Summary
Denne protokol beskriver en adfærdsmæssige analyse, baseret på Barnes labyrint-test, for at studere hvordan instinktiv defensive aktioner er ændret af viden om fysisk miljø.
Abstract
Udviklingen har valgt et repertoire af defensiv adfærd, der er afgørende for overlevelse på tværs af alle dyrearter. Disse adfærdsmønstre er ofte stereotypt handlinger fremkaldte i svar til medfødt afskrækningsmiddel sensoriske stimuli, men deres succes kræver tilstrækkelig fleksibilitet for at tilpasse forskellige rumlige miljøer, som kan ændre sig hurtigt. Her, beskriver vi en adfærdsmæssige analyse for at vurdere indflydelsen af lærde rumlige viden på defensiv adfærd i mus. Vi har tilpasset den udbredte Barnes labyrint rumlig hukommelse analyse for at undersøge, hvordan mus navigerer til et ly under flugt reaktioner på medfødt afskrækningsmiddel sensoriske stimuli i en roman miljø, og hvordan de tilpasser til akutte ændringer i miljøet. Denne nye analyse er en etologiske paradigme, der ikke kræver uddannelse og udnytter den naturlige udforskning mønstre og navigation strategier i mus. Vi foreslår, at sæt af protokoller er beskrevet her er et effektivt middel til at studere målrettet adfærd og stimulus-udløst navigation, som bør være af interesse for begge felterne instinktiv adfærd og rumlig hukommelse.
Introduction
Instinktiv defensiv adfærd anses i vid udstrækning at være hardwired stimulus-respons, såsom C-start bevægelsen i fisk og padder, som flytter dyr fra en trussel kilde1. Defensiv adfærd kan dog mere adaptive hvis de fleksibelt tage hensyn til oplysninger lærte om det aktuelle miljø. Et eksempel på sådanne fleksibilitet er skiftet fra flugt til frysning af gnavere når konfronteret med truslen, afhængigt af forudgående viden om tilstedeværelsen eller fraværet af et krisecenter i miljøet2,3. Andre eksempler på fleksibilitet i medfødte adfærd omfatter tilpasning flyvning indledning tærskel eller undslippe hastighed afhængig af afstanden mellem et bytte og dets læ4, afstanden til truslen5,6, og tidligere erfaring 11 , 12, samt valg af forskellige defensive strategier afhængig af de sensoriske egenskaber af afskrækningsmiddel stimulus7, eller endda undertrykke defensiv adfærd over for konkurrerende motivationer som sult8, 9,10. Afhængighed af handling udvalg erhvervede viden om de rumlige funktioner af miljøet gør instinktiv defensiv adfærd i mus en kraftfuld model til at studere mål udvælgelse, rumlig hukommelse og navigation. Her, vi beskriver tilpasningen af et almindeligt anvendte adfærdsmæssige opgave, Barnes labyrint (BM) rumlig hukommelse assay13, til at bestemme den rumlige miljø indflydelse på defensive foranstaltninger udvalg i mus, og deres strategier for navigation når flygter til et krisecenter.
Standard Barnes labyrinten bruges til at studere læring og rumlige hukommelse i mus består af en cirkulær ~ 90 cm diameter platform med 20 jævnt fordelt huller, hvoraf 19 er lukket, og en fører til en underjordisk husly, som musene forsøge at undgå åben-felt miljø af platformen. Svage afskrækningsmiddel stimuli (buzzer, lys, ventilator) bruges ofte kontinuerligt gennem hele analysen at gøre miljøet afskrækningsmiddel og dermed fremme adgang til husly14. De mest almindeligt anvendte assay15,16har dyret en tilvænning rettergang hvor det er guidet til læ manuelt af eksperimentatoren umiddelbart efter at være placeret på platformen. Dette efterfølges af en 4-dages erhvervelse periode, hvor hver dag musen er tilladt at navigere frit i labyrinten for 3 min, hvorefter den er igen manuelt styret hen til Skjul hvis det ikke når det perioden udforskning. Den sidste etape af analysen er en sonde retssag på de 5th dag (selv om en langsigtet syv-dages hukommelse retssag er også almindeligvis udføres) når dyret udforsker labyrinten med alle huller lukket. Læring og langsigtet hukommelse er kvantificeret, af den tid, det tager at finde ly og puffer i de forkerte huller i perioden, erhvervelse og af tidsforbrug nær lukkede husly hul i sonden retssag. Typiske resultater viser et fald i antallet af fejl og ventetid at nå ly under erhvervelse og en ovenfor chance andel af tid i kvadrant indeholdende lukkede målet hullet i sonden retssag15.
