Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Genindsættelse af stof-søgende i mus ved hjælp af konditioneret sted præference paradigme

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Denne protokol beskriver aircondition sted præference (CPP) som en model for tilbagefald. Denne fremgangsmåde tillader måling af tilbagefald hos forsøgsdyr, overvejer virkningerne af drug-associeret miljømæssige stikord som trang og tilbagefald i undlade at narkomaner er aktuelt fokus for stofmisbrug behandlingsprogrammer.

Abstract

Denne protokol beskriver aircondition sted præference (CPP) som en model for tilbagefald i narkotikamisbrug. I denne model, dyr er først uddannet til at erhverve en konditioneret sted præference i en drug-parret rum og efter efter conditioning test, de udfører flere sessioner for at slukke den etablerede præference. CPP tillader evaluering af konditioneret givende virkningerne af narkotika relaterede til miljømæssige stikord. Derefter, den slukkede CPP kan håndfast genindføres ved ikke-kontingent administration af en priming dosis af lægemidlet og eksponering for stressende stimuli. Begge metoder vil blive forklaret her. Når dyret reinitiates den adfærdsmæssige reaktion, betragtes en genindsættelse af konditioneret belønning at have fundet sted.

De vigtigste fordele ved denne protokol er at det er non-invasiv, billig og enkel med god validitets-kriterierne. Desuden, det giver mulighed for undersøgelse af forskellige miljømæssige manipulationer, såsom stress eller kost, som kan modulere tilbagefald i stof søger adfærd. Dog er en begrænsning, at hvis forskeren har til formål at udforske motivation og primære forstærkende virkninger af stoffet, det bør suppleres med selvforvaltning procedurer, som de indebærer operant svar af dyr.

Introduction

Aircondition sted præference (CPP) paradigme tilbyder en enkel måde at vurdere konditioneret belønningen induceret af forskellige stimuli1,2, og har været anvendt bredt til at studere de konditioneret givende effekter af vanedannende narkotika3 . Det er baseret på pavlovsk conditioning, evaluere motiverende værdien af drug-associeret miljømæssige stikord for at opretholde vanedannende opførsel4. I denne model, miljømæssige stikord erhverve sekundære appetitive egenskaber (konditioneret givende effekter) når parret med en primær reinforcer3. For eksempel, en i første omgang neutralt sted (f.eks. farve i et rum i CPP bur) er parret med de specifikke virkninger af et stof misbrug under nogle conditioning sessioner5, mens en anden rum er forbundet med indsprøjtning af et køretøj. Efter konditionering, hvis dyret tilbringer mere tid i rummet tidligere forbundet med stoffet, forudsættes det, at CPP har udviklet3. Oprettelsen af præferencen, der er opnået når dyret giver en positiv værdi for de miljømæssige stikord knyttet til det stof, som er den primære forstærker. Derfor vil dyr udføre adfærdsmæssige stof-søger svar i svar til de kontekstuelle tidskoder6. CPP model tillader evaluering af subthreshold doser af narkotika, viser om dyr i en bestemt tilstand (f.eks., at have lidt fra sociale nederlag tidligere) er mere sårbare og følsomme over for doser, der er givende egenskaber ikke effektiv i naive dyr7.

CPP model er også blevet brugt til at vurdere udryddelse/genindsættelse som en dyremodel til at studere tilbagefald3, hvilket er formålet med denne protokol. Der er tre forskellige faser: erhvervelse, udryddelse og genansættelse (figur 1). I CPP genindsættelse model, dyr først erhverve CPP for en narkotika-parret rum, og derefter de udfører flere extinction sessioner. Vi definerer uddø som det tidspunkt, hvor dyret reducerer sine adfærdsmæssige reaktioner af tilnærmelse til en konditioneret givende stimulus, der har været fjernet (f.eks.stoffet)8. I den udslettelse sessioner udforske dyr rum i mangel af stoffet, så den erhvervede præference er gradvist svækket9. Et vigtigt spørgsmål at overveje er, at den adfærdsændring, som dyret udstiller under udryddelse (den gradvise reduktion i tiden tilbragt i lægemiddel-parret rum) kan være på grund af nye læreprocesser, der konkurrerer med de tidligere lærde svar, eller på grund af et fald i den indre motiverende tilstand af emnet3. Endelig vil være en genskabelse af sted præference gennem kontekst eller narkotika stikord vores model af genindsættelsen1.

Administration af en priming injektion af tilknyttede lægemidlet kan genindsætte den præference, der anses for en genskabelse af en tilnærmelse til de kontekstuelle tidskoder. Drug priming genindsættelse opstår på grund af den vedvarende hukommelse af lystbetonet virkningerne af narkotika, som inducerede trang og motiverer dyrene til at søge de miljømæssige stikord relateret til belønning.

Nogle af fordelene CPP genindsættelse model er, at proceduren er non-invasiv (i modsætning til selvforvaltning, som kræver operation), billig og simpel. Endvidere, denne model har et godt kriterium validitet, da det efterligner godt hvad der sker i mennesker10,11, inducerende genansættelse med stimuli, der inducerer tilbagefald, såsom re-eksponering for stoffet12,13 eller understrege14.

