Summary
פרוטוקול זה מתאר assay התנהגותי, המבוסס על הבדיקה מבוך בארנס, ללמוד איך אינסטינקטיבית הגנתי פעולות עוברות שינוי באמצעות הידע של הסביבה המרחבית.
Abstract
האבולוציה בחרה רפרטואר התנהגויות ההגנה החיוניים להישרדות על פני כל מיני בעלי חיים. התנהגויות אלו הם לעתים קרובות פעולות הסטראוטיפי elicited בתגובה לגירויים החישה aversive מולד, אך ההצלחה שלהם דורש גמישות מספקת להסתגלות סביבות מרחביות שונות, אשר יכול להשתנות במהירות. כאן, אנו מתארים assay התנהגותית כדי להעריך את ההשפעה של המלומד הידע המרחבי על התנהגויות הגנתית בעכברים. אנחנו הסתגלו בארנס בשימוש נרחב מבוך וזמינותו זיכרון מרחבי לחקור כמה עכברים לנווט אל מקלט במהלך הבריחה התגובות מולד aversive גירויים בסביבה הרומן, איך הם מסתגלים לשינויים חריפה בסביבה. Assay החדש הזה הוא הפרדיגמה ethological אינה דורשת הכשרה, מנצלת את חקר טבעי דפוסי ואסטרטגיות ניווט בעכברים. אנו מציעים כי קבוצת פרוטוקולים המתוארים כאן הם אמצעי רב עוצמה לומד התנהגויות מכוון מטרה, המופעלות גירוי ניווט, אשר צריכה להיות עניין על שני השדות של ההתנהגויות האינסטינקטיביות וזיכרון מרחבי.
Introduction
התנהגויות הגנתית אינסטינקטיבית נחשבים במידה רבה קשיחה גירוי-תגובות, כגון C-start התנועה דגים, דו-חיים, אשר מעביר את החיה מן מקור איום1. עם זאת, התנהגויות הגנה יכול להיות יותר גמישים אם ייקחו בגמישות לתוך פרטי חשבון למדו על הסביבה הנוכחית. דוגמה אחת של גמישות כזו היא המתג של בריחה אל קפוא שמוצג על ידי מכרסמים להתמודדות עם האיום, בהתאם ידע מוקדם על נוכחות או היעדרות של מקלט של הסביבה2,3. דוגמאות נוספות של גמישות בהתנהגויות מולדת לכלול התאמת את סף חניכה טיסה או לברוח במהירות בהתאם למרחק בין טרף ל שלה מחסה4, מרחק כדי איום5,6, והקודם ניסיון 11 , 12, כמו גם בחירת אסטרטגיות הגנה שונות בהתאם המאפיינים חושית של גירוי aversive7, או אפילו דיכוי התנהגות מתגוננת מול המניעים מתחרות כמו הרעב8, 9,10. התלות של בחירת פעולה על הידע הנרכש על התכונות המרחבי של הסביבה הופך התנהגויות הגנתית אינסטינקטיבית בעכברים במודל רב עוצמה ללמוד המטרה הבחירה, זיכרון מרחבי וניווט. כאן, אנו מתארים את העיבוד של משימה התנהגותית נפוץ, הזיכרון המרחבי של מבוך (מוניטור) בארנס assay13, כדי לקבוע את ההשפעה של הסביבה המרחבית על פעולת הגנה ובחירת בעכברים, את האסטרטגיות הניווט שלהם כאשר בריחה לכיוון המקלט.
המבוך בארנס סטנדרטי חקר למידה וזיכרון מרחבי בעכברים מורכב מעגלית ~ 90 ס"מ קוטר פלטפורמה עם 20 חורים במרווחים לא פחות, אשר 19, ויש אחד מוביל מקלט תת קרקעי עכברים שמבקשים כדי למנוע בשדה פתוח סביבה של הפלטפורמה. לעתים קרובות, גירויים aversive חלש (זמזם, אור בהיר, מאוורר) משמשים באופן רציף לאורך כל וזמינותו כדי להפוך את הסביבה aversive ובכך לקדם את הערך לתוך מקלט14. 15,assay הנפוץ16, החיה יש משפט habituation אחד שבו ומודרכים למקלט באופן ידני על-ידי הנסיין מיד לאחר מיקומו על הרציף. זה מלווה תקופה רכישת 4 ימים, איפה כל יום שהעכבר מותר לנווט באופן חופשי בתוך המבוך למשך 3 דקות, לאחר מכן שוב באופן ידני ומודרכים למקלט אם לא מגיעים זה במהלך תקופת חקירה. השלב האחרון של וזמינותו היא רגש אחד למשפט ביוםth 5 (למרות זיכרון שבעה ימים ניסיון גם שכיח לבצע) כאשר החיה בוחנת את המבוך עם כל החורים סגור. למידה וזיכרון לטווח ארוך הם לכמת לוקחים את הזמן כדי למצוא מחסה, בפוקס החורים הלא במהלך תקופת הרכישה, וכן את הזמן ליד החור מקלט סגור במשפט בדיקה. תוצאות טיפוסי מראות ירידה מספר שגיאות של השהיה כדי להגיע למקלט במהלך הרכישה, של פרופורציה מעל-ההזדמנות של הזמן המושקע ברביע המכיל החור המטרה סגור בדיקה ניסיון15.
