Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Verhalten-Assay, basierend auf dem Barnes Labyrinth-Test, wie instinktiv Defensive studieren werden Aktionen durch die Kenntnis der räumlichen Umwelt geändert.
Abstract
Evolution hat ein Repertoire von defensive Verhaltensweisen ausgewählt, die über alle Tierarten überlebenswichtig sind. Diese Verhaltensweisen sind oft Stereotype Aktionen als Reaktion auf angeborene aversive sensorische Reize ausgelöst, sondern ihren Erfolg erfordert genügend Flexibilität zur Anpassung an unterschiedliche räumliche Umgebungen, die sich schnell ändern können. Hier beschreiben wir eine Verhaltens-Assay um den Einfluss des erlernten räumlichen Wissens auf defensive Verhaltensweisen bei Mäusen zu beurteilen. Wir haben angepasst, den weit verbreiteten Barnes Labyrinth räumliche Gedächtnis Test um zu untersuchen, wie Mäusen zu einem Schutz während der Flucht Antworten auf angeborene aversive sensorische Reize in einer neuen Umgebung navigieren, und wie sie auf akute Veränderungen in der Umwelt anpassen. Dieser neue Test ist ein ethologischen Paradigma, die erfordert keine Ausbildung und nutzt die natürliche Exploration Muster und Navigation Strategien bei Mäusen. Wir schlagen vor, dass die Reihe von Protokollen, die hier beschrieben sind ein mächtiges Mittel des Studiums zielgerichtetes Verhalten und Reiz ausgelöste Navigation, die vom Interesse zu den Bereichen instinktiven Verhaltensweisen und räumliche Gedächtnis sind.
Introduction
Instinktive defensive Verhaltensweisen gelten weitgehend als Hardwired Reiz-Reaktionen, wie z. B. der C-Start-Bewegung in Fische und Amphibien, die das Tier Weg von einer Bedrohung Quelle1bewegt sich. Defensive Verhaltensweisen kann jedoch anpassungsfähiger, wenn sie flexibel, Account-Informationen über die aktuelle Umgebung gelernt berücksichtigen. Ein Beispiel für eine solche Flexibilität ist der Wechsel von Flucht zum Einfrieren durch Nagetiere angesichts der Bedrohung, je nach Vorwissen über das Vorhandensein oder Fehlen von einem Tierheim in der Umgebung2,3gezeigt. Weitere Beispiele für Flexibilität bei der angeborenen Verhaltensweisen umfassen, Anpassung der Flug Einleitung Schwellenwerts oder Geschwindigkeit abhängig von der Entfernung zwischen Beute und seinen Unterschlupf4zu entkommen, Entfernung zum Bedrohung5,6, und frühere Erfahrung 11 , 12, sowie verschiedene defensive Strategien abhängig von den sensorischen Eigenschaften des aversiven Reiz7auswählen oder sogar unterdrücken Abwehrverhalten angesichts konkurrierender Motivationen wie Hunger8, 9,10. Die Abhängigkeit der Aktion Auswahl auf erworbenen Kenntnisse über die räumlichen Eigenschaften der Umwelt macht instinktiven defensive Verhaltensweisen bei Mäusen ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung Ziel Auswahl, räumliche Gedächtnis und Navigation. Hier beschreiben wir die Anpassung eines häufig verwendeten behavioral Tasks, die Barnes Labyrinth (BM) räumliche Gedächtnis assay13, um den Einfluss der räumlichen Umwelt auf defensive Aktion Auswahl bei Mäusen und ihre Navigation-Strategien bei auf der Flucht in Richtung einen Unterschlupf.
Das standard Barnes Labyrinth genutzt, um lernen und das räumliche Gedächtnis bei Mäusen untersuchen besteht aus einer kreisförmigen ~ 90 cm Durchmesser Plattform mit 20 gleichmäßig angeordneten Löchern, von denen 19 sind geschlossen, und man führt zu einem unterirdischen Unterschlupf die Mäuse zu suchen, um das Öffnen-Feld zu vermeiden Umfeld der Plattform. Oft sind schwach aversive Reize (Summer, helles Licht, Ventilator) kontinuierlich verwendet während des Tests zu machen die Umwelt aversive und fördern so die Einreise in das Tierheim14. In den am häufigsten verwendeten Assay15,16hat das Tier eine Gewöhnung Studie wo es ins Tierheim manuell durch den Experimentator orientiert sich unmittelbar nach der auf der Plattform positioniert. Dies ist gefolgt von einer 4-tägigen Erwerb Periode, wo jeden Tag, die die Maus darf frei Navigieren in das Labyrinth für 3 min, nach denen es manuell wieder ins Tierheim orientiert sich wenn es es nicht während der Exploration Periode erreicht. Die letzte Etappe des Assays ist eine Sonde Versuch am 5ten Tag (obwohl eine sieben-Tage-Langzeitgedächtnis Testversion auch allgemein durchgeführt wird), wenn das Tier das Labyrinth mit alle Löcher geschlossen untersucht. Lern- und Langzeitgedächtnis werden quantifiziert durch die Zeit, um Schutz und stochert in die falschen Löcher während der Akquisition zu finden und durch die Zeit, in der Nähe der geschlossenen unterstand Loch in der Sonde Versuch. Typische Ergebnisse zeigen einen Rückgang der Anzahl von Fehlern und Latenz, Tierheim während der Akquisition zu erreichen und eine über Chance Anteil der Zeitaufwand im Quadranten mit der geschlossenen Ziel Loch in der Sonde Versuch15.
