Summary
Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.
Abstract
הצרעה תכשיט Nasonia vitripennis התפתחה מערכת מודל יעיל לחקר תהליכים כולל קביעת מין, זוויג האפלו-דיפלואידי, ארס סינתזה של אינטראקציות מארח-ונאבו, בין היתר. מגבלה עיקרית של עבודה עם האורגניזם הוא המחסור פרוטוקולים יעיל כדי לבצע שינויים הגנום מכוונת. חלק חשוב של שינוי הגנום הוא משלוח של עריכת ריאגנטים, לרבות מולקולות CRISPR/Cas9, העוברים דרך microinjection. בעוד microinjection וותיקה אורגניזמים דגם רבים, טכניקה זו היא מאתגרת במיוחד כדי לבצע ב- vitripennis (ש ע) בעיקר בשל גודלו העובר קטן, ואת העובדה כי התפתחות מתרחשת לחלוטין בהישג זבוב parasitized גולם. ההליך הבא מתגבר על אלה אתגרים משמעותיים תוך הפגנת הליך יעיל, חזותי להסרת ביעילות צרעה העוברים מן parasitized מארח הגלמים, microinjecting אותם, בזהירות משתילים אותם חזרה אל המחשב המארח עבור המשך והשלמה של פיתוח. פרוטוקול זה יהיה בתוקף לשפר את היכולת של קבוצות מחקר כדי לבצע שינויים מתקדמים הגנום ב האורגניזם הזה.
Introduction
צרעה תכשיט, (ש ע) vitripennis, הוא אחד מארבעת המינים בתוך הסוג של Nasonia כי הם ectoparasitoids של בשר לאכול זבובים כגון Sarcophaga bullata1. עקב תקופות שלהם מהיר-דורי, קלות לגידול של המעבדה, ומגוון רחב של תכונות ביולוגיות חשוב וייחודי, ש vitripennis היה מוקד לפיתוח של כלי ניסיוני מרובים הנמצאים במודל המסורתי אורגניזמים . לדוגמה, תכונות מסוימות ביולוגי ייחודי כוללים מערכת רבייה האפלו-דיפלואידי2, יחסים עם טפילים חיידקים ותעשיה3,4supernumary (B) כרומוזום5,6 ,7. יחדיו, אלה גורמים vitripennis (ש ע) מערכת ניסויית חשוב עבור ניסויים שמטרתם הבהרת ההיבטים הסלולר המולקולריים של תהליכים אלה, בנוסף אחרים כולל ארס הייצור8, 9, נחישות סקס10,11, ו האבולוציה והתפתחות של ציר דפוס היווצרות12,13,14. יתר על כן, ערכת הכלים גנטי לחקר הביולוגיה של N. vitripennis גדל באופן דרמטי במהלך העשור האחרון, או אז, עם הרצף של הגנום ברזולוציה גבוהה15, ביטוי גנים מספר מחקרים16,17,18, ו היכולת לשבש באופן פונקציונלי ביטוי גנים להסתמך על התערבות RNA (RNAi)19,20, אשר ביחד יש משופרים ללקוחות שלנו, יכולות להופיע גנטיקה הפוך את האורגניזם הזה.