Mens flere varianter af BM analysen har været tidligere beskrevet17,18,har19, paradigme vi beskrive her tre grundlæggende ændringer fra den standard assay. Først dyret er overladt til at udforske labyrinten og finde ly på sin egen, og test er gjort i den samme session, kort efter ly har fundet, i perioder, hvor dyr er involveret i sonderende adfærd. Selvom denne indstilling ikke teste langtidshukommelse af husly placering, er det designet til at være en naturalistisk scenarie, der efterligner udforskning af roman område, under truslen om underbud. Desuden, det giver mulighed for afprøvning af hvordan dyr tilpasses akutte ændringer i miljøet, såsom pludselige ændringer i landskabet. For det andet er et nøgleaspekt i vores analyse, at eksperimentatoren aldrig tvinger dyret i eller ud af den skjul, som kan forvirre dyret og udelukke sti integration20 som en levedygtig navigation strategi21. Stien integration er en navigation strategi, der bruger selv motion stikord, såsom proprioceptive og vestibulære stikord, som følge af integrationen af motor udstrømning, at opdatere den aktuelle placering af dyret og navigere mod et mål, der ikke er muligt hvis de dyret er passivt flyttet af eksperimentatoren. Tredje, bruger vi medfødt afskrækningsmiddel visuelle22 og auditive23 stimuli til at fremkalde flugt til husly, som er let at skelne fra igangværende fouragering adfærd og giver mulighed for vurdering og kvantificering af specifikke navigation strategier, der anvendes under forsvar mod overhængende trusler. Vi foreslår, at denne analyse vil være nyttig for dissekere rolle af rumlig hukommelse ved udvælgelsen og gennemførelsen af defensiv adfærd, og mere generelt til den bredere undersøgelse af målrettet navigation og rumlige korttidshukommelsen. De protokoller er beskrevet her blev indført af Vale mfl. i 2017, som vi henvise læserne til mere i dybden diskussion af grundlaget for eksperimenter og resultater.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført under den britiske dyr (videnskabelige procedurer) Act af 1986 (PPL 70/7652) efter lokale etiske godkendelse.
1. opsætning af adfærdsmæssige apparatet
Bemærk: Den vigtigste komponent i den adfærdsmæssige apparater er en variant af Barnes labyrint13 består af en hvid akryl cirkulære platform (92 cm i diameter) med 20 ækvidistante, 5 cm i diameter, cirkulære huller, beliggende radialt, 5 cm fra kanten af platformen . 19 af disse er lukket med sort plast plug (5 mm dyb), mens det resterende hul fører til en sort plexiglas shelter (dimensioner 15 x 5,8 x 4,7 cm), at mus kan nemt indtaste og afslutte. Det centrale område af arenaen består af et fast cirkulært platform (22 cm i diameter) og i periferien er monteret på en ramme, der tillader rotation over 360 grader gennem en computer-styrede stepper motor. Platformen er forhøjet 45 cm fra gulvet til at forhindre musene i at klatre ned. Se skematisk tegning i figur 1.
- Vedhæfte visuelle stikord til periferien af platform (2D eller 3D symboler med forskellige figurer, farver og mønstre), mindst 2 cm fra kanten til at forhindre musene i at nå dem.
Bemærk: Eksempler på visuelle stikord er almindelig blå firkanter af 262 cm2eller cirkler (diameter på 15,5 cm) fyldt med diagonale lilla striber. - Tilføje ~ 2 g af sengetøj fra muss hjem-bur til indersiden af husly til at tjene som en lokal olfaktoriske cue. Valgfrit, placere en lysemitterende diode (LED) ved indgangen til husly til at give en lokal visuelle landemærke cue.
- For at isolere musen fra eksterne, samle distale visuelle stikord, en ottekantet eller cylindrisk væg, udvide 40 cm over og 15 cm under overfladen, platform, omkring arena, placeret 10 cm fra kanten af platformen.
- Placer en ultralyd højttaler 50 cm over midten af platformen, til at levere afskrækningsmiddel auditive stimuli.
- Sted en gennemsigtig skærm 64 cm over arena på bagsiden-projektet overhead afskrækningsmiddel visuelle stimuli ved hjælp af en projektor.
- Lys, som projektoren vil belyse de adfærdsmæssige apparater; kalibrere den, så der er 5-10 lx midt på platform overfladen. Placer infrarøde lys og et infrarødt kamera over platform, med en lang-pass filter (> 700 nm) at forhindre projektor flimmer i den erhvervede video.
- Spore placeringen af mus online, ved hjælp af enten kommercielt tilgængelige software eller en egnet algoritme. Til sporing sorte mus på en hvid arena, er en simpel tærskel operation efterfulgt af beregningen af maske barycentrum passende.
