revelar se o transgene (e seu produto proteico) mostram a promessa como agentes terapêuticos1,2,3,4. Inclusão de elementos reguladores de cis-agindo na gaveta do transgene expressão permite a avaliação da actividade destes elementos no endotélio arterial na vivo5,6. Conhecimento da atividade de elementos reguladores de cis-agindo de forma específicas pode ser usado para projetar cassettes de expressão mais ativo e para sondar os mecanismos de regulação gênica em grande artéria endotélio na vivo7.
Os coelhos são um modelo valioso para vários aspectos da fisiologia humana vascular e doença. Coelhos partilham muitas das características vasculares com seres humanos. Por exemplo, valores hematológicos basais, regulamento hemostático e tensão longitudinal vascular são semelhantes entre os coelhos e os humanos8. Modelos de coelho de doenças vasculares replicam características-chave de muitas doenças humanas, incluindo: aneurismas (semelhante geométricas e características de fluxo)9, vasoespasmo (resposta semelhante ao tratamento endovascular)10,11, e aterosclerose (placas da íntima com características semelhantes, incluindo um núcleo rico em células de músculo liso, macrófagos e lipídios em uma tampa fibrosa)12,13. Nesse sentido, foram desenvolvidos modelos de coelho para muitas doenças vasculares, como trombose, vasoespasmo, aneurisma, estenose de enxerto vascular, diabetes e aterosclerose8,13,14, 15,16.
Para os investigadores a escolher entre os modelos animais de Fisiologia vascular e doença, o coelho tem várias vantagens. Em comparação com roedores, os maiores navios de coelhos permitam fácil manipulação cirúrgica, uso de dispositivos endovasculares e uma maior quantidade de tecido para medições quantitativas. Coelhos são muito mais próximos filogeneticamente primatas que são roedores17, e a maior diversidade genética de coelhos outbreds melhor se aproxima da variabilidade genética dos seres humanos. Diversidade genética é particularmente importante para estudos pré-clínicos, que-por sua natureza-visam desenvolver terapias que podem ser aplicadas para a população humana geneticamente diversa. Como com muitas se não todas as outras espécies de modelo, genes do coelho são facilmente clonados ou sintetizados porque foi sequenciado o genoma de coelho com cobertura alta (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Comparado a outros grandes modelos animais (tais como cães, porcos ou ovelhas), os coelhos são relativamente baratos comprar e casa e eles são mais fáceis de criar e manipular. Modelos específicos de doença vascular em coelhos cada tem suas próprias vantagens e deficiências como modelos de doenças humanas que estão além do escopo deste manuscrito8,12,18. Um investigador deve rever essas vantagens e deficiências para determinar se o coelho é o melhor modelo para responder a uma pergunta específica e experimental.
Introdução de sequências regulamentar de Ácido desoxirribonucleico (DNA) em células endoteliais na vivo permite a investigação da actividade destas sequências em um ambiente fisiológico complexo. Estudos in vitro em células endoteliais transfectadas podem ser útil para a avaliação inicial de sequências reguladoras de DNA; no entanto, os níveis de expressão em cultura de tecidos modelos às vezes não são reproduzidos quando os estudos são repetidos na vivo19,5,20. Sistemas in vitro também podem ser útil para explorar caminhos básicos de proteínas de sinalização e fisiologia endotelial, bem como comunicação entre culturas de células vasculares; no entanto, caminhos mais complexos ou redes reguladoras que são influenciadas pelas populações complexas de células vasculares vizinhas ou o sistema imunológico são mais bem estudadas na vivo sistema6,20. O método descrito aqui fornece uma plataforma para explorar a regulação da expressão do transgene no endotélio dentro do contexto de uma nave intacta, com ou sem doença. O sistema in vivo também permite investigação do crosstalk celular fisiológico e patológico e a identificação das contribuições do sistema imunológico para regulamento de gene expressão6.
Transgênese germinal (especialmente em ratos) é uma abordagem alternativa para dirigir a expressão do transgene para células endoteliais. Esta abordagem pode fornecer a expressão do transgene ao longo da vida, com direcionamento endotelial mediada pelo promotor específico ou regiões reguladoras21,22. No entanto, a geração de ratos transgénicos é demorado e caro, várias linhas de transgênicas devem ser frequentemente testadas para garantir direcionamento do transgene para o tipo de célula desejada e a conquista de níveis de expressão do transgene adequada e experimental resultados em sistemas de murino podem ser dependente da tensão. Murino modelos transgénicos com transgenes endotelial-alvo têm muitas vantagens: não há necessidade de realizar a cirurgia em cada animal experimental a fim de alcançar a transgênese, ratos experimentais podem ser criados com numerosos outros ratos transgênicos disponíveis no a fim de testar interações genéticas e fenotípicas, e há uma grande variedade de anticorpos que reagem com proteínas murino, facilitando a caracterização de fenótipos. No entanto, direcionamento de transgenes para o endotélio através da linha de germe normalmente resulta na expressão do transgene em todo o sistema vascular,22 , tornando-se difícil determinar o local em que o produto do transgene está agindo. Isto é especialmente verdadeiro quando o produto do transgene é secretado, porque um transgene produto secretado pelas células endoteliais em todo o sistema vascular pode ter atividade biológica em qualquer número de sites dentro de um animal. Embora o método descrito neste manuscrito requer conhecimento técnico e instalações especializadas, pode ser menos demorado e menos caro do que desenvolver uma linha de rato transgénico endoteliais específicas. Permite a avaliação da função de uma proteína seletivamente nas células endoteliais de um segmento de grande artéria, e que permite o uso da carótida contralateral comum como um controle pareado (eliminando os fatores sistêmicos que podem variar entre experimental animais-por exemplo, a pressão arterial ou os níveis de colesterol-como variáveis não controladas).
