Summary
Микроинъекции Nasonia vitripennis эмбрионов является важным метод для генерации изменения наследственными генома. Описанные здесь является детальная процедура микроинъекции и трансплантации эмбрионов Nasonia vitripennis , что значительно облегчит будущие генома манипуляции в этом организме.
Abstract
Драгоценность осы Nasonia vitripennis возник как систему эффективной моделью для изучения процессов, включая определение пола, определение пола haplo диплоидные, яд синтеза и хост Симбионт взаимодействий, среди других. Основным ограничением работы с этого организма является отсутствие эффективных протоколов для выполнения изменения направлены генома. Важной частью генома модификации является поставка реагентов, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 молекулы, в том числе в эмбрионов путем микроинъекции редактирования. В то время как микроинъекции в многих модельных организмов, этот метод является особенно сложным для выполнения в N. vitripennis главным образом из-за его небольшой эмбриона размер и тот факт, что развитие эмбриона происходит полностью в пределах Воднорастворимый blowfly куколки. Следующая процедура преодолевает эти серьезные проблемы, в то время как демонстрации обтекаемый, визуальные процедуры для эффективного удаления осы эмбрионов от паразитируют хост куколок, microinjecting их, и тщательно трансплантировать их обратно в принимающей для продолжения и завершения разработки. Этот протокол будет сильно укрепить потенциал исследовательских групп выполнять расширенные генома изменения в этом организме.
Introduction
Драгоценность Оса, н. vitripennis, является одним из четырех видов в пределах рода Nasonia , которые эктопаразитоидов плоти есть мух например аристолохиевая пузырчатая1. Из-за их быстрый поколений периодов, простота воспитания в лаборатории и целый ряд уникальных и важных биологических атрибутов, н. vitripennis был фокус для разработки нескольких экспериментальных инструментов, найденных в традиционной модели организмов . Например некоторые уникальные биологические атрибуты включают в себя haplo диплоидные воспроизводства системы2, отношения с микробов и генетические паразитов3,4и supernumary (B) хромосомы5,6 ,7. Взятые вместе, они делают N. vitripennis важным экспериментальная система для экспериментов, направленных на изучение молекулярных и клеточных аспекты этих процессов, помимо других включая яд производства8, 9, секс определение10,11и эволюция и развитие оси модель формирования12,,1314. Кроме того генетические инструментарий для изучения биологии N. vitripennis резко возросли за последние десять лет или так, с секвенирования генома с высоким разрешением15, несколько экспрессии генов исследований16,17,18и возможность функционально нарушить экспрессии генов, полагаясь на РНК-интерференции (RNAi)19,20, которые вместе улучшили уступчивость и возможности выполнения обратной генетики в этом организме.
Несмотря на множество важных научных достижений и расширенных инструментов в этом организме по состоянию на настоящее время знаний только одна группа успешно выполнил эмбриональных микроинъекций для создания генома наследственные изменения21. Это главным образом из-за трудностей работы с эмбрионами N. vitripennis , как они довольно хрупкие и малых, будучи ~2/3 размер Drosophila melanogaster эмбрионов, делая их обычно трудно манипулировать. Кроме того н. vitripennis самок депонировать свои яйца на предварительно задело blowfly куколок, в рамках которых происходит полностью и эмбриогенеза, личинки, куколки развития. Таким образом для успешного микроинъекций, предварительно бластодермы стадии, эмбрионы должны быть эффективно собраны из принимающих куколок, быстро microinjected и сразу же пересаженные обратно в их хосты для развития. Эти шаги требуют точность и ловкость, чтобы избежать повреждения microinjected эмбрионы, или куколки узлов, что делает технику исключительно сложной. Несмотря на это существует один короткий протокол, опубликовано более десяти лет назад, описывающий N. vitripennis эмбриона микроинъекции22. Однако эта процедура требует сморщившимися свежезаваренным положил эмбрионов, он использует клейкой лентой, чтобы якорь яйца для микроинъекции и не включают в себя визуальные демонстрации техники. Таким образом описанные здесь это обновленный и пересмотренный Протокол, включая визуальные процедуры, подробно улучшения шаг за шагом протокол для микроинъекций эмбриона N. vitripennis , которые могут сопровождаться любой базовой лаборатории для создания наследуемого генома изменения в этой важной моделью насекомых.