- Ideelt, Placer apparatet adfærdsmæssige inde en lyd - og lys-bevis for, at forhindre eksterne stikord i påvirker forsøget.
2. levere medfødt afskrækningsmiddel Stimuli
Bemærk: De stimuli, der er beskrevet nedenfor kan være genereret med en bred vifte af forskellige software-pakker, herunder LabVIEW og Matlab.
- Visuelle stimuli
- Projekt stimuli på skærmbilledet placeret 64 cm over arenaen. Stimulus består af et lineært ekspanderende mørk cirkel på en grå baggrund22 (Weber kontrast =-0.98, luminans = 7,95 cd/m2).
Bemærk: Den standard cirkel bør ideelt set være centreret direkte over placeringen af musen, dækbladene en visuel synsvinkel 2.6° på debut og udvider lineært på 224 ° s over 200 ms 47.4 °, hvor det er op til 250 ms før forskydning. - Når levere den visuelle stimuli, centrere det over med musen. Dette kan opnås enten ved venter indtil musen passerer gennem en pre-defineret region i arena eller ved tracking mouse placeringen online og ved hjælp af sporing koordinater til at definere midten af cirklen.
Bemærk: Selvom vi foreslår, at projicere den visuelle stimuli direkte over musen, defensiv adfærd kan også være fremkaldt hvis den samme stimulus forventes foran musen (mens stadig parallelt med gulvet). Vores erfaring er dette tilfældet i det mindste indtil 30 cm foran den mus holdning.
- Projekt stimuli på skærmbilledet placeret 64 cm over arenaen. Stimulus består af et lineært ekspanderende mørk cirkel på en grå baggrund22 (Weber kontrast =-0.98, luminans = 7,95 cd/m2).
- Auditive stimulus
- Udløse en stimulus, bestående af et tog af tre frekvens-moduleret op-fejer fra 17 til 20 kHz23 over 3 s, varig 9 s i alt. Lydtrykket (SPL), målt på platform niveauet, bør være i et område mellem 73 og 78 dB.
- Tilslut et lydkort og en forstærker til ultralyd højttaler placeret over arenaen til at levere den auditive stimulus.
3. dyr:
- Brug mandlige eller kvindelige C57BL/6J mus, mellem 6 og 24 uger gamle. Vedligeholde dyr på en 12-timers lys cyklus med fri adgang til chow og vand.
- Sikre, at musene er enkelt anbragt mindst 72 timer før den adfærdsmæssige analyse og test dem i lys-fase af lys cyklus.
Bemærk: Vi finder, at baseline sonderende funktionsmåden for single-opstaldet mus er mere sammenlignelige på tværs af dyr end på tværs af opstaldes mus. Derudover dyr med kirurgiske implantater til neurale aktivitet optagelse eller manipulation ofte skal være enkelt opstaldet, og det kan derfor være gavnligt at have kontrol datasæt i de samme boligforhold.
4. standard adfærdsmæssige Assay:
- Grundigt rengøre overfladen på platformen med 70% ethanol eller eddikesyre til at fjerne uønskede olfaktoriske stikord. Skyl shelter med vand og vask det med 70% ethanol, hvorefter det bør skylles med vand igen for at mindske ethanol lugt.
- Tør både platformen og shelter grundigt, så musen kan undgå at indtaste ly, hvis det er vådt.
- Randomisere placering af ly i platformen for hvert forsøg af roterende platform før forsøget. Skjul placering vil være forankret i arenaen men vil være roteret i forhold til adfærdsmæssige apparater kabinet.
- Bringe musen til eksperiment rum i sit hjem-bur og bur på test-platformen for en 10 min akklimatisering periode.
- Fjerne musen fra sit hjem-bur og undgå hentning af halen: enten cup det eller lade den klatre op på en berigelse vare, der kan løftes. Picking mus i halen har været Vis for at øge angst niveauer og dermed kan påvirke adfærdsmæssige reaktioner for at trussel24.
- Forsigtigt Placer musen på midten af arenaen og starte video-erhvervelse.
- Mulighed for en 7 min tilvænning periode, hvor ingen afskrækningsmiddel stimulus er præsenteret. Sikre, at musen har tid nok til at finde og indtaste ly mindst én gang. Betragte det som en post, hvis alle fire lemmer er inde i indkapslingen. 7 min burde være nok for de fleste af mus til at finde og indtaste ly, men hvis dette ikke sker, forlænge perioden tilvænning af yderligere perioder på 5 min. indtil mindst én indgang er blevet verificeret.
- Udløse levering af afskrækningsmiddel stimulus (auditive eller visuelle) enten manuelt ved at observere på live video feed, eller automatisk ved tracking placeringen af dyret online og forhånd definere en region af interesse i arenaen for at udløse stimulus-levering når dyret når det. Den visuelle stimuli er normalt leveret direkte over dyret ved hjælp af online video tracking koordinater.
- Du kan fremkalde mere end én flugt reaktion i samme session, lad musen frivilligt forlader krisecentret. Hvis musen ikke slippe med held hen til Skjul efter den sidste afskrækningsmiddel stimulus, vent mindst 60 s forelægge en anden stimulus.
- Når analysen er færdig, skal du returnere dyret til sit hjem-bur. I tilfælde af yderligere afprøvning af samme mus er påkrævet, skal du vente mindst 48 timer før efterprøvning.
- Ren platformen og læ som beskrevet i trin 4.1 og 4.2 før testning næste dyret.
Bemærk: Trin 5, 6 og 7 er uafhængige variationer af den standard adfærdsmæssige assay og hver kan udføres individuelt.
«5» navigation strategi» adfærdsmæssige Assay:
Bemærk: Målet med denne analyse er at afgøre, hvilke køindikatorer mus bruger til at guide undslippe adfærd. I denne analyse drejes den bevægelige ydre del af platformen mens musen er på byens faste arena, som radialt fortrænger ly, de olfaktoriske stikord placeret inde i ly og de proksimale visuelle stikord knyttet til platformen. Hvis musen er efter nogen af de signaler, der er roteret for at navigere hen til Skjul, det korrekt vil flygte til den nye placering i læ, men hvis det bruger andre stikord, der er forblevet på plads, det vil gå til den tidligere husly placering.
- Udfør trin 4.1 til 4,8 af den standard adfærdsmæssige assay beskrevet ovenfor, fremkalde mindst én flyvning svar til at blive anvendt som baseline.
- Lad musen aktivt forlade ly og vente på at navigere til den centrale del af platformen. Placer en lille skål med sengetøj midt opmuntre udforskning og holde dyret i den centrale platform længe nok til at give mulighed for rotation af den ydre del af platformen. Tilføje parabol og sengetøj, mens musen er inde i ly og efter den succesfulde flugt der går forud for rotation af platformen. Hvis musen ikke indtaste ly under flugt reaktion, vente på at frivilligt Angiv ly og derefter tilføje parabol og sengetøj.
- Bruge stepper motor til at rotere platform mindst 36 grader (2 huller) og derefter straks bruge en sensorisk stimulus for at fremkalde en flugt reaktion. Det er muligt, at rotationen udløser en overraske og endda indleder en flugt reaktion.
Bemærk: Fra vores erfaring, ~ 55% af musene vil køre uden for det centrale (ikke-roterende) platform mens den ydre del stadig dreje, og disse forsøg bør udelukkes fra analysen. - Rengør platform og husly, og returnere musen til sit hjem-bur som beskrevet i trin 4.10 og 4.11.
6. dynamisk miljø adfærdsmæssige Assay:
Bemærk: Dette assay er designet til at evaluere, hvordan mus tilpasse deres defensiv adfærd til pludselige ændringer i miljøet. I disse eksperimenter, efter fremkalde mindst én undslippe svar, placeringen af krisecentret er ændret og musen får lov til at besøge den gang før en efterfølgende flugt reaktion er udløst. Hvis musen perfekt opdaterer den nye placering af ly og beregner manglen læ på sin tidligere placering, bør det flygte til den nye placering. Ellers, enten det har ikke udenad den nye placering i læ eller det har memoreret begge steder, men foretrækker at flygte til det gamle.
- Udføre denne analyse, efter trin 4.1 til 4,8 beskrevet ovenfor, fremkalde mindst én flyvning svar som en kontrol.
- Når musen frivilligt forlader krisecentret, fjerne ly og re-holdning den i et nyt hul i den modsatte ende af platformen.
- Tillad musen til at udforske miljøet, indtil den træder husly på dens nye placering.
- Når musen frivilligt kommer ud af den skjul, nuværende det med et afskrækningsmiddel stimulus og observere dens svar.
- Bruge den auditive stimulus for dette eksperiment på grund af længere varighed, som under langvarig trussel, dyr kan udføre yderligere undslippe svar til andre steder, hvis de kunne finde ly i første omgang.
- Rengør platform og husly og returnere musen til sit hjem-bur som beskrevet i trin 4.10 og 4.11.
7. ' ingen læ' adfærdsmæssige Assay:
Bemærk: Formålet med denne analyse er at forstå, hvordan manglen på et krisecenter i miljøet påvirker udtryk for defensiv adfærd.