Der er andre teknikker såsom udryddelse – genindsættelse model af intravenøs selvforvaltning. Her, tryk dyr på en løftestang til at administrere stoffet, hvorved man kan vurdere den operant reaktion animalsk, compulsivity og motivation14,15,16. Den største fordel ved CPP over selvforvaltning procedurer er at CPP genindsættelse anses for at afspejle reaktivering af kontekst stimuli parret med stof, bestående af genopblussen af metoden med incitament-motiverende værdi adfærd til kontekst17. Desuden kan ikke-drug stimuli, såsom stress, også fremkalde genindsættelse18,19. For eksempel, beskrevet en selvstændig administration undersøgelse ingen virkninger på genindsættelse af heroin indtag i rotter efter en fod chok eller tilbageholdenhed understrege20. Forfatterne diskuterede, at det var mislykket, fordi stressfaktorer blev testet udenfor selvforvaltning kammer i en anden sammenhæng. Derimod når du bruger CPP model af genindsættelsen, der var en klar genetablering af morfin-induceret CPP efter ved hjælp af de samme stressfaktorer, og anvendes i en anden sammenhæng til CPP og på forskellige tidspunkter (0 og 15 min efter stress eksponering)18 .

Flere undersøgelser i litteraturen har vist forskellige måder af narkotika og stress-induceret genansættelse. På den ene side er narkotika-induceret genansættelse blevet rapporteret hos rotter og mus ved hjælp af morfin5,21,22,23, kokain24,25, amfetamin26, 27, ethanol28,29og 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA)30. På den anden side, kan udsættelse for stress være en afgørende faktor i sårbarhed over for stofmisbrug. Stress er kendt for at øge de givende virkningerne af narkotika7,31,32 og deres rolle i tilbagefald er veletableret33,34. For eksempel, genindfører nederlag i social interaktion med en conspecific morfin og kokain CPP18,19. Derudover dyr udsættes for gentagne sociale nederlag er mere sårbare over for konditioneret givende virkningerne af subthreshold doser af kokain, og genindsætte præference med meget lave doser af kokain7.

Anvendelse af CPP genindsættelse model er en nyttig og følsomme måde at vurdere sårbarheden over for tilbagefald hos dyr, og tillader vurdering af forskellige subtile miljømæssige manipulationer, som er de vigtigste udløser, der truer menneskers tilbagefald, som narkotika - eller stress-induceret genansættelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer mus og deres pleje i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale love og bestemmelser, som er i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU af Europa-Parlamentet og Rådet for September 22, 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Dyr brug og efterbehandling Udvalget af Universitet i Valencia godkendt denne protokol.

1. materialer og Set-up for konditioneret sted præference:

  1. Håndtere mus 3 dage før testning for 1-2 min. Bunden af halen bør udnyttes. Kroppen bør støttes, hvis muligt. Dette er gjort til at minimere smerter og angst, når du håndterer et dyr og forebygge interfererende variabler, såsom stress.
    Bemærk: 1 mandlige mus 60 dage gamle (unge voksne) vejer 35-40 g var ansat i de nuværende eksperimenter. Drug-induceret genansættelse kan udføres i mus af begge køn. Dog om stress-induceret genindsættelse og sociale nederlag paradigme er designet kun for mandlige gnavere, som kvinder gør ikke fremkalde en aggressiv respons i bopæl-mus.
  2. Sted conditioning, bruge identiske kasser lavet med to identiske rum (30,7 cm lang × 31,5 cm bredt × 34,5 cm høj) adskilt af en mindre central grå område (13,8 lang × 31,5 cm bredt × 34,5 høj).
    Bemærk: Rum har forskellige gulvet teksturer og væg farver (et glat gulv i det sorte rum og et ujævnt gulv i den hvide). Hvert rum i boksen CPP indeholder fire infrarød lys bjælker og seks i den centrale rum. Dette giver mulighed for optagelse af grænseovergangene mellem rum og placeringen af dyret.
  3. Sat op værelse lys (off eller sænket) hver dag. Brug røde lys (anbefales), som dyrene ikke opfatter det og det er svækket til eksperimentatoren (ca 40 lux målt på 1 m over gulvniveau).
  4. Indstille programmet til at registrere 15 min til før og efter conditioning test (Se Tabel af materialer til software) (figur 2)
  5. Forberede den kokain løsning kræves for hele eksperimentet. Opløse kokain hydrochlorid i 0,9% NaCl (saltvand) i en mængde på 0,1 mL/10 g kropsvægt. Vortex blanding og opbevares ved 4 ° C ved slutningen af dagen.
    Bemærk: Kokain koncentrationer kan variere afhængigt af undersøgelsens formål. Hvis formålet er at vurdere de subthreshold doser af kokain, kunne en 1 mg/kg koncentration være brugt, som er ineffektive i kontroldyr, som set i tidligere undersøgelser24,35. Hvis en effektiv dosis er formålet, kan 6 mg/kg koncentration være valgt, som er effektive, men ikke fremkalde genindsættelse24eller en 25 mg/kg koncentration, som er effektiv og inducerer genindsættelse af præference19.
  6. Forsøgsdyr under deres mørke fase og bruge den samme boks til hvert dyr i dage.
  7. Bringe dyr hver dag til test værelse i deres hjem bure og lade dem uforstyrret i 15 min. som en tilvænning periode for alle test-relaterede lyde.