למרות הפיתוחים המדעיים החשובים, ומקורות המורחב של האורגניזם רבים, החל הידע הנוכחי רק קבוצה אחת ביצעה בהצלחה microinjections עובריים ליצירת שינויים הגנום heritable21. זאת בעיקר בשל הקשיים של עבודה עם עוברי של vitripennis (ש ע) כפי שהם די קטן, להיות ~2/3 בגודל של עוברי דרוזופילה melanogaster , שהופך אותם בדרך כלל קשה לתמרן ושבירה. בנוסף, vitripennis (ש ע) הנקבות להפקיד את ביציהם לגלמים זבוב מראש נעקץ, שבתוכה מתרחשת מכלול של מופרה, זחל, ופיתוח הגולמי. לכן, עבור microinjections מוצלח, שלב טרום blastoderm, העוברים חייב להיות ביעילות שנאסף מארח הגלמים, במהירות microinjected, מושתלים מיד בחזרה לתוך מארחיהם לפיתוח. הפעולות הבאות דורשות דיוק ומיומנות כדי למנוע נזק העוברים microinjected, או המארחים הגולמי, ביצוע הטכניקה מאתגר במיוחד. על אף האמור, יש פרוטוקול קצר אחד, שפורסם לפני יותר מעשור המתארת vitripennis (ש ע) העובר microinjection22. עם זאת, הליך זה דורש העוברים צבען להיות desiccated, היא משתמשת סרט דביק כדי לעגן את הביצים על microinjection, לא כולל הדגמה ויזואלית של הטכניקה. לכן, המתוארים כאן הוא פרוטוקול מעודכן, מתוקנת, לרבות הליך חזותי, המפרט את פרוטוקול צעד אחר צעד משופרת עבור העובר vitripennis ש microinjections זה יכולה להיות מלווה בכל מעבדה בסיסיות ליצירת heritable הגנום שינוי מודל חשוב החרק.
Protocol
1. Vitripennis (ש ע) גידול מושבת
- הגדרת מספר מושבות (~ 3-5) על-ידי הצבת 200-500 מבוגרים (ש ע) vitripennis (עם יחס של 3:1 של נקבה: זכר) בכלובים במעונות באג.
הערה: חלופה לשימוש באג במעונות, צרעות יכול גם להיות מופצות במבחנות מרובים, םת מחובר עם כותנה עם 15-20 צרעות/מבחנה.- לשמור על הצרעות-25 ± 1 ° C עם 30% לחות יחסית, 12:12 אור מחזור כהה, להאכיל אותם מדי יום עם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים.
הערה: התפשטות של צרעה מושבות ואוספים יכול להתבצע גם בטמפרטורת החדר ללא לחות מבוקרת; עם זאת, טמפרטורות נמוכים מ- 25 ° C תפחית במקצת את התזמון התפתחותית של העוברים.
- לשמור על הצרעות-25 ± 1 ° C עם 30% לחות יחסית, 12:12 אור מחזור כהה, להאכיל אותם מדי יום עם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים.
- לאפשר צרעות להזדווג לפחות 4 ימים לפני זריקות.
- במשך היומיים הראשונים, לאפשר נקבות ובסיומה ניזונים טריים הגלמים ס bullata , כמו גם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים.
- במשך היומיים הבאים, הסר את הגלמים זבוב לשלול הצרעות הנשי של אתר ההטלה, הפיכתם gravid מאוד.
2. אוסף ויישור של העוברים בשלב טרום blastoderm ש Vitripennis
- לאפשר נקבות הצרעה על הדורות (oviposit עוברי) לתוך מארחים צעיר (ס' bullata גלמי). כדי לשמור מארחים טריים, לאחסן מארחים 4 ° C מיד לאחר קבלת אותם ולהסיר רק בעת הצורך.
הערה: מארחים צעיר יכול להיקבע על ידי בעל puparium בצבע אדום בעוד מארחים בוגרים יש בצבע כהה יותר puparium (איור 1 א').- מקום טריים בודדים bullata ס הגלמים לתוך פקק קצף עם חור בגודל של הגלמים לחתוך לתוך המרכז. לחשוף רק ~ 0.2 ס מ בקצה הקדמי (אתר ההטלה מועדף) של המארחת של ריכוז מרבי של parasitization ואוסף העובר קל יותר.
הערה: הסוף קדמי מעוגל, ואילו הקצה האחורי סמיך ומכיל חור 'מכתש דמוי' (איור 1B). - המקום מארח גלמי (בערך 5 מארח הגלמים לכל הצרעות 100) בסידור זה לתוך הכלוב ולא לחכות בערך 45 דקות כדי לאפשר צרעות הדורות אותם (איור 2- ii).
הערה: חשוב מאוד כי העוברים הם צעירים ככל שניתן, באופן אידיאלי בתוך השעה הראשונה של להיות oviposited, כדי להבטיח כי הם בשלב טרום blastoderm. עוברי הישן (> 1.5 h) לא צריך להיות מוזרק. - להסיר מארחים parasitized על-ידי איחזורם ביד ובעדינות צחצוח/לפוצץ את כל המתגוררים צרעות. להחליף אותם עם המארחים טריים לאחר כל ~ 15 דקות כדי להמשיך באיסוף מוקדם מבוים ביצים במהלך זריקות.
- מקום טריים בודדים bullata ס הגלמים לתוך פקק קצף עם חור בגודל של הגלמים לחתוך לתוך המרכז. לחשוף רק ~ 0.2 ס מ בקצה הקדמי (אתר ההטלה מועדף) של המארחת של ריכוז מרבי של parasitization ואוסף העובר קל יותר.
- הסר את המארחים טרי parasitized כלוב בעבודת יד. תחת מיקרוסקופ ויבתר, באמצעות מלקחיים, בזהירות הקילוף בקצה האחורי (0.4 ס מ) של puparium החיצוני (מעטפת הגולמי) לחשוף את הביצים (ש ע) vitripennis (איור 2- iii).
הערה: יש לנקוט כדי להימנע ניקב העור הגולמי; אם זה יקרה, hemolymph ירטבו העוברים צרעה, אשר יהיה קשה מאוד להסיר על microinjection. - השתמש דבק נוזלי כדי להדביק את coverslip על זכוכית נקי כדי להכין שקופיות יישור של העובר (איור 3).
הערה: דבק מיידית ביצועים גבוהים משמש כדי להגדיל את בונד חוזק, ייבוש מהירות, אולם בדבק כלשהו שיכול למנוע את coverslip לנוע בשקופית מקובל. - אתה מנסה לחתוך העוברים מהמחשב המארח בזהירות עם מברשת פיין-טיפ רטוב, מוודא שלא יגרמו נזק לעור רך הגולמי של המחשב המארח.
הערה: "העובר לבחור," שזה בעצם חצי של זוג מלקחיים חדה במיוחד, ניתן להשתמש במקום במכחול. - העברת ~ 20 עוברי אחד--אחד על גבי השקופית, ומייד בסמוך לצד של coverslip באמצעות מברשת צבע רטוב. אוריינט בקצה הקדמי של העובר כנגד הקצה של השקופית כיסוי כך באחד העוברים עליה הצבעת באותו כיוון (איור 2- iv). זה יאפשר דיוק גבוה יותר של הזרקת לאותה תנוחה בין כל העוברים.
הערה: שיפור טכניקה זו אינה דורשת דו-צדדית קלטת דביק לתקן את העוברים אל השקופית כפי שתואר לעיל21,22. בנוסף, אין וכשתתחילי העוברים, או לכסות את הביצים בשמן halocarbon במהלך ההזרקה כפי שתואר לעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjection22.
3. מחט הכנה Microinjections
- המקום זכוכית נימי aluminosilicate לתוך פולר המחט.
הערה: מחט טובה הוא קריטי עבור מוצלחת vitripennis ש עוברי זריקות. המחטים הזרקת צריך יש שארפ פיין-טיפ כדי לאפשר חדירה קלה דרך chorion. קוורץ ומחטים נימי בורוסיליקט גם יכול להיות בשימוש (איור 4). - להגדיר את החום 605, את מהירות 130, עיכוב ל-80, משוך 70, ואת הלחץ 500 פולר המחט.
הערה: ההגדרות פולר המחט נוספים עבור משיכת קוורץ ומחטים בורוסיליקט ניתן לראות בטבלה 1; הפרמטרים עשויים להשתנות עבור אלו שלוחצים שונים של חוטים. - הפעל את פולר מחט כדי ליצור את המחט הנכון. חזור על צורך ייצור מחטים מרובים.
הערה: ניתן לאחסן מחטים משך על-ידי הצבתם לתוך צלחת פטרי המכילות שבמקביל מספר גלילים מחימר של התיקים מסחרי. - מסגרת משופעת של מחט על-ידי נגיעה במקצת את הטיפ יהלומים מחוספסים לצלחת בסביבות 10 s ב- 25 ° C (איור 2- iii).
הערה: המחטים הזרקת תועלת שיפוע באמצעות קידום כניסתו העוברים עם נזק מינימלי תוך שיפור בו זמנית את הזרימה של חברי ההנהלה דרך המחט.
4. העובר Microinjection
- להכין לתערובת הזרקת המורכב של הגנום השינוי ריאגנטים (למשל, transposon + עוזר transposase, או CRIPSR ריאגנטים, וכו '.), ולשמור אותו בקרח.
- לטעון את המחט הזרקה עם 2 µL של הזרקת תערובת באמצעות טיפים microloader.
הערה: התערובת הזרקת הפגינו בפרוטוקול מורכב יחיד-מדריך RNA (sgRNA) (s), חלבון רקומביננטי Cas9 מעורב ב H2O. - מקם את השקופית זכוכית עם העוברים שורות לבמה של מיקרוסקופ המתחם.
- הכנס היטב את המחט בקצה האחורי של העובר עם זווית אנכי של 25-35 מעלות.
הערה: אם התערובת הזרקה מדי מוזרק העובר זה ייתכן פרץ לסילוק הציטופלסמה של העובר. בנוסף, באופן לא תקין משופע או שבור מחטים עם גדול מדי של פתיחה עלולים גם הם לגרום קרע העובר.
- נסה מחדש מסגרת משופעת מחטים אם סתימת מתרחשת. הציטופלסמה של vitripennis (ש ע) העוברים הוא באופן חריג צמיגה, דביק, מה שמוביל המחט תכופים סתימת (1/25 זריקות).
הערה: חשוב לשמור את העוברים לחות במהלך תקופת הזרקת בהוספת מים מיוננים שימוש במכחול באופן קבוע. כמות המים על המברשת היא המפתח כדי לנוע עוברי ליישר בקלות. מדי מים תוצאות עוברי מים צפים מעט מדי גורם להם קשה לנוע. - להזריק ~ 20-40 ביצים בבת אחת (אמור לקחת בערך 10 דקות), אז תפסיק. להעביר את הביצים מוזרק באמצעות מברשת צבע רטוב על-ידי נגיעה בקלילות את הביצים מוזרק, למקם אותם לתוך מחשב מארח. ואז להמשיך להזריק שוב באמצעות טרי שזה עתה זיון אצווה של ביצים (> הישן 1 h).
הערה: באופן אידיאלי פרוטוקול זה הוא היעיל ביותר אם אדם אחד ללא הרף איסוף בתור ביצים, בעוד אדם אחר הוא הזרקת רכיבי השינוי של הגנום משתילים עוברי מוזרק אל המחשב המארח הגלמים.
5. משתילים Injected G0 vitripennis (ש ע) העוברים על גבי Pre-stung מארח
- בזהירות המקום העוברים0 גרם מוזרק אל בעבר נעקץ ס bullata גלמי (איור 2- vi) באמצעות מברשת צבע רטוב לאחר microinjection.
הערה: הגלמים מארח המשמש לאיסוף העוברים על microinjection יעבוד למטרה זו. בנוסף, למרות מאמץ משמעותי, יש כיום אין מזון מלאכותי זמין זה יכול להיות בשימוש22.- הצב עוברי עד 40 מוזרק אחת בכל פעם על גבי מארח נעקץ מראש אחד כדי למנוע תחרות, צפיפות זחל.
הערה: הזרקת יגרום נזק העוברים; השתלת רשלנית של העוברים מוזרק אל הגלמים המארח יכול לסחוט את הרכיב מוזרק או החלמון, להוביל למותו של העוברים.
- הצב עוברי עד 40 מוזרק אחת בכל פעם על גבי מארח נעקץ מראש אחד כדי למנוע תחרות, צפיפות זחל.
- למקם את הגלמים מארח צלחת פטרי עם נייר סינון לח, כדורי צמר-גפן, דגירה אותם 25 ° c עם בערך 70% לחות עד עוברי מוזרק בוקעות (בערך 1-2 ימים) (איור 2- vii).
הערה: חשוב, המארחים יכול להישאר עם קלופים puparium, את vitripennis (ש ע) ביצים יתפתחו בדרך כלל כל עוד הם מודגרת בתוך תא humidified (צלחת פטרי עם נייר סינון לח, כדורי צמר-גפן) כדי למנוע לייבוש. מספיקה המקננת בטמפרטורת החדר, עם לחות מן הכדורים כותנה לחה, במקרה שלא ניתן לשלוט לחות. - העברת הגלמים מארח לתוך צלחת פטרי חדש ב 70% לחות ו- 25°C לאחר G0 עוברי הפתח.
- לנטר את המחשב המארח הגלמים וזחלים מוזרק G0 מדי יום. אם הגלמים המארח יש ריח רע, להעביר את הזחלים מוזרק הגלמים מארח בריאה חדשה.
6. הקרנת עבור שינויים הגנום
- הסר כל גלמי vitripennis ש המארח באמצעות מברשת הצבע בסדר או העובר פיק. שהוחדר G0 הזחלים צריך pupate בסביבות 8 ימים שלאחר ההזרקה.
- המקום כל גולם שהוסר לתוך בקבוקון זכוכית מבודדת מחובר עם כותנה ולאפשר להם לצאת כמו G0 מבוגרים, המבטיח כי הנקבות המקווקו תהיה בתולה אשר יסייע עם צלבים גנטי במורד הזרם.
הערה: נקבות ניתן למיין מן הזכרים לפי אורך הזרוע: נקבות יש כנפיים יותר אשר להרחיב מעבר לפרופיל הגוף כשמלאו בצד. ניתן להציב כל הגלמים הנשי microinjected יחד לתוך בקבוקון פקוק, אותו הדבר חל על גלמי זכרים. - מסך G0 יחידים, לאחר וגיחתו על-ידי ה-PCR גם או ויזואלית (אם לשבש את פעולת הגן פנוטיפי). לדוגמה, אם CRISPR משמש ליצירת מחיקות בגן נתון הגן שיבשו מקנה הפנוטיפ גלויים, ואז למיין ולשמור אנשים עם גירסת מוטציה פנוטיפ המושפע (איור 2- viii)21. אם, לעומת זאת, הגן המושפעת מקודד עבור הפנוטיפ גלויים, כגון מוטציה של ג'ין חיוני, לבצע ערכה המעבר (קרוס G0 זכר עם נקבה פראי סוג או קרוס G0 נקבה עם זכר פראי סוג) כדי לשחזר לבין מסך עבור מוטציות heritable דרך assaying קטלני או עקרות.
הערה: דומה melanogaster ד, מבוגרים vitripennis ש יכול להיות מרותק למיטה על ידי חשיפה CO2 המאפשרות מניפולציה פשוטה. יתר על כן, נקבות unmated יהיה להצמיח האפרוחים זכר הפלואידי 100%, אז לכן שנקבה unmated מוטציה יכולים להצמיח מספר גדול של הזכרים מוטציה יכול לשמש לצורך ניתוח מאוחר יותר.
הערה: מוטציות בגנים חיוניים יהיה צורך להיות כל הזמן על ידי הזדווגות ששרד G0 מוזרק נקבות (ככל הנראה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור מוטציה) זכרים פראי סוג; במקרה ספציפי זה, מחצית הוא צאצא זכר1 G צריך למות בגלל הורשת המוטציה קטלני, בעוד חצי צאצאים נקבה1 G יהיו נשאים של שוק. - Outcross G0 מבוגרים על מסך G רומא1 עבור הוספות transgene באמצעות סמנים transgenesis אם המטרה היא transgenesis. כעת transgenesis נשאר להדגים ב vitripennis ש.
Representative Results
פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורט המושבה לגידול, אוסף blastoderm מראש העובר, יישור, microinjection של השתלת הבאים לאחר ההזרקה, יכול לשמש עבור הנדסה הגנום יעיל ב- vitripennis ש. כפי שמוצג באיור2, רצף השלבים עבור microinjection מוצלח לתוך vitripennis ש כללי כוללים: (i) המתיר מבוגרים זכרים ונקבות להזדווג (~ 4 ימים), (ii) אספקת גלמי לטוס טרייה המארח (S. bullata) ממוקם הכנס קצף ששונה נקבות ובסיומה, המאפשרות ההטלה (~ 45 min), (iii) בזהירות פילינג משם את הקוטיקולה הגלמים המארח parasitized כדי לחשוף ולאסוף שלב טרום blastoderm צרעה עוברי (~ 15 דקות), יישור (iv) שנאספו עוברי (~ 15 דקות), (v) רכיבי השינוי הגנום microinjecting לתוך עוברי (~ 15 דקות), העוברים מוזרק מהצבת בקפידה (vi) חזרה אל המארחים נעקץ מראש כדי לאפשר פיתוח תקין (~ 15 דקות), ו (vii) מניעת התייבשות של המחשב המארח/העובר מוזרק על ידי העברת אותם לתא humidified עם בערך 70% לחות יחסית (~ 15 דקות). המארחים parasitized ואז מודגרת למשך בערך 14 ימים כדי לאפשר את התפתחות מלאה של עוברי vitripennis ש . ברגע מוזרק, מבוגרים מגיחים המארח (השמיני), לבודד, חבר, לבין מסך אותם בנפרד לנוכחות של מוטציות הצפוי.
חדירה יעיל מחט, microinjection לתוך vitripennis ש עוברי, מספר סוגים של מחטים נימי זכוכית עם נימה כולל סוגי הקוורץ, aluminosilicate ובורוסיליקט נבדקים. הוא נמצא כי האיכות של המחט הוא קריטי עבור הימנעות שבירה/סתימת במהלך ההזרקה, להשגת שיעור גבוה של שני יעילות הישרדות וטרנספורמציה של העובר. עבור כל סוג הזכוכית, פרוטוקול יעיל פותחה כדי למשוך מחטים כדי יש הרצוי תת-עורית דמוי זמן טיפ יעיל עבור vitripennis ש microinjection העובר באמצעות אלו שלוחצים micropipette שונים (P-1000, ו P-2000) (טבלה 1 איור 4).
כדי למטב את ההליך, נמדדים שיעורי ההישרדות לאחר ההזרקה של כמויות משתנות של הגנום שינוי רכיבים. הגנום שינוי הרכיבים המשמשים כאן היו מעורבים RNAs הוראות Cas9 חלבון עבור גנום בתיווך CRISPR עריכה, אשר היו הפגינו בעבר לעבוד גם ב vitripennis (ש ע)21. בדומה למה שהיה קודם לכן דיווח, כאן פילוח sgRNA הגן כינאבאר ותחתית מסונתז. על ידי מיקוד ומפריעה גן זה, החלפת פנוטיפי הניתנות לזיהוי בקלות הוא לראות את צבע העיניים של19,האורגניזם21. תערובת הזרקת המשלבת בתוכה מגוון של ריכוזים של sgRNA (0, 20, 40, 80, 160, ו 320 ng/µL) עם חלבון Cas9 (0, 20, 40, 80, 160, ו 320 ng/µL) נוצר, מוזרק העוברים מסוג הפרוע vitripennis ש. שיעור ההישרדות של עוברי מוזרק הוא נמצא כדי להיות תלוי במינון (טבלה 2)21. ריכוז מוגבר של sgRNA ו- Cas9 חלבון להוביל שיעורי ההישרדות ירד (טבלה 2), אולי בגלל תופעות מוספים את המטרה. לחות גבוהה (~ 70%) נמצא גם חשוב להישרדות העובר לאחר ההשתלה למארחים, כמו לחות נמוכה (~ 10%), גרמו 100% מוות כל העוברים מוזרק.
איור 1 . הכנת הגלמים המארח (S. bullata) עבור vitripennis ש העובר ההטלה. (א) יאנג, גלמי bullata ס הישן. גלמים מבוגרת יש לציפורן כהה יותר ואילו הצעיר גלמי יש גוון אדמדם יותר כדי לציפורן שלהם. הגלמים הצעירים עדיפים למקסם ההטלה. ניתן גם להבחין וקצה אחורי קדמי של הגלמים על-ידי "דמוי מכתש פתיחת בקצה האחורי, ואילו בקצה הקדמי מגיע לנקודה מעוגל. (B) המארח (S. bullata) גולם לקראת ההטלה העובר ש vitripennis . הוספת הגלמים מארח לתוך פקק קצף כי יש לו את הגלמים בגודל חור בנה. יש את הצד האחורי של הפנים הגלמים מארח בתוך התקע בעוד 0.2 ס מ בקצה הקדמי חשוף כדי לאפשר ריכוז מרבי של הטלה לתוך האזור הקדמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . ציר זמן עבור יצירת vitripennis ש מוטציות מאת microinjection. ציר הזמן של אוסף העובר (ש ע) vitripennis , microinjection CRISPR/Cas9 ושגרות שלאחר ההזרקה. (ש ע) vitripennis מבוגרים הורשו להזדווג בהעדר אתר ההטלה של ארבעה ימים (אני). טרי, זבוב הבשר מארח הגלמים, ס bullata, בתוך פקק קצף באשר רק לחשוף 0.5 ס מ של הסוף האחורי, הבאים, הוצגה בפני הנקבות gravid למשך 45 דקות כדי לאפשר parasitization (ii). במקביל הוכנו הזרקת חומרים כולל מחטים microinjection ורכיבים CRISPR/Cas9 (iii). העוברים היו הנאסף מהמחשב המארח (iv), מיושר (v), מוזרק עם רכיבים CRISPR/Cas9 (vi). העוברים מוזרק היו בקפידה להחזיר את מארח נעקץ מראש (vii), מודגרות עד מפותחת (14 ימים) (השמיני). כאשר המבוגרים הגיח, מוטציות הוקרנו על פנוטיפים של מוטציות CRISPR/Cas9 המושרה הצפוי הגן היעד (ix). ההליך כולו אורכת בדרך כלל 19 ימים כדי להשלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . שקופיות מיקרוסקופ ששונה לצורך התאמת עוברי. (א) א coverslip. (B) של שקופיות מיקרוסקופ. (C) התקן יישור של העובר.Coverslip יכול להיות דבוק לשקופית מיקרוסקופ כדי לשמש קו עוברי להזרקה. המטרה של coverslip היא לפעול כמו קצה כדי לאפשר טיפול קל, הציפוי הפנימי של העוברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הכנה מחט ההזרקה. (א) דוגמאות aluminosilicate טוב ורע זכוכית מחטים. (B) קצות המחט משופע unbeveled כראוי משופע, גרוע. Aluminosilicate זכוכית צינורות קפילר הוסרו על-ידי שימוש של פולר micropipette. העצות המחט המיוצר היו אז פתח בעדינות ומעודן באמצעות של beveler. המחט המשופעים טוב יש קצה חד מאד, המחט המשופעים רע יש קצה קהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סוג זכוכית נימי | מודל פולר המחט סאטר | חום | פילמנט | מהירות | עיכוב | משוך | לחץ |
| קוורץ | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| Aluminosilicate | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| בורוסיליקט | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
טבלה 1. הגדרות עבור מחט פולר.
הערה: ההגדרה פולר המחט להשתנות מכונת מכונת אז כל המעבדה יהיה עליך למטב את הגדרות פולר משלהם המחט. טבלה זו שונתה מ- Li. et al. 21
| sgRNA-1 | Cas9 | סה כ עוברי | השתלת (10% לחות) | השתלת (70% לחות) | |||
| הזחלים ניצולים | הזחלים ניצולים | ניצולים מבוגרים | |||||
| סה כ (%) | סה כ (%) | ♂ | ♀ | סה כ (%) | |||
| אין הזרקה | אין הזרקה | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| מים | מים | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 ng/µL | 20 ng/µL | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 ng/µL | 40 ng/µL | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 ng/µL | 80 ng/µL | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 ng/µL | 160 ng/µL | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 ng/µL | 320 ng/µL | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
בטבלה 2. הזרקת והשתלות שאירים מוטגנזה מכוונת וקצבי בהתבסס על זריקות של ריכוזים שונים של sgRNA ושל Cas9. טבלה זו שונתה מ- Li. et al. 21
Discussion
רצף האחרונות של הגנום vitripennis ש יש שיחרר צורך חשוב כלים לאפיין באופן פונקציונלי הגנים לא ידוע בתוך זה מינים23. מערכת CRISPR-Cas9, וכלים רבים אחרים ג'ין העריכה, הוכיחו להיות יקר בחקירת פונקציות ג'ין עבור מספר אורגניזמים24. עם זאת, כדי ליצור מוטציות heritable, כלים אלה דורשים ביצוע העובר microinjections. לכן, הפגינו הנה טכניקה חזותית מפורטת כולל מספר חידושים המאפשרים יעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjections.
בסך הכל, טכניקה זו מפורט מציע מספר חידושים משמעותיים, לגבי שיטות קיימות23, המאפשרות יעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjections. לדוגמה, כדי להקל על האוסף מהירה של העוברים, כלי ההטלה (קצף פקק) הוא נוצרים ונמצאים בשימוש כדי להגביל את הנחת לחלוטין לקצה האחורי של המחשב המארח (איור 1), אשר מאוד מקל אוסף של רבים העוברים בתוך ביצה תקופה קצרה של זמן. שיטות לגידול צרעה מושבות עם מספרים גדולים כדי לאסוף מספר רב יותר של ביצים משופרת גם ומוגדר. בנוסף, כדי להאיץ עובר יישור, מפותחת התקן יישור העובר, מה שמאפשר עבור עוברי ביעילות מיושר, מוזרק מבלי להשתמש דו-צדדית קלטת דביק כדי לאבטח את העוברים במקום (איור 3).
יתר על כן, הוא נמצא כי על ידי שמירה על לחות עם מים העוברים במהלך ההזרקה ולא desiccating את העוברים או מכסה אותם עם שמן שיפרה שיעורי ההישרדות. בנוסף, נבדקים מספר סוגי זכוכית נימי, נקבעים פרמטרים כדי לבנות את המחטים מושלם עבור vitripennis (ש ע) microinjection (טבלה 1, איור 4). יתר על כן, microinjection הבאות, הישרדות העובר תעריפי אפשרות להגדיל באופן משמעותי עקב המקננת ביצים מוזרק המארחים מראש נעקץ להציב בתאי לחה (70%). חידושים אלה מאפשרים שגרה microinjection יותר יעילה ומצליחה vitripennis ש.
ניתן לבצע שינויים מזעריים במונחים של מכשיר הזרקה, והגידול הליכים פרוטוקול זה, בהתאם להעדפות משתמש. עם זאת, מספר צעדים קריטיים יהיה חיוני ליצירת מוטציות בהצלחה ב- vitripennis (ש ע). לדוגמה, עובד מהר. כך הם עוברי מוזרק > העתיקה h 1, ומבטיחה כי מחטים הזרקת אינם חדים מספיק. למזער את הנזק העובר שנינו נהיה חיוני. בעוד פרוטוקול זה צריך להיות יעיל ליצירת מוטציות בגנים רבים (אם לא כולם), מגבלה אחת גדולה היא הדרישה CRIPSR/Cas9 למטרה רצף פאם (הגולה) אשר יכתיב את רצף היעד.
לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקה זו משופרת כדי ליצור סוגים רבים של הגנום שינויים, כגון מוטציות, מחיקות, ואולי אפילו הוספות באמצעות טכנולוגיות CRIPSR/Cas921, או אפילו transgene הוספות ליצירת הטרנסגניים (ש ע) vitripennis, אשר צריך להאיץ באופן משמעותי הפונקציונלית במחקר האורגניזם הזה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נדיב, שבוצע באוניברסיטת קליפורניה, מעבדה ריברסייד (UCR) סטארט-אפ לקרן O.S.A, משרד החקלאות המכון הלאומי של המזון, החקלאות (NIFA) פתח פרוייקט (1009509) O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
