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Behavior

Wiedereinführung der Drug-seeking bei Mäusen mit dem klimatisierten Ort Präferenz Paradigma

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Dieses Protokoll beschreibt bedingt Platz Präferenz (CPP) als Modell für einen Rückfall. Dieses Verfahren ermöglicht die Messung von Rückfällen bei Versuchstieren, unter Berücksichtigung der Auswirkungen der Droge verbundenen ökologischen Cues als Begierde und Rückfall in Verzicht Süchtige steht derzeit im Mittelpunkt der Drogenmissbrauch Behandlungsprogramme.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt bedingt Platz Präferenz (CPP) als Modell für einen Rückfall in die Drogensucht. In diesem Modell Tiere sind zunächst darauf trainiert, klimatisierten Ort bevorzugt in einem Medikament gepaart Fach erwerben und nach dem Post-Klimaanlage-Test führen sie mehrere Sitzungen, um die etablierten Präferenz zu löschen. Die CPP erlaubt die Auswertung der konditionierten lohnende Effekte von Drogen im Zusammenhang mit ökologischen Cues. Dann kann erloschene CPP robust durch die nicht-Kontingent-Verwaltung einer Grundierung Dosis des Medikaments, und durch die Einwirkung von belastenden Reize wieder eingesetzt werden. Beide Methoden werden hier erklärt. Wenn das Tier die Verhaltensreaktion reinitiates, gilt eine Wiedereinsetzung der konditionierten Belohnung stattgefunden haben.

Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind, dass es nicht-invasive, kostengünstig und einfach mit guten Validitätskriterien ist. Darüber hinaus ermöglicht es das Studium der verschiedenen ökologischen Manipulationen, wie Stress oder Ernährung, die Rückfall in Drogen sucht Verhalten modulieren kann. Eine Einschränkung ist jedoch, dass wenn der Forscher die Motivation und primäre verstärkende Wirkung des Medikaments zu erkunden soll, mit Selbstverwaltung Verfahren ergänzt werden sollte, da sie operante Reaktionen der Tiere beteiligen.

Introduction

Das Paradigma konditioniert Ort Präferenz (CPP) bietet eine einfache Möglichkeit zur Beurteilung des konditionierten Lohn induziert durch vielfältige Reize1,2, und wurde weitgehend verwendet, um die konditionierten lohnende Suchtgifte3 untersuchen . Es basiert auf Pawlowsche Konditionierung, Auswertung der motivationalen Wertes von Medikament verbundenen ökologischen Cues für die Aufrechterhaltung der Suchtverhalten4. In diesem Modell ökologische Hinweise sekundäre begehrliche Eigenschaften (konditionierte lohnende Effekte) zu erwerben, wenn gepaart mit einem primären Verstärker3. Beispielsweise ein zunächst neutraler Ort (z. B. die Farbe von einem Abteil in der CPP-Käfig) paart sich mit speziellen Wirkungen eines Medikaments von Missbrauch während einiger Sitzungen5, Klimaanlage, während ein weiteres Fach mit der Injektion eines Fahrzeugs verbunden ist. Klimaanlage, wenn das Tier mehr Zeit in das Fach, die zuvor mit dem Medikament verbundenen verbringt folgend wird davon ausgegangen, dass CPP3entwickelt hat. Die Einrichtung der Präferenz ist erreicht, wenn das Tier die Umwelt Cues, verbunden mit der Droge, die die primäre Verstärker ist einen positiven Wert verleiht. Infolgedessen werden Tiere Droge-suchenden Verhaltensreaktionen in Reaktion auf diese kontextuellen Signale6durchführen. Die CPP-Modell ermöglicht die Auswertung der lohnendsten Eigenschaften der Eingangssignale Dosen des Medikaments, die anzeigt, ob Tiere in einem bestimmten Zustand (z. B.zuvor von sozialen Niederlage erlitt) sind anfällig und empfindlich auf Dosen, die können nicht wirksam bei der naiven Tiere7.

CPP-Modell hat auch zur Auslöschung/Wiedereinsetzung als Tiermodell Rückfall3, zu studieren, das ist das Ziel dieses Protokolls zu bewerten. Es gibt drei verschiedene Phasen: Erwerb, vom Aussterben bedroht und Wiedereinstellung (Abbildung 1). In der CPP Wiedereinstellung Modell Tiere erwerben zunächst die CPP für ein Medikament gepaart, und dann führen sie mehrere vom Aussterben bedroht-Sitzungen. Wir definieren vom Aussterben bedroht, wie der Moment, in dem das Tier reduziert seine Verhaltensreaktionen der Annäherung an eine konditionierte lohnende Stimulus, der wurde (z. B.das Medikament entfernt)8. Während der Sitzungen vom Aussterben bedroht erkunden Tiere die Fächer in der Abwesenheit des Medikaments, so dass die erworbenen Präferenz allmählich abgeschwächte9ist. Ein wichtiges Thema zu berücksichtigen ist, dass die Verhaltensänderungen, die das Tier während vom Aussterben bedroht (die fortschreitende Abnahme in den Zeitaufwand in der Droge gepaart Fach) zeigt durch neue Lernprozesse sein kann, die mit der vorherigen erlernte Reaktion konkurrieren, oder zu einem Rückgang der interne motivationale Zustand des Thema3fällig. Schließlich wäre die Wiederherstellung der Ort-Voreinstellung durch den Kontext oder Medikament Hinweise unseres Modells der Wiedereinstellung1.

Verwaltung eine Grundierung Injektion des Medikaments verbunden kann die Präferenz, wiedereinsetzen, die eine Wiederherstellung der Annäherung an die kontextuellen Signale gilt. Medikament Priming Wiedereinstellung erfolgt durch die anhaltende Erinnerung an die angenehmen Effekte der Droge, die induzierte Begierde und motiviert Tiere, die Umwelt Cues im Zusammenhang mit Belohnung zu suchen.