2. test

  1. Erhvervelse
    Bemærk: Proceduren for sted Conditioning, fordomsfri med hensyn til første spontane præference, består af tre faser: før Conditioning, aircondition og efter Conditioning (figur 1).
    1. Før Conditioning (Pre-C) (3 dage) (figur 2, figur 3, figur 4)
      Bemærk: Her, neutral værdien af rum i boksen CPP er evalueret. Måle tiden i hvert rum og senere sammenligne det med at brugt i det samme rum i post Conditioning test.
      1. Bringe dyr til prøvelokalet og lade dem vænnes til 15 min.
      2. Kontroller, at slagsakse fjernes fra buret.
      3. Konfigurer computeren og programmet. Angiv dyr id'er og tryk på kommandoen "Retssag" og "Start" (figur 2).
      4. Placer musen forsigtigt ind i det midterste kammer (grå rum) og forlade den test værelse med mindst støj.
      5. Bringe alle dyr tilbage i deres hjem bure og gemme dataene, når retssagen er afsluttet.
      6. Tillad mus adgang til begge rum af apparater til 15 min (900 s) per dag på 3 på hinanden følgende dage.
      7. På dag 3, nedskrive tiden i hvert rum i en 900 s periode og gemme den til tildeling af rum i den næste fase (figur 3).
      8. Tildele halv dyr i hver gruppe modtage stof eller køretøjet i et rum (fx, sort), og anden halvdelen i de andre rum (f.eks.hvidt) (figur 4).
        NOTE: Den endelige fordeling af dyr, der skal sikre, at halvdelen af dyrene er knyttet til den i første omgang foretrukne rum og anden halvdelen til den ikke-foretrukne rum. Derudover fik halvdelen af dyrene stoffet i et rum (eksempelvis den sorte sig) og anden halvdelen i den anden (i dette tilfælde, at hvid ene).
      9. Balance scores i gruppen inden for begge rum samt på tværs af grupper (test gruppe forskelle med en variansanalyse (ANOVA)). Som omtrentlige vejledning, værdier bør være omkring 360-370 s i Pre-C test (figur 4). Bemærk: ingen væsentlige forskelle bør registreres mellem den tid tilbragt i lægemiddel-parret og køretøj-parret rum under Pre-C test.
      10. Udelukke dyr, der udviser en stærk modvilje eller præference til ethvert rum. Overveje aversion som bruger mindre tid end 33% i rummet, og overveje præference, når dyret har brugt mere end 67% af den samlede tid i dette rum.
    2. Conditioning (4 dage) (figur 5)
      1. Vejes dyrene og bruge disse vægte for kokain doser under konditioneringen.
      2. Forberede sprøjter med kokain eller saltvand baseret på kroppen vægte.
      3. Indsprøjtes en mus på et tidspunkt intraperitoneal (ip) og straks placerer det forsigtigt i den tildelte sorte eller hvide rum i deres boks.
      4. Efter et interval på 4 h, injicere stof dosis umiddelbart før musen er begrænset til den stof-parret rum til 30 min (figur 5).
      5. Suppleant denne procedure hver dag, begynder med kokain på dage 1 og 3, og saltvand på dage 2 og 4.
      6. Kontroller, at indespærring foretages i begge tilfælde ved at lukke guillotine døren, der adskiller de to rum gør den centrale område utilgængelige.
        Bemærk: I denne fase er der ingen grund til at konfigurere PC-program.
    3. Efter konditionering (Post-C) (1 dag)
      1. Bringe dyr til prøvelokalet og lade dem vænnes til 15 min.
      2. Fjerne guillotine døren adskiller de to rum.
      3. Konfigurer computeren og programmet. Angiv dyr id'er og tryk på kommandoen "start".
      4. Registrere tid brugt af ubehandlede mus i hvert rum i løbet af en 900 s observationsperiode.
      5. Når retssagen er afsluttet, bringe alle dyr tilbage i deres hjem bure og gemme data.
      6. Overveje at stoffet har induceret sted præference, hvis tiden tilbragt i lægemiddel-parret rum under Post-C er betydeligt større end i Pre-C test. Hvis modsat sker, overveje en aversion for narkotika-parret rum.
  2. Udryddelse
    1. Foretage en ugentlig extinction session i alle grupper/dyr, der er udviklet en præference for narkotika-parret rum.
    2. Placere dyret i apparater (uden slagsakse) i 15 min, (samme som de præ- og Post-C test) (figur 1).
      Bemærk: Hvis dosis ansat i CPP er høj (25 mg/kg), udføre 1 udryddelse session per uge. Hvis en subthreshold dosis er brugt (1 mg/kg), derefter udføre 2 extinction sessioner per uge (f.eks. mandag og torsdag).
    3. Overveje præference slukkes når data fra udryddelse test ikke udviser forskelle med hensyn til Pre-C test, men de viser forskelle med hensyn til Post-C test.
    4. Gentag testen 24 timer senere for at bekræfte udslettelsen.
  3. Genindsættelse af CPP
    1. Priming-induceret genindsættelse
      1. Evaluere virkningerne af en priming dosis kokain 24 h efter udryddelse er blevet bekræftet.
        Bemærk: Priming doser er halv tidligere dosis, som dyret har fået under konditioneringen. Genansættelse test gennemgår den samme protokol som i Pre-C og Post-C test, bortset fra at dyr modtage dosis kokain i en ikke-kontingent sted 15 min før prøven. Effekten af narkotika priming i inducerende genansættelse kan forbedres efter gentagne udryddelse/genansættelse oplevelser23, selv om rækkefølgen af doserne ikke synes at spille en rolle i resultaterne opnået36.
      2. Bringe dyr til et andet rum fra den test værelse (ikke-kontingent sted) (figur 6).
      3. Indsprøjte dem med halvdelen af den tidligere dosis kokain (f.eks.hvis dyr var aircondition med 25 mg/kg kokain, en priming dosis ville være 12,5 mg/kg).
      4. Bringe dem tilbage til deres vivarium i 15 min.
      5. Tages testing rummet og dyr i apparatet straks (uden guillotine døre adskiller rum) for 15 min (samme som den pre og Post-C test).
      6. Overvej forskellen i sekunder mellem tidsforbrug i stof-parret rum under den sidste Extinction session og genindsættelse test som et mål for graden af genindførelse af præference induceret af stoffet.
      7. Gentag extinction-genindsættelse procedure hver gang med faldende doser indtil det er bekræftet for at være ineffektiv.
        Bemærk: En saltvand injektion kontrol kan bruges til at styre kapaciteten af kokain priming (og ikke af injektion, selv) til at fremkalde genansættelse.
    2. Stress-induceret genindsættelse
      1. Evaluere virkningerne af stress-induceret genindførelse 24 h efter udryddelse er blevet bekræftet
        Bemærk: Genindsættelse test er de samme som dem, der foretages i Post-C (gratis ambulation i 15 min.), bortset fra at dyr er testet 15 min efter den sociale nederlag i en agonistisk støder (figur 6)
      2. Tage dyr til et andet rum fra CPP værelse.
      3. Sted den eksperimentelle mus med en aggressiv modstander sex matches af samme alder og kropsvægt i den plast bur (figur 6).
        Bemærk: Den agonistiske møde består af en 10 min test i en neutral gennemsigtig plast bur (23x13.5x13cm) med et nederlag resultat for den eksperimentelle mus. For at forberede den aggressiv modstander, først isolere forskellige dyr, der matcher i alder og kropsvægt som de eksperimentelle mus i 3 uger. Træne dem til at erhverve en kæmpe erfaring og teste dem for at have høje niveauer af aggressiv territoriale adfærd. For at få aggressive artsfæller, mus skal være isoleret i mindst 3 uger og derefter uddannet i aggressivt og angribe adfærd. Dyr er uddannet i et neutralt miljø, vender dem parvis. Vi lader dem bide modstander 2 eller 3 gange og få dem ud af buret, altid slutter uddannelse før en af de to mus viser indsendelse, således at oplevelsen af mødet styrker aggressiv adfærd. Efter at have lidt aggression (trussel og angreb fra aggressive conspecific), bør eksperimentelle mus fremlægge undgåelse/flygte og defensiv/underdanig adfærd. Kriteriet er at vedtage en specifik kropsholdning af nederlag, karakteriseret ved en underdanig køl, limp forepaws, opadgående retning vinklet hoved, og tilbagetrukket ører (figur 6). Ifølge Burke et al., 2016, mener vi, at det sociale møde afsluttes tidligere, hvis tyven viser en underdanig rygliggende stilling for > 8 s eller hvis 13 angreb bider opstod. En anden mulighed at skærmen dyr uden risiko for betydelig skade kunne være at tempoet dyret i en mesh kabinet med et hul, ikke stor nok til enten dyr at passere.  Aggression kunne påvises uden at udsætte dyr for direkte aggressiv adfærd.  Hvis et dyr, der opretholder en skade med en såret 1cm i diameter og/eller direkte eksponering af muskel, det er udelukket fra undersøgelsen og bør aflives.
      4. Efter 10 min af agonistisk støder, tages testing rummet mus og placere dyr i CPP-apparat straks (uden guillotine døre adskiller rum) i 15 min. (samme som den pre og Post-C test).