- Tilslut alle 20 huller. I dette eksperiment er der ingen husly til rådighed i arenaen.
- Efter rensning og tørring platform (trin 4.1 og 4.2), udføre trin 4,4-4,6.
- Tillade en 7 min tilvænning periode.
- Præsentere den visuelle stimuli og observere de defensive svar. Manglen på et krisecenter fremmer indefrysning adfærd, normalt varig for varigheden af den visuelle stimuli. Bruge en langsomt voksende spot (fx. en cirkel, spaender over en visuel synsvinkel 2.6 ° på debut og udvider lineært på 11.2 ° s over 4 s til 47.4 °, hvor det stadig for 1 s før forskydning) at lette observation af frysning svar.
- Hvis der kræves mere end ét svar pr. musen, bruge en Inter stimulus interval på mindst 60 s.
- Efter at opnå det nødvendige antal svar i mangel af husly, indføre ly under et af hullerne og lad musen udforske miljøet i mindst 5 min. vil 5 min være tid nok til de fleste mus til at finde og indtaste den nyindførte ly , men, hvis dette ikke sker, forlænge denne periode med yderligere 5 min blokke indtil mindst én post er bekræftet.
- Gentag trin 4.8 og 4.9, og observere undslippe svar udført i overværelse af et krisecenter i miljøet.
- Rengør platform og husly og returnere musen til sit hjem-bur som beskrevet i trin 4.10 og 4.11.
8. dataanalyse:
Bemærk: Hver af de følgende data analyse trin kan udføres uafhængigt.
- Undslippe svar hen kan let identificeres som en pludselig acceleration efter præsentationen af et afskrækningsmiddel stimulus. Kvantificere ventetid at undslippe som tiden mellem stimulus præsentation og enten begyndelse en hoved drejning bevægelse rettet mod målet for at undslippe eller begyndelsen af acceleration bevægelse, hvad der kommer først.
- Frysning svar kan karakteriseres ved total immobilitet af dyr med undtagelse af vejrtrækning bevægelser25, varig mindst 0,5 s7. Måle ventetid til at fryse som tiden mellem præsentation af afskrækningsmiddel stimulus og immobilitet periodens begyndelse.
- For hvert enkelt svar for flugt, kvantificere lineariteten af flyvevejen ved beregning af forholdet mellem afstanden mellem musen og ly og det faktiske deplacement under flyvningen.
- For hver undslippe svar, skal du beregne nøjagtigheden ved at måle afstanden mellem hullet hvor dyret instrueret sin flyvning til og hullet fører til læ. Da der er 20 huller, hvert hul væk fra målet repræsenterer en faldende på 10% i nøjagtighed (fx., 2 huller ud mål kan udtrykkes som 80% nøjagtighed)
- «Navigation strategi» adfærdsmæssige assay, kvantificere nøjagtigheden af svar i forhold til læ sted før platform rotation. En gennemsnitlig nøjagtighed, der ikke er signifikant forskellig fra før rotation nøjagtighed angiver, at dyret ikke bruger nogen af de sensoriske stikord, som var roteret for at navigere til flugt destination.
- 'Dynamisk miljø' adfærdsmæssige assay, klassificere hver flugt reaktion fremkaldt som rettet mod den nye eller den gamle husly placering, eller at ingen af dem. Evaluere, hvordan mønsteret udvikler langs gentagelser af de elicited defensive adfærd.
- Til 'ingen læ' adfærdsmæssige assay, sammenligne den mus hastighed efter præsentationen af afskrækningsmiddel visuelle stimuli i tilstedeværelse og fravær af et krisecenter og beregne ventetid til indledningen af den defensive svar. Desuden beregne sandsynligheden for udløser en indefrysning svar i svar på stimulus for hver situation.
Representative Results
Mus udsættes for auditive eller visuelle stimuli indledt hurtig flugt svar med kort ventetid mellem udbrud af stimulation og indledningen af en flyvning. Den gennemsnitlige ventetid til at flygte fra den visuelle stimuli var 202 ± 16 ms (n = 51 svar fra 26 dyr) og betydeligt længere tid for auditive stimulation: 510 ± 61 ms (n = 36 svar fra 15 dyr, p< 0.0001 t-test mellem visuelle og auditive stimulation; Figur 2A) (trin 8.1). Undslippe svar var præcist rettet til læ (betyde nøjagtighed for visuelle stimuli: 97.2 ± 1,4% og 95.0 ± 1,4% for auditive stimulus, ikke signifikant forskellig mellem de to typer af stimuli, p = 0.1655 t-test; Figur 2B) (trin 8.4), og flight baner var tæt på en lige linje (gennemsnitlig ratio af fordrivelse med afstand til ly for visuelle stimuli 107.3 ± 1,3% og 113.9 ± 1,5% for auditive stimulus; Figur 2 c) (trin 8.3). Observere en kort ventetid fra stimulus er vigtigt at skelne mellem stimulus-fremkaldte adfærd fra homing løber, og en høj linearitet flyvning bane viser at undslippe svar har målet om at nå Skjul, og ikke blot at flytte væk stimuli.