Terapia gênica é uma abordagem promissora para o tratamento das doenças vasculares, doenças crônicas particularmente, porque um único aplicativo pode fornecer sustentada ou possivelmente ao longo da vida a expressão de um gene terapêutico23. A promessa terapêutica da terapia genética tem sido explorada em modelos animais de transferência de genes somáticos, muitas vezes direcionando o fígado24,,25, que é um alvo relativamente fácil, porque muitos vetores virais transmitidas pelo sangue são hepatotropic. No entanto, para ter efeito na doença vascular, terapia genética direcionada para o fígado deve alcançar sistêmica superexpressão de proteínas. Isso normalmente requer grandes doses de vetor, que pode ser tóxico ou mesmo fatal26. Além disso, aumentou os níveis sistêmicos de um aumento de proteínas, o risco de efeitos secundários fora do alvo, o que pode complicar ou mesmo obscurecer a interpretação dos resultados experimentais. Terapia de gene locais visando o endotélio vascular, conforme descrito neste manuscrito poderia evitar efeitos secundários sistêmicos porque o vetor infundido não é amplamente divulgado além do segmento arterial transduzido e efeitos vasculares locais podem ser obtidos sem alterações nos níveis plasmáticos sistêmicos de proteína. 27 -além disso, uma quantidade muito menor de vetor é necessária para transduce um segmento arterial do que é necessário para alcançar a transdução hepática robusta. Expressão do transgene do fígado relatou a diminuir ao longo do tempo, provavelmente devido a renovação celular, que exigem dosagem repetida se expressão do transgene de alto nível é para ser mantida. 28 em contraste, a baixa rotatividade do endotélio fornece expressão estável durante pelo menos 48 semanas em coelhos alimentados com comida e pelo menos 24 semanas em lesões ateroscleróticas de coelhos alimentados com colesterol. 1 , 27
Para determinar se este método de transferência de genes de endotélio de carótida comum coelho é apropriado, as vantagens e desvantagens (tabela 1) devem ser consideradas no contexto dos objetivos específicos de investigação. As vantagens deste método incluem: outbreds coelhos são melhor representante da diversidade genética humana do que são puras ratos (importantes para trabalhos pré-clínicos); coelhos de fornecer maiores navios para manipulação mais fácil e mais tecido para análise; o método pode atingir a expressão do transgene endotélio-alvo muito mais rapidamente do que o germe-linha endotelial de direcionamento em ratos transgénicos; dose de vetor pode ser facilmente ajustada aos níveis variáveis de modelo da expressão do transgene; processos específicos de grande artéria endotélio podem ser investigados; e transgênese vascular local permite a carótida oposta no mesmo animal para ser usado como um controle, eliminando fatores sistêmicos como variáveis não controladas. As desvantagens incluem: instalações especiais e conhecimentos são necessários; menos fundos geneticamente modificados no qual a experiência estão disponíveis em coelhos do que em ratos; e há uma menos extensa seleção de anticorpos de coelho contra proteínas do mouse (para immunodetection de proteína do transgene e outros antígenos que podem ser importantes na interpretação de resultados experimentais).
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade de Washington escritório de bem-estar Animal e associado institucional Cuidado Animal e Comitê de uso (IACUC) e foram concluídos em conformidade e em conformidade com todos os relevante regulamentar e institucional diretrizes.
Nota: A transferência de genes para as artérias carótidas comuns coelho é executada em coelhos por um cirurgião com o auxílio de um anestesista ou assistente.
1. transferência de Gene para as artérias carótidas comuns coelho: pré-operação
- Anestesia o coelho. Pese o coelho. Combine a 30 mg/kg de ketamina e 2 mg/kg de xilazina em uma seringa. Injecte cetamina/xilazina intramuscular (IM) na musculatura paraespinhal para induzir anestesia.
- Enquanto aguarda o coelho a tornar-se anestesiada, prepare a sala de preparação e mesas de sala de cirurgia (OR).
- Na sala de preparação OR: colocar a pomada oftálmica e o patch fentanil ao alcance a tabela de preparação; configurar a máquina de cortar cabelo e vácuo para barbear o pescoço do coelho e da orelha; Reserve uma almofada da preparação do álcool, um cateter 24 x ¾", um orifício de injecção e esparadrapo para fixar a linha intravenosa (IV) na veia de orelha de coelho.
- Na sala de operações: configurar o equipamento de monitorização e posicionar as sondas [eletrocardiograma (ECG), saturação de oxigênio (SpO2), temperatura] na tabela OR; Prepare-se oxigênio e isoflurano; Amarre a tira de gaze para a máscara facial para segura-lo para o coelho e colocar a máscara na cabeça final da tabela.
Nota: As tiras de gaze amarradas a máscara de rosto devem ter 2 caudas de cerca de 45 cm cada. - Ligue o aquecimento cobertor de água sobre a mesa de OR. Em cima do cobertor de água, coloque uma toalha enrolada para apoio de pescoço e uma placa de eletrodo dispersivo (mais tarde colocada embaixo do coelho).
- Configurar a bomba ou IV com 100 mL de uma bolsa de soro salina com uma agulha de 18-19G anexado e definir a taxa de fluxo de 10 mL/h / kg.
- Combinar a 1 mL de lidocaína HCl (solução a 2% das ações) e 1 mL de HCl de bupivacaina (0,5% solução estoque) em uma seringa, para ser utilizado como um analgésico local.
- Quando o coelho é totalmente anestesiado, prepare o coelho para a cirurgia.
Nota: Verificar a falta de um pedal reflex (pitada um dedo do pé; olhar para retirada de membro) para garantir a profundidade anestésica e continuar a monitorar o reflexo pedal durante a cirurgia.- Aplica a pomada oftálmica de olhos. Remova fezes do reto do coelho, pressionando com os dedos com a luva na parte inferior do abdome anterior (acima do reto) e os dedos se movendo em direção ao ânus. Isto permitirá para posterior colocação de uma sonda de temperatura retal.
- Rapar o pescoço anterior do esterno notch à borda da mandíbula enquanto estiver usando um vácuo para manter a área limpa. Também raspar ambos os ouvidos para a colocação de IV e o anexo de patch fentanil e raspar uma pata traseira esquerda para a sonda de oximetria de pulso.
Nota: O protocolo assume que o cirurgião é lado direito do coelho por todo o procedimento. Se a configuração OR coloca o cirurgião no lado oposto, inverta os lados nesta etapa para manter os fios e IV em frente do cirurgião. Os lados de etapas futuras também devem ser ligados conforme necessário. - Limpe a orelha esquerda com uma almofada da preparação do álcool, colocar um cateter IV 24 na veia da orelha esquerda, tampa com o orifício de injecção e fita o cateter e o porto de orelha de coelho para fixá-la. Aplica um patch de fentanil (25 µ g/h) a orelha do coelho.
- Transportar o coelho para o OR... e colocar em decúbito dorsal na mesa de operação com uma toalha de apoio de pescoço enrolado no pescoço do coelho, apenas abaixo da cabeça. Estenda suavemente o pescoço do coelho até é reta e horizontal aproximadamente.
- Gancho o coelho até a máscara facial com O2 em 1 L/min e iniciar a administração de isoflurano. Fixe a máscara envolvendo as extremidades da faixa de gaze amarradas à máscara ao redor da toalha de apoio de pescoço sob o coelho. Ajuste o isoflurano (tipicamente 1-2%) conforme necessário (com base na frequência cardíaca, frequência respiratória e reflexo pedal) para manter a anestesia adequada para o resto do procedimento.
- Certifique-se de que a placa do eletrodo dispersivo é centralizada em volta do coelho. Coloque as sondas de temperatura e oxímetro de pulso e aplique a EKG leva o coelho.
- Arranjar solução salina IV para o porto de cateter na orelha do coelho, iniciando a bomba salina a 10 mL/h / kg.
Nota: Depois de 1 h, a bomba salina pode ser reduzida a 5 mL/h / kg. - Conter as pernas da frente do coelho por frouxamente, amarrando-os para a mesa. Opcionalmente, coloque uma pequena mesa de plástico sobre o coelho a proteger o coelho sejam submetidos a pressão torácica/abdominal do cirurgião, apoiando-se no peito/abdômen de coelho.