3. den statistiske analyse

Bemærk: Ideel prøvestørrelse skal være mindst 15 dyr pr. gruppe.

  1. Analysere den mellemliggende tid tilbragt i lægemiddel-parret rum af gruppen ved hjælp af en blandet ANAVA med en mellem variabel, behandling, med to niveauer (kontrolgruppe, eksperimentelle gruppe, eksempel på to grupper er i figur 7 c), og en inden for variabel-dage, med 2 niveauer (præ- og Post-C).
    Bemærk: I kontrolgruppen, dyr får stoffet men har ingen miljømæssige manipulationer. På den anden side i den eksperimentelle gruppe udsættes dyr for forskellige miljøforhold. Sammenlign tidsforbrug i stof-parret rum på dagens Post-C med respekt Pre-C test for at se, om der er væsentlige forskelle i følsomhed over for lægemidlet.
  2. Derudover udføre Bonferroni post-hoc analyser for at kontrollere enten af de betydelige scores.
  3. Analysere data vedrørende udryddelse og genindsættelse værdier i grupperne at udviklede præference ved hjælp af Student´s t-test til at fortsætte proceduren extinction-genindsættelse i løbet af eksperimentet, men i sidste øjeblik, analysere dem med en ANOVA med en inden for variabel (dage) med antallet af niveauer afhængigt af hver gruppe.
    Bemærk: Når antallet af sammenligninger er steget, antallet af dem, der vil være betydelige tilfældigvis også steget. Som sådan, for at undgå at få falske-positiver (Type 1 fejl) rette vi' ' p-værdi hvorved testen mere konservative med Bonferroni korrektion for flere t-test. For genansættelse test, skal sammenligningen foretages mellem genindsættelse test og den sidste extinction test. Derfor er der ikke behov for korrektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For det første, repræsentative resultater fra en priming - og stress-induceret genindførelse er vist i figur 7 ved hjælp af adult OF1 mandlige mus.

Dataene i figur 7a-b repræsenterer tid tilbragt i stof-parret segmenter i den pre- og Post-C test blev analyseret med gentagne foranstaltninger ANAVA med en inden for fag variable dage (sammenligning præ- og Post-C). Resultaterne viste en signifikant effekt af de variable dage [F(1,34) = 51.179; p < 0,001], som alle dyr udviklet en præference i den Post-C dag i forhold til Pre-C. Alle dyr, der var aircondition med 25 mg/kg kokain og når extinction blev opnået, den ene gruppe modtog en priming dosis af 12,5 mg/kg kokain at teste genansættelse (figur 7a) og den anden blev udsat for en social interaktion, hvor den eksperimentelle dyret blev besejret af en aggressiv modstander (figur 7b). 15 min efter de to begivenheder, dyr blev testet i deres tilsvarende CPP boks.

Priming-induceret genansættelse (figur 7a) blev udsat til efterfølgende faldende priming doser (halv den tidligere ene) indtil en priming dosis er bekræftet for at være ineffektiv. Doserne var: 12,5, 6,25, 3.125 og 1,56 mg/kg kokain. Student´s t-test afslørede en betydelig effekt på 12,5 mg/kg kokain genansættelse med hensyn til udryddelse session (t statistik (t) = 20.589, frihedsgrader (DF) = 17; p < 0,001) og efterfølgende doser (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3,125 mg/kg: t = 14.260; 1,56 mg/kg: t = 16.934 d.f. = 17; p < 0,001). Priming med 0,78 mg/kg ikke fremkalde genetableringen.