Protocol
1. N. Vitripennis колонии воспитания
- Настройка несколько колоний (~ 3-5), поместив 200-500 н. vitripennis взрослых (при соотношении 3:1 женщины: мужчины) в клетках общежитии ошибка.
Примечание: Альтернативой использованию ошибка общежития, осы также могут распространяться в нескольких, небольшие стеклянные пробирки, подключены с хлопка с примерно 15-20 ОС/флакон.- Поддерживать осы 25 ± 1 ° C с относительной влажности 30% и 12:12 света темные цикл, кормит их ежедневно с маленькие капельки 1:10 (v/v) сахарозы/водный раствор.
Примечание: Распространение осы колоний и коллекции могут также проводиться при комнатной температуре без контролируемой влажности; Однако температура ниже 25 ° C будет немного ниже сроков развития эмбрионов.
- Поддерживать осы 25 ± 1 ° C с относительной влажности 30% и 12:12 света темные цикл, кормит их ежедневно с маленькие капельки 1:10 (v/v) сахарозы/водный раствор.
- Разрешить осы mate для по крайней мере за 4 дня до инъекции.
- За первые два дня, позволяют растяжением женщин кормить на свежий S. пузырчатая куколки, а также маленькие капельки 1:10 (v/v) сахарозы/водный раствор.
- Для следующих двух дней удалите blowfly куколки лишить женщин осы сайта откладки яиц, что делает их очень беременных.
2. сбор и выравнивание N. Vitripennis этап предварительной бластодермы эмбрионов
- Разрешить женского осы для паразитируют (разведению эмбрионов) в молодых хостов (S. пузырчатая куколки). Чтобы сохранить свежий хостов, хранить хостов в 4 ° C сразу же после их получения и удалить только при необходимости.
Примечание: Молодые хостов может быть определен путем иметь красный цветной puparium, тогда как старые хозяева имеют темный цветной puparium (рис. 1A).- Место индивидуальных свежие S. пузырчатая куколки в пробку пены с отверстием куколок размера вырезать в центр. Предоставляют только ~ 0,2 см переднего конца (предпочтительный откладка сайт) узла для максимальной концентрации parasitization и легче эмбриона коллекции.
Примечание: Округлены в передний конец, в то время как задний конец, толще и содержит «кратер как» открытие (рис. 1B). - Место пребывания куколки (примерно 5 принимающих куколки за 100 ОС) в этой договоренности в клетку и ждать примерно 45 минут, чтобы позволить осы паразитируют их (рис. 2- ii).
Примечание: Это очень важно, что эмбрионы молодых, насколько это возможно, в идеале в течение первого часа oviposited, чтобы обеспечить, что они находятся в стадии предварительного бластодермы. Старый эмбрионов (> 1,5 ч) не должен быть введен. - Удаление количеству хостов, получая их от руки и осторожно чистки/продувания любого проживающего осы. Заменить их свежие узлы после каждого ~ 15 мин продолжать собирать рано поставил яйца во время инъекции.
- Место индивидуальных свежие S. пузырчатая куколки в пробку пены с отверстием куколок размера вырезать в центр. Предоставляют только ~ 0,2 см переднего конца (предпочтительный откладка сайт) узла для максимальной концентрации parasitization и легче эмбриона коллекции.
- Вручную удалите свежезаваренным количеству хостов из клетки. Под микроскопом рассечения, используя пинцет тщательно очистите от заднего конца (0,4 см) наружных puparium (куколки оболочки) подвергать N. vitripennis яйца (рис. 2- iii).
Примечание: Необходимо быть осторожность во избежание проколов кожи куколки; Если это произойдет, гемолимфа смачивают осы эмбрионов, которые будет очень трудно удалить микроинъекции. - Используйте жидкий клей клей coverslip на слайд чистого стекла подготовить слайд выравнивание эмбриона (рис. 3).