Stimulus præsentation efter rotation af den udvendige del af labyrinten mens musen var stationær i center platform (range = 36° - 90°, gennemsnit 56°) med held fremkaldte undslippe svar (trin 5). Alle mus flygtede mod den tidligere placering af husly, med noget fald i nøjagtighed og linearitet flyvning bane i forhold til forsøg før rotation. Den gennemsnitlige nøjagtighed, målt i forhold til den oprindelige husly holdning, var 96,3 ± 1,3% før rotation (n = 25 Reaktionerne fra 8 mus) og endda lidt højere efter rotation (100 ± 0%, p = 0,009 t-test mellem pre og post rotation). Den gennemsnitlige linearitet i forhold til den oprindelige husly placering var 109.4 ± 5,0% før rotation (25 Reaktionerne fra 8 mus) og 109.1 ± 2,1%, efter rotation (n = 8 svar fra 8 mus), p = 0.957 t-test mellem præ- og post rotation, figur 3A og B). Disse resultater viser, at proksimale visuelle stikord ikke bruges til at guide flyrejse hen til Skjul (trin 8.3-8,5).
Ændre placeringen af Skjul efter fremkalde et vellykket flugt svar (trin 6) resulterede i mus besøger det nye læ sted kort efter ændringen (Gennemsnitlig tid til at besøge den nye læ = 33.1 s, range = 4-82 s). Efterfølgende sekventielle forsøg med sund stimulation produceret en gradvis stigning i sandsynligheden for at undslippe til den nye placering (44,4% på den første retssag), nåede 100% på tværs af alle dyr af den femte retssag (n = 9 dyr, figur 3 c). Disse eksperimenter sonde dynamikken i opdatering husly placering hukommelse til at tilpasse sig ændringer i miljøet (trin 8.6).
Efter løbet 7 min akklimatisering til labyrint med ingen læ (trin 7) præsentation af en 5 s længe visuelle stimuli produceret indefrysning adfærd i stedet for at flygte (frysning sandsynlighed = 95.2%, betyder frysning tid = 7,9 ± 2.7 s, n = 7 dyr). Efterfølgende indførelsen af et krisecenter i den samme session og præsentationen af den lange visuelle stimulus fremkaldte undslippe svar pålideligt, viser, at mus fleksibelt kan skifte defensive strategier afhængig af tilstedeværelsen af tilflugt (figur 3D) ( trin 8,1 og 8.7).
Figur 1: skematisk af arenaen adfærdsmæssige. Tegning af de vigtigste komponenter i den adfærdsmæssige arena set fra toppen (højre) og fra den side (venstre). En stor del af platformen kan roteres, herunder ly og de tilknyttede visuelle stikord. Mørke rande i den øverste visning er hullerne som ly kan knyttes til alle identiske (et eksempel husly placering er angivet). Hele arenaen er omsluttet af en lyd-dæmpning kabinet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: undslippe svar er hurtig og præcis målrettet adfærd. (A) ventetid undslippe udbrud fra starten af visuelle eller auditive stimulation. B rigtigheden af navigation til læ under flugt, måles således, at værdien er 100% hvis musen løber direkte hen til Skjul, og 10% mindre for hvert hul fra ly (fx., 80%, hvis hullet nåede først var to huller fra den berigtige sig). (C) forskydning af musen under flugt plottes den lineære afstand mellem dyrets oprindelige holdning og destinationsplaceringen, viser, at flyvning er tæt på lineær. Vises data fra 10-90 percentilen boks og knurhår og de resterende datapunkter er vist som cirkler. Rød farve parceller er data fra auditory stimulation (n = 36 svar fra 15 dyr) og sort er fra visuel stimulation (n = 51 svar fra 26 dyr). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mus bruger ikke proksimale visuelle stikord eller husly-relaterede stikord til at guide undslippe svar. (A) forskydning plot som i figur 2 c, for de svar før og efter rotation af platformen. B rigtigheden af navigation under flugt i præ- og post rotation betingelser. Efter rotation nøjagtighed måles i forhold til den oprindelige placering af ly, og viser, at musene navigere tilbage til den oprindelige placering, husly i stedet den nye position. (C) brøkdel af undslippe svar rettet mod den nye læ placering plottes stimulation nummer. Efter de 5th præsentation af stimulus, alle dyrene undslippe direkte mod den nye læ placering (n = 9 dyr). (D) mener hastighed på tværs af dyr i svar til visuel stimulation med en shelter tilgængelige (rød) eller fraværende (blå), viser flugt og frysning svar, henholdsvis. Hastighed er blevet normaliseret til baseline og justeret til reaktionstid (defineret som enten begyndelse en flyvning eller frysning svar, stiplet linje). Skyggefulde områder viser SEM. (n = 7 dyr). 