Med hensyn til stress-induceret genansættelse (Se figur 7b), at blive udsat for en aggressiv dyr og besejrede 15 min før testen fører til at genindsætte den tidligere slukkede præference (t = 26.810; d.f. = 15; p < 0,001)19 .

Andre miljømæssige manipulationer, som lider under gentagne sociale nederlag før proceduren CPP ændre givende virkningerne af subthreshold doser af kokain (figur 7 c). A blandet ANAVA med den mellem variablen "stress" og inden for variabel "dage" blev udført, og der var en signifikant effekt af interaktion Stress x dage [F(1,29) = 4.144; p < 0,05]. Eneste socialt besejret dyr udstillet præference for narkotika-parret rum med en subthreshold dosis af kokain, som har vist sig at være ineffektive i standard dyr7. Derudover efter udryddelse af præferencen, socialt besejret dyr genindsat deres præference med kun 0,5 mg/kg kokain priming (t = 25.484 d.f. = 17; p < 0,001).

For det andet et negativt resultat, kan vi se hvordan genansættelse kan forebygges ved en positiv social interaktion med en ikke-aggressiv conspecific (figur 8a). Det er derfor vigtigt at vurdere, om dyrene er besejret eller ikke efter en social støder37.

Et andet eksempel på negative resultater, der forhindrer genansættelse kan være ernæringsmæssige manipulationer, såsom et højt fedtindhold velsmagende kost indtagelse. Først, ANOVA analyse viste en effekt af de variable dage [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], som begge grupper udviklet præference for narkotika-parret rum (p < 0,01) (fig. 8b). Efter udryddelse viser vores resultater, at dyrene skiftede til højt fedtindhold kost efter Post-C test faldt deres følsomhed over for narkotika-priming induceret genansættelse, som de ikke genindsætte præference med en 6,25 mg/kg kokain dosis38.

Figure 1
Figur 1: forsøgsmetoden aircondition sted præference. Det består af tre faser: før Conditioning, aircondition og efter Conditioning. Der er 4 conditioning dage, hvor proceduren er vekslede hver dag, begynder med kokain på dag 1 og 3 og med køretøjet på dage 2 og 4. Derefter, udryddelse og genindsættelse sessioner udføres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Software skik sessioner for præ- og Post-C test hvor tid brugt i hvert rum og antallet af poster registreres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Data efter præ- og Post-C test Her, registrere oplysninger indhentet under prøven. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: upartiske tildeling af dyr til rum for den næste fase af conditioning. Tage data fra den sidste Pre-C test dag i de hvide og sorte rum. Halv dyr tildeles modtage stoffet eller køretøjet i et rum (sort eller hvid), og anden halvdelen i andre rum. Udelukke dyr, der udviser stærk modvilje eller præference. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: afsluttende opgave af køretøjet og kokain parret sessioner. Denne figur viser skiftevis på rækkefølgen af bindinger. På dag 1 og 3, et dyr (f.eks.1.1) er først udsat for kokain-parret rum (den hvide,), og efter fire timer, er udsat for det køretøj-parret rum (den sorte,). På dage 2 og 4, rækkefølgen af bindinger er omvendt, og dyret er først udsat til køretøj-parret (sort) rum og efter fire timer, til den kokain-parret (hvid) rum. Da denne procedure er neutral og modvægt, samtidige conditioning sessioner kan udføres med to dyr ved hjælp af begge rum af samme boks (f.eks.dyr 1.1 og 2.4, 3.1 og 1,3), som tillader os at reducere tid afsat til den Eksperimentel procedure. Bemærk, at disse par af dyr følger den tilbageførte rækkefølgen af bindinger gennem conditioning fase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: to modeller af genindsættelse. (en) Priming-induceret genindsættelse og (b) stress-induceret genansættelse. (en) dyr modtager en drug injektion i en ikke-kontingent værelse og bringes til vivarium; 15 min senere de er testet i boksen CPP. (b) dyr er besejret i en agonistisk støder på en ikke-kontingent med plads til 10 min, og bagefter, de er testet i boksen CPP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: repræsentative positive resultater. Priming (en) og stress-induceret (b) genansættelse efter 25 mg/kg kokain CPP. (c) virkningerne af sociale nederlag på de givende effekter af subthreshold doser af kokain (1 mg/kg). Søjler repræsenterer den gennemsnitlige (± SEM) tid i sekunder tilbragt i lægemiddel-parret rum under pre conditioning (hvid), efter conditioning (sort), den sidste extinction session (lys grå) og genansættelse (mørk grå). Genansættelse test blev evalueret 15 min efter en priming dosis af halvdelen af den tidligere dosis modtaget. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001 signifikant forskel vs Pre-C (ANOVA med en i-fag variable dage (sammenligning præ- og Post-C) eller den foregående extinction session (Student's t-test). Disse tal er blevet ændret fra 7,19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: repræsentative negative resultater. Virkningerne af beskyttende miljømæssige manipulationer på de givende virkninger af kokain. (en) virkningerne af en positiv social interaktion før genindsættelsen test. (b) effekter af et højt fedtindhold kost i løbet af hele extinction periode og genindsættelse. Kontrolgruppen blev fodret med en standard kost (13% af kcal fra fedt, 67% kcal fra kulhydrater og 20% kcal fra protein; 2,9 samlede kcal/g) og højt fedtindhold kost-gruppen (45% kcal fra fedt, 36% kcal fra kulhydrater og 19% kcal fra protein, 4.6 samlet kcal/g). Søjler repræsenterer den gennemsnitlige (± SEM) tid i sekunder tilbragt i lægemiddel-parret rum under pre conditioning (hvid), efter conditioning (sort), den sidste extinction session (lys grå) og genansættelse (mørk grå). Genansættelse test blev evalueret 15 min efter en priming dosis af halv tidligere modtagne dosis. * p < 0,05; ** p < 0,01; signifikant forskel vs Pre-C (ANOVA med en i-fag variable dage (sammenligning præ- og Post-C) eller den foregående extinction session (Student's t-test). Disse tal er blevet ændret fra 37,38. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det centrale punkt i narkotika afhængighed forskning er udvikling af behandlinger, der mindsker trangen og dermed reducere sårbarheden over for tilbagefald. Takket være den genindførelse model af CPP paradigme er det muligt at undersøge indflydelsen af forskellige proceduremæssige og miljømæssige faktorer, at modulerer tilbagefald, som er et prioriteret mål for fremtidig forskning. Der er nogle vigtige punkter at overveje, som CPP paradigme er en test, der er yderst følsomme over for miljøfaktorer.