Nota: A tabela pequena pode ajudar a prevenir a regurgitação forçada do conteúdo abdominal. - Injete 2 mL de lidocaína previamente preparada (2% das ações) / bupivacaína (0,5% das ações) (mistura 50/50) por via subcutânea ao longo da linha de incisão de pescoço planejada para a anestesia local.
- Deixe o assistente preparar o local cirúrgico com 3 alternando esfrega de clorexidina e isopropanol e em seguida um spray com betadine. Esfoliante, vestido e luvas, seguindo uma técnica asséptica adequada.
Nota: O cirurgião deve estar usando 2 x lupas cirúrgicas para ajudar com a primeira metade da cirurgia. Durante a cirurgia de sobrevivência é vital para manter a esterilidade do campo cirúrgico e do cirurgião. Só o assistente deve lidar com todos os itens não-esterilizados e materiais esterilizados devem ser passados para o cirurgião ou colocados na mesa instrumento drapeado assepticamente. Toalhas estéril podem ser usadas pelo cirurgião para manter a esterilidade ao manipular equipamentos não esterilizados, tais como o microscópio.
2. sobrevivência cirurgia (transferência de genes)
- Prepare instrumentos e campo estéril.
- Deixe o assistente abre a mochila de pano estéril contendo um pano de mesa, uma cortina de papel para o coelho e várias toalhas. Assepticamente, transferi os itens para o cirurgião.
- Cubra a mesa do instrumento. O papel e coloque a 6 toalhas estéreis drapejar sobre a mesa drapeada.
- Com 4 toalhas, cubra o pescoço do coelho, deixando apenas o sítio cirúrgico exposto (aproximadamente 4 cm x 10 cm). Colocar a cortina de papel sobre o coelho.
- Deixe o assistente abre a mochila de instrumento esterilizado e assepticamente coloque sobre a mesa do instrumento.
- Deixe o assistente, abra os seguintes equipamentos e assepticamente, coloque sobre a mesa do instrumento ou mão ao cirurgião: três seringas de 1 mL (e uma agulha se as seringas já não são carregadas com agulhas), uma seringa de 20 mL, uma agulha 21G, uma agulha de 19g, 3-0 poliglicólico sutura ácido (PGA), 5-0 PGA sutura, sutura de polipropileno de 7-0 e dois 24 G IV-cateteres.
- Prenda o cabo do eletrocautério para drapejar coelho usando a 7,25" Kantrowitz fórceps e depois soltar a ficha final fora da mesa. Deixe o assistente conectar o cabo à unidade de eletrocirurgia e ligar a energia.
- Encher uma seringa de 20 mL com soro fisiológico estéril, extraídas de uma bolsa de soro ou frasco realizada pelo assistente. Use esta solução salina conforme necessário para manter o tecido exposto húmida durante o procedimento.
- Prepare uma seringa de 1 mL com 1 mL de meio Eagle modificado do de Dulbecco (DMEM, para a lavagem da artéria). Para cada artéria carótida que vai ser transformada, 0,35 mL de vírus diluído são necessários. Se o mesmo vírus é usado para ambos os lados, prepare uma seringa de 1 mL com vírus diluído em DMEM a um volume de 0,7 mL. Se os lados diferentes estão recebendo diferentes vírus [por exemplo um "Nulo" controle de vírus de um lado], prepare duas seringas de 1 mL, cada um com 0,35 mL de solução de antivírus. Para auxiliar dependentes adenovírus, a concentração de vírus é 2 x 1011 partículas virais (vp) / mL.
Nota: Deixe o assistente preparar o vírus. O cirurgião que elabora suspensão DMEM e vírus em seringas esterilizadas. - Faça um furo na cortina. O tamanho do furo deve ser do mesmo tamanho que o sítio cirúrgico no pescoço do coelho que é emoldurado pelas toalhas na etapa 2.1.3. Prenda os cantos do buraco na cortina de papel para as toalhas subjacentes que são drapejadas sobre o pescoço do coelho com os grampos de toalha.
- Isole as artérias carótidas comuns.
Nota: 2 x lupas cirúrgicas deve ser usado para esta parte.- Cortar a pele com um eletrocautério ao longo da linha mediana estendendo aproximadamente 7-9 cm cranialmente em direção a mandíbula e prenda a pele aberta com braçadeiras de toalha.
- Fazer um corte lateral curto através da fáscia com o eletrocautério na extremidade caudal. Em seguida, insira a tesoura grande no corte e sem rodeios, dissecar a fáscia ao longo de toda sua mediana. Corte a fáscia dissecada para baixo da linha média com eletrocautério.
- Com tesouras pequenas de dissecação, disse entre os músculos em forma de V (músculo sternocephalic) e o músculo de sternohyoid sobre a traqueia, para expor as artérias carótidas comuns, começando do lado direito.
- Disse a artéria carótida comum direita livre de tecidos, dividindo todos os ramos, da base do pescoço caudalmente para a travessia do nervo faríngeo cranialmente circundantes. Uso do silicone cirúrgico loops para ajudar na retração da artéria durante a dissecção.
Nota: Tenha cuidado para não perturbar o nervo vago que corre paralelo a carótida comum, ou os nervos menores que atravessam a carótida comum. - Ligate qualquer grandes ramos saindo da artéria carótida comum (1-2 em cada lado) com suturas de seda 5-0 antes de cortar o ramo distalmente para liberar um segmento de 4 a 5 cm da carótida. Corte ramos ligados 1-2 mm afastada a gravata para que a gravata não escorregar.
- Repita a dissecação do lado esquerdo (etapas 2.2.3 - 2.2.5).
- Infundi vetores em artérias carótidas comuns.
Nota: Um microscópio cirúrgico (16x) é usado como necessário para a realização de arteriotomia, infundindo solução/controle de vetor e reparação de arteriotomia.- Deixe o assistente remova as lupas cirúrgicas o cirurgião e posicionem-se o microscópio cirúrgico. Armar uma toalha estéril sobre o microscópio para permitir a manipulação do microscópio sem contaminar o campo estéril.
- Injetar heparina [150 unidades internacionais (IU) /kg] no cateter IV e lavar com 10 mL de solução salina.
- Retornando a carótida comum direita isolada, colocar duas gravatas de seda em torno a porção média do segmento mobilizado carótida e amarrar um único nó de laçada em cada - sem apertá-los.
- Dobrar a agulha 19g logo acima o bisel para aproximadamente 80° usando o driver de agulha grande (Não dobre o bisel; A Figura 1).
- Grampeie a artéria em cada extremidade do segmento isolado com clips vasculares, colocando o clipe craniano primeiro para permitir a artéria de enchimento e então colocar o clipe de caudal.
- Punção da artéria carótida comum com a agulha 19g torta só cranial ao caudal clipe vascular, tomando muito cuidado para não perfurar as paredes laterais ou traseiras. Avançar para a ponta da agulha dentro do lúmen e retirá-la duas vezes para certificar-se de arteriotomia completamente atravessa a parede da artéria. Em seguida, Retire cuidadosamente a agulha.
Notas: É importante criar uma arteriotomia que penetra todas as camadas da parede arterial, limpa e não dissecar a parede da artéria (passando axialmente através da adventícia e média). Para realizar isto, a carótida deve ser perfurada com a ponta da agulha posicionada mais próximo possível de um ângulo de 90°, contra a parede da artéria (Figura 1). Perfuração na carótida em um ângulo de 90° é auxiliada por pegar a artéria por adventitia com pinça fina e levantando suavemente a superfície de artéria enquanto pressiona a ponta da agulha só caudal ao ponto de elevador. Esta manobra também reduz o risco de bater a parede posterior (Figura 1). - Desdobrar e monte-se vários gaze em um ninho onde depositam a seringa usada para as infusões. Coloque o ninho no peito do coelho caudal para a incisão.
- Colocar um cateter IV-sobre a seringa que contém somente DMEM (não muito apertada) e dobre o cateter ~ 4 mm da ponta, de modo que a curva detém cerca de 75 ° depois que for lançado.
- Introduza o IV-cateter na artéria até o ponto de curva e lavar todo o sangue da artéria com DMEM (~ 0,25 mL x 2). Para cada lavagem, encher a artéria com DMEM e remova DMEM residual do lúmen do vaso pressionando suavemente sobre a artéria com um dedo protegido por luva, começando apenas caudal ao clipe vascular craniano. Mantendo uma pressão suave, deslize o dedo de cranial para caudal. O conteúdo luminal lavará para fora através da arteriotomia.
- Manter o cateter na artéria e trocar a seringa DMEM para a seringa contendo a solução de antivírus. Certifique-se de que nenhum ar entra o cateter.
- Deslize as gravatas de seda se a artéria, para que eles cercam a artéria na zona da ponta do cateter, mas não aperte-os.
- Infundi 0,03 mL da solução de vírus para empurrar o restante DMEM sem o cateter e depois esvazie a artéria. Recolhê-lo novamente removendo todos os fluidos do lúmen com um dedo, cranial ao caudal (como na etapa 2.3.9).
- Aperte os dois laços em torno da ponta do cateter para selar o lúmen. Administrar a solução de vírus (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL para adenovírus) pressionando o êmbolo da seringa suavemente até a artéria é distendida ao calibre fisiológica.
Nota: É importante que a artéria expande para calibre fisiológica e permanece distendida durante a infusão de vírus. Se não, o grau de transferência do gene vai cair significativamente. - Deite suavemente a seringa no ninho de gaze.
- Coloque uma sutura de polipropileno de 7-0 no adventitia carótida comum só caudal do clipe vascular craniano para marcar o limite cranial da transdução de gene
- Depois que a solução contendo vírus tem sido no lúmen arterial por 20 min, retire a seringa contendo vírus e substituí-lo com uma seringa vazia. Aspire a solução contendo vírus suavemente até que o navio entra em colapso e remova a seringa. Corte ou desfazer os laços de seda e com cuidado, remova o cateter.
Nota: Corte os laços muito curta SIDA em removê-los. Remova o cateter cuidadosamente para evitar causar dano ao endotélio da carótida. - Usando o microscópio cirúrgico, feche a arteriotomia com polipropileno de 7-0, usando um X-padrão (Figura 2).
- Fazer um passe de primeiro entrada no canto inferior-direito da arteriotomia e saída do navio no canto inferior esquerdo. Em seguida, atravessar a abertura e fazer uma segunda passagem do topo-direito ao canto superior esquerdo.
- Antes amarrando a sutura, expulsar a artéria liberando muito brevemente o clipe vascular craniano. Sangue fluirá fora a arteriotomia quando o clipe for lançado, removendo o ar e vírus residual do lúmen.
- Puxe os pontos para suavemente feche a arteriotomia e amarrar uma sutura com 2 nós de praça.
Nota: Puxando a sutura apertada causará ajuntamento do tecido que irá perturbar o fluxo, aumentando o risco de trombose e alterando o fluxo que pode ser uma variável importante descontrolada em modelos de doenças.
- Solte o grampo vascular craniano e em seguida o caudal clip vascular, exercendo uma ligeira pressão com gaze para parar qualquer sangramento. Se a hemorragia persistir, continue a pressão para 1-2 min. Se a arteriotomia foi fechada corretamente, o sangramento para sempre dentro deste prazo.
- Deixe o assistente injetar buprenorfina [0,02 mg/kg; subcutâneo (SQ)], desta vez para fornecer analgesia pós-operatória, até que os níveis plasmáticos de fentanil tornar-se terapêutica.
Nota: Uma segunda buprenorfina injeção (0,02 mg/kg; SQ) pode ser necessários 6 h após a primeira injeção para manter analgesia, até que os níveis plasmáticos de fentanil tornam terapêuticos. - Repita o protocolo de infusão de vírus no lado esquerdo, seguindo passos 2.3.2 - 2.3.19.
- Fechamento da ferida
- Use uma sutura de PGA de 5-0 para fechar a fáscia mediana com uma sutura contínua.
- Com uma sutura de PGA 3-0, feche a pele com um padrão intradérmico, usando um nó enterrado em ambas as extremidades.
- Limpeza e recuperação pós-operatória.
Nota: O coelho deve ser monitorado continuamente para adequada oxigenação e a temperatura corporal enquanto se recuperava da anestesia. Recuperação deve ocorrer em um ambiente calmo e tranquilo.- Desligar o fluxo de isoflurano e oxigênio e remover a máscara facial de coelho.
- Desenganche o soro, mas deixar o porto de IV no lugar para acesso de emergência IV.
- Levar o coelho para a área de recuperação e colocar de lado em uma gaiola com um cobertor de água aquecimento ligado (ou, opcionalmente, um aquecedor de Bair Hugger).
- Dar O2 por máscara até o SpO2 é estável.
- Deixe que o coelho em uma gaiola, recupera virá-lo para o outro lado cada 15 min, até que o coelho pode sentar-se nas suas patas e se mover.
- Quando o coelho é móvel, remova o IV seu ouvido antes de retornar para a gaiola.
Nota: Não retornam o coelho para a companhia de outros animais até que ele está totalmente recuperado da anestesia.
- Elimine qualquer coisa que teve contato com o vetor ou foi no campo operatório, farelos e biohazard apropriado seguir protocolos de resíduos.
3. transferência de Gene para as artérias carótidas comuns coelho: cuidados pós-operatórios
- Avalie a condição geral do coelho diariamente após cirurgia, verificação de cicatrização de feridas, evidência de infecção, apetite, respiração e sinais de dor.
- Verifique a posição de orelha de coelho (orelhas para baixo podem ser um sinal de dor ou desconforto, especialmente quando combinada com uma aparência descuidada). Verifica que o coelho permanece ativa e móvel. Verifique o coelho para a respiração normal sem estridor. Verifique se o ferimento está limpo, seco e intacto. Verifique o coelho para uma temperatura normal do corpo. Consulte serviços veterinários se o coelho não é móvel e ativa, com a temperatura normal do corpo, uma aparência arrumada, uma ferida limpa e normal de respiração.
- Verifique se há ingestão de alimentos normais e evidência de urina e fezes frescas.
Nota: A ingestão de alimentos pode ser reduzida após a cirurgia, mas deve retornar ao normal dentro de 2 dias; fornece alimento suplementar conforme necessário.
- Remova o patch fentanil no 3º dia pós-operatório.
Nota: Buprenorfina pode ser administrada conforme necessário para dor pós-operatória não é gerenciado pelo patch fentanil, ou no caso do patch fentanil é removido mais cedo.
4. terminal colheita cirurgia: pré-operação
- Anestesia o coelho. Consulte as seções 1.3 e 1.3.5 em matéria de conquista e manutenção da anestesia.
- Pese o coelho. Combine a 30 mg/kg de ketamina e 2 mg/kg de xilazina em uma seringa. Injecte cetamina/xilazina IM na musculatura paraespinhal para induzir anestesia.
- Prepare a sala de preparação e/ou tabelas enquanto aguarda o coelho para tornar-se anestesiado.
- Na sala de preparação OR: configurar a máquina de cortar cabelo e vácuo para barbear o pescoço e a orelha de coelho.
- Na sala de operações: configuração de equipamentos de monitorização e posicionar as sondas (SpO2, temperatura) na tabela OR; Prepare-se oxigênio e isoflurano; Amarre uma tira de gaze para a máscara facial para segura-lo para o coelho e colocar a máscara na cabeça final da tabela.
Nota: As tiras de gaze amarradas a máscara devem ter 2 caudas de cerca de 45 cm cada. - Ligue o aquecimento cobertor de água sobre a mesa de OR. Em cima do cobertor de água, coloque uma toalha enrolada para apoio de pescoço e uma placa de eletrodo dispersivo (mais tarde colocada embaixo do coelho).
- Combinar a 1 mL de lidocaína HCl (2% das ações) e 1 mL de HCl de bupivacaina (0,5% das ações) (mistura 50/50) em uma seringa como um analgésico local.
- Quando o coelho é totalmente anestesiado, prepare o coelho para a cirurgia.
- Remova fezes do reto, conforme descrito em 1.3.1, para permitir a posterior colocação de uma sonda de temperatura.
- Raspe o coelho do notch esterno ao ângulo da mandíbula ao usar um vácuo para manter a área limpa. Também raspe dedo médio esquerdo traseiro para a sonda de oximetria de pulso.
Nota: O protocolo assume que o cirurgião será lado direito do coelho. Se a configuração OR colocará o cirurgião no lado oposto, inverta os lados nesta etapa para manter os fios em frente do cirurgião. Os lados de etapas futuras também devem ser ligados conforme necessário. - Transportar o coelho para o OR... e colocar em decúbito dorsal na mesa de operação com uma toalha de apoio de pescoço enrolado no pescoço do coelho, apenas abaixo da cabeça. Estenda suavemente o pescoço do coelho até é reta e horizontal aproximadamente.
- Gancho o coelho até máscara facial com O2 em 1 L/min e iniciar a administração de isoflurano. Fixe a máscara envolvendo as extremidades da faixa de gaze amarradas à máscara ao redor da toalha de apoio de pescoço sob o coelho. Ajuste o isoflurano (tipicamente 1-2%) conforme necessário para manter a anestesia adequada para o resto do procedimento.
- Verifique a placa do eletrodo dispersivo é centralizada em volta do coelho. Coloque sondas de temperatura e oxímetro de pulso.
- Conter as pernas da frente do coelho por frouxamente, amarrando-os para a mesa.
Nota: Opcionalmente, coloca uma pequena mesa de plástico sobre o coelho para proteger o coelho sejam submetidos a pressão torácica/abdominal do cirurgião, apoiando-se no peito/abdômen de coelho. O objetivo aqui é evitar regurgitação forçada do conteúdo abdominal. - Injete 2 mL de lidocaína (solução a 2% das ações) / bupivacaína (0,5% solução) (50/50 mistura; de passo 2.4) por via subcutânea ao longo da linha de incisão de pescoço planejada para a anestesia local.
- Pulverize o local cirúrgico com betadine. Coloque luvas limpas para procedimento cirúrgico.
5. terminal cirurgia (colheita de navio)
- Prepare instrumentos e campo cirúrgico.
- Abra uma embalagem de pano limpo contendo uma tabela drape e caimento de um papel para o coelho. Cubra a mesa do instrumento.
- Abra o pacote de instrumento, coloque sobre a mesa do instrumento e organizar instrumentos. Coloque os seguintes equipamentos sobre a mesa de instrumento: uma seringa de 20 mL e uma agulha 21G.
- Prenda o cabo do eletrocautério para drapejar coelho usando a 7,25" Kantrowitz fórceps. Ligue a ficha à unidade de eletrocirurgia e ligá-lo.
- Encha uma seringa de 20 mL com soro fisiológico estéril. Use esta solução salina conforme necessário para manter o tecido exposto húmida durante o procedimento.
- Coloque a cortina de papel sobre o coelho e corte um buraco na cortina sobre o local cirúrgico no pescoço do coelho. Prenda os cantos do buraco no lugar de pele de coelho com os grampos de toalha.
- Isole as artérias carótidas comuns.
Nota: 2 x lupas cirúrgicas deve ser usado para esta parte.- Corte a pele com um eletrocautério ao longo da linha mediana estendendo aproximadamente 7-9 cm cranialmente em direção à pele de mandíbula e grampo aberta com braçadeiras de toalha.
Nota: Se a colheita é apenas alguns dias após a cirurgia anterior, eletrocautério não é necessária. Corte as suturas e puxe delicadamente aberto a incisão da cirurgia anterior. - Fazer um corte lateral curto através da fáscia com um eletrocautério na extremidade caudal. Insira uma tesoura grande o corte e dissecar sem rodeios a fáscia ao longo da linha média inteira. Corte a fáscia dissecada para baixo da linha média com o eletrocautério.
- Com tesouras pequenas de dissecação, disse entre os músculos em forma de V (músculo sternocephalic) e o músculo de sternohyoid sobre a traqueia, para isolar as artérias carótidas comuns, começando do lado direito.
- Disse a artéria direita livre de tecidos da base do pescoço caudalmente para a travessia do nervo faríngeo circundantes cranialmente. Uso do silicone cirúrgico loops para ajudar na retração da artéria durante a dissecção.
- Repita a dissecação do lado esquerdo (etapas 5.2.3 - 5.2.4).
- Com uma sutura de seda 3-0, ligate a artéria carótida comum cranial ao segmento que foi infundido com o vetor (uso adventícia colocado na primeira cirurgia para localizar a extensão cranial da infusão de vetor de sutura. Então ligate caudal para a arteriotomia reparada na carótida.
- Impostos especiais de consumo do segmento carótido entre a ligadura e irrigue o lúmen com soro fisiológico. Aparar fora excesso de tecido adventícia do vaso e cortar o carótida segmento em pedaços menores para as diferentes análises de ponto de extremidade (histologia, ADN, ácido ribonucleico (RNA), proteína, explantes cultura, etc.).
- Injectar 1 mL de Beuthanasia IV, a eutanásia e confirmar a eutanásia do coelho.
- Corte a pele com um eletrocautério ao longo da linha mediana estendendo aproximadamente 7-9 cm cranialmente em direção à pele de mandíbula e grampo aberta com braçadeiras de toalha.
- Elimine qualquer coisa que tiveram contato com o vetor ou foi no campo operatório, farelos e biohazard apropriado seguir protocolos de resíduos.
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Representative Results
Para implementar esse método com confiança, experimentos preliminares são necessários para estabelecer que o operador realize transferência de genes eficiente e reprodutíveis, com expressão do transgene principalmente em células endoteliais luminal. Em nossa experiência, isto é mais facilmente avaliado utilizando um vetor que expressa a β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) dos segmentos de carótida comuns coloração removido 3 dias após a infusão de vetor, bem como a medida de β-galactosidase mRNA (RNA mensageiro) com cadeia de polimerase transcrição reversa quantitativa reação (qRT-PCR), irá revelar a localização das células transduzidas, reprodutibilidade e eficiência. Para experimentos que investigar os efeitos da expressão do transgene ou medem a atividade transcricional elementos cis-agindo, normalmente medimos o transgene mRNA como indicação inicial de nível e reprodutibilidade da transferência de genes.
Um novo operador no nosso laboratório procurou estabelecer proficiência com esse método por transducing coelho comum artérias carótidas com um vetor de adenovírus (2 x 1011 vp/mL) expressando um transgene de β-galactosidase, impulsionado por um citomegalovírus (CMV) promotor. Transduzidas artérias foram colhidos 3 dias mais tarde e foram cortadas transversalmente em segmentos. Segmentos individuais foram, então, qualquer corte aberto axialmente ou deixaram como anéis intactas. Todos os segmentos foram manchada em tubos microcentrifuga X-galão. Segmentos que tinham sido cortados abertos axialmente foram colocados sobre uma superfície horizontal e a superfície luminal màxima expostos, usando pinos conforme necessário para impedir que o segmento ondulando acima. Imagens de rosto en da superfície luminal mostraram coloração endotelial robusto com X-gal (Figs. 3A e 3B). Imagens axiais da superfície luminal do anéis carótidas intactos mostraram X-galão coloração somente sobre a superfície luminal (figuras 3 e 3D). Os segmentos que tinham sido abertos axialmente foram processados em parafina, seccionados e Counter-corados com hematoxilina e eosina ou nuclear rápido vermelho. Imagens Mostrar X-galão coloração principalmente no endotélio, embora haja uma pequena quantidade de coloração na camada adventícia (figuras 3E e 3F). Transdução de células adventícia pode ocorrer através do escapamento do vetor através do site da arteriotomia ou por vazamento através de pequenos ramos proximais aos sites da ligadura do ramo de lado. 29
Em um experimento separado, um novo operador procurou estabelecer proficiência em alcançar níveis reprodutíveis da expressão do transgene, como um prelúdio para experimentos vista investigar atividades biológicas dos transgenes. Coelho, artérias carótidas comuns foram transfectadas com adenovírus auxiliar dependente (2 x 1011 vp/mL) contendo qualquer uma apo A-I (HDAdApoAI) ou o transgene de IL-10 (HDAdIL10), ambos sob controle de um promotor de CMV. Transduzidas artérias foram colhidos 3 dias depois da transdução e cortar-se transversalmente em segmentos. RNA foi extraído o navio segmentos e apo A-I e expressões de mRNA de IL-10 foram quantificados por qRT-PCR, com normalização de gliceraldeído 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) mRNA na mesma extratos (Figura 4). Nas artérias HDAdIL10-transfectadas, apenas 1 de 6 artérias tinham uma muito baixa, mas detectável apo A-eu sinal de mRNA. Quer dizer a expressão de apo A-eu mRNA foi 700-fold maior nos vasos transformados com HDAdApoAI do que em vasos transfectadas com HDAdIL10. Baixos níveis de mRNA de IL-10 endógenos foram detectados nas artérias HDAdApoAI-transfectadas, dizer com expressão aumentada de 6-fold em HDAdIL10-transfectadas artérias. Da nota, há considerável intra e inter artery variabilidade na eficiência de transdução e expressão do transgene, conforme mostrado nas figuras 3 e 4, respectivamente. Encontramos esta variabilidade mesmo com operadores experientes.
Figura 1 . Arteriotomia na artéria carótida comum. Pinça fina é usada para agarrar a adventícia da carótida e aplicar tração ascendente para a artéria. Esta manobra expande o lúmen da embarcação e gera uma superfície vertical na qual está inserida a agulha 19g torta, minimizando assim o risco de perfurar a parede da artéria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Encerramento da arteriotomia carótida comum. a arteriotomia é fechada com uma sutura de polipropileno de 7-0, usando um X-padrão. A primeira passagem da agulha e sutura entra o lúmen da artéria na inferior direita da arteriotomia (local 1) e sai do lúmen no canto inferior esquerdo (local 2). A agulha sutura cruzar a arteriotomia e re-introduzir o lúmen no canto superior direito (sítio 3). A agulha, em seguida, sai do lúmen no canto superior esquerdo (sítio 4). Tração suave em ambas as extremidades da sutura fecha a arteriotomia. As extremidades da sutura (sair do site 1 e site 4) atadas com 2 nós de praça. Círculos cinzas representam locais de suturas, passando através da parede do vaso. Linhas sólidas azuis indicam áreas onde a sutura é fora da parede do vaso. Linhas pontilhadas azuis indicam áreas onde a sutura é dentro do lúmen. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Expressão do transgene endotelial eficiente. As artérias carótidas comuns coelho foram transfectadas com um vetor de adenovírus expressando um transgene de β-galactosidase e colhidos 3 dias mais tarde. Artéria transduzidas segmentos eram X-galão manchado como anéis intactas ou depois de ser aberto com um corte axial. (-B) Imagens de rosto pt da superfície luminal da carótida anéis que foram cortados axialmente. (C-D) Vista axial no espaço luminal dos anéis carótidas intactas. (E-F) X-galão manchado, parafina carótidos segmentos foram seccionados e Counter-manchados com (E) hematoxilina e eosina ou (F) nuclear rápido vermelho. Barra de escala = 100 µm. Eu = íntima; M = meios de comunicação; e um = adventícia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Quantificação da expressão de RNAm de transgene. As artérias carótidas comuns coelho foram transfectadas com auxiliar dependente adenovírus expressando qualquer apo A-I (HDAdApoAI) ou IL-10 (HDAdIL10) sob controle de um promotor de CMV. As artérias foram colhidas 3 dias depois. a expressão de RNAm de (A) Apo A-I e (B) IL-10 foram quantificados por qRT-PCR, normalizada para GAPDH mRNA na mesma artéria e expressa em unidades arbitrárias (AU). Barra indica o valor médio; Valor de P é de rank-sum test. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Vantagens | Desvantagens | |
| Em relação aos modelos de roedores | Mais próximos filogeneticamente aos primatas | Mais caro para comprar e casa |
| Maior diversidade genética, facilitando a tradução clínica | Mais difícil de criar e manipular | |
| Os maiores navios permitir fácil manipulação cirúrgica e fornece mais tecido para análise quantitativa | Requisitos normativos mais extensos | |
| Permite o uso de dispositivos endovasculares projetado para seres humanos | Menos fundos geneticamente modificados | |
| Menos extensa seleção de anticorpos contra proteínas de coelho | ||
| Em comparação com modelos maiores de animais | Relativamente barato de comprar e de casa | Possivelmente menos clinicamente relevantes do que outros modelos animais grandes para algumas doenças vasculares |
| Mais fácil de criar e manipular | ||
| Comparado a transgênese germinal | Transgene expressado somente em grande artéria; efeito do transgene especificamente no local de interesse pode ser determinado | Aplicação do método de células que não sejam o endotélio é difícil |
| Pode usar a carótida contralateral como um controle pareado; elimina os parâmetros sistêmicos (ex., pressão arterial, nível de colesterol) como variáveis não controladas | Sala de operações e a perícia cirúrgica necessária; provável de instalações do núcleo não disponível | |
| Maior rendimento para o teste de atividade de sequência reguladora de DNA no endotélio de vasos grandes | Transgene pode ser expresso na maioria dos leitos vasculares | |
| Potencialmente mais rápido e mais barato | ||
| Exposição sistêmica à proteína transgénica improvável — minimiza os efeitos fora do alvo | ||
| Em comparação com abordagens de terapia sistêmica (ex.. Transduction do fígado através da injeção de veia periférica) |
Expressão do transgene mais estável do que a terapia sistêmica (fígado) | Entrega de vetor requer intervenção cirúrgica |
| Transgene expressado na parede da artéria, permitindo a entrega local de altos níveis de proteína transgênica | Sala de operações e a perícia cirúrgica necessária | |
| Exposição sistêmica à proteína transgénica improvável — minimiza os efeitos fora do alvo | Tratamento limitado para as artérias que são especificamente orientadas para a intervenção; não tratar fatores sistêmicos (EG., lipídios) | |
| Pode usar a carótida contralateral como um controle pareado; elimina os parâmetros sistêmicos (por exemplo, pressão arterial, nível de colesterol) como variáveis não controladas | ||
| Menor dose de vetor necessário |
Tabela 1. Vantagens e desvantagens do modelo de transferência do coelho comum artéria carótida endotelial-seletiva do gene.
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Discussion
Certos aspectos da técnica cirúrgica merecem particular atenção. Exposição completa e mobilização da artéria carótida comum através de dissecção cuidadosa vai facilitar a transferência e arteriotomia reparação de gene. No entanto, durante a dissecção, manipulação direta da artéria carótida deve ser minimizada para evitar o vasoespasmo. Além disso, qualquer sangramento adjacente à artéria deve ser interrompida, aplicando uma ligeira pressão com gaze e sangue extravasado deve ser limpa imediatamente por enxaguar a área com soro fisiológico normal. Também é importante para não danificar o nervo vago, que corre paralelo à artéria carótida comum. Aparar a adventícia na área da arteriotomia planejada ajudará o operador para realizar uma arteriotomia limpa e funcional e para reparar a arteriotomia. Finalmente, ramos da artéria carótida comum devem ser identificados e ligados firmemente para impedir o escapamento do vetor do lúmen da carótida.
Há também aspectos críticos da arteriotomia reparação e infusão de vetor. Durante a infusão de vetor, é importante distender a carótida comum para fisiológico ou ligeiramente maior calibre para atingir a transdução eficiente. Ao reparar a arteriotomia, a sutura deve penetrar a parede do vaso, tão próximo quanto possível das bordas da arteriotomia e deve limpa entrar e sair do lúmen em vez de axialmente passar através da parede do vaso. Se apenas as camadas externas da parede do vaso são puxadas juntos porque a sutura axialmente passa através da parede do vaso, em vez de radialmente passando através da parede e entrar o lúmen, uma lacuna permanecerá em íntima e aumentará o risco de trombose. Se as penetrações de sutura são também amplamente espaçadas, ou se a sutura é excessivamente apertada quando amarrado, dobras de tecido serão criadas no local da arteriotomia. Essas dobras perturbam o fluxo normal do sangue laminar, aumentando também o risco de trombose. Características de fluxo consistente de manutenção é importante para experimentos realizados em modelos animais de doenças (ex., aterosclerose) porque o fluxo alterado pode contribuir para o processo de doença30.
Novos operadores geralmente encontram artérias Trombosadas na colheita. Trombose Luminal é uma complicação devastadora, tornando a artéria inutilizável como uma amostra experimental. Para evitar a trombose, rotineiramente administramos heparina IV antes da transferência do gene. Trombose também é impedida pela cuidadoso encerramento da arteriotomia, conforme descrito acima. A dosagem de heparina pode ser aumentada para evitar trombose, ou aspirina poderia ser dada no pós-operatório. No entanto, uma maior dose de heparina também aumentaria o potencial para complicações do sangramento, e aspirina poderia interferir com pontos de extremidade experimentais, especialmente se a inflamação está sendo estudada. Portanto, é preferível concentrar-se na melhoria técnica cirúrgica como meio de prevenir a trombose.
Se manipulado muito vigorosamente, artérias carótidas podem sofrer espasmos, que também poderiam contribuir para trombose, diminuindo o fluxo. Se o vasoespasmo é encontrado, ele pode ser aliviado por aplicação tópica papaverina. Quando o navio colheitas são planejadas por mais de 2-3 dias após a transdução e a trombose é uma preocupação, ultra-som transcutâneo pode ser usado para avaliar canaliza a patência do vaso. Descoberta das artérias Trombosadas pode levar a eutanásia para optimizar os custos de habitação. Animais adicionais também podem ser inscritos prontamente, para preencher os grupos experimentais. Mortalidade de peri - e pós - intervention associada com este método deve ser < 1% (i. e., não diferente da mortalidade associada a outras cirurgias realizadas em coelhos saudáveis)31.
Depois de um operador, torna-se confortável com os aspectos técnicos do protocolo cirúrgico, uma capacidade de realizar a transferência do gene eficiente para o endotélio deve ser verificada, usando abordagens descritas na seção acima sobre resultados representativos. Caso surjam questões com realização de transferência de genes pode ser reproduzido, o culpado é provável em uma das duas áreas. Depois que o navio está isolado e o sangue é lavado do lúmen, é importante remover o tampão de lavagem DMEM para que a solução infundida vetor não é diluída durante a transdução. O outro aspecto importante é a distender o navio a fisiológica ou ligeiramente maior calibre durante a infusão de vetor. Porque, em nossa experiência, uma artéria carótida que não é totalmente distendida ou não permanece distendido durante a infusão de 20 minutos confiantemente tem expressão do transgene baixa, é provável que a distensão da artéria ao calibre fisiológica melhora a transdução eficiência. No entanto, que nunca estudamos isso sistematicamente. É possível que aumentando a pressão de infusão acima dos níveis fisiológicos poderia aumentar a eficiência de transdução e também permitir que níveis mais elevados de transdução de células na mídia vascular. No entanto, rompimento da barreira endotelial provavelmente iria danificar o navio e aumentar o risco de trombose. Se o navio não permanece distendido para o período inteiro vector-incubação de 20 minutos, é provável que o vetor está vazando de ramos da artéria carótida comum. Tenha cuidado durante a dissecção para identificar e ligar todos os ramos para impedir o escapamento do vetor do lúmen da carótida.
Este método tem várias limitações que estão relacionadas ao uso de coelhos. Coelhos são menos caros abrigar e alimentar do que outros animais de grandes porte (cães, porcos, ovelhas); no entanto, os custos de aquisição, alojamento e alimentação de coelhos são consideravelmente mais do que para camundongos e ratos. As instalações de sala de operações e requisitos normativos para cirurgias de coelho também são muito mais extensos do que para os roedores. Além disso, considerável conhecimento técnico é necessário para executar o protocolo de transferência de gene cirúrgico efetivamente. Esta experiência pode ser adquirida pelos operadores que não tenham tido nenhum treinamento formal e cirúrgico. Pelo menos 2 pessoas no nosso grupo (incluindo o autor principal deste manuscrito) aprendeu as técnicas cirúrgicas e aplicou-as de forma produtiva. Não obstante, treinamento meticuloso e uma validação cuidadosa da eficiência de transferência do gene do operador e da reprodutibilidade (conforme descrito na seção resultados representativos) são necessárias antes que o operador pode começar a gerar dados de alta qualidade.
É o confinamento da expressão do transgene quase exclusivamente para o endotélio com este método29,32,33,34,35,36,37 útil que permite a investigação dos efeitos do transgene em células endoteliais e medição da actividade cis-atuação reguladoras de sequências de ADN em células endoteliais. Um pequeno número de células adventícia ou medial pode ser transformado; no entanto, a incapacidade deste método de transduce eficientemente as células nonendothelial impede a aplicação do método para o estudo de outros tipos de células da parede vascular (por exemplo, células musculares lisas e macrófagos). Embora a superexpressão de proteínas secretadas de células endoteliais transduzidas pode permitir que a investigação dos efeitos destas proteínas em outras células vasculares tipos, as funções de proteínas não-secretada nesses outros tipos de células vasculares (ex. receptores ou proteínas envolveram na transdução de sinal) não pode ser investigado com este método.
Como um meio para testar a terapia de gene orientada para a parede de artéria, o método difere de outros métodos pré-clínicos em duas maneiras principais. Primeiro, o método utiliza um modelo de coelho na vivo testes de terapia genética, ao invés de mais comumente usado modelos roedores8,12,15,38,39. O uso de coelhos permite a avaliação da expressão do transgene e o papel biológico do produto do transgene em um modelo animal outbred, que é mais representativa da diversidade genética humana do que são puras de roedores. O modelo pode ser usado para avaliar a terapia genética em artérias ou normal de coelho ou nas artérias do coelho que têm patologia arterial que é semelhante ao encontrado nas artérias humanas doentes. Artérias de coelho também são mais perto em tamanho de artérias humanas que são roedores artérias e fornecer muito mais tecido para análise do que está disponível a partir do roedores artérias. A segunda grande diferença é que este método usa uma abordagem cirúrgica para entregar o transgene vetor para o endotélio vascular. Terapia genética somática é muitas vezes entregues sistemicamente, mais frequentemente pela segmentação do fígado com o objetivo de alterar os níveis plasmáticos do transgene proteína25,40. Alvejando o endotélio vascular, o método fornece o produto terapêutico transgene localmente, com sua concentração de pico dentro da parede da artéria, precisamente onde ela é necessária para o tratamento de doença vascular. Entregando o transgene apenas localmente, o método também elimina os efeitos secundários sistêmicos do produto do transgene. Outros grupos estão desenvolvendo métodos usando peptídeos, anticorpos ou outras modificações de capsídeo para segmentação sistemicamente injetados vetores de endotélio saudável ou doente para fornecer a terapia de gene vascular local41,42 , 43. no entanto, estes métodos de segmentação permanecem em desenvolvimento e ainda são complicadas por transdução sistémica substancial, especialmente no fígado42,,43,44. Nosso método cirúrgico fornece uma introdução precisa e eficiente de transgenes para o endotélio vascular com mínima - se houver - transdução em outros locais. 1 o método também é uma forma mais conveniente, eficiente e superior-em toda a média (comparada a transgênese germinal ou injeção sistêmica de vetores endotelial-alvo) para testar a atividade de sequências reguladoras de DNA no vaso grande endotélio, para teste da função das proteínas do transgene na parede da artéria e para testar a terapia gênica navio-parede-alvo.
Esse método permite que a investigação do papel biológico de qualquer transgene, quando é expresso no endotélio grande artéria. Se modificado para expressar perda-de-função reagentes tais como receptores negativos dominantes ou grampo de cabelo curto do RNA, permitiria a investigação das funções de proteínas endoteliais endógenas e vias de sinalização. O método também pode ser usado para medir a atividade transcricional de qualquer sequência de DNA de cis-agindo em grande artéria células endoteliais5,6,7. Além disso, o método permite que o teste de qualquer tipo de vetor de transferência do gene para a eficiência e segurança quando entregues localmente ao endotélio e irá revelar a capacidade do vetor para atingir a expressão do transgene durável. Finalmente, o método permite desenvolvimento e teste de combinações de vetores e transgenes que são projetados para fornecer a terapia genética orientada na parede vascular. O método poderia servir como uma ferramenta de triagem para identificar genes terapêuticos que poder-no futuro-ser entregue ao endotélio de todas as grandes artérias (ou todos os doentes grandes artérias) por injetada por via percutânea vasculares vetores orientados para a parede. Por causa da imunidade pré-existente em seres humanos para adenovírus tipo 545, isso será um desafio usar vetores baseados em 5 do adenovírus tipo em aplicações clínicas. Engenharia do capsídeo adenovírus 5, uso de adenovírus alternativa serótipos46, ou a utilização de menos imunogênica vetores como vírus adeno-associados podem ser necessários para conseguir a terapia gênica vascular para a clínica. Como uma ferramenta experimental, no entanto, nós somos inconscientes de qualquer vetor que pode competir com auxiliar dependente adenovírus 5 em alcançar a expressão do transgene eficiente e durável em vasos sanguíneos1.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos AdVec, Inc. permissão usar HDAd reagentes, Julia Feyk para assistência administrativa e os serviços veterinários do departamento de medicina comparativa para cirúrgico conselhos e apoio. Este trabalho foi financiado pelo HL114541 e o John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
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