2A og 2B, boks og whiskers vise data fra 10-90 percentilen og de resterende datapunkter er vist som cirkler. Rød farve parceller er data fra auditory stimulation før platform rotation (n = 25 Reaktionerne fra 8 dyr) og blå er fra svar efter roterende platform (n = 8 svar fra 8 dyr). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Assays vi beskrive her er teknisk ligetil at udføre, og med undtagelse af platformen kan rotation eksperimenter, let gennemføres i en standard Barnes labyrint. Ikke desto mindre et par komplikationer kan opstå: på den ene side musen kan synes bange for at indtaste shelter, der ikke kan på grund af husly er tilstraekkeligt rengøres eller tørret. På den anden side kan musen holde inde i ly for meget lange perioder. Det er afgørende for disse eksperimenter, at dyr er aldrig fjernet fra ly manuelt, da dette kan forstyrre stien integration samt nød dyrene og ændre deres reaktion på truslen. Vi foreslår afslutter eksperimentet efter 90 min og efterprøvning efter 48 h, hvis nødvendigt. En anden relevante praktiske overvejelse er, at når musen undersøger kanten af platformen, det ikke kan afsløre visuelle stimuli hvis hovedet er vinklet over kanten, og dermed anbefaler vi tilbageholde stimuli i sådanne situationer. Derudover kan mus hoppe ned fra platformen ved sjældne lejligheder. Foreslår vi slutter eksperimentet og efterprøvning efter 48 h. mus, der aktivt forlader perronen engang er tilbøjelige til at gøre det igen fremover og muligvis blive udelukket fra undersøgelsen. Endelig, fra vores erfaring, de fleste mus vil reagere på den visuelle stimuli (34/36 mus). Men hvis musene ikke viser nogen form for reaktion på den visuelle stimuli (enten en overraske, en flyvning eller en indefrysning svar), de bør udelukkes fra undersøgelsen.
Et vigtigt punkt at overveje er, at kontrol af sensoriske signaler er typisk et problem i rumlig hukommelse assays, så ofte det er svært at fjerne alle mulige kilder til forurenende stikord. Vores eksperimentel opsætning reducerer eksterne visuelle signaler ved at omgive labyrint med en mur, og det er placeret inde i et lyd-dæmpning kabinet til lydisolerende. For at minimere olfaktoriske stikord, anbefaler vi grundigt rengøring set-up med 70% ethanol eller eddikesyre mellem eksperimenter.
Vores adfærdsmæssige assay tilføjer til tidligere metoder til at studere rumlige navigation26 ved hjælp af instinktiv defensiv adfærd for at sonde rumlig hukommelse og fokusere på etologiske scenarier. En afgørende forskel mellem de procedurer, der er beskrevet her, og den standard BM assay er manglen på uddannelse sessioner. I vores assays sikrer perioden tilvænning, at musen besøg husly mindst en gang og ofte mange gange mere, som vi tidligere har vist sig for at være tilstrækkelig til at huske læ sted2. Vi mener, at en vigtig årsag til den høje succesrate og nøjagtighed i at finde husly på trods af manglende uddannelse aldrig passivt fortrænger dyret under eksperimentet, hvilket gør stien integration en levedygtig navigation strategi. Vi Bemærk dog at vores analyse beskæftiger sig med hukommelse dannet og vurderet i en enkelt session, og at vi ikke har testet for langtidshukommelse af husly placering, som normalt er formålet med standard BM eksperimenter. Endelig, ved hjælp af diskrete medfødt afskrækningsmiddel stimuli i stedet for almindeligt anvendte fan eller buzz for varigheden af sessionen, vores analyse giver meget god eksperimentelle kontrol over to opførsel, der muligvis bruger forskellige navigation strategier: fouragering og ly-instrueret undslippe. Vi mener, at brugen af disse assays i kombination med moderne neurovidenskab teknikker til optagelse og manipulere neurale aktivitet kan give vigtig indsigt i hvordan neurale kredsløb beregne adfærd.