Ændringer og fejlfinding: CPP version af genindsættelse model bør ændres afhængigt af stof af interesse. Der er forskellige faktorer, der kan påvirke størrelsen af konditioneret præference, som varighed og antallet af sessioner, aircondition. Antallet af foreninger varierer normalt fra en til seks, med fire er den mest almindelige. Varigheden af conditioning testene er etableret efter forholdene i stoffet og dets farmakokinetik.

CPP undersøgelser indebære normalt mange forsøg, så det er nyttigt at bruge protokoller, der reducerer den tid, der kræves. En måde at opnå dette er at reducere antallet af forsøg og en anden måde er at udføre to sessioner af conditioning pr. dag, som er vist i denne protokol. I dette tilfælde er det nødvendigt at sikre, at virkningerne af narkotika fra den foregående mødeperiode ikke trækker denne anden session39, hvilket er grunden til intervallet af fire timer mellem kokain - køretøj session blev valgt. For eksempel, bør timingen af parring for kokain i forbindelse med condition hver 24 h i 4 dage med en parring varighed 30 min. Tværtimod tidsforløb forretningsorden conditioning ethanol bør hver 48 h, ialt 8 dage, 1 conditioning session per dag, og skiftevis køretøj og EtOH, endelig har ialt 4 EtOH bindinger. Ethanol parring bør have en kort varighed, såsom 5 min, som mere tid kunne producere afskrækningsmiddel stater. Effektive doser spænder fra 1-2 g/kg og subthreshold doser er 0,75 g/kg40. Priming-induceret genindsættelse bør være halvdelen af den tidligere dosis modtaget, og apparatet bør være den samme.

Dog kan vælger at gøre 1 eller 2 sessioner døgnet påvirke resultaterne i nogle særlige medicin misbrug. For eksempel for MDMA-induceret CPL med to-session protokol, er konditioneret præference i post conditioning ikke observeret, der henviser til, at dette kan opnås ved at udføre en enkelt forening hver dag30, så MDMA bør også gives hver 48 h, men varigheden af conditioning session skal være 30 min.

Der er to hovedmetoder for udryddelse, der kunne køres efter oprettelsen af CPP, enten daglige injektioner af køretøjet begrænser dyret i både tidligere stof- og køretøj aircondition rum41,42, 43, eller ved at gentage CPP test, at lade dyr udforske de tre rum uden guillotinen indtil præference er ikke længere observeret7,18,30,38. I denne protokol, vi ansat sidstnævnte, fordi det er en type af spontan udryddelse uden farmakologisk eller adfærdsmæssige manipulation forbindelse med condition (mere svarende til den forekommer i menneskelige misbrugere), men begge metoder er acceptabelt og gyldig, som litteratur har vist i år.

Begrænsninger af teknikken: Den vigtigste begrænsning af CPP paradigme og genindsættelse model er, at de er meget følsomme over for eventuelle ændringer i miljøet. Derfor bør rum og vivarium betingelser forblive stabil og konstant under hele proceduren. Særlig omsorg bør tages til aspekter som bor i samme rum med kammerater af det modsatte køn, bure med artefakter som hjul, der gør en specifik og konstant støj, eller light betingelser. Ud over at kontrollere disse variabler, er forskerens rolle også kritisk, som de kan fremkalde en stigning i dyrenes stress niveauer og blande sig med resultaterne.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder: Med hensyn til andre metoder, i CPP version af modellens genindsættelse er forskeren den, der administrerer lægemidlet til dyr, i modsætning til selvforvaltning paradigmer, der evaluerer animal´s motivation til at tage stoffet. Det er vigtigt, at vi tager dette i betragtning. Det betyder, at vi ikke evaluerer motivation gennem en operant svar eller de primære forstærkende virkninger af laegemidlet. Som vi nævnte, er CPP en nyttig model til vurdering af miljømæssige stikord kritiske rolle på tilbagefald i stofmisbrug lidelser, som i virkeligheden er de vigtigste faktorer, som modulerer tilbagefald hos mennesker.

Fremtidige programmer: Fremtidige anvendelser af CPP genindsættelse model bør være orienteret mod den såkaldte inkubation af begær, som består af en gradvis stigning i cue reaktivitet efter afholdenhed af narkotika, efterligne trang hos mennesker. I dag, er lidt kendt om dette i CPP paradigme. Et par år siden, antydede kun en undersøgelse, at CPP også kunne måle denne inkubation periode44. For nylig, blev det vurderet, hvorvidt miljømæssige stikord parret med morfin i CPP kunne øge den adfærdsmæssige reaktion over tilbagetrækning periode45. Denne undersøgelse viste, at antallet af poster til CPP rum stigende over tid, afspejler inkubation af trang og foreslå at belønne erindringer og narkotika trang kunne skelnes i CPP paradigme.