בעוד גרסאות שונות של מוניטור וזמינותו היה שתואר לעיל17,18,19, הפרדיגמה נתאר כאן יש שלושה שינויים מהותיים מ וזמינותו סטנדרטי. ראשית, בעל החיים נשאר כדי לחקור את המבוך ולמצוא מקלט בכוחות עצמו, נעשה במהלך אותה הפעלה, זמן קצר לאחר למקלט נמצאה, בתקופות איפה החיה עוסקת בהתנהגות גישוש. למרות הגדרה זו לא יבחן זיכרון לטווח ארוך של מיקום מקלט, זה נועד להיות תרחיש נטורליסטי המחקה את החיפושים של הטריטוריה הרומן, תחת האיום של טריפה. בנוסף, היא מאפשרת בדיקה של מה חיות להסתגל לשינויים חריפה לסביבה, כגון שינויים פתאומיים בנוף. שנית, היבט מרכזי של assay שלנו הוא כי הנסיין כוחות מעולם לא החיה בתוך או מחוץ למקלט, אשר ניתן לבלבל את החיה, אל תכלול אינטגרציה נתיב20 כמו אסטרטגיה ניווט קיימא21. נתיב אינטגרציה היא אסטרטגיה ניווט המשתמשת רמזים תנועה עצמית, כגון רמזים נראה שההתפתחות שלהם ואת שיווי המשקל, הנובעים השילוב של המנוע יצוא, כדי לעדכן את המיקום הנוכחי של החיה לנווט לעבר מטרה, אשר אינו אפשרי אם חיה פסיבי תועבר על ידי הנסיין. שלישית, אנו משתמשים חזותי מולד aversive22 ו גירויים שמיעתיים23 שמעודדים בריחה למקלט, אשר בקלות להבחין בין התנהגות הרעיה מתמשך מאפשר הערכת כימות של אסטרטגיות ספציפיות ניווט בשימוש במהלך הגנה מפני איומים מיידית. אנו מציעים כי assay הזה יהיה שימושי ניקוד את התפקיד של זיכרון מרחבי בבחירה והטמעה של התנהגויות הגנתית, וללמוד יותר בדרך כלל כדי רחבה של ניווט מכוון מטרה, הזיכרון המרחבי לטווח קצר. הפרוטוקולים המתוארים כאן הוכנסו על-ידי וייל ואח. ב-2017, שאליו אנו מתייחסים הקוראים יותר בדיון עומק של הרציונל ניסויים ותוצאות.
Protocol
כל הניסויים בוצעו תחת חוק חיות בבריטניה (וצפייה) משנת 1986 (PPL 70/7652), בעקבות אישור מוסרי המקומית.
1. הגדרת המנגנון התנהגותית
הערה: המרכיב העיקרי של המנגנון התנהגותית הוא וריאציה של מבוך בארנס13 המורכב של אקריליק מעגלית משטח לבן (92 ס מ קוטר) עם 20 קו מקביל, בקוטר 5 ס מ, חורים עגולים, הממוקם בצורה רדיאלית, 5 ס מ מהקצה של פלטפורמת . 19 אלה הן ייסגרו עם תקע מפלסטיק שחור (5 מ"מ עמוק), בעוד החור הנותרים מוביל מקלט פרספקס שחור (מידות 15 x 5.8 x 4.7 ס"מ) כי עכברים יכולה בקלות להיכנס ולצאת. אזור מרכזי של הזירה מורכב פלטפורמה מעגלית קבוע (22 ס מ קוטר), הפריפריה הוא רכוב על מסגרת המאפשרת סיבוב מעל 360 מעלות באמצעות מנוע stepper מבוקר-מחשב. הפלטפורמה היא מוגברות של 45 ס מ מן הרצפה כדי למנוע העכברים יטפס למטה. ראו ציור סכמטי באיור1.
- לצרף רמזים חזותיים לפריפריה של פלטפורמת (2D או 3D סמלים עם צורות שונות, צבעים ותבניות), לפחות 2 ס"מ מהקצה כדי למנוע מעכברים מלהגיע אותם.
הערה: דוגמאות ברמזים חזותיים הם ריבועים כחול רגיל של 262 ס מ2, או עיגולים (בקוטר של 15.5 ס"מ) מלא עם פסים סגולים אלכסוני. - הוסף ~ 2 גר' מצעים מהכלוב-העכבר הבית הפנימי של המקלט לשמש רמז חוש הריח מקומיים. באופן אופציונלי, מקם דיודה (LED) בכניסה למקלט כדי לספק רמז חזותי ציון מקומי.
- כדי לבודד את העכבר מ חיצוני, ברמזים חזותיים הדיסטלי, להרכיב קיר מתומן או גלילי, הרחבת 40 ס מ מעל ו 15 ס מ מתחת לפני השטח פלטפורמה, סביב הזירה, ממוקם 10 ס מ מהקצה של הפלטפורמה.
- הצב של רמקול סאונד 50 ס מ מעל המרכז של הפלטפורמה, כדי לספק aversive לגירויים שמיעתיים.
- במקום מסך שקוף 64 ס מ מעל הזירה כדי האחורי-פרוייקט גירויים חזותיים תקורה aversive שימוש במקרן.
- האור שמספק את המקרן תדלק את המנגנון התנהגותית; לכייל אותו כדי שלא יהיה 5-10 lx במרכז השטח פלטפורמה. מקום אורות אינפרא-אדום, מצלמה אינפרא אדום מעל הרציף, עם מסנן פס ארוך (> 700 nm) כדי למנוע הבהוב מקרן וידאו שנרכשו.
- לעקוב אחר המיקום של העכבר באינטרנט, באמצעות תוכנה זמינים מסחרית או באלגוריתם מתאימים. מעקב עכברים שחורים על ארנה לבן, פעולת קביעת סף פשוט ואחריו חישוב של centroid המסכה מתאימה.
- באופן אידיאלי, מקם את המנגנון התנהגותית בתוך קופסא של אור-אטומים, כדי למנוע סימנים חיצוניים המשפיעים על הניסוי.
2. מתן גירויים Aversive מולד
הערה: הגירויים המתוארים להלן ניתן להפיק עם מגוון רחב של חבילות תוכנה שונים, לרבות LabVIEW Matlab.
- גירויים חזותיים
- פרוייקט הגירויים על המסך ממוקמת 64 ס מ מעל הזירה. הגירוי מורכב עיגול כהה מתרחבת באופן ליניארי על רקע אפור22 (וובר ניגוד =-0.98, הזוהר = 7.95 cd/m2).
הערה: המעגל תקן אידיאלי צריך להיות מרוכז ישירות מעל המיקום של העכבר, subtending זווית ויזואלית של ° 2.6-תחילת ומרחיב באופן ליניארי-224 ° /s מעל 200 ms נמצא 47.4 °, בו נותר ms 250 לפני היסט. - בעת העברת הגירוי החזותי, מרכז זה מעל העכבר. זו יכולה להיות מושגת על-ידי המתנה עד מצביע העכבר עובר דרך אזור מוגדר מראש בזירה, או על-ידי מעקב אחר המיקום העכבר באינטרנט ושימוש הקואורדינטות מעקב כדי להגדיר את מרכז המעגל.
הערה: למרות אנו מציעים מקרין את הגירוי החזותי ישירות מעל העכבר, התנהגויות הגנה יכול גם להיות elicited אם הגירוי אותו מוקרן לפני העכבר (בעוד עדיין מקביל לרצפה). מניסיוננו, זהו המקרה לפחות עד 30 ס מ לפני העמדה של העכבר.
- פרוייקט הגירויים על המסך ממוקמת 64 ס מ מעל הזירה. הגירוי מורכב עיגול כהה מתרחבת באופן ליניארי על רקע אפור22 (וובר ניגוד =-0.98, הזוהר = 7.95 cd/m2).
- גירוי שמיעתי
- לעורר גירוי המורכב של רכבת של שלושה מאופנן תדירות למעלה-הרייטינג של 17 עד 20 kHz23 מעל 3 s, שנמשך 9 s בסך הכל. רמת לחץ קול (SPL), נמדד ברמת פלטפורמה, צריך להיות בטווח בין 73 ו- 78 dB.
- להתחבר עם soundcard מגבר אל הדובר אולטרסאונד ממוקמת מעל הזירה כדי לספק את הגירוי השמיעתי.
3. בעלי חיים:
- השתמש עכברים C57BL/6J זכר או נקבה, בין בן 6 ו- 24 שבועות. לשמור על שהחיות על 12 שעות אור במחזוריות עם גישה חופשית אוכל ומים.
- להבטיח כי העכברים יחיד שוכנות לפחות 72 שעות לפני assay התנהגותית ובדיקה אותם במהלך שלב האור של האור מחזור.
הערה: אנו מוצאים כי ההתנהגות גישוש בסיסית של עכברים שוכנים יחיד הוא יותר דומה על פני בעלי חיים מאשר על פני עכברים שוכנים קבוצה. בנוסף, בעלי חיים עם שתלים כירורגי עבור הקלטת פעילות עצבית או מניפולציה לעיתים קרובות צריך להיות יחיד שוכן, ובכך למאכסן יש שליטה datasets דיור באותם התנאים.
4. תקן Assay התנהגותיות:
- בקפידה לנקות את השטח של פלטפורמת עם 70% אתנול או חומצה אצטית להסיר רמזים חוש הריח לא רצויים. לשטוף את המקלט במים, לשטוף אותו עם אתנול 70%, לאחר מכן זה צריך לשטוף עם מים שוב כדי להפחית את הריח אתנול.
- יבש את הפלטפורמה והן למקלט ביסודיות, כמו העכבר עשוי להימנע מהזנת למחסה אם הוא רטוב.
- אקראי המיקום של בית המחסה של הפלטפורמה בכל ניסוי על-ידי סיבוב פלטפורמת לפני הניסוי. מיקום המקלט מעוגן בזירה אבל יהיה לסובב ביחס המתחם המנגנון התנהגותית.
- להביא את העכבר לחדר ניסוי בכלוב שלה הביתה ומניחים את הכלוב על גבי פלטפורמת בדיקה עבור תקופת הסתגלות של 10 דקות.
- להסיר את העכבר מכלובה מהבית ולהימנע מאחזר בזנב: גביע זה או זה לטפס על פריט העשרה שלא ניתן להעלות. אוסף עכברים בזנב כבר להראות כדי להגדיל את רמות החרדה, ובכך עלולה להשפיע על תגובות התנהגותיות איום24.
- בעדינות למקם העכבר במרכז הזירה ולהתחיל וידאו-הרכישה.
- לאפשר לתקופה habituation 7 דקות, במהלכן אין גירוי aversive מוצג. ודא העכבר יש מספיק זמן כדי לחפש ולהזין את המקלט לפחות פעם אחת. מחשיבים אותו בתור ערך אם כל ארבעת הגפיים נמצאים בתוך המקלט. 7 דקות צריך להיות מספיק עבור רוב העכברים למצוא ואת להיכנס למקלט, אבל במקרה זה לא קורה, להאריך את תקופת habituation מאת לתקופות נוספות של 5 דקות עד כניסה אחת לפחות אומתה.
- לעורר את המסירה של הגירוי aversive (שמיעתי או חזותי) או באופן ידני על ידי התבוננות על וידאו בשידור חי, או באופן אוטומטי על-ידי מעקב אחר המיקום של החיה באינטרנט והגדרת מראש אזור עניין בזירה עבור מפעילה גירוי-מסירה ברגע החיה מגיע אליו. הגירוי החזותי בדרך כלל מועבר ישירות מעל החיה באמצעות וידאו מקוון מעקב אחר נקודות ציון.
- לעורר תגובת הבריחה אחד או יותר במהלך אותה הפעלה, תן את העכבר בהתנדבות לצאת מהמקלט. אם העכבר בהצלחה לחמוק למקלט בעת הגירוי aversive האחרון, חכה לפחות 60 s לפני הצגת גירוי אחר.
- לאחר סיום וזמינותו, להחזיר את החיה בכלוב בבית. אם יש צורך בבדיקות נוספות של העכבר זהה, להמתין לפחות 48 שעות לפני שגוי.
- לנקות את הפלטפורמה ואת בית המחסה כפי שמתואר בשלב 4.1 ו- 4.2 לפני בדיקה החיה הבאה.
הערה: שלבים 5, 6 ו- 7 הם וריאציות עצמאית של סטנדרט התנהגות וזמינותו, כל אחד יכול להתבצע באופן אינדיבידואלי.
5. ' ניווט אסטרטגיה' Assay התנהגותיות:
הערה: מטרת assay הזאת היא כדי לקבוע איזה רמזים עכברים השתמש להנחות התנהגות הבריחה. ב הזה assay, מטלטלין בחלק החיצוני של פלטפורמת מסובבים אמנם בעכבר על מרכז הזירה קבוע, אשר בצורה רדיאלית מזיחה למקלט, הותאם חוש הריח הממוקם בתוך המקלט, על רמזים חזותיים proximal קשורה לרציף. אם העכבר עוקב כל אחד המקלות זה כבר שסובבת על מנת לנווט למקלט, זה יברח כראוי אל המיקום החדש של המקלט, אבל אם היא משתמשת כל רמזים אחרים נשארו במקום, זה נווט אל מיקום מקלט הקודם.
- בצע שלבים 4.1 עד 4.8 של סטנדרט התנהגות וזמינותו שתוארה לעיל, הצליחו יותר במשיכת תגובה טיסה אחת לפחות כדי לשמש בסיס.
- תן את העכבר באופן פעיל לצאת מהמקלט. ולחכות שזה לנווט אל החלק המרכזי של הפלטפורמה. מקם צלחת קטנה עם מצעים במרכז לעודד את חקר ולשמור את החיה ברציף מרכזי ארוך מספיק כדי לאפשר את הסיבוב של החלק החיצוני של הפלטפורמה. הוסף את המנה ומצעים העכבר נמצא בתוך המקלט ואילו לאחר הבריחה מוצלחת אחרי זה הסיבוב של הפלטפורמה. אם העכבר נכשל להיכנס למקלט במהלך התגובה לברוח, המתן עד בהתנדבות להיכנס למקלט ולאחר מכן להוסיף את המנה ומצעים.
- השתמש המנוע stepper סובב את פלטפורמת לפחות 36 מעלות (2 חורים) ולאחר מכן להשתמש מיד גירוי חושי להפיק תשובה לברוח. זה אפשרי כי הסיבוב מפעיל להבהיל, אפילו יוזם מענה לברוח.
הערה: מהניסיון שלנו, ~ 55% של העכברים יפעלו מחוץ לפלטפורמה המרכזית (לא מסתובב) ואילו החלק החיצוני עדיין מסתובב, נסיונות אלו לא להיות כלולים בניתוח. - לנקות את פלטפורמת ומחסה, וחוזרים העכבר שלו הביתה כלוב כפי שמתואר בשלב 4.10 ו- 4.11.
6. "סביבה דינאמית' Assay התנהגותיות:
הערה: assay הזה נועד להעריך כמה עכברים להסתגל שלהם התנהגויות הגנתי על שינויים פתאומיים בסביבה. בניסויים אלה, לאחר הצליחו יותר במשיכת תגובה לפחות אחד לברוח, שינוי המיקום של המקלט, העכבר מותר לבקר אותה פעם אחת לפני בריחה שלאחר מכן מופעלת בתגובה. אם העכבר בצורה מושלמת מעדכן את המיקום החדש של המקלט, מחשבת את העדר של המקלט במיקום הקודם שלה, זה צריך לברוח אל המיקום החדש. אחרת, זה לא בעל המיקום החדש של המקלט או זה בעל שני המקומות אבל מעדיף לברוח עם הקודם.
- בצע הזה assay לאחר השלבים 4.1 עד 4.8 שתוארה לעיל, הצליחו יותר במשיכת תגובה אחת לפחות טיסה כפקד.
- ברגע העכבר עוזב מרצונו החופשי למקלט, להסיר את המקלט, ולמקם אותו מחדש בחור חדש בקצה הנגדי של הפלטפורמה.
- לאפשר את העכבר כדי לחקור את הסביבה עד שהוא יעבור את המקלט במיקום החדש.
- כאשר העכבר מרצון מגיע מהמקלט, נוכח זה עם גירוי aversive, לבחון את תגובתה.
- להשתמש את הגירוי השמיעתי לניסוי הזה בגלל משך זמן שלה, כמו תחת איום ממושך, בעלי חיים ניתן לבצע תגובות נוספות לברוח למקומות אחרים אם הם נכשלים למצוא את המקלט בהתחלה.
- לנקות את פלטפורמת ומחסה וחוזרים העכבר שלו הביתה כלוב כפי שתואר בשלבים 4.10 ו- 4.11.
7. ' מקלט' Assay התנהגותיות:
הערה: מטרת assay הזה הוא להבין כיצד העדר מקלט מפני הסביבה משפיעה על הביטוי של התנהגויות הגנתית.
- חבר את כל החורים 20. בניסוי זה, יש מקלט בזירה.
- לאחר ניקוי וייבוש הפלטפורמה (שלבים 4.1 ו- 4.2), לבצע את השלבים 4.4-4.6.
- לאפשר תקופה habituation 7 דקות.
- להציג את הגירוי החזותי ולבחון את התגובה ההגנתית. העדר מקלט מקדם התנהגות קופא, בדרך כלל שנמשך משך הזמן של הגירוי החזותי. להשתמש במקום הרחבת לאט (למשל. עיגול subtends זווית ויזואלית של ° 2.6-תחילת ומרחיבה באופן ליניארי-° 11.2 /s מעל 4 s ° נמצא 47.4, בו נותר 1 s לפני קיזוז) כדי להקל על התצפית להקפאת תגובות.
- אם נדרשת תגובה יותר מפעם אחת לכל העכבר, להשתמש במרווח הבין-גירוי לפחות 60 s.
- לאחר השגת את המספר הנדרש של תגובות, בהעדר בית-המחסה, להציג את בית המחסה מתחת לאחד החורים, תן העכבר לחקור את הסביבה על פחות 5 דק 5 דקות יהיה מספיק זמן במרבית העכברים לחפש ולהזין את המקלט החדש הציג , אבל במקרה זה לא קורה, להאריך תקופה זו על ידי 5 דקות נוספות בלוקים עד אימות כניסה אחד לפחות.
- חזור על שלבים 4.8 ו- 4.9, ולבחון את הבריחה תגובות לבצע בנוכחות מקלט בסביבה.
- לנקות את פלטפורמת ומחסה וחוזרים העכבר שלו הביתה כלוב כפי שתואר בשלבים 4.10 ו- 4.11.
8. נתוני ניתוח:
הערה: כל אחד השלבים הבאים של ניתוח נתונים ניתן לבצע באופן עצמאי.
- הבריחה תגובות ניתן לזהות בקלות בכל האצה פתאומית בעקבות הצגת הגירוי aversive. לכמת ההשהיה לברוח משך הזמן בין הגירוי מצגת תחילתה של תנועה סיבוב הראש מכוון היעד של הבריחה או תחילת התנועה האצה, מה שיבוא קודם.
- הקפאת תגובות יכול להיות מאופיין על ידי נייחות הכוללת של החיה חוץ נושם תנועות25, שנמשך לפחות 0.5 s7. למדוד ההשהיה להקפיא את משך הזמן בין הצגת הגירוי aversive תחילת תקופת נייחות.
- עבור כל תגובה לברוח, לכמת על ליניאריות של נתיב הטיסה על-ידי חישוב היחס בין המרחק בין העכבר ואת המחסה העקירה בפועל במהלך הטיסה.
- עבור כל תגובה לברוח, לחשב את רמת הדיוק על ידי מדידת המרחק בין החור שבו החיה ביים את הטיסה החור המוביל למקלט. מאז יש חורים 20, כל חור מהמטרה מייצג של הקטנת של 10% ברמת הדיוק (למשל., 2 חורים מהמטרה יכולה להתבטא כ 80% דיוק)
- עבור 'ניווט אסטרטגיה' וזמינותו התנהגותית, לכמת את הדיוק של התגובה יחסיים למיקום מחסה לפני הסיבוב פלטפורמה. דיוק ממוצע שאינו שונה באופן מהותי מן הדיוק סיבוב מראש מציינת החיה לא משתמש כל אחד המקלות חושי זה היו לסובב כדי לנווט אל המטרה לברוח.
- עבור 'סביבה דינאמית' וזמינותו התנהגותית, לסווג כל תגובה לברוח elicited כמו להיות מכוונת כלפי החדש או את מיקום המקלט הישן, או אף אחד מהם. להעריך איך התבנית מתפתח לאורך חזרות של ההתנהגויות הגנתי elicited.
- עבור 'מקלט' וזמינותו התנהגותית, להשוות בין המהירות של העכבר בעקבות המצגת של גירויים חזותיים aversive הנוכחות ואת העדר מקלט ולחשב ההשהיה כדי אתחול של התגובה ההגנתית. בנוסף, לחשב את ההסתברות של מפעילה תגובה מקפיא בתגובה הגירוי לכל מצב.
Representative Results
עכברים חשופים לגירויים או ויזואלי יזם בריחה מהירה התגובות עם השהיות ארוכות יותר קצר בין תחילת גירוי, חניכה של הטיסה. ההשהיה מתכוון לברוח מן הגירוי החזותי היה 202 ± 16 מילי-שניות (n = 51 תגובות מחיות 26), משמעותית יותר לגירוי שמיעתי: 510 ± 61 ms (n = 36 תגובות 15 חיות, p< 0.0001 -t-test בין חזותיים ושמיעתיים גירוי; איור 2 א) (שלב 8.1). הבריחה תגובות במדויק הופנו למקלט (כלומר הדיוק של גירויים חזותיים: 97.2 ± 1.4%, 95.0 ± 1.4% עבור גירוי שמיעתי, לא שונה באופן משמעותי בין שני סוגי גירויים, p = 0.1655 -t-test; איור 2B) (שלב 8.4), מסלולי טיסה והיו קרובים קו ישר (כלומר יחס של עקירה מרחק למקלט עבור גירויים חזותיים 107.3 ± 1.3% ו 113.9 ± 1.5% על גירוי שמיעתי; איור 2C) (שלב 8.3). התבוננות על השהיה קצרה מן הגירוי חשוב להבחין בין התנהגות עורר גירוי לבין ריצות ביות ומדגים ליניאריות גבוהה של מסלול הטיסה כי התגובה לברוח יש מטרת להגיע למקלט, לא פשוט מתרחקים מן הגירוי.
גירוי המצגת לאחר הרוטציה של החלק החיצוני של מבוך העכבר היה נייח ברציף מרכז (טווח = 36° - ב-90°, אומר 56°) בהצלחה elicited לברוח תגובות (שלב 5). כל העכברים ברח לכיוון המיקום הקודם של המקלט, עם ירידה דיוק או ליניאריות של מסלול הטיסה בהשוואה הניסויים לפני הסיבוב. הדיוק מתכוון, נמדד ביחס המיקום המקורי של מקלט, היה 96.3 ± 1.3% לפני סיבוב (n = 25 תגובות של עכברים 8) ומעלה ואפילו מעט לאחר סיבוב (100 ± 0%, p = 0.009 -t-test בין טרום ולפרסם סיבוב). ליניאריות רעה בקשר למיקום מחסה המקורי היה 109.4 ± 5.0% לפני הסיבוב (25 תגובות של עכברים 8) ו 109.1 ± 2.1%, לאחר סיבוב (n = 8 תגובות של עכברים 8), p = 0.957 -t-test בין טרום שלאחר סיבוב, דמות 3A ו- B). תוצאות אלו מדגימים ברמזים חזותיים הפרוקסימלית לא משמשים כדי להנחות את הטיסה למקלט (שלבים 8.3-8.5).
שינוי המיקום של המקלט לאחר הצליחו יותר במשיכת תגובה לבריחה אחת (שלב 6) גרמו בעכברים. שאתם מבקרים המיקום מחסה החדש זמן קצר לאחר השינוי (זמן לבקר את בית המחסה החדש = 33.1 s, טווח = s 4-82). המשפטים הבאים רציפים של גירוי צליל המופק עלייה הדרגתית ההסתברות של בריחה אל המיקום החדש (44.4% במשפט הראשון), מושיטים יד 100% על פני כל בעלי החיים על ידי המשפט החמישי (n = 9 בעלי חיים, איור 3C). ניסויים אלה לחקור את הדינמיקה של עדכון הזיכרון מיקום מקלט להסתגל לשינויים בסביבה (שלב 8.6).
לאחר תקופת הסתגלות של 7 דקות כדי במבוך עם מקלט (שלב 7), הפיק המצגת של גירוי חזותי זמן s 5 התנהגות קופא במקום לברוח (הקפאת ההסתברות = 95.2%, אומר עוצר את הזמן = s ± 2.7 7.9, n = 7 חיות). מבוא עוקבות המקלט באותה הפעלת המצגת של הגירוי החזותי זמן elicited לברוח תגובות בצורה אמינה, מראה כי עכברים ניתן לעבור בגמישות אסטרטגיות הגנה תלות בנוכחות של מקלט (איור תלת-ממד) ( שלבים 8.1 ו- 8.7).
איור 1: סכימטי של הזירה התנהגותיות. ציור של הרכיבים העיקריים של הזירה התנהגותית צפו ב מלמעלה (מימין), מן הצד (משמאל). חלק גדול של הפלטפורמה ניתן לסובב, כולל בית המחסה על רמזים חזותיים המצורפת. עיגולים כהים זווית ישרה הם החורים שאליו המקלט ניתן לחבר, אשר הם זהים (מיקום מקלט דוגמה מצוינת). הזירה כולה מוקפת בארון קול וגלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הבריחה תגובות הן מהיר ומדויק מכוון מטרה התנהגויות. (א) השהיה כדי לברוח התחלתה של תחילת גירוי חזותי או שמיעתי. (ב) הדיוק של ניווט למקלט במהלך הבריחה, נמדד כזה כי הערך הוא 100% אם העכבר פועל ישירות למקלט, ולא 10% פחות עבור כל חור רחוק מהמחנה (למשל., 80% אם החור הגיע ראשון היה שני חורים הרחק הנכונה). (ג) העתק של העכבר במהלך הבריחה להתוות נגד מרחק ליניארי בין העמדה הראשונית של החיה למיקום היעד, מראה כי הטיסה הוא קרוב ליניארי. תיבת ושפמו הצג נתונים אחוזון 10-90, נקודות הנתונים הנותרים מופיעות כעיגולים. צבע אדום המגרשים נתונים גירוי שמיעתי (n = 36 תגובות מחיות 15) והם שחורים של גירוי חזותי (n = 51 תגובות מחיות 26). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: עכברים אין להשתמש ברמזים חזותיים proximal או רמזים הקשורות מחסה להנחות תגובות לברוח. (א) העתק העלילה כמו דמות 2C, התגובות מראש, שלאחר סיבוב של הפלטפורמה. (ב) הדיוק של הניווט במהלך הבריחה תנאי קדם וסיבוב פוסט. לאחר סיבוב דיוק נמדד ביחס המיקום ההתחלתי של המקלט ומראה כי העכברים לנווט בחזרה למיקום המקורי מקלט במקום זאת המיקום החדש. (ג) שבר של תגובות לברוח לכיוון המיקום מחסה החדש לעומת המספר גירוי. לאחר המצגתth 5 הגירוי, כל החיות לברוח ישירות לכיוון המיקום מחסה החדש (n = 9 חיות). (ד) אומר מהירות מעבר החיות בתגובה גירוי חזותי עם מקלט זמין (אדום) או נעדר (כחול), המציגה escape, הקפאת תגובות, בהתאמה. יש מהירות מנורמל בסיסית, המיושר זמן התגובה (כהגדרתו גם תחילתו של טיסה או התגובה מקפיא, קו מקווקו). אזורים מוצללים הצג ב- SEM (n = 7 חיות). עבור 2A ו- 2B, תיבת שפם הצג נתונים אחוזון 10-90, נקודות הנתונים הנותרים מופיעות כעיגולים. צבע אדום המגרשים נתונים גירוי שמיעתי לפני סיבוב פלטפורמה (n = 25 תגובות מחיות 8) הינם כחול מן התגובות אחרי סיבוב הפלטפורמה (n = 8 תגובות מחיות 8). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
מבחני שנתאר כאן הן מבחינה טכנית פשוטה לביצוע, למעט הפלטפורמה סיבוב ניסויים, ניתן בקלות ליישם בתוך מבוך בארנס סטנדרטי. בכל זאת, כמה סיבוכים שעלולים להתעורר: מצד אחד, העכבר אולי נראה חושש להזין את המחסה, אשר יכול להיות עקב למקלט לא להיות מספיק נקי או מיובשים. מצד שני, העכבר יכולים לשהות בתוך המקלט במשך פרקי זמן ארוכים מאוד. . זה קריטי עבור ניסויים אלה כי בעלי חיים מעולם לא יוסרו מהמקלט באופן ידני, כמו זה יכול לשבש את הנתיב אינטגרציה, כמו גם מצוקה החיות ולשנות את תגובתם לאיום. אנו מציעים הפסקת הניסוי לאחר 90 דקות של שגוי לאחר 48 שעות, אם יש צורך בכך. שיקול מעשי רלוונטי נוסף הוא כי כאשר העכבר חוקר את הקצה של הפלטפורמה, זה ייתכן שלא תזהה גירויים חזותיים אם ראשו המשופע מעבר לקצה, לכן אנו ממליצים הלנת הגירויים במצבים כאלה. בנוסף, עכברים יכול לקפוץ למטה פלטפורמת במקרים נדירים. אנו ממליצים לסיים את הניסוי של שגוי לאחר ה 48 עכברים המותירים באופן פעיל את הפלטפורמה פעם נוטים לעשות זאת שוב בעתיד, ייתכן שיהיה עליך לא ייכללו המחקר. לבסוף, מהניסיון שלנו, במרבית העכברים יגיב הגירוי החזותי (עכברים 34/36). עם זאת, אם העכברים אינם מראים כל סוג של תגובת הגירוי החזותי (להבהיל, טיסה או תגובה הקפאה), הם לא להיות כלולים המחקר.
נקודה חשובה שיש לקחת בחשבון הוא השליטה של רמזים חושיים הוא בדרך כלל בעיה במבחני זיכרון מרחבי, שכן לעיתים קרובות קשה לחסל את כל מקורות אפשריים של מזהם רמזים. הגדרת הניסוי שלנו מפחית ברמזים חזותיים חיצוניים על-ידי תחימת במבוך עם קיר, הוא ממוקם בתוך ארון קול וגלים עבור בידוד צליל. כדי למזער הריח רמזים, אנו ממליצים לנקות ביסודיות את הסידור עם 70% אתנול או חומצה אצטית בין ניסויים.
Assay התנהגותית שלנו מוסיפה שיטות קודמות ללמוד ניווט מרחבי26 מאת שימוש בהתנהגויות הגנתית אינסטינקטיבית כדי לחקור זכרון מרחבי ומיקוד על תרחישי ethological. הבדל קריטי בין ההליכים המתוארים כאן ואת וזמינותו מוניטור סטנדרטית היא חוסר סשנים של הדרכה. במבחני שלנו, תקופת habituation מבטיחה כי העכבר מבקר את המקלט לפחות פעם אחת, לעתים קרובות יותר פעמים רבות, אשר בעבר הראינו כדי להספיק לשנן את מיקום מקלט2. אנו מאמינים כי סיבה למה אחוזי הצלחה גבוהים והדיוק במציאת בית המחסה למרות העדר הכשרה הוא אף פעם לא פסיבי ועקרו מבתיהם החיה במהלך הניסוי, ובכך אינטגרציה נתיב הניווט קיימא אסטרטגיה. נציין עם זאת assay שלנו עוסק זיכרון נוצר ואת העריך במהלך מושב בודד, שלא בדקנו עבור זיכרון לטווח ארוך של מיקום מקלט, אשר בדרך כלל המטרה של ניסויים מוניטור סטנדרטי. בסופו של דבר, באמצעות גירויים מולד aversive דיסקרטית במקום מאוורר נפוץ או באז למשך כל ההפעלה, וזמינותו שלנו מספק בקרה ניסויית טוב מאוד על פני שתי התנהגויות עשוי להשתמש באסטרטגיות ניווט שונה: שיחור מזון ו מכוון מקלט להימלט. אנו מאמינים כי השימוש של מבחני אלה בשילוב עם טכניקות מודרניות במדעי המוח עבור הקלטה של מניפולציה פעילות עצבית יכולה לספק תובנות חשובות המעגלים העצביים איך לחשב התנהגות.
Disclosures
רוב הנתונים הכלולים בסעיף התוצאות הוא קבוצת משנה של הנתונים המוצגים ב- Vale et. al 2017.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי Wellcome אמון/רויאל החברה הנרי דייל מלגת (098400/Z 12 Z), המועצה למחקר רפואי (MRC) להעניק MC-UP-1201/1, טרסט ואת גטסבי קרן צדקה SWC אחווה (כדי שחפת), MRC PhD Studentship (ד. א. ו- R.V) ו- Boehringer Ingelheim Fonds PhD מלגת (R.V). אנו מודים Kostas Betsios על תכנות של התוכנה רכישת נתונים, LMB מכני, סדנאות חשמל לבניית הזירה ניסיוני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared iluminators TV6700 | Abus | - | |
| DLP projector Infocus IN3126 | Infocus | 0001740992-00000001 | |
| Ultrasound speaker Pettersson L60 | Pettersson Elektronik | - | |
| Amplifier QTX PRO240 | QTX | - | |
| Soundcard Xonar D2 | Asus | 90-YAA021-1UAN00Z | |
| HP Z840 desktop | HP | F5G73AV | |
| 100 micron drafting film | Xerox | 3R98145 | |
| Near infrared camera: Basler acA1300-60gmNIR | Basler | 106202 | |
| National Instruments BNC-2110 | National instruments | 777643-01 | |
| LabVIEW 2015 64-bit | National instruments | - | |
| Custom made Barnes maze | MRC Laboratory of Molecular Biology mechanical workshop | - |
References
- Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J Exp Biol. 66 (1), 65-81 (1977).
- Vale, R., Evans, D. A., Branco, T. Rapid Spatial Learning Controls Instinctive Defensive Behavior in Mice. Curr Biol. 27 (9), 1342-1349 (2017).
- Blanchard, R. J., Flannelly, K. J., Blanchard, D. C. Defensive behavior of laboratory and wild Rattus norvegicus. J Comp Psychol. 100 (2), 101-107 (1986).
- Dill, L. M., Houtman, R. The influence of distance to refuge on flight initiation distance in the gray squirrel (Sciurus carolinensis). Canadian Journal of Zoology. 67 (1), 233-235 (1989).
- Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Rodgers, J., Weiss, S. M. The characterization and modelling of antipredator defensive behavior. Neurosci Biobehav Rev. 14 (4), 463-472 (1990).
- Fanselow, M. S., Lester, L. S. A functional behavioristic approach to aversively motivated behavior: Predatory imminence as a determinant of the topography of defensive behavior. Evolution and learning. , (1988).
- De Franceschi, G., Vivattanasarn, T., Saleem, A. B., Solomon, S. G. Vision Guides Selection of Freeze or Flight Defense Strategies in Mice. Curr Biol. 26 (16), 2150-2154 (2016).
- Bräcker, L. B., et al. Essential role of the mushroom body in context-dependent CO 2 avoidance in Drosophila. Current Biology. 23 (13), 1228-1234 (2013).
- Ghosh, D. D., et al. Neural architecture of hunger-dependent multisensory decision making in C. elegans. Neuron. 92 (5), 1049-1062 (2016).
- Bellman, K. L., Krasne, F. B. Adaptive complexity of interactions between feeding and escape in crayfish. Science. 221 (4612), 779-781 (1983).
- Rodgers, W., Melzack, R., Segal, J. "Tail flip response" in goldfish. Journal of comparative and physiological psychology. 56 (5), 917 (1963).
- Dill, L. M. The escape response of the zebra danio (Brachydanio rerio) II. The effect of experience. Animal Behaviour. 22 (3), 723-730 (1974).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Physiol Psychol. 93 (1), 74-104 (1979).
- Pompl, P. N., Mullan, M. J., Bjugstad, K., Arendash, G. W. Adaptation of the circular platform spatial memory task for mice: use in detecting cognitive impairment in the APP(SW) transgenic mouse model for Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 87 (1), 87-95 (1999).
- Patil, S. S., Sunyer, B., Höger, H., Lubec, G. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water maze. Behavioural Brain Research. 198 (1), 58-68 (2009).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Protocol Exchange. , (2007).
- Attar, A., et al. A shortened Barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8 (11), e80355 (2013).
- Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learn Mem. 13 (6), 809-819 (2006).
- Leary, T. P., Brown, R. E. The effects of apparatus design and test procedure on learning and memory performance of C57BL/6J mice on the Barnes maze. J Neurosci Methods. 203 (2), 315-324 (2012).
- Mittelstaedt, M. -L., Mittelstaedt, H. Homing by path integration in a mammal. Naturwissenschaften. 67 (11), 566-567 (1980).
- Stackman, R. W., Golob, E. J., Bassett, J. P., Taube, J. S. Passive transport disrupts directional path integration by rat head direction cells. J Neurophysiol. 90 (5), 2862-2874 (2003).
- Yilmaz, M., Meister, M. Rapid innate defensive responses of mice to looming visual stimuli. Curr Biol. 23 (20), 2011-2015 (2013).
- Mongeau, R., Miller, G. A., Chiang, E., Anderson, D. J. Neural correlates of competing fear behaviors evoked by an innately aversive stimulus. J Neurosci. 23 (9), 3855-3868 (2003).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Paylor, R., Tracy, R., Wehner, J., Rudy, J. W. DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning. Behavioral neuroscience. 108 (4), 810 (1994).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203 (2), 151-164 (2009).