Disclosures
De fleste af de data, der er inkluderet i afsnittet resultater er en delmængde af oplysningerne i Vale et. al 2017.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en Wellcome Trust/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z), en medicinsk forskning Rådet (MRC) give MC-UP-1201/1, Wellcome Trust og Gatsby Charitable Foundation SWC Fellowship (til T.B.), MRC PhD Studentship (D.E. og R.V) og en Boehringer Ingelheim Fonds ph.d.-stipendium (til R.V). Vi takker Kostas Betsios for programmering data erhvervelse software, LMB mekaniske og elektriske Workshops for at opbygge den eksperimentelle arena.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared iluminators TV6700 | Abus | - | |
| DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
| Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | - | |
| Amplifier QTX PRO240 | QTX | - | |
| Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
| HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
| 100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
| Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
| National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
| LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | - | |
| Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | - |
References
- Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J Exp Biol. 66 (1), 65-81 (1977).
- Vale, R., Evans, D. A., Branco, T. Rapid Spatial Learning Controls Instinctive Defensive Behavior in Mice. Curr Biol. 27 (9), 1342-1349 (2017).
- Blanchard, R. J., Flannelly, K. J., Blanchard, D. C. Defensive behavior of laboratory and wild Rattus norvegicus. J Comp Psychol. 100 (2), 101-107 (1986).
- Dill, L. M., Houtman, R. The influence of distance to refuge on flight initiation distance in the gray squirrel (Sciurus carolinensis). Canadian Journal of Zoology. 67 (1), 233-235 (1989).
- Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Rodgers, J., Weiss, S. M. The characterization and modelling of antipredator defensive behavior. Neurosci Biobehav Rev. 14 (4), 463-472 (1990).
- Fanselow, M. S., Lester, L. S. A functional behavioristic approach to aversively motivated behavior: Predatory imminence as a determinant of the topography of defensive behavior. Evolution and learning. , (1988).
- De Franceschi, G., Vivattanasarn, T., Saleem, A. B., Solomon, S. G. Vision Guides Selection of Freeze or Flight Defense Strategies in Mice. Curr Biol. 26 (16), 2150-2154 (2016).
- Bräcker, L. B., et al. Essential role of the mushroom body in context-dependent CO 2 avoidance in Drosophila. Current Biology. 23 (13), 1228-1234 (2013).
- Ghosh, D. D., et al. Neural architecture of hunger-dependent multisensory decision making in C. elegans. Neuron. 92 (5), 1049-1062 (2016).
- Bellman, K. L., Krasne, F. B. Adaptive complexity of interactions between feeding and escape in crayfish. Science. 221 (4612), 779-781 (1983).
- Rodgers, W., Melzack, R., Segal, J. "Tail flip response" in goldfish. Journal of comparative and physiological psychology. 56 (5), 917 (1963).
- Dill, L. M. The escape response of the zebra danio (Brachydanio rerio) II. The effect of experience. Animal Behaviour. 22 (3), 723-730 (1974).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Physiol Psychol. 93 (1), 74-104 (1979).
- Pompl, P. N., Mullan, M. J., Bjugstad, K., Arendash, G. W. Adaptation of the circular platform spatial memory task for mice: use in detecting cognitive impairment in the APP(SW) transgenic mouse model for Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 87 (1), 87-95 (1999).
- Patil, S. S., Sunyer, B., Höger, H., Lubec, G. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze. Behavioural Brain Research. 198 (1), 58-68 (2009).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. , (2007).
- Attar, A., et al. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8 (11), e80355 (2013).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learn Mem. 13 (6), 809-819 (2006).
- Leary, T. P., Brown, R. E. The effects of apparatus design and test procedure on learning and memory performance of C57BL/6J mice on the Barnes maze. J Neurosci Methods. 203 (2), 315-324 (2012).
- Mittelstaedt, M. -L., Mittelstaedt, H. Homing by path integration in a mammal. Naturwissenschaften. 67 (11), 566-567 (1980).
- Stackman, R. W., Golob, E. J., Bassett, J. P., Taube, J. S. Passive transport disrupts directional path integration by rat head direction cells. J Neurophysiol. 90 (5), 2862-2874 (2003).
- Yilmaz, M., Meister, M. Rapid innate defensive responses of mice to looming visual stimuli. Curr Biol. 23 (20), 2011-2015 (2013).
- Mongeau, R., Miller, G. A., Chiang, E., Anderson, D. J. Neural correlates of competing fear behaviors evoked by an innately aversive stimulus. J Neurosci. 23 (9), 3855-3868 (2003).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Paylor, R., Tracy, R., Wehner, J., Rudy, J. W. DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning. Behavioral neuroscience. 108 (4), 810 (1994).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203 (2), 151-164 (2009).