Kritiske trin: der er flere kritiske trin i protokollen. For at bekræfte, at dyr genindsat deres præference, bør extinction data afspejle en reel udryddelse af præference, bekræftes før genindsættelse test. Data fra udryddelse test bør ikke vise forskelle med hensyn til Pre-C test men med hensyn til Post-C test.

Med hensyn til den sociale stress-induceret genindsættelse version, bør vi har bekræftet, at dyret har været faktisk besejret, da en positiv social møde, der ikke ender i nederlag viser beskyttende virkninger blokering genindsættelse af sted præference for kokain. Hvis de eksperimentelle dyr ikke er besejret, vil de blive udelukket fra undersøgelsen. Vi anbefaler optagelse og evaluere den agonistiske møde, måle latenstiden for den aggressive adfærd eller indsendelse adfærd, antallet af angreb og tiden i hver af disse adfærd. Vi mener, at den eksperimentelle dyr er besejret, når den modtager et minimum af 2 angreb (bites) og viser tegn på indsendelse (som illustreret i figur 6). I alle tilfælde varer mødet 10 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministeriet for sundhed, sociale ydelser og ligestilling. Delegationen af regeringen for den nationale Plan om narkotika, forskningsprojekter vedrørende narkotika afhængigheder, 2014I007; Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne (MINECO), sundhed Institut Carlos III, netværk af vanedannende lidelser (RTA) RD12 / 0028/0005 og RD16 / 0017/0007 og EU, FEDER midler "una manera de hacer Europa", og PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bardo, M., Bevins, R. Conditioned place preference: what does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153, 31 (2000).
  2. Tzschentke, T. M. Review on CPP: Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addiction biology. 12 (3-4), 227-462 (2007).
  3. Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Neurobiological mechanisms of the reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain research reviews. 59 (2), 253-277 (2009).
  4. García-Pardo, M. P., Roger-Sánchez, C., De la Rubia Ortí, J. E., Aguilar, M. A. Animal models of drug addiction. Adicciones. 12 (0), 823 (2017).
  5. Manzanedo, C., Aguilar, M. A., Rodrı́guez-Arias, M., Miñarro, J. Effects of dopamine antagonists with different receptor blockade profiles on morphine-induced place preference in male mice. Behavioural brain research. 121 (1), 189-197 (2001).
  6. Robbins, T. W. The acquisition of responding with conditioned reinforcement: effects of pipradrol, methylphenidate, d-amphetamine, and nomifensine. Psychopharmacology. 58 (1), 79-87 (1978).
  7. Montagud-Romero, S., Nuñez, C., Blanco-Gandia, M. C., Martínez-Laorden, E., Aguilar, M. A., Navarro-Zaragoza, J., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: dopamine transcription factors, proBDNF signaling pathways, and the TrkB receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. , (2017).
  8. Pavlov, I. P. Conditioned Reflexes. , Oxford University Press. Oxford. (1927).
  9. Yahyavi-Firouz-Abadi, N., See, R. E. Anti-relapse medications: preclinical models for drug addiction treatment. Pharmacology & therapeutics. 124 (2), 235-247 (2009).
  10. Epstein, D. H., Preston, K. L., Stewart, J., Shaham, Y. Toward a model of drug relapse: an assessment of the validity of the reinstatement procedure. Psychopharmacology. 189 (1), 1-16 (2006).
  11. Geyer, M. A., Markou, A. Animal models of psychiatric disorders. Psychopharmacology: the Fourth Generation of Progress. Bloom, F. E., Kupfer, D. J. , Raven. New York. 787-798 (1995).
  12. De Wit, H. Priming effects with drugs and other reinforcers. Experimental and Clinical Psychopharmacology. 4 (1), 5 (1996).
  13. Wang, B., Luo, F., Zhang, W. T., Han, J. S. Stress or drug priming induces reinstatement of extinguished conditioned place preference. Neuroreport. 11 (12), 2781-2784 (2000).
  14. Shalev, U., Erb, S., Shaham, Y. Role of CRF and other neuropeptides in stress-induced reinstatement of drug seeking. Brain research. 1314, 15-28 (2010).
  15. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology. 229 (3), 453 (2013).
  16. Weiss, F. Neurobiology of craving, conditioned reward and relapse. Current opinion in pharmacology. 5 (1), 9-19 (2005).
  17. Mueller, D., Stewart, J. Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction. Behavioural brain research. 115 (1), 39-47 (2000).
  18. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Armario, A., Miñarro, J. Social stress is as effective as physical stress in reinstating morphine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 185 (4), 459-470 (2006).
  19. Titomanlio, F., Manzanedo, C., Rodríguez-Arias, M., Mattioli, L., Perfumi, M., Miñarro, J., Aguilar, M. A. Rhodiola rosea impairs acquisition and expression of conditioned place preference induced by cocaine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , (2013).
  20. Shalev, U., Highfield, D., Yap, J., Shaham, Y. Stress and relapse to drug seeking in rats: studies on the generality of the effect. Psychopharmacology. 150 (3), 337-346 (2000).
  21. Lu, L., Ceng, X., Huang, M. Corticotropin-releasing factor receptor type 1 mediates stress-induced relapse to opiate dependence in rats. Neuroreport. 11 (11), 2373-2378 (2000).
  22. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Manzanedo, C., Rodriguez-Arias, M., Miñarro, J. Reinstatement of morphine-induced conditioned place preference in mice by priming injections. Neural Plast. 10, 279-290 (2003).
  23. Do Couto, B. R., Aguilar, M. A., Rodriguez-Arias, M., Miñarro, J. Long-lasting rewarding effects of morphine induced by drug primings. Brain research. 1050 (1), 53-63 (2005).