Примечание: Высокая производительность Мгновенный клей используется для повышения адгезии и сушки скорость, однако любой клей, который может держать coverslip передвигаться на слайд является приемлемым. - Автомобиль эмбрионы от хоста тщательно с мокрой кистью штраф наконечник, убедившись в том, чтобы не повредить мягкие куколки кожу хозяина.
Примечание: ' выбрать эмбрион,' который является по существу половина пары ультрадисперсных щипцов, может использоваться вместо кисти. - Трансфер ~ 20 эмбрионов один на один на слайд, непосредственно примыкающем к стороне coverslip с мокрой кистью. Ориент переднего конца эмбриона против слайд крышка края так, чтобы задний конец эмбрионы указал в том же направлении (Рисунок 2- iv). Это позволит обеспечить высокую точность путем инъекций в ту же позицию среди всех эмбрионов.
Примечание: Этот метод более не требуют двухсторонняя клейкая лента для исправить эмбрионов на слайд, как описано ранее21,22. Кроме того не забираются эмбриона, или крышки яйца с маслом галоидоуглеводородов во время инъекции, как описано выше для N. vitripennis эмбриона микроинъекции22.
3. Подготовка иглы для микроинъекций
- Поместите алюмосиликатного стекла капилляров в съемник иглы.
Примечание: Хороший игла имеет решающее значение для успешного N. vitripennis эмбрионы инъекции. Инъекционным иглам должен иметь острые и штраф наконечник позволяет легко проникновения через хориона. Кварц и боросиликатного капиллярного иглы также может быть использован (рис. 4). - Установите тепла до 605, скорость до 130, задержки до 80, тянуть до 70 и давление до 500 на иглы съемник.
Примечание: Дополнительные иглы съемник настройки для буксировки кварца и боросиликатного иглы можно увидеть в таблице 1; параметры могут различаться для разных Съемники и нитей. - Активируйте иглы съемник для создания правильного иглы. При необходимости повторите для производства несколько игл.
Примечание: Вытащил иглы могут храниться, помещая их в чашке Петри, содержащий несколько параллельных рулоны коммерческих моделей глины. - Скос кончик иглы, слегка касаясь кончика к пластине абразивные алмазные около 10 s при 25 ° C (рис. 2- iii).
Примечание: Инъекционным иглам выгоду от фаски путем поощрения вступления в эмбрионов с минимальным ущербом при одновременно увеличения потока регенты через иглу.
4. эмбриона микроинъекции
- Подготовить раствор для инъекций смесь, состоящую из генома модификации реагенты (например, transposon + вспомогательный Транспозаза, или CRIPSR реагенты, и т.д.) и держать его на льду.
- Загрузите иглу с 2 мкл инъекции смеси с помощью microloader советы.
Примечание: Смеси инъекции, продемонстрировал в протоколе состоит из одного руководство РНК (sgRNA) (s) и Рекомбинантный белок Cas9, смешанные в H2O. - Место стекла слайд с подкладом эмбрионы на стадии составной микроскоп.
- Осторожно вставьте иглу в задний конец эмбриона с вертикальный угол 25-35 °.
Примечание: Если смесь слишком много инъекции вводят в эмбриона он может лопнуть, развенчание цитоплазмы из эмбриона. Кроме того, неправильно скошенный или сломанные иглы с слишком большой открытия также может вызвать разрыв эмбриона.
- Попробуйте повторно фаски иглы в случае засорения. В цитоплазму н. vitripennis эмбрионы необычно вязкой и липкое, что приводит к частым иглы, засорения (1/25 инъекции).
Примечание: Важно сохранить эмбрионы влажный период впрыска, регулярно добавив деионизированной водой с помощью кисти. Количество воды на кисть является ключом для перемещения эмбрионов и выровнять с легкостью. Слишком много воды приводит к эмбрионов, которые плавающей и слишком мало воды делает их трудно передвигаться. - Придать ~ 20-40 яйца в то время (занимает примерно 10 минут), затем остановить. Передача вводят яйца с мокрой кистью, слегка касаясь вводят яйца и поместите их в узел. Затем продолжить инъекций, снова используя свежие недавно заложили партии яиц (> 1 час старый).
Примечание: Идеально этот протокол является наиболее эффективным если один человек постоянно сбора и выстраиваются яйца, а другому лицу инъекций компоненты модификации генома и пересадка вводят эмбрионов для хоста куколок.
5. пересадка эмбрионов N. vitripennis на Pre-stung принимающей Injected G0
- Осторожно поместите вводят G0 эмбрионов на ранее задело S. пузырчатая куколки (Рисунок 2- vi) с мокрой кистью после микроинъекции.
Примечание: Хост куколок, используемые для сбора эмбрионов для микроинъекции будет работать для этой цели. Кроме того несмотря на значительные усилия, в настоящее время нет доступных искусственные диеты, которая может быть использоваться22.- Место до 40 эмбрионы вводят один на один раз на один узел предварительно задело чтобы избежать переполненности и личинок конкуренции.
Примечание: Инъекции может привести к повреждению эмбрионов; небрежно трансплантация вводят эмбрионов для куколок хост может сжать вводят компонента или желток и привести к смерти эмбрионов.
- Место до 40 эмбрионы вводят один на один раз на один узел предварительно задело чтобы избежать переполненности и личинок конкуренции.
- Место пребывания куколки в чашку Петри с влажной фильтровальная бумага и ватные шарики и инкубировать их при 25 ° C с примерно 70% влажности, пока эмбрионы вводят Люк (примерно 1-2 дня) (Рисунок 2- vii).
Примечание: Важно отметить, что хосты могут быть оставлены с очищенные от puparium и н. vitripennis яйца будут нормально развиваться до тех пор, пока они инкубируют в камере увлажненные (Петри блюдо с влажной фильтровальная бумага и ватные шарики) для предотвращения высыхания. Инкубации при комнатной температуре и влажности от смоченной ватные шарики достаточно, в случае, если влажность не может контролироваться. - Передача принимающей куколки в новой Петри на 25°C и влажности воздуха 70% после G0 эмбрионов люк.
- Мониторинг хост куколок и вводят личинки0 G ежедневно. Если хост куколок имеют неприятный запах, передавать новые куколки здорового пребывания вводят личинки.
6. Скрининг для изменения генома
- Удаление каждого N. vitripennis куколки от узла, с помощью тонкой кисточки или эмбриона забрать. Вводят личинки0 G должен окукливаются инъекции пост около 8 дней.
- Место каждого удалены куколки в изолированной стеклянный флакон подключен с хлопком и позволить им выйти как взрослые0 G, обеспечивая что вылупившиеся женщин будет девственной который поможет с течению генетических кресты.
Примечание: Самки могут быть отсортированы от мужчины, Длина крыла: женщины имеют больше крылья, которые удлиняют мимо корпус профиль при включении на стороне. Все microinjected женские куколки могут быть помещены вместе, во флаконе подключен, и то же самое относится к мужской куколок. - Экран G0 лиц, после eclosion, либо ПЦР или визуально (если нарушая фенотипические гена). Например, если ТРИФОСФАТЫ используется для создания исключений данного гена и нарушается ген дает видимый фенотип, затем отсортировать и держать людей с черепашки версии затронутых фенотип (Рисунок 2- viii)21. Если, однако, пострадавших ген кодирует для неотображаемых фенотип, таких как мутант важно генов, выполните пересечение схемы (крест G0 мужчины с женщиной дикого типа, или женщина с дикого типа мужчины крест0 G) для восстановления и экран для наследственные мутантов через опробование летальности или бесплодия.
Примечание: Похож на D. melanogaster, н. vitripennis взрослых может быть иммобилизованным под воздействием CO2 позволяет для простой манипуляции. Кроме того unmated женщин приведет к 100% гаплоидным мужской выводка, поэтому женщина мутантов unmated может привести к большое количество мутант мужчин, которые могут использоваться для последующего анализа.
Примечание: Мутации в важно генов нужно будет храниться спаривания сохранившихся G0 вводили женщин (предположительно гетерозиготных мутации) и дикого типа мужчин; в данном конкретном случае половина мужского потомства1 G должен умереть из-за наследования смертоносных мутации, в то время как половина потомства женщин1 G будет носителей смертоносной. - Подмес G0 взрослых и экран G1 потомства для вставки трансген, используя маркеры трансгенез, если целью является трансгенез. В настоящее время трансгенез остается будет продемонстрирована в н. vitripennis.