Während mehrere Varianten des BM-Assays zuvor beschriebenen17,18,wurden hat19, das Paradigma, die wir hier beschreiben drei grundlegende Änderungen gegenüber der standard-Test. Zuerst das Tier bleibt das Labyrinth zu erkunden und finden Zuflucht auf eigene und Prüfung erfolgt in der gleichen Sitzung, kurz nachdem das Tierheim, während Perioden gefunden wurde wo das Tier exploratives Verhalten beteiligt ist. Obwohl diese Einstellung nicht Langzeitgedächtnis des Standortes Tierheim getestet wird, soll es eine naturalistische Szenario sein, die die Erforschung von neuartigen Gebiet, unter Androhung von Raub imitiert. Darüber hinaus ermöglicht es testen wie Tiere auf akute Veränderungen im Umfeld, wie plötzliche Veränderungen in der Landschaft anpassen. Zweitens ist ein zentraler Aspekt unserer Assay, dass der Experimentator nie zwingt das Tier innerhalb oder außerhalb des Schutzes, die das Tier zu verwirren und Pfad Integration20 als eine brauchbare Navigation Strategie21ausschließen kann. Pfad-Integration ist eine Navigation-Strategie, die nutzt Eigenbewegung Hinweise wie propriozeptive und vestibuläre Signale aus der Integration der motor Abfluss zu aktualisieren die aktuelle Position des Tieres und Navigieren auf ein Ziel, was nicht möglich ist wenn die Tier wird durch den Experimentator passiv bewegt. Drittens setzen wir angeboren aversive visuelle22 und auditive23 Reize Flucht ins Tierheim, zu entlocken, die leicht von laufenden Futtersuche Verhalten zu unterscheiden und ermöglicht die Bewertung und Quantifizierung der Strategien, die spezifische navigation während der Verteidigung von unmittelbar drohende Gefahren. Wir schlagen vor, dieser Assay nützlich ist für sezieren die Rolle des räumlichen Gedächtnisses in der Auswahl und Umsetzung der defensive Verhaltensweisen und mehr im Allgemeinen, je breiter, zielgerichtete Navigation und räumliche Kurzzeitgedächtnis studieren. Die hier beschriebenen Protokolle wurden von Vale Et al.eingeführt. im Jahr 2017, auf die wir die Leser für mehr in die Tiefe Diskussion über die Gründe für Experimente und Ergebnisse verweisen.
Protocol
Alle Versuche wurden unter dem UK Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act von 1986 (PPL 70/7652) nach lokalen ethischen Genehmigung durchgeführt.
1. Einrichten das Behavioral Gerät
Hinweis: Die Hauptkomponente des Verhaltens Apparats ist eine Variante des Barnes Labyrinth13 bestehend aus ein weißes Acryl runden Podest (92 cm Durchmesser) mit gleichem Abstand 20, 5 cm Durchmesser, runde Löcher, radial, befindet sich 5 cm vom Rand der Plattform . 19 davon sind mit schwarzen Kunststoff-Stecker (5 mm tief), geschlossen werden, während die andere Öffnung führt zu einem schwarzen Plexiglas-Schutz (Abmessungen 15 x 5,8 x 4,7 cm), die Mäuse leicht betreten und verlassen können. Der zentrale Bereich der Arena besteht aus einer festen runden Plattform (22 cm im Durchmesser) und die Peripherie ist montiert auf einem Gestell, der über 360 Grad Drehung durch ein computergesteuertes Schrittmotor erlaubt. Die Plattform ist erhöhte 45 cm über dem Boden zu verhindern, dass die Mäuse Klettern hinunter. Schematische Zeichnung in Abbildung 1zu sehen.
- Fügen Sie visuelle Hinweise an den Rand der Plattform (2D oder 3D Symbole mit verschiedenen Formen, Farben und Mustern), mindestens 2 cm vom Rand zu verhindern, dass Mäuse sie zu erreichen.
Hinweis: Beispiele für visuelle Hinweise sind schlichte blaue Quadrate von 262 cm2oder Kreise (Durchmesser 15,5 cm) gefüllt mit Diagonalstreifen violett. - Zugeben Sie ~ 2 g Einstreu aus der Maus zuhause-Käfig an der Innenseite des Tierheims, dienen als lokale olfaktorische Cue. Positionieren Sie optional eine Leuchtdiode (LED) am Eingang des Tierheims zu einem Wahrzeichen visuelle Cue.
- Um die Maus von außen zu isolieren, montieren distale visuelle Hinweise, eine achteckige oder zylindrische Wand, Verlängerung 40 cm oben und 15 cm unter der Oberfläche der Plattform, um die Arena, 10 cm vom Rand der Plattform zu positionieren.