Einige Vorteile des CPP Wiedereinstellung Modells sind, dass das Verfahren ist nicht-invasiv (im Gegensatz zu Selbstverwaltung, die Operation erfordert), kostengünstig und einfach. Darüber hinaus hat dieses Modell eine gutes Kriterium Gültigkeit, wie es gut imitiert, was tritt bei Menschen10,11, induzierende Wiedereinstellung mit reizen, die Rückfall, wie Re-Exposition gegenüber der Droge12,13 auslösen oder betonen Sie14.

Es gibt andere Techniken wie das Aussterben – Wiedereinsetzung Modell der intravenöse Selbstverwaltung. Hier drücken Sie Tiere einen Hebel, um das Medikament selbst verabreichen, das die Bewertung der operanten Reaktion des Tieres, Compulsivity und Motivation14,15,16erlaubt. Der größte Vorteil der KPP über Selbstverwaltung Verfahren ist, dass CPP Wiedereinsetzung gilt entsprechend die Reaktivierung der Anreiz-motivierende Wert der Kontext Stimuli gepaart mit der Droge, bestehend aus dem Wiedererscheinen des Ansatzes Verhalten, die Kontext-17. Darüber hinaus können nicht-medikamentöse Reize wie Stress, auch Wiedereinstellung18,19induzieren. Zum Beispiel beschrieben eine Selbstverwaltung Studie keine Auswirkungen auf die Wiedereinführung der Heroin-Aufnahme bei Ratten nach einem Fuß Schock oder Zurückhaltung betonen20. Autoren diskutiert, dass es nicht erfolgreich war, weil diese Stressoren außerhalb der Selbstverwaltung Kammer in einem anderen Zusammenhang getestet wurden. Im Gegensatz dazu Wenn Sie die CPP-Modell der Wiedereinstellung zu verwenden, gab es eine klare Wiedereinsetzung in den vorigen Morphin-induzierte CPP nach der Verwendung der gleichen Stressoren und in einem anderen Kontext auf, der KPP und zu unterschiedlichen Zeiten angewendet (0 und 15 min nach stress Exposition)18 .

Mehrere Studien in der Literatur haben verschiedene Arten von Drogen- und Stress-induzierte Wiedereinstellung gezeigt. Auf der einen Seite wurde bei Ratten und Mäusen mit Morphin5,21,22,23, Kokain24,25, Amphetamin26Medikamenten-induzierten Wiedereinstellung berichtet, 27, Ethanol28,29und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA)30. Auf der anderen Seite möglicherweise Exposition gegenüber betonen ein entscheidender Faktor bei Anfälligkeit für Drogenmissbrauch. Stress ist bekanntermaßen die lohnenden Effekte von Drogen7,31,32 zu erhöhen und ihre Rolle in der Rückfall ist gut etablierte33,34. Niederlage in sozialen Interaktionen mit ein Artgenosse werden z. B. Morphium und Kokain CPP18,19wiederhergestellt. Darüber hinaus Tieren wiederholt soziale Niederlage sind anfälliger für die konditionierten lohnende Effekte der Eingangssignale Dosen von Kokain, und die Präferenz mit sehr niedrigen Dosen von Kokain7wieder.

Anwendung des Modells CPP Wiedereinstellung ist eine nützliche und sensible Art, Anfälligkeit für Rückfälle bei Tieren zu bewerten, und ermöglicht die Bewertung der verschiedenen feinstofflichen Umwelt Manipulationen, die Hauptauslöser sind, die menschliche Rückfall, wie z. B. bedrohen Drogen oder Stress-induzierte Wiedereinstellung.

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Protocol

Alle Verfahren, die Mäuse und deren Pflege erfüllt mit nationalen, regionalen und lokalen Gesetze und Verordnungen, die gemäß Richtlinie 2010/63/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 über den Schutz von Tieren, die für verwendet werden wissenschaftliche Zwecke. Der Einsatz von Tieren und Pflege Ausschuss der Universität Valencia genehmigt dieses Protokolls.

(1) Materialien und Set-up für konditionierte Ort Präferenz:

  1. 3 Tage vor dem Test für 1 – 2 min. Mäuse zu behandeln. Die Schwanzwurzel sollten erfasst werden. Der Körper sollte wenn möglich unterstützt werden. Dies geschieht, Schmerzen und Leiden zu minimieren, beim Umgang mit einem Tier und störende Variablen, wie zum Beispiel Stress zu verhindern.
    Hinweis: 1 männliche Mäuse waren 60 Tage alt (junge Erwachsene) mit einem Gewicht von 35-40 g in die heutigen Experimenten beschäftigt. Arzneimittel-induzierter Wiedereinsetzung kann bei Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt werden. Jedoch über Stress-induzierte Wiedereinstellung soziale Niederlage Paradigma richtet sich nur für männliche Nager wie Weibchen keine aggressive Reaktion bei den ansässigen Mäusen zu induzieren.
  2. Statt Klimaanlage verwenden Sie identische Kästen mit zwei identischen Fächern (30,7 cm langen × 31,5 cm Breite × 34,5 cm hoch) durch eine kleinere zentrale Grauzone (13,8 lange × 31,5 cm Breite × 34,5 hohe) getrennt.
    Hinweis: Fächer haben unterschiedliche Texturen und Wandfarben (einen glatten Boden im schwarzen Fach und einen rauen Boden in der weißen). Jedes Fach der CPP-Box enthält vier Infrarot-Lichtstrahlen und sechs in der zentralen Fach. Dies ermöglicht die Aufnahme von Kreuzungen zwischen Fächern und die Position des Tieres.
  3. Legen Sie oben die Raumbeleuchtung (off oder gesenkt) jeden Tag. Verwenden Sie rote Ampeln (empfohlen), wie Tiere es nicht wahr nehmen und es ist für den Experimentator (ca. 40 Lux bei 1 m über dem Boden gemessen) gedämpft.
  4. Richten Sie das Programm registrieren 15 min für Pre- und Post-Klimaanlage test (siehe die Tabelle der Materialien für Software) (Abbildung 2)
  5. Bereiten Sie die Kokain-Lösung für das ganze Experiment benötigt. Auflösen von Kokain-Hydrochlorid in 0,9 % NaCl (Kochsalzlösung) in einem Volumen von 0,1 mL/10 g Körpergewicht. Vortex-Mischung und Store bei 4 ° C am Ende des Tages.
    Hinweis: Kokain Konzentrationen variieren je nach Zweck der Studie. Wenn das Ziel ist es, die Eingangssignale Dosen von Kokain zu bewerten, könnte eine Konzentration von 1 mg/kg verwendet werden, das heißt unwirksam bei Kontrolltieren, wie in früheren Studien24,35zu sehen. Wenn eine wirksame Dosis der Zweck ist, kann eine Konzentration von 6 mg/kg, gewählt, die ist wirksam, aber nicht dazu veranlassen, Wiedereinstellung24, oder eine 25 mg/kg-Konzentration, die effektive und Wiedereinstellung der Präferenz19induziert.
  6. Testen Sie die Tiere während ihrer dunklen Phase und verwenden Sie das gleiche Feld für jedes Tier über Tage hinweg.
  7. Bringen Sie Tiere täglich zu den Prüfraum in ihren Käfigen zu Hause und lassen sie ungestört für 15 min als kurzer Gewöhnung an all die Test-Geräusche.

2. test

  1. Erwerb
    Hinweis: Das Verfahren der Ort Konditionierung, unvoreingenommene in Bezug auf die erste spontane Präferenz besteht aus drei Phasen: Pre-Klimaanlage, Klimaanlage und Post-Klimaanlage (Abbildung 1).
    1. Vorbehandlung (Pre-C) (3 Tage) (Abbildung 2, Abbildung 3 Abbildung 4( )
      Hinweis: Hier wird der neutrale Wert der Fächer im Feld CPP ausgewertet. Messen Sie die Zeit in jedem Fach und später damit verbracht in dasselbe Fach in der Post-Klimaanlage Test zu vergleichen.
      1. Bringen Sie die Tiere in den Testraum und lassen für 15 min gewöhnt.
      2. Überprüfen Sie, dass Guillotines aus dem Käfig entfernt werden.
      3. Richten Sie den Computer und das Programm. Geben Sie Tier ID ein und drücken Sie den Befehl "Trial" und "Start" (Abbildung 2).
      4. Platzieren Sie den Mauszeiger sanft in die mittlere Kammer (graue Fach) und verlassen Sie den Prüfraum mit minimalem Rauschen.
      5. Bringen Sie alle Tiere zurück in ihre Heimat Käfige und sichern Sie Ihre Daten, wenn der Prozess abgeschlossen ist.
      6. Mäuse auf beide Fächer des Apparates für 15 min zugreifen können (900 s) pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen.
      7. Am 3. Tag notieren Sie sich die Zeit in jedem Fach über einen Zeitraum von 900 s, und speichern Sie sie für die Zuordnung der Fächer in der nächsten Phase (Abbildung 3).
      8. Weisen Sie die Hälfte der Tiere in jeder Gruppe, das Medikament oder das Fahrzeug in ein Fach (z.B.schwarz) und die andere Hälfte in das andere Fach (z.B.weiß) (Abbildung 4) zu empfangen.
        Hinweis: Die endgültige Verteilung der Tiere muss sicherstellen, dass die Hälfte der Tiere zunächst bevorzugte Fach und die andere Hälfte in das Fach nicht bevorzugten zugeordnet sind. Darüber hinaus erhielt die Hälfte der Tiere das Medikament in ein Fach (z. B. eine schwarze) und die andere Hälfte in die andere (in diesem Fall, weißen).
      9. Balance-Resultate in der Gruppe in beiden Fächern sowie in Gruppen (Test gruppenunterschiede mit einer Varianzanalyse (ANOVA)). Als ungefähre Orientierung sollte Werte um 360-370 s in der Pre-C-Test (Abbildung 4). Hinweis: keine signifikanten Unterschiede sollten zwischen den Zeitaufwand in der Droge gepaart und Fahrzeug gepaart Fächer während der Pre-C-Test erkannt werden.
      10. Schließen Sie Tiere, die eine starke Abneigung oder Vorliebe für jedes Fach aufweisen. Halte Abneigung als weniger Zeit als 33 % im Abteil, und bevorzugt zu berücksichtigen, wenn das Tier mehr als 67 % der Gesamtzeit in diesem Fach ausgegeben.
    2. (4 Tage) Klimaanlage (Abbildung 5( )
      1. Wiegen Sie die Tiere und verwenden Sie diese Gewichte für Kokain Dosen während der Aufbereitung.
      2. Bereiten Sie Spritzen mit Kokain oder Kochsalzlösung basierend auf Körpergewicht.
      3. Eine Maus zu einem Zeitpunkt zu injizieren, intraperitoneal (Ip) und legen Sie es sofort sanft in den zugewiesenen schwarzen oder weißen Innenraum ihrer Box.
      4. Injizieren Sie nach einem Intervall von 4 h die Medikamentendosis unmittelbar vor die Maus auf das Medikament gepaart Fach für 30 min (Abbildung 5) beschränkt ist.
      5. Wechseln Sie diese Prozedur jeden Tag beginnend mit Kokain an den Tagen 1 und 3 und saline an den Tagen 2 und 4.
      6. Kontrollieren Sie die Entbindung in beiden Fällen erfolgt durch die Guillotine Tür, die trennt die beiden Fächer macht den zentralen Bereich unzugänglich.
        Hinweis: In dieser Phase gibt es keine Notwendigkeit, das PC-Programm einrichten.
    3. Post-Klimaanlage (Post-C) (1 Tag)
      1. Bringen Sie die Tiere in den Testraum und lassen für 15 min gewöhnt.
      2. Entfernen Sie die Guillotine Tür trennt die beiden Fächer.
      3. Richten Sie den Computer und das Programm. Geben Sie Tier IDs und drücken Sie den Befehl "Start".
      4. Notieren Sie die Verweildauer der unbehandelten Mäuse in jedem Fach einen Zeitraum 900 s Beobachtung.
      5. Wenn der Prozess abgeschlossen ist, bringen Sie die Tiere zurück in ihre Heimat Käfige und sichern Sie Ihre Daten.
      6. Der Auffassung, dass das Medikament Ort Präferenz induziert hat, wenn die Verweildauer in der Droge gepaart Fach während der Post-C deutlich größer als in der Pre-C-Test ist. Sollten Sie das Gegenteil der Fall ist, eine Abneigung gegen das Fach Medikament gepaart.
  2. Vom Aussterben bedroht
    1. Führen Sie eine wöchentliche Aussterben-Sitzung in allen Gruppen/Tiere, die eine Vorliebe für das Medikament gepaart Fach entwickelt.
    2. Legen Sie das Tier in der Vorrichtung (ohne Guillotines) für 15 min (identisch mit der Pre- und Post-C-Tests) (Abbildung 1).
      Hinweis: Wenn die Dosis in beschäftigt die CPP ist hoch (25 mg/kg), 1 vom Aussterben bedroht-Sitzung pro Woche durchführen. Wenn eine Eingangssignale Dosis (1 mg/kg) ist, führen Sie 2 Aussterben Sitzungen pro Woche (z.B. Montag und Donnerstag).
    3. Betrachten Sie die Präferenz ausgelöscht, wenn Daten aus dem Aussterben Test keine Unterschiede in Bezug auf die Pre-C-Test zeigen, aber sie Unterschiede in Bezug auf die Post-C-Test zeigen.
    4. Wiederholen Sie den Test 24 h später um die Löschung zu bestätigen.
  3. Wiedereinführung der CPP
    1. Priming-induzierte Wiedereinstellung
      1. Bewerten Sie die Auswirkungen einer Grundierung Dosis Kokain 24 h nach der Bestätigung vom Aussterben bedroht.
        Hinweis: Priming-Dosen sind die Hälfte der vorherigen Dosis, die das Tier während der Aufbereitung erhalten hat. Die Wiedereinstellung Test durchläuft das gleiche Protokoll wie Pre-C und Post-C-Tests, mit der Ausnahme, dass Tiere die Dosis von Kokain in einem nicht-Kontingent erhalten Platz 15 min vor dem Test. Die Wirksamkeit des Medikaments Priming bei der Induktion von Wiedereinsetzung kann gesteigert werden, nach wiederholter Aussterben/Wiedereinsetzung23, Erfahrungen, obwohl die Reihenfolge der Dosen nicht scheint, um eine Rolle in den Ergebnissen36erhalten.
      2. Bringen die Tiere in einem anderen Raum aus den Prüfraum (nicht-Kontingent Platz) (Abbildung 6).
      3. Injizieren sie mit Hälfte der vorherigen Dosis Kokain (wärez.B., wenn Tiere mit einer Grundierung-Dosis 25 mg/kg Kokain konditioniert wurden 12,5 mg/kg).
      4. Bringen sie zurück zu ihrer Vivarium für 15 Minuten.
      5. Nehmen sie in den Prüfraum und legen Sie die Tiere in den Apparat sofort (ohne die Guillotine Türen trennen die Fächer) für 15 min (identisch mit der Pre- und Post-C-Tests).
      6. Betrachten Sie die Differenz in Sekunden die Zeit in das Medikament gepaart Fach während der letzten Sitzung vom Aussterben bedroht und die Wiedereinsetzung-Test als Maß für den Grad der Wiedereinstellung der Voreinstellung durch das Medikament verursacht.
      7. Wiederholen Sie vom Aussterben bedroht-Wiedereinstellung jedesmal mit abnehmender Dosen bis es bestätigt wird, unwirksam.
        Hinweis: Eine Kochsalzlösung Einspritzregelung kann verwendet werden, um die Kapazität von Kokain Priming (und nicht der Injektion selbst) zu steuern, Wiedereinstellung zu induzieren.
    2. Stress-induzierte Wiedereinstellung
      1. Bewerten Sie die Auswirkungen der eine Stress-induzierte Wiedereinsetzung 24 h nach der Bestätigung vom Aussterben bedroht
        Hinweis: Wiedereinsetzung Tests sind identisch mit denen in Post-C (freie Gehfähigkeit für 15 min), durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Tiere 15 min getestet werden, nachdem die soziale Niederlage in eine agonistische auftreten (Abbildung 6)
      2. Nehmen Sie die Tiere in einen anderen Raum aus der CPP-Zimmer.
      3. Platzieren Sie die experimentelle Maus mit einer aggressiven Gegner Sex gleich Alter und Körpergewicht in den Kunststoffkäfig (Abbildung 6) abgestimmt.
        Hinweis: Die agonistische Begegnung besteht aus einem 10 min. Test in einem neutralen transparent Kunststoffkäfig (23x13.5x13cm) mit einer Niederlage für die experimentelle Maus. Zur Vorbereitung des aggressiven Gegners zuerst isolieren Sie verschiedene Tiere, die in Alter und Körpergewicht als die experimentellen Mäuse für 3 Wochen zu entsprechen. Trainieren sie kämpfen Erfahrungen sammeln und testen, um hohe aggressives territoriale Verhalten haben. Um aggressive Artgenossen zu erhalten, Mäuse müssen mindestens 3 Wochen lang isoliert und dann ausgebildet in aggressiven Verhaltensweisen angreifen. Tiere werden in einer neutralen Umgebung, vor denen sie paarweise ausgebildet. Wir lassen Sie sie beißen die Gegner 2 oder 3 Mal und sie aus dem Käfig immer das Training beenden, bevor einer der beiden Mäuse Unterwerfung, zeigt so, dass die Erfahrung der Begegnung aggressives Verhalten verstärkt. Nach Aggression (Bedrohung und Angriff der aggressiven Artgenosse) leiden, sollten experimentellen Mäuse Vermeidung/fliehen und Defensive/submissive Verhalten präsentieren. Das Kriterium besteht darin, eine bestimmte Haltung der Niederlage, gekennzeichnet durch eine aufrechte unterwürfige Position, limp Vorderpfoten nach oben abgewinkelten Kopf und Ohren (Abbildung 6) eingefahren. Nach Burke Et Al., 2016, man bedenkt, dass die sozialen Begegnung früher beendet wird, wenn der Eindringling eine devote gleichgültige Haltung zeigt > 8 s oder 13 Angriff Bisse aufgetreten ist. Eine andere Möglichkeit zum Bildschirm Tiere ohne erhebliche Verletzungsgefahr wäre das Tier in einem Netz-Gehäuse mit einem Loch, nicht groß genug, um jedem Tier übergeben Tempo.  Aggression konnte nachgewiesen werden, ohne Unterwerfung Tiere, aggressives Verhalten zu lenken.  Wenn ein Tier eine Verletzung mit einer Wunde 1 cm im Durchmesser und/oder direkte Einwirkung des Muskels trägt, ist aus der Studie ausgeschlossen und sollte eingeschläfert werden.
      4. Nehmen Sie nach 10 min der agonistischen Begegnung die Mäuse in den Testraum und die Tiere in der CPP-Apparat sofort (ohne die Guillotine Türen trennen die Fächer) für 15 min (identisch mit der Pre- und Post-C-Tests).

3. statistische Analyse

Hinweis: Optimale Stichprobengröße sollte mindestens 15 Tiere pro Gruppe.

  1. Analysieren der Zwischenzeit verbrachte in dem Medikament gepaart Fach der Gruppe durch eine gemischte ANOVA mit einem zwischen Variablen, Behandlung, mit zwei Ebenen (Kontrollgruppe, Versuchsgruppe, Beispiel für zwei Gruppen ist in Abbildung 7 c), und in Variable-Tage, mit 2 Ebenen (Pre-C und Post-C).
    Hinweis: In der Kontrollgruppe Tiere erhalten das Medikament aber haben keine Umwelt Manipulationen. Auf der anderen Seite sind Tiere in der experimentellen Gruppe unterschiedliche Umweltbedingungen ausgesetzt. Vergleichen Sie die Zeit in der Droge gepaart Fach am Post-C Tag mit Respekt die Pre-C zu testen, um festzustellen, ob es gibt keine signifikanten Unterschiede in der Empfindlichkeit auf das Medikament.
  2. Darüber hinaus führen Sie Bonferroni Post-hoc-Analysen, um entweder die wesentlichen Punkte zu überprüfen.
  3. Analysieren von Daten im Zusammenhang mit vom Aussterben bedroht und Wiedereinstellung Werte in den Gruppen, dass entwickelten Präferenz durch Zugewinn t-Tests weiterhin mit dem Aussterben-Wiedereinsetzung-Verfahren im Laufe des Experiments, aber im letzten Moment, sie zu analysieren mit einer ANOVA mit einem in Variablen (Tage) mit der Anzahl der Ebenen je nach jeder Gruppe.
    Hinweis: Wenn die Anzahl der Vergleiche erhöht wird, stieg die Zahl derjenigen, die erheblich sein wird durch Zufall auch. Als solche korrigieren"um zu vermeiden Fehlalarme (Typ-1-Fehler), wir" den p-Wert, wodurch des Tests eher konservativen mit der Bonferroni-Korrektur für mehrere t-Tests. Für die Wiedereinstellung Test sollte der Vergleich zwischen der Wiedereinstellung-Test und der letzte vom Aussterben bedroht-Test erfolgen. Daher besteht keine Notwendigkeit zur Korrektur.

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Representative Results

Erstens sind repräsentative Ergebnisse aus der Grundierung und Stress-induzierte Wiedereinsetzung in Abbildung 7 dargestellt mit Hilfe von Erwachsenen OF1 männlichen Mäusen.

Die Daten in Abbildung 7-b für Zeit verbracht in der Droge gepaart Kompartiments in der Pre- und Post-C Test wurden mit einer Messwiederholung ANOVA mit einer innerhalb der Themen Variablen Tagen (Vergleich von Pre-C und Post-C) analysiert. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Effekt der Variable Tage [F(1,34) = 51.179; p < 0,001], wie alle Tiere eine Präferenz in der Post-C Tag im Vergleich zu den Pre-C entwickelt. Alle Tiere wurden mit 25 mg/kg Kokain konditioniert und Aussterben erreicht wurde, eine Gruppe erhielt eine Grundierung Dosis von 12,5 mg/kg Kokain, die Wiedereinstellung (Abb. 7a) zu testen und das andere wurde eine soziale Interaktion in der experimentellen Tier wurde von einem aggressiven Gegner (Abb. 7 b) besiegt. 15 min nach den beiden Veranstaltungen, Tiere wurden in ihre entsprechenden CPP-Box getestet.

Priming-induzierte Wiedereinstellung (Abb. 7a) unterlag zu nachfolgenden Grundierung Dosen (die Hälfte der vorhergehende) bis eine Grundierung Dosis verringern wird bestätigt, um unwirksam sein. Die Dosen wurden: 12,5, 6,25 und 3,125 1,56 mg/kg Kokain. Der Student t-Test zeigte einen signifikanten Effekt auf die 12,5 mg/kg Kokain Wiedereinstellung in Bezug auf die vom Aussterben bedroht-Sitzung (t-Kenngröße (t) = 20.589, Freiheitsgrade (d.f.) = 17; p < 0,001) und nachfolgenden Dosen (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3,125 mg/kg: t = 14.260; 1,56 mg/kg: t = 16.934 d.f. = 17; p < 0,001). Grundierung mit 0,78 mg/kg nicht dazu veranlassen, die Wiedereinstellung.

In Bezug auf die Stress-induzierte Wiedereinstellung (siehe Abb. 7 b), wird ein aggressives Tier ausgesetzt und besiegte 15 min vor der Test zur Wiedereinführung der zuvor erloschen Präferenz führt (t = 26.810; d.f. = 15; p < 0,001)19 .

Andere ökologische Manipulationen, wie wiederholte soziale Niederlage vor dem Eingriff CPP ändern die lohnenden Effekte der Eingangssignale Dosen von Kokain (Abb. 7 c). A gemischt ANOVA mit der zwischen Variable "Stress" und die in Variable "Tage" wurde durchgeführt, und es gab ein signifikanten Effekt der Interaktion Stress x Tage [F(1,29) = 4.144; p < 0,05]. Nur sozial besiegt Tiere ausgestellt Präferenz für das Fach Droge-gepaart mit einer Eingangssignale Dosis von Kokain, das gezeigt worden ist, im standard Tiere7unwirksam. Darüber hinaus nach Aussterben der Präferenz, sozial besiegt Tiere wieder in Kraft gesetzt ihre Vorliebe mit nur 0,5 mg/kg Kokain Priming (t = 25.484 d.f. = 17; p < 0,001).

Zweitens als ein negatives Ergebnis, können wir sehen, wie die Wiedereinstellung durch eine positive soziale Interaktion mit einem aggressiven Artgenosse (Abb. 8a) verhindert werden kann. Daher ist es wichtig zu beurteilen, ob Tiere unterliegen oder nicht nach einer sozialen37 Begegnung.

Ein weiteres Beispiel für negative Ergebnisse, die Wiedereinstellung verhindern kann Ernährung Manipulationen, wie eine fettreiche schmackhaft Diät-Aufnahme sein. Erstens ANOVA-Analyse ergab einen Effekt der Variable Tage [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], da beide Gruppen Vorliebe für das Medikament gepaart Fach entwickelt (p < 0,01) (Abb. 8 b). Nach Aussterben zeigen unsere Ergebnisse, dass Tiere auf fettreiche Ernährung umgestellt, nach der Post-C-Test ihrer Empfindlichkeit gegenüber Drogen-Priming induzierte Wiedereinstellung, sank wie sie die Einstellung mit einem 6,25 mg/kg Kokain nicht wiedereinzusetzen38dosieren.

Figure 1
Abbildung 1: experimentelle Verfahren der klimatisierten Ort Präferenz. Es besteht aus drei Phasen: Pre-Klimaanlage, Klimaanlage und Post-Klimaanlage. Es gibt 4 Klimaanlage Tage, in denen das Verfahren jeden Tag abwechselnd ist beginnend mit Kokain an den Tagen 1 und 3 und Fahrzeug an den Tagen 2 und 4. Dann sind vom Aussterben bedroht und Wiedereinstellung Sitzungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Software-Nutzung-Sitzungen für Pre-C und Post-C Tests wo verbrachte Zeit in jedem Fach und Anzahl der Einträge wird aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Daten nach dem Pre-C und Post-C Test Hier, zeichnen Sie bei der Prüfung gewonnenen Daten auf Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: unvoreingenommene Zuordnung von Tieren, die Fächer für die nächste Phase der Konditionierung. Nehmen Sie die Daten der letzten Pre-C-Test-Tag in den weißen und schwarzen Abteilen. Hälfte der Tiere werden zugewiesen, um das Medikament oder Fahrzeug in einem Abteil (schwarz oder weiß) und die andere Hälfte in das andere Fach zu erhalten. Schließen Sie Tiere aus, die starke Abneigung oder Vorlieben zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: endgültige Zuordnung von Fahrzeug und Kokain gepaart Sitzungen. Diese Abbildung zeigt Wechsel in der Größenordnung von Paarungen. An den Tagen 1 und 3 ein Tier (z.B.1.1) ist zunächst das Kokain gepaart Fach (weiße eine) ausgesetzt und nach vier Stunden das Fahrzeug gekoppelt Fach (eine schwarze) ausgesetzt ist. An den Tagen 2 und 4 die Reihenfolge der Paarungen wird invertiert und das Tier wird zunächst ausgesetzt, Fahrzeug gekoppelt (schwarz) Fach und nach vier Stunden, um das Kokain gepaart (weiß) Fach. Dieses Verfahren ist neutral und ausgewogen, simultane Konditionierung Sitzungen durchgeführt werden können, mit zwei Tieren, die mit beiden Kammern der gleichen Box (z.B.Tiere, 1.1, 1.3 und 2,4 und 3,1), das uns erlaubt, zu verringern Zeit gewidmet die experimentelle Verfahren. Beachten Sie, dass diese Paare von Tieren die umgekehrte Reihenfolge der Paarungen durch die Klimaanlage Phase folgen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: zwei Modelle der Wiedereinstellung. (ein) Priming-induzierte Wiedereinsetzung und (b) Stress-induzierte Wiedereinstellung. (ein) Tiere erhalten eine Injektion von Drogen in einem nicht-Kontingent-Raum und an das Vivarium gebracht; 15 min später in der CPP-Box testeten. (b) Tiere sind im agonistischen Begegnung in einem nicht-Kontingent Raum für 10 min besiegt, und danach werden sie in der CPP-Box getestet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Repräsentative positive Ergebnisse. Grundierung (ein) und Stress-induzierte (b) Wiedereinstellung nach 25 mg/kg Kokain CPP. (c) Auswirkungen der sozialen Niederlage auf die lohnenden Effekte der Eingangssignale Dosen von Kokain (1 mg/kg). Balken stehen für die Zwischenzeit (± SEM) in Sekunden in das Medikament gepaart Fach während der Vorkonditionierung (weiß), Post-Klimaanlage (schwarz), der letzten Sitzung vom Aussterben bedroht (hellgrau) und Wiedereinstellung (dunkelgrau) verbracht. Die Wiedereinstellung Test wurde 15 min nach einer Grundierung Dosis von Hälfte der vorherigen Dosis erhielt bewertet. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001 signifikanter Unterschied Vs Pre-C (ANOVA mit einer in-Themen, Variable Tage (Vergleich von Pre-C und Post-C) oder der vorherigen Sitzung vom Aussterben bedroht (der Student t-Test). Diese Zahlen wurden von 7,19geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Repräsentative negative Ergebnisse. Auswirkungen der schützende Umwelt Manipulationen auf die lohnende Effekte des Kokains. (ein) Wirkungen eine positive soziale Interaktion vor die Wiedereinstellung zu testen. (b) Auswirkungen einer fettreichen Ernährung während der gesamten Aussterben Periode und Wiedereinstellung. Die Kontrollgruppe wurde mit einem standard-Diät (13 % der kcal aus Fett, 67 % kcal aus Kohlenhydrate und 20 % kcal aus Protein; 2,9 Gesamt kcal/g) und die fettreiche Diät-Gruppe (45 % kcal aus Fett, 36 % kcal aus Kohlenhydraten und 19 % kcal aus Protein; 4,6 insgesamt kcal/g) gefüttert. Balken stehen für die Zwischenzeit (± SEM) in Sekunden in das Medikament gepaart Fach während der Vorkonditionierung (weiß), Post-Klimaanlage (schwarz), der letzten Sitzung vom Aussterben bedroht (hellgrau) und Wiedereinstellung (dunkelgrau) verbracht. Der Wiedereinstellung Test war 15 min nach einer Grundierung Dosis von Hälfte der vorherigen empfangene Dosis ausgewertet. * p < 0,05; ** p < 0,01; signifikanter Unterschied Vs Pre-C (ANOVA mit einer in-Themen, Variable Tage (Vergleich von Pre-C und Post-C) oder der vorherigen Sitzung vom Aussterben bedroht (der Student t-Test). Diese Zahlen wurden von 37,38geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Der entscheidende Punkt der Droge Suchtforschung ist die Entwicklung von Behandlungen, die Begierde zu verringern und folglich reduzieren die Anfälligkeit für Rückfälle. Dank der Wiedereinstellung Modell des CPP Paradigmas ist es möglich, Untersuchung des Einflusses von verschiedenen prozeduralen und Umweltfaktoren, die Rückfall, modulieren die Priorität der zukünftigen Forschung hat. Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten, wie das CPP-Paradigma ist ein Test, der sehr empfindlich auf Umwelteinflüsse reagiert.

Modifikationen und Fehlersuche: Die CPP-Version des Modells Wiedereinsetzung sollte abhängig von der Droge von Interesse geändert werden. Es gibt verschiedene Faktoren, die Einfluss auf das Ausmaß der konditionierten Präferenz, wie Dauer und Anzahl der Sitzungen, Klimaanlage. Die Anzahl der Zuordnungen reicht in der Regel von eins bis sechs, mit vier ist die am häufigsten. Die Testdauer Klimaanlage ist je nach den Eigenschaften des Medikaments und die Pharmakokinetik gegründet.

CPP-Studien beinhalten in der Regel viele Prüfungen, so ist es nützlich, um Protokolle zu verwenden, die die erforderliche Zeit reduzieren. Ein Weg, um dies zu erreichen ist, die Anzahl der Versuche zu reduzieren und eine weitere Möglichkeit ist, zwei Sitzungen von Klimaanlage pro Tag durchzuführen, wie in diesem Protokoll angezeigt wird. In diesem Fall ist es notwendig, um sicherzustellen, dass die Wirkungen der Droge aus der vorherigen Sitzung nicht zu diesem zweiten Sitzung39, ziehen auf, weshalb das Intervall von vier Stunden zwischen den Kokain - Fahrzeug Sitzung gewählt wurde. Beispielsweise sollte der Zeitpunkt der Paarung bei Kokain während der Konditionierung Phase alle 24 h für 4 Tage mit einer Paarung Dauer von 30 Minuten. Im Gegenteil, der zeitlichen Verlauf des Verfahrens von Ethanol Klimaanlage sollte alle 48 h, insgesamt 8 Tage, 1 Sitzung pro Tag, Klimaanlage und abwechselnd Fahrzeug und EtOH, schließlich mit insgesamt 4 EtOH-Paarungen. Ethanol Paarung sollten eine kurze Dauer, z. B. 5 min, haben mehr Zeit aversive Staaten produzieren könnte. Effektive Dosen reichen von 1-2 g/kg und Eingangssignale Dosen sind 0,75 g/kg40. Priming-induzierte Wiedereinsetzung sollte die Hälfte der vorherigen Dosis erhalten, und das Gerät sollte identisch sein.

Jedoch kann Wahl dazu 1 oder 2 Sitzungen pro Tag die Ergebnisse in einigen speziellen Drogen beeinflussen. Beispielsweise ist bei MDMA-induzierte CPL mit dem zwei-Sitzungsprotokoll, die konditionierte Präferenz in Post-Klimaanlage nicht beobachtet, während diese bezogen werden kann, durch die Durchführung eines einzigen Verbandes jeden Tag30, so dass MDMA auch verabreicht werden sollten, Alle 48 h, aber die Dauer der Sitzung, Klimaanlage sollte 30 min sein.

Es gibt zwei Hauptmethoden vom Aussterben bedroht, die nach der Gründung der CPP ausgeführt werden konnte, entweder täglichen Injektionen des Fahrzeugs beschränken das Tier vorher Medikament sowohl im Fahrzeug bedingt Fächer41,42, 43, oder durch die Wiederholung des CPP-Tests, Vermietung Tiere erforschen die drei Fächer ohne die Guillotine bis Präferenz7,18,30,38nicht mehr eingehalten werden. In diesem Protokoll eingesetzt wir letzteres, denn es ist eine Art von spontaner Aussterben ohne pharmakologische oder Verhaltensstörungen Manipulation im Zusammenhang mit Klimaanlage (mehr ähnlich wie die dabei auftretende in menschlichen Süchtige), aber beide Methoden akzeptabel sind und gültig, wie die Literatur seit Jahren gezeigt hat.

Beschränkungen der Technik: Die wichtigste Einschränkung der CPP-Paradigma und die Wiedereinsetzung-Modell ist, dass sie sehr empfindlich auf jede Veränderung der Umwelt. Zimmer und Vivarium Bedingungen sollten daher während des gesamten Verfahrens stabil und konstant bleiben. Besondere Sorgfalt sollte auf Aspekte wie Leben im selben Raum mit Freunden des anderen Geschlechts, Käfige mit Artefakten wie Räder, die einen bestimmten und Konstanten Lärm machen oder bei schlechten Lichtverhältnissen. Neben der Steuerung dieser Variablen, ist die Rolle des Forschers auch kritisch, induzieren eine Zunahme der Stressbelastung der Tiere und die Ergebnisse beeinträchtigen können.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden: Bezug auf die anderen Methoden in der CPP-Version des Modells Wiedereinstellung ist der Forscher derjenige, der das Medikament für das Tier, im Gegensatz zu Selbstverwaltung Paradigmen, die die Futtersorten Motivation verwaltet, das Medikament zu bewerten. Es ist wichtig, dass wir dies berücksichtigen. Dies bedeutet, dass wir nicht die Motivation durch eine operante Reaktion noch die primäre verstärkenden Wirkungen der Droge Bewertung sind. Wie wir bereits erwähnt, ist CPP ein sinnvolles Modell, die entscheidende Rolle zu ermitteln, die ökologische Hinweise auf Rückfall in Drogenmissbrauch Störungen spielen, die in der Tat sind die wichtigsten Faktoren, die Rückfall in den Menschen zu modulieren.

Zukunft Anwendungen: Zukünftige Anwendungen des Modells CPP Wiedereinsetzung sollte orientiert sich an der sog. Inkubation des Verlangens, bestehend aus einer schrittweisen Anhebung in Cue Reaktivität nach Abstinenz von Drogen, imitiert verlangen beim Menschen. Heute ist wenig bekannt über diese in der CPP-Paradigma. Vor ein paar Jahren zufolge nur eine Studie CPP auch diese Inkubation Zeitraum44messen konnte. Die Untersuchung ergab vor kurzem, unabhängig davon, ob ökologische Hinweise zu Morphin in der CPP gepaart die Verhaltensreaktion über die Rücknahme Zeitraum45erhöhen könnte. Diese Studie fand heraus, dass die Anzahl der Einträge in die CPP-Fächer Anstiegen im Laufe der Zeit reflektieren die Inkubation von Begierde und was darauf hindeutet, dass Belohnung Erinnerungen und das Medikament verlangen in der CPP-Paradigma unterschieden werden könnte.

Wichtige Schritte: Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Um zu bekräftigen, dass Tiere ihre Vorliebe wieder eingestellt, sollten Aussterben Daten eine echte Aussterben der Vorzug vor der Wiedereinstellung Test bestätigt wird entsprechen. Daten aus dem Aussterben-Test sollte keine Unterschiede in Bezug auf die Pre-C-Test, aber in Bezug auf die Post-C-Test zeigen.

Bezüglich der sozialen Stress-induzierte Wiedereinstellung Version wir sollten bestätigt haben, dass das Tier tatsächlich besiegt wurde, da eine positive soziale Begegnung, die nicht in einer Niederlage endet schützende Wirkung blockieren die Wiedereinführung des Ortes zeigt Bevorzugung von Kokain. Wenn VERSUCHSTIERE nicht besiegt wurden, werden sie von der Studie ausgeschlossen. Wir empfehlen Erfassung und Auswertung der agonistischen Begegnung messen die Latenz das aggressive Verhalten oder Vorlage Verhalten, die Zahl der Angriffe und der Zeitaufwand in jedem dieser Verhaltensweisen. Für uns ist, dass das Versuchstier besiegt ist, wenn es ein Minimum von 2 Angriffen (Bisse) erhält und Anzeichen einer Vorlage zeigt (wie in Abbildung 6dargestellt). In allen Fällen dauert die Begegnung 10 Minuten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministerium für Gesundheit, soziale Dienste und Gleichheit. Delegation der Regierung für den nationalen Plan auf Drogen, Forschungsprojekte zur Drogenabhängigkeit, 2014I007; Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (MINECO), Health Institute Carlos III, Netzwerk der süchtig machende Störungen (RTA) RD12 / 0028/0005 und RD16 / 17.07.00 und der Europäischen Union, der FEDER Mittel "Una Manera de Hacer Europa" und der PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

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Verhalten Ausgabe 136 konditionierte platzieren Präferenz Kokain Wiedereinstellung Stress Mäuse Drogen-sucht
Wiedereinführung der Drug-seeking bei Mäusen mit dem klimatisierten Ort Präferenz Paradigma
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Blanco-Gandía, M. C., Aguilar,… More

Blanco-Gandía, M. C., Aguilar, M. A., Miñarro, J., Rodríguez-Arias, M. Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e56983, doi:10.3791/56983 (2018).

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