Representative Results
Этот протокол предоставляет подробные руководящие принципы для воспитания колонии, предварительно бластодермы эмбриона коллекции, выравнивание, микроинъекции и последующей трансплантации после инъекции и может быть использована для эффективного генома инженерии в н. vitripennis. Как показано на рисунке 2, Общая последовательность шагов для успешного микроинъекции в N. vitripennis включают: (i) разрешительные взрослых мужчин и женщин к спариванию (~ 4 дней), (ii) поставки свежих хост летать куколки (S. пузырчатая) помещены в изменение пены вилка растяжением самок и позволяя для откладки яиц (~ 45 мин), (iii) тщательно пилинг от количеству хост куколок кутикулы, чтобы разоблачить и собирать предварительно бластодермы стадии осы эмбрионов (~ 15 мин), (iv) выравнивание собранные эмбрионов (~ 15 мин), (v) microinjecting компоненты модификации генома в эмбрионов (~ 15 мин), (vi) тщательно размещение эмбрионы вводят обратно в предварительно задело хостов для надлежащего развития (~ 15 мин), и (vii) Предотвращение обезвоживания вводят эмбриона/принимающей страны путем передачи их в увлажненные камеру с примерно 70% относительной влажности (~ 15 мин). Количеству хостов затем инкубируют для примерно 14 дней для полного развития эмбрионов N. vitripennis . После того, как вводили, взрослых выйти из узла (viii), изолировать, мате и экран их индивидуально на наличие ожидаемого мутаций.
Для проникания эффективное иглы и микроинъекции в N. vitripennis эмбрионы проверяются несколько типов капиллярные стеклянные иглы с нити, включая кварц, алюмосиликатные и боросиликатного типы. Он обнаружил, что качество иглы имеет решающее значение для предотвращения поломки/засорения во время инъекции и для достижения высоких темпов выживания и преобразование эффективности обоих эмбриона. Для каждого типа стекла, эффективный протокол был разработан тянуть иглы для того, чтобы иметь желаемый подкожных как длинный наконечник эффективным для N. vitripennis микроинъекции эмбриона с использованием различных микропипеткой Съемники (P-1000 и P-2000) (Таблица 1 Рисунок 4).
Чтобы оптимизировать процедуру, выживаемости измеряются после введения различное количество компонентов изменения генома. Компоненты изменения генома, используемые здесь были смешанные руководство РНК и белка Cas9 для ТРИФОСФАТЫ опосредованной генома редактирования, которые были продемонстрированы ранее хорошо работать в N. vitripennis21. Подобно к что было ранее сообщалось, здесь sgRNA ориентации, разработан и синтезированных киноварь ген. Ориентации и нарушая этот ген, легко идентифицировать фенотипические изменения рассматривается в цвет глаз организм19,21. Смесь инъекции, сочетая различные концентрации sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 и 320 нг/мкл) с Cas9 белком (0, 20, 40, 80, 160 и 320 нг/мкл) создан и вставлен в зародыши дикого типа N. vitripennis. Показатель выживаемости эмбрионов вводят установлено дозозависимое (Таблица 2)21. Повышенная концентрация sgRNA и Cas9 белок приводят к снижению выживаемости (Таблица 2), возможно из-за эффект суммирования пробить. Высокая влажность (~ 70%) находится также имеет важное значение для выживаемости эмбрионов после пересадки узлам, как низкая влажность (~ 10%) привело к смерти 100% к все эмбрионы вводят.
Рисунок 1 . Подготовка принимающей куколок (S. пузырчатая) для N. vitripennis эмбриона oviposition. (A) Молодые и старые S. пузырчатая куколок. Старые куколок имеют темный кутикулы, тогда как молодые куколки имеют более красноватый оттенок для их кутикулы. Молодые куколки являются предпочтительными для максимизации откладки яиц. Задний и передний концы куколки можно выделить также открыв «кратер как на заднем конце, тогда как передний конец приходит к округлые точке. (B) подготовка куколки хост (S. пузырчатая) для откладки яиц эмбриона N. vitripennis . Вставка узла куколки в вилки пены, что куколки размера вырезал отверстие. Иметь задней стороне лица куколок узла внутри вилки, а 0,2 см передний конец действию для максимальной концентрации откладки яиц в область передней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Временная шкала для создания N. vitripennis мутантов путем микроинъекции. Хронология N. vitripennis эмбриона коллекции, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 микроинъекции и впрыск процедур. N. vitripennis взрослых разрешалось mate в отсутствие сайта откладки яиц для 4 дней (я). После, свежие, плоть fly хост куколок, S. пузырчатая, внутри пены пробку а предоставляют только 0,5 см задний конец, была введена для беременных женщин для 45 мин для parasitization (ii). Одновременно (iii) были подготовлены материалы инъекция, микроинъекции иглы и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 компоненты. Эмбрионы были собраны от хоста (iv), выровнены (v) и вводят с компонентами ТРИФОСФАТЫ/Cas9 (vi). Эмбрионы вводят тщательно были переведены обратно на узел предварительно задело (vii) и инкубированы до полностью развитых (14 дней) (viii). Когда взрослые возникла, мутанты были экранированы для фенотипов ожидаемых ТРИФОСФАТЫ/Cas9 индуцированные мутации в гене цели (ix). Вся процедура обычно занимает 19 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Изменение микроскопа для футеровки эмбрионов. (A) A coverslip. (B) микроскопа. (C) устройство выравнивание эмбриона.Coverslip может быть на приклеены микроскопа использоваться для линии эмбрионов для инъекций. Coverslip призвана действовать в качестве кромку позволяет легко манипулировать и накладки эмбрионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Иглы для приготовления инъекций. (A) примеры хороших и плохих алюмосиликатного стекла иглы. (B) советы unbeveled, правильно скошенная и плохо среза иглы. С помощью съемника микропипеткой были вытягиваны алюмосиликатного стекла капилляры. Производимых иглы советы были затем аккуратно открыты и уточнены с помощью оборудованием. Хорошо скошенные игла имеет очень острый кончик, и плохой скошенные иглы имеет тупой совет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Капиллярные стеклянные тип | Саттер иглы съемник модель | Жара | Накаливания | Скорость | Задержка | Тяга | Давление |
| Кварц | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| Алюмосиликатные | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| Боросиликатное | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
Таблица 1. Параметры для иглы съемник.
Примечание: Установка иглы съемник варьируются от машины к машине так каждой лаборатории необходимо оптимизировать свои собственные параметры съемник иглы. Эта таблица была изменена от Li et al. 21
| sgRNA-1 | Cas9 | Всего эмбрионов | Трансплантация (10% влажности) | Трансплантация (влажность 70%) | |||
| Живых личинок | Живых личинок | Взрослые выжившие | |||||
| Всего (%) | Всего (%) | ♂ | ♀ | Всего (%) | |||
| Без инъекций | Без инъекций | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| Воды | Воды | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 нг/мкл | 20 нг/мкл | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 нг/мкл | 40 нг/мкл | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 нг/мкл | 80 нг/мкл | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 нг/мкл | 160 нг/мкл | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 нг/мкл | 320 нг/мкл | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
В таблице 2. Инъекции и трансплантации выживания и мутагенез коэффициенты, основанные на инъекции различных концентраций sgRNA и Cas9. Эта таблица была изменена от Li et al. 21
Discussion
Последние секвенирования генома N. vitripennis развязал важную потребность в молекулярных инструменты функционально характеризовать неизвестных генов в рамках этого вида23. ТРИФОСФАТЫ-Cas9 системы и многие другие инструменты гена редактирования, оказались полезными в расследовании функции гена для ряда организмов24. Однако для создания наследственные мутации, эти инструменты требуют выполнения эмбриона микроинъекций. Таким образом, продемонстрировал, Вот подробный визуальный метод, который включает ряд новшеств, которые позволяют эффективно N. vitripennis эмбриона микроинъекций.
В целом, что этот подробный метод предлагает целый ряд важных нововведений, в отношении существующих методов23, позволяют для эффективного N. vitripennis эмбриона микроинъекций. Например чтобы облегчить быстрое коллекции эмбрионов, инструмент