- Positionieren Sie einen Ultraschall-Lautsprecher 50 cm oberhalb der Mitte der Plattform, aversive auditive Reize zu liefern.
- Platzieren Sie eine durchscheinende Leinwand 64 cm oberhalb der Arena auf Rückseite-Projekt Aufwand aversive visuelle Reize mit einem Projektor.
- Das Licht vom Projektor leuchtet die Verhaltensstörungen Apparat; Damit gibt es 5-10 lx in der Mitte der Plattform Oberfläche zu kalibrieren. Infrarot-Licht und einer Infrarot-Kamera über der Plattform mit einem Long-Pass-Filter zu platzieren (> 700 nm), Projektor Flimmern im erworbenen Video zu verhindern.
- Verfolgen Sie die Position der Maus online, mit im Handel erhältlichen Software oder ein geeigneter Algorithmus. Für tracking-schwarze Mäuse auf eine weisse Arena, ist eine einfache Schnittstellenüberwachung Operation gefolgt von Berechnung der Maske Zentroid geeignet.
- Idealerweise platzieren der behavioral Apparat in einer schallisolierten und Licht Box zu verhindern, dass externe Signale beeinflusst das Experiment.
2. Bereitstellung von Haus aus Aversive Reize
Hinweis: Die unten beschriebenen Reize können mit einer breiten Palette von verschiedenen Software-Paketen, einschließlich LabVIEW und Matlab generiert werden.
- Visuelle Reize
- Projizieren Sie die Reize auf dem Bildschirm positioniert 64 cm über der Arena. Der Reiz besteht aus einer linear wachsenden dunklen Kreis auf einem grauen Hintergrund22 (Weber Kontrast =-0.98, Luminanz = 7,95 cd/m2).
Hinweis: Die standard Kreis sollte idealerweise direkt über die Position der Maus, gegenüberliegende Gesichtswinkel von 2,6 ° zu Beginn zentriert werden und erweitert linear bei 224 ° / s mehr als 200 ms auf 47,4 °, bei denen es für 250 ms vor Offset bleibt. - Bei der visuellen Stimulus, zentrieren Sie ihn über die Maus. Dies kann erreicht werden, indem er wartet, bis die Maus durchläuft einen vordefinierten Region in der Arena, oder durch die Verfolgung der Position des Mauszeigers online und unter Verwendung der Tracking-Koordinaten, um die Mitte des Kreises zu definieren.
Hinweis: Obwohl wir projizieren die visuelle Reize direkt über die Maus nahe, dann können defensive Verhaltensweisen auch ausgelöst werden wenn der gleiche Reiz vor der Maus (während noch parallel zum Boden) projiziert wird. Nach unserer Erfahrung ist dies der Fall mindestens bis 30 cm vor die Mausposition.
- Projizieren Sie die Reize auf dem Bildschirm positioniert 64 cm über der Arena. Der Reiz besteht aus einer linear wachsenden dunklen Kreis auf einem grauen Hintergrund22 (Weber Kontrast =-0.98, Luminanz = 7,95 cd/m2).
- Auditiven Reiz
- Lösen einen Anreiz, bestehend aus einem Zug drei Frequenz moduliert Up-Sweeps von 17 bis 20 kHz23 über 3 s, Dauer 9 s insgesamt. Der Schalldruckpegel (SPL), gemessen an der Bahnsteigebene sollte in einem Bereich zwischen 73 und 78 dB.
- Verbinden Sie eine Soundkarte und einen Verstärker mit der Ultraschall-Lautsprecher oberhalb der Arena, die auditive Impulse liefern.
(3) Tiere:
- Verwenden Sie männlich oder weiblich C57BL/6J Mäuse, zwischen 6 und 24 Wochen alt. Pflegen Sie die Tiere auf ein 12 h Licht mit freiem Zugang zu Chow und Wasser-Zyklus.
- Stellen Sie sicher, dass die Mäuse single sind mindestens 72 Stunden vor der Verhaltens-Assay und Test während der Licht-Phase des Lichts Zyklus untergebracht.
Hinweis: Wir finden, dass die Grundlinie exploratives Verhalten von Mäusen Einzelzimmer untergebracht vergleichbarere über Tiere als über Mäuse Gruppe untergebracht. Darüber hinaus müssen Tiere mit chirurgischen Implantaten für die neuronale Aktivität Aufnahme oder Manipulation oft single zu sein untergebracht, und es kann daher nützlich sein, Kontrolle Datasets in der gleichen Wohnverhältnisse haben.
4. standard Verhaltens Assay:
- Reinigen Sie sorgfältig die Oberfläche der Plattform mit 70 % Ethanol oder Essigsäure, unerwünschte olfaktorische Signale zu entfernen. Spülen Sie Tierheim mit Wasser und waschen Sie ihn mit 70 % Ethanol, danach sollte es mit Wasser wieder zu Ethanol Geruch vermindern gespült werden.
- Trocknen Sie die Plattform und das Tierheim gründlich, da die Maus vermeiden kann, das Tierheim zu betreten, wenn es nass ist.
- Randomisieren Sie die Lage des Tierheims in der Plattform für jeden Versuch durch Drehen der Plattform vor dem Experiment. Die Tierheim Lage wird in der Arena verankert sein, aber in Bezug auf das behavioral Apparat Gehäuse gedreht werden.
- Bringen Sie die Maus zum Experiment Raum in seinem Haus-Käfig und legen Sie den Käfig auf der Testplattform für ein 10 Minuten Eingewöhnungszeit.
- Entfernen Sie die Maus aus seinem Haus-Käfig und vermeiden Sie am Schwanz abrufen: Tasse es oder lassen Sie es auf eine Bereicherung zu steigen, die angehoben werden können. Kommissionierung Mäuse am Schwanz wurde zeigen, um Angst zu erhöhen und somit Verhaltensreaktionen um24Bedrohung beeinflussen kann.
- Sanft platzieren Sie den Mauszeiger in die Mitte der Arena, und starten Sie die Video-Übernahme.
- Ermöglichen Sie einen 7 min Gewöhnung Zeitraum, während, den keine aversiven Reiz präsentiert wird. Sicherstellen Sie, dass die Maus genügend Zeit hat zu finden und geben mindestens einmal im Tierheim. Betrachten Sie es als einen Eintrag, wenn sich alle vier Gliedmaßen im Tierheim befinden. 7 min. sollten ausreichen, für die Mehrheit der Mäuse zu finden und geben im Tierheim, aber für den Fall, dass dies nicht geschieht, verlängern Sie die Gewöhnung durch zusätzliche Punkte von 5 min bis mindestens ein Eingang überprüft worden ist.
- Lösen Sie die Lieferung des aversiven Stimulus (auditive oder visuelle aus), entweder manuell durch die Beobachtung der live-video-Feed, oder automatisch durch die Verfolgung der Position des Tieres online und vor Festlegung einer Region of Interest in der Arena für die Auslösung von Reiz-Lieferung Sobald das Tier erreicht. Der visuelle Reiz wird in der Regel direkt über das Tier mit dem online-Video tracking-Koordinaten geliefert.
- Um mehr als eine Flucht-Reaktion in der gleichen Sitzung auslösen, lassen Sie die Maus im Tierheim freiwillig zu verlassen. Wenn die Maus nicht erfolgreich ins Tierheim nach den letzten aversiven Reiz, warten Sie mindestens 60 s vor der Präsentation einen anderen Reiz zu entkommen.
- Nachdem der Test abgeschlossen ist, das Tier zurück zu seinem Haus-Käfig. Für den Fall, dass weitere Tests an die gleiche Maus erforderlich ist, warten Sie mindestens 48 h vor der Wiederholung der Prüfungen.
- Reinigen Sie die Plattform und das Tierheim wie unter Punkt 4.1 und 4.2 beschrieben, bevor Sie das nächste Tier testen.
Hinweis: Schritte 5, 6 und 7 sind unabhängige Variationen des standard Verhaltens Assays und jeweils einzeln durchgeführt werden kann.
5. "Navigation-Strategie" Behavioral Assay:
Hinweis: Das Ziel dieses Tests ist festzustellen, welche Signale Mäuse verwenden, um Flucht Verhalten führen. In diesem Test wird der bewegliche äußere Teil der Plattform gedreht, während die Maus auf das feste Arena Center, ist die Radial verdrängt das Tierheim, die olfaktorische Signale befindet sich im Tierheim und der proximalen visuelle Hinweise an die Plattform angeschlossen. Wenn die Maus eine der Cues folgt, die gedreht wurden, um ins Tierheim zu navigieren, wird es korrekt an den neuen Speicherort des Tierheims zu entkommen, aber wenn es andere Hinweise, die geblieben sind vorhanden nutzt, wird es zur vorherigen Tierheim Position navigieren.
- Führen Sie Schritte 4.1 bis 4,8 des standard Verhaltens Assays oben beschriebenen entlocken mindestens eine Flucht-Reaktion als Grundlinie verwendet werden.
- Lassen Sie die Maus aktiv das Tierheim verlassen und warten Sie, bis es zu den zentralen Teil der Plattform zu navigieren. Positionieren Sie eine kleine Schale mit Einstreu in der Mitte zu fördern Exploration und halten das Tier in die zentrale Plattform lang genug, um die Rotation des äußeren Teils der Plattform zu ermöglichen. Fügen Sie das Gericht und die Bettwäsche, während die Maus im Tierheim und nach der erfolgreichen Flucht, die die Rotation der Plattform vorausgeht. Wenn die Maus nicht im Tierheim während der Flucht-Reaktion eingeben, warten sie, geben freiwillig im Tierheim und fügen Sie dann das Gericht und die Bettwäsche.
- Verwenden Sie den Schrittmotor zu drehen der Plattform mindestens 36 Grad (2 Löcher) und dann sofort ein Sinnesreiz verwenden, um eine Flucht-Reaktion auslösen. Es ist möglich, dass die Rotation eine Startle löst und sogar eine Flucht-Reaktion initiiert.
Hinweis: Aus unserer Erfahrung ~ 55 % der Mäuse laufen außerhalb der Mittelbahnsteig (nicht rotierend) während der äußere Teil ist noch drehen, und diese Studien aus der Analyse ausgeschlossen werden sollte. - Reinigen Sie die Plattform und Obdach, und seine Heimat-Käfig wie in Schritt 4.10 und 4.11 beschrieben die Maus wieder.
6. "dynamische Umwelt" Behavioral Assay:
Hinweis: Dieser Test soll bewerten, wie Mäuse ihre defensive Verhaltensweisen auf plötzliche Veränderungen in der Umwelt anpassen. In diesen Experimenten, nachdem mindestens eine Flucht-Reaktion zu entlocken die Position des Tierheims wird geändert und die Maus ist erlaubt, es zu besuchen, sobald vor einer anschließenden Flucht Reaktion ausgelöst wird. Wenn die Maus perfekt den neuen Speicherort des Tierheims aktualisiert und das Fehlen des Tierheims in seiner vorherigen Position berechnet, sollte es an den neuen Speicherort zu entkommen. Ansonsten hat es nicht auswendig, den neuen Standort des Tierheims oder es hat beiden Speicherorten gespeichert, sondern lieber mit dem alten zu entkommen.
- Durchführen Sie dieser Assay nach Stufen 4.1 bis 4,8 entlocken mindestens eine Flucht-Reaktion als Steuerelement beschrieben.
- Sobald die Maus freiwillig im Tierheim verlässt, entfernen Sie Tierheim zu und neu positionieren Sie es in ein neues Loch am entgegengesetzten Ende der Plattform.
- Lassen Sie die Maus, um die Umgebung zu erkunden, bis es im Tierheim an seinem neuen Standort tritt.
- Wenn die Maus freiwillig verlässt das Tierheim, vorhanden mit einem aversiven Reiz und beobachten seine Reaktion.
- Verwenden den auditiven Stimulus für dieses Experiment aufgrund der längeren Dauer, wie unter der anhaltenden Bedrohung Tiere verrichten zusätzliche Flucht Antworten zu anderen Orten Wenn sie nicht im Tierheim anfangs zu finden.
- Reinigen Sie die Plattform und das Tierheim und zurückkehren Sie die Maus zu seinem Heimat-Käfig wie 4.10 und 4.11 beschrieben.
7. "kein Schutz" Behavioral Assay:
Hinweis: Das Ziel dieses Tests ist zu verstehen, wie das Fehlen von einem Tierheim in der Umgebung den Ausdruck der defensive Verhaltensweisen auswirkt.
- Stopfen Sie alle 20 Löcher. In diesem Experiment gibt es keine Zuflucht in der Arena.
- Nach der Reinigung und Trocknung die Plattform (Schritte 4.1 und 4.2), führen Sie Schritte 4,4-4,6.
- Maximal 7 Minuten Gewöhnung zu ermöglichen.
- Die visuelle Reize zu präsentieren und die defensive Reaktion zu beobachten. Der Mangel an einem Tierheim fördert Einfrieren Verhalten, in der Regel für die Dauer des visuellen Reizes dauert. Verwenden einer langsam wachsenden Ort (zB. einen Kreis, der Querbalken Gesichtswinkel von 2,6 ° zu Beginn und erweitert linear bei 11,2 ° / s mehr als 4 s auf 47,4 °, an dem es für 1 bleibt s vor Offset), die Beobachtung des Einfrierens Antworten zu erleichtern.
- Wenn mehrere Antworten per Mausklick erforderlich ist, verwenden Sie ein Inter-Stimulus-Intervall von mindestens 60 s.
- Nach erhalten die erforderliche Anzahl von Antworten in der Abwesenheit des Verstecks im Tierheim unter eines der Löcher einführen und lassen die Maus erkunden Sie die Umgebung für mindestens 5 min. werden 5 min genügend Zeit für die meisten Mäuse zu finden und geben die neu eingeführten Schutz , aber für den Fall, dass dies nicht der Fall, verlängert diese durch zusätzliche 5 min Blöcke bis mindestens einen Eintrag überprüft wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.8 und 4.9 und beobachten Sie Flucht Antworten durchgeführt in Anwesenheit von einem Tierheim in der Umgebung zu.
- Reinigen Sie die Plattform und das Tierheim und zurückkehren Sie die Maus zu seinem Heimat-Käfig wie 4.10 und 4.11 beschrieben.
8. Analyse:
Hinweis: Die folgenden Daten Analyse Schritten kann unabhängig voneinander durchgeführt werden.
- Flucht-Reaktionen können leicht als eine plötzliche Beschleunigung nach der Vorstellung der einen aversiven Reiz identifiziert werden. Quantifizieren der Latenz, als die Zeit zwischen reizdarbietung und Beginn einer Kopfdrehung Bewegung gerichtet auf das Ziel der Flucht oder der Beginn der Beschleunigung Bewegung zu entkommen, was zuerst eintritt.
- Einfrieren von Antworten kann durch totale Unbeweglichkeit des Tieres außer atmen Bewegungen25, dauerhafte mindestens 0,5 s7charakterisiert werden. Messen Sie die Latenz, als die Zeit zwischen der Darstellung des aversiven Stimulus und der Unbeweglichkeit Periodenanfang einzufrieren.
- Quantifizieren Sie für jede Antwort Flucht die Linearität der Flugbahn durch die Berechnung des Verhältnis des Abstands zwischen der Maus und das Tierheim und die tatsächliche Verschiebung während des Fluges.
- Berechnen Sie die Genauigkeit für jede Flucht-Reaktion durch Messung der Entfernung zwischen dem Loch wo das Tier seinen Flug nach gerichtet und das Loch führt ins Tierheim. Da gibt es 20 Löcher, jedes Loch verfehlt das Tor stellt eine Decrement des 10 % Genauigkeit (zB., 2 Löcher vom Zielwert als 80 % Genauigkeit ausgedrückt werden können)
- Quantifizieren Sie für die "Navigation-Strategie" Verhaltens-Assay die Richtigkeit der Antwort relativ zum Speicherort der Unterschlupf vor der Plattform-Rotation. Eine durchschnittliche Genauigkeit, die nicht signifikant verschieden von der Pre-Drehung-Genauigkeit ist zeigt, dass das Tier nicht von sensorischen Signale verwendet, die gedreht wurden, um auf der Flucht-Ziel zu navigieren.
- Klassifizieren Sie für die "dynamische Umwelt" Verhaltens-Assay jede Flucht Reaktion ausgelöst als in Richtung der neuen oder alten Tierheim Standort oder zu keiner von ihnen gerichtet. Bewerten Sie, wie das Muster entlang der Iterationen der provozierten defensive Verhaltensweisen entwickelt.
- Vergleichen Sie für die "kein Schutz" Verhaltens-Assay die Mausgeschwindigkeit nach der Vorstellung der aversive visuelle Reize in an- und Abwesenheit von einem Tierheim zu und berechnen Sie die Wartezeit auf die Einleitung des defensiven Reaktion. Darüber hinaus berechnet die Wahrscheinlichkeit der Auslösung einer eiskalten Antwort als Reaktion auf den Reiz für jede Situation.
Representative Results
Mäuse, auditive oder visuelle Reize ausgesetzt initiiert schnelle Flucht Antworten mit kurzen Wartezeiten zwischen dem Beginn der Stimulation und Einleitung des Fluges. Die mittlere Wartezeit zu entkommen, die visuelle Reize wurde 202 ± 16 ms (n = 51 Antworten von 26 Tieren) und wesentlich länger für auditive Reize: 510 ± 61 ms (n = 36 Antworten von 15 Tieren, p< 0,0001 t-Test zwischen visueller und auditiver Stimulation; Abbildung 2A) (Schritt 8.1). Flucht Antworten richteten sich genau ins Tierheim (Genauigkeit für visuelle Reize bedeuten: 97,2 ± 1,4 % und 95.0 ± 1,4 % für auditive Anregung, nicht signifikant zwischen den beiden Arten von Reizen, p = 0.1655 t-Test; Abbildung 2 b) (Schritt 8.4), und Flugbahnen waren nah an einer geraden Linie (mittlere Verhältnis von Hubraum, Entfernung zum Zufluchtsort für visuelle Reize 107,3 ± 1,3 % und 113,9 ± 1,5 % für auditiven Stimulus; Abbildung 2) (Schritt 8.3). Eine kurze Latenz von den Reiz zu beobachten ist wichtig, homing läuft Reiz-evozierten Verhalten unterscheiden, und die hohe Linearität der Flugbahn zeigt, dass die Flucht-Reaktion das Ziel erreichen das Tierheim, und nicht einfach weg von den Reiz.
Reizdarbietung nach der Rotation des äußeren Teils des Labyrinths während die Maus stationär in den Center-Plattform war (Palette = 36° - 90°, Mittelwert 56°) erfolgreich löste Flucht Antworten (Schritt 5). Alle Mäuse floh in Richtung der vorherigen Position des Verstecks mit keine Abnahme der Genauigkeit und Linearität der Flugbahn im Vergleich zu den Studien vor der Drehung. Die mittlere Genauigkeit, gemessen in Bezug auf die Ausgangsposition Tierheim war 96,3 ± 1,3 % vor der Drehung (n = 25 Antworten von 8 Mäuse) und sogar etwas höher nach der Drehung (100 ± 0 %, p = 0,009 t-Test zwischen Pre und post-Drehung). Die mittlere Linearität im Verhältnis zu den Originalschauplätzen Tierheim war 109,4 ± 5,0 % Pre-Rotation (25 Antworten von 8 Mäuse) und 109,1 ± 2,1 %, nach Drehung (n = 8 Antworten von 8 Mäuse), p = 0.957 t-Test zwischen Pre- und Post-Drehung, Abbildung 3A und B). Diese Ergebnisse zeigen, dass proximalen visuelle Hinweise nicht verwendet werden, um den Flug ins Tierheim (Schritte 8.3-8.5) zu führen.
Ändern des Speicherorts für das Tierheim nach einer erfolgreichen Flucht-Reaktion (Schritt 6) zu entlocken bei Mäusen besuchen die neue Tierheim Position kurz nach dem Wechsel führte (mittlere Zeit bis zur neuen Tierheim besuchen = 33,1 s, Palette = 4-82 s). Sequentielle Nachfolgeprozesse von klangstimulation produziert eine schrittweise Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Flucht an den neuen Speicherort (44,4 % auf die erste Studie), bis 100 % über alle Tiere durch die fünfte Studie (n = 9 Tiere, Abbildung 3). Diese Experimente Sonde die Dynamik der Aktualisierung Tierheim Standort Speicher zur Anpassung an Veränderungen in der Umwelt (Schritt 8,6).
Nach einer 7 min Eingewöhnungszeit an das Labyrinth mit keinen Schutz (Schritt 7), produziert die Präsentation eines 5 s lang visuellen Reizes Einfrieren Verhalten statt Flucht (Einfrieren Wahrscheinlichkeit = 95,2 %, Mittelwert Einfrieren Zeit = 7,9 ± 2,7 s, n = 7 Tiere). Nachträgliche Einführung von einem Tierheim in der gleichen Sitzung und die Präsentation des lange visuelle Stimulus ausgelöst entkommen Antworten zuverlässig, zeigen, dass Mäuse defensive Strategien je nach dem Vorhandensein der Zuflucht (Abbildung 3D) (flexibel wechseln können Schritte, 8.1 und 8,7).
Abbildung 1: Schematische der behavioral Arena. Zeichnung der Hauptkomponenten der behavioral Arena gesehen von oben (rechts) und von der Seite (links). Ein großer Teil der Plattform kann gedreht werden, einschließlich das Tierheim und die beigefügten visuelle Hinweise. Dunkle Kreise in der Draufsicht sind die Löcher im Tierheim, befestigt werden kann, die sind alle identisch (eine Beispiel-Tierheim-Position wird angezeigt). Die gesamte Arena wird in einem Ton-Dämpfung Schrank eingeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Escape Antworten sind schnell und präzise zielgerichtetes Verhalten. (A) Latenz bis zum Auftreten der Flucht aus dem Beginn der visuellen oder auditiven Stimulation. (B) die Genauigkeit der Navigation ins Tierheim während Flucht, gemessen, so dass der Wert 100 %, wenn die Maus läuft direkt ins Tierheim und 10 % weniger für jedes Loch vom Tierheim (zB., 80 %, wenn das Loch erreicht zuerst zwei Löcher Weg richtig war). (C) Verschiebung der Maus während Flucht aufgetragen gegen die Luftlinie zwischen Ausgangsposition des Tieres und der Zielposition zeigen, dass Flug in der Nähe von linear ist. Box und Schnurrhaare zeigen Daten von 10-90 Perzentile und die übrigen Datenpunkte werden als Kreise dargestellt. Rote Farbe Grundstücke liegen Daten für auditive Reize (n = 36 Antworten von 15 Tiere) und schwarz aus visuellen Stimulation (n = 51 Antworten von 26 Tieren). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Mäuse nicht mit proximalen visuelle Hinweise oder Tierheim-bezogene Hinweise Flucht Antworten leiten. (A) verschiebungsdarstellung wie in Abbildung 2, für die Antworten, Pre- und Post-Drehung der Plattform. (B) die Genauigkeit der Navigation während Flucht im Pre- und Post-Drehung Bedingungen. Post-Drehung Genauigkeit wird in Anlehnung an den ursprünglichen Speicherort der Tierheim gemessen und zeigt, dass die Mäuse wieder an den ursprünglichen Speicherort der Tierheim navigieren Sie stattdessen die neue Position. (C) Anteil der Flucht Reaktionen auf die neue Tierheim Lage aufgetragen gegen Stimulation Anzahl gerichtet. Nach der 5th -Präsentation des Reizes, fliehen alle Tiere direkt in Richtung der neuen Tierheim-Position (n = 9 Tiere). (D) meine Geschwindigkeit über die Tiere als Reaktion auf visuelle Stimulation mit einem Tierheim zur Verfügung (rot) oder fehlender (blau), zeigen, Flucht und Antworten, bzw. Einfrieren. Geschwindigkeit wurde auf Grundlinie normalisiert und Reaktionszeit (definiert als entweder der Anfang eines Fluges oder Einfrieren Antwort, gestrichelte Linie) ausgerichtet. Schattige Bereiche zeigen SEM (n = 7 Tiere). Für 2A und 2 b, die Box und Schnurrhaare zeigen Daten von 10-90 Perzentile und die übrigen Datenpunkte werden als Kreise dargestellt. Rote Farbe Grundstücke liegen Daten für auditive Reize vor der Plattform Drehung (n = 25 Antworten von 8 Tiere) und blau sind von Reaktionen nach dem Drehen der Plattform (n = 8 Antworten von 8 Tiere). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die Assays, die wir hier beschreiben sind technisch einfach durchzuführen, und mit Ausnahme der Plattform kann Drehung Experimente, ohne weiteres in einem standard Barnes Labyrinth implementiert werden. Dennoch, ein paar Komplikationen auftreten: auf der einen Seite die Maus mag Angst vor Eintritt in das Tierheim, die durch das Tierheim nicht ausreichend gereinigt oder getrocknet werden kann. Auf der anderen Seite kann die Maus für sehr lange Zeit im Tierheim bleiben. Es ist wichtig für diese Experimente, dass Tiere nie aus dem Tierheim manuell entfernt werden, da das Pfad-Integration sowie die Not der Tiere zu stören und ihre Reaktion auf Bedrohung ändern kann. Wir empfehlen das Experiment zu beenden, nach 90 min und Wiederholung der Prüfungen nach 48 h bei Bedarf. Eine weitere relevante praktische Überlegung ist, dass wenn die Maus über den Rand der Plattform untersucht, es nicht visuelle Reize erkennen kann ob den Kopf über den Rand abgewinkelt ist, und daher empfehlen wir die Reize in solchen Situationen Zurückhaltung. Darüber hinaus können Mäuse von der Plattform in seltenen Fällen springen. Wir empfehlen, das Experiment zu beenden und Wiederholung der Prüfungen nach 48 h. Mäuse, die aktiv die Plattform einmal verlassen werden voraussichtlich in der Zukunft wieder zu tun und können aus der Studie ausgeschlossen werden. Endlich, nach unserer Erfahrung die meisten Mäuse visuelle Reize (34/36 Mäuse) beantworten. Jedoch wenn die Mäuse keine Art von Reaktion auf visuelle Reize (ein Startle, einen Flug oder eine eiskalte Antwort) angezeigt werden, sollten sie von der Studie ausgeschlossen werden.
Ein wichtiger Punkt ist, dass die Kontrolle der sensorischen Signale in der Regel ein Problem in räumliche Gedächtnis-Tests, da es oft schwierig, alle mögliche Quellen der Kontaminierung Hinweise zu beseitigen ist. Unser Versuchsaufbau reduziert externe visuelle Hinweise durch das Labyrinth mit einer Mauer umgeben und befindet sich in einem Ton-Dämpfung Schrank für Schallisolation. Um olfaktorische Signale zu minimieren, empfiehlt es sich, gründliche Reinigung der Einrichtung mit 70 % Ethanol oder Essigsäure zwischen Experimente.
Unsere behavioral Assay fügt zu bisherigen Methoden für die Untersuchung räumlicher Navigation26 mit instinktiven defensive Verhaltensweisen räumliche Gedächtnis zu untersuchen und mit Schwerpunkt auf ethologische Szenarien. Ein entscheidenden Unterschied zwischen den hier beschriebenen Verfahren und der standard BM-Test ist der Mangel an Schulungen. In unseren Tests die Gewöhnung Zeitraum gewährleistet, dass die Maus besucht mindestens einmal im Tierheim und oft viele weitere Male, die wir zuvor gezeigt haben, ausreichen, um das Tierheim Lage2auswendig zu lernen. Wir glauben, dass ein wichtiger Grund für die hohe Erfolgsquote und Genauigkeit bei der Suche nach Tierheim trotz fehlender Ausbildung nie passiv das Tier während des Experiments verdrängt, wodurch Pfad Integration eine brauchbare Navigation-Strategie. Wir beachten Sie jedoch, dass unsere Assay mit Speicher gebildet und während einer einzigen Sitzung bewertet Angebote und wir nicht für das Langzeitgedächtnis Tierheim Standort getestet haben in der Regel das Ziel der standard BM Experimente. Schließlich mithilfe diskrete angeboren aversive Reize anstatt der häufig verwendeten Lüfter oder Summen für die Dauer der Sitzung unsere Assay bietet sehr gute experimentelle Kontrolle über zwei Verhaltensweisen, die verschiedenen Navigation Strategien verwenden könnte: auf Futtersuche und unter der Regie von Tierheim zu entkommen. Wir glauben, dass die Verwendung dieser Assays in Kombination mit modernen Neurowissenschaften Techniken für die Erfassung und Manipulation von neuronaler Aktivität kann wichtige Erkenntnisse wie neuronale Schaltkreise Verhalten Compute.
Disclosures
Die meisten Daten im Abschnitt Ergebnisse enthalten ist eine Teilmenge der Daten in Vale et al 2017 vorgestellt.
Acknowledgments
Diese Arbeit durch ein Wellcome Vertrauen/Royal Society Henry Dale Fellowship (098400/Z/12/Z) finanziert wurde, ein Medical Research Council (MRC) gewähren, MC-UP-1201/1, Wellcome Trust und Gatsby Charitable Foundation SWC Gemeinschaft (T.B.), MRC PhD Zugehörigkeit (d.e. und R.V) und ein Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship (auf R.V). Wir danken für die Programmierung der Datenerfassungs-Software, die LMB mechanische und elektrische Workshops für den Aufbau der experimentellen Arena Kostas Betsios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared iluminators TV6700 | Abus | - | |
| DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
| Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | - | |
| Amplifier QTX PRO240 | QTX | - | |
| Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
| HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
| 100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
| Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
| National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
| LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | - | |
| Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | - |
References
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