  24. Maldonado, C., Rodriguez-Arias, M., Castillo, A., Aguilar, M. A., Miñarro, J. Gamma-hydroxybutyric acid affects the acquisition and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference in mice. Behav. Pharmacol. 17, 119-131 (2006).
  25. Maldonado, C., Rodriguez-Arias, M., Castillo, A., Aguilar, M. A., Miñarro, J. Effect of memantine and CNQX in the acquisition, expression and reinstatement of cocaine-induced conditioned place preference. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 31, 932-939 (2007).
  26. Cruz, F. C., Marin, M. T., Planeta, C. S. The reinstatement of amphetamine-induced place preference is long-lasting and related to decreased expression of AMPA receptors in the nucleus accumbens. Neuroscience. 151, 313-319 (2008).
  27. Li, S. M., Ren, Y. H., Zheng, J. W. Effect of 7-nitroindazole on drug-priming reinstatement of D-methamphetamine-induced conditioned place preference. Eur. J. Pharmacol. 443, 205-206 (2002).
  28. Font, L., Miquel, M., Aragon, C. M. Involvement of brain catalase activity in the acquisition of ethanol-induced conditioned place preference. Physiol. Behav. 93, 733-741 (2008).
  29. Roger-Sánchez, C., Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Aragon, C. M., Miñarro, J. Age-and sex-related differences in the acquisition and reinstatement of ethanol CPP in mice. Neurotoxicology and teratology. 34 (1), 108-115 (2012).
  30. Daza-Losada, M., Do Couto, B. R., Manzanedo, C., Aguilar, M. A., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Rewarding effects and reinstatement of MDMA-induced CPP in adolescent mice. Neuropsychopharmacology. 32 (8), 1750-1759 (2007).
  31. Will, M. J., Watkins, L. R., Maier, S. F. Uncontrollable stress potentiates morphine's rewarding properties. Pharmacol. Biochem. Behav. 60, 655-664 (1998).
  32. Der-Avakian, A., Will, M. J., Bland, S. T., Deak, T., Nguyen, D. T., Schmid, M. J., Spencer, R. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Surgical and pharmacological suppression of glucocorticoids prevents the enhancement of morphine conditioned place preference by uncontrollable stress in rats. Psychopharmacology. 179, 409-417 (2005).
  33. Sinha, R. How does stress increase risk of drug abuse and relapse? Psychopharmacology. 158, 343-359 (2001).
  34. Lu, L., Shepard, J. D., Hall, F. S., Shaham, Y. Effect of environmental stressors on opiate and psychostimulant reinforcement, reinstatement and discrimination in rats: a review. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 457-491 (2003).
  35. Vidal-Infer, A., Arenas, M. C., Daza-Losada, M., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. High novelty-seeking predicts greater sensitivity to the conditioned rewarding effects of cocaine. Pharmacol Biochem Behav. 102, 124-132 (2012).
  36. Reguilón, M. D., Montagud-Romero, S., Ferrer-Perez, C., Roger-Sánchez, C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Dopamine D2 receptors mediate the increase in reinstatement of the conditioned rewarding effects of cocaine induced by acute social defeat. European Journal of Pharmacology. 799, 48-57 (2017).
  37. Ribeiro Do Couto, B., Aguilar, M. A., Lluch, J., Rodríguez-Arias, M., Miñarro, J. Social experiences affect reinstatement of cocaine-induced place preference in mice. Psychopharmacology. 207 (3), 485-498 (2009).
  38. Blanco-Gandía, M. C., Aracil-Fernández, A., Montagud-Romero, S., Aguilar, M. A., Manzanares, J., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Changes in gene expression and sensitivity of cocaine reward produced by a continuous fat diet. Psychopharmacology. 234 (15), 2337-2352 (2017).
  39. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference paradigm: a comprehensive review of drug effects, recent progress and new issues. Progress in neurobiology. 56 (6), 613-672 (1998).
  40. Blanco-Gandía, M. C., Ledesma, J. C., Aracil-Fernández, A., Navarrete, F., Montagud-Romero, S., Aguilar, M. A., Manzanares, J., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. The rewarding effects of ethanol are modulated by binge eating of a high-fat diet during adolescence. Neuropharmacology. 121, 219-230 (2017).
  41. Itzhak, Y., Martin, J. L. Cocaine-induced conditioned place preference in mice: induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants. Neuropsychopharmacology. 26 (1), 130-134 (2002).
  42. Kreibich, A. S., Blendy, J. A. cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement. Journal of Neuroscience. 24 (30), 6686-6692 (2004).
  43. Zavala, A. R., Weber, S. M., Rice, H. J., Alleweireldt, A. T., Neisewander, J. L. Role of the prelimbic subregion of the medial prefrontal cortex in acquisition, extinction, and reinstatement of cocaine-conditioned place preference. Brain research. 990 (1), 157-164 (2003).
  44. Orsini, C., Bonito-Oliva, A., Conversi, D., Cabib, S. Genetic liability increases propensity to prime-induced reinstatement of conditioned place preference in mice exposed to low cocaine. Psychopharmacology. 198 (2), 287-296 (2008).
  45. Sun, Y., Pan, Z., Ma, Y. Increased entrances to side compartments indicate incubation of craving in morphine-induced rat and tree shrew CPP models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 159, 62-68 (2017).

Tags

Adfærd sag 136 konditioneret sted præference kokain genindsættelse stress mus stof-søgende
Genindsættelse af stof-søgende i mus ved hjælp af konditioneret sted præference paradigme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar,… More

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e56983, doi:10.3791/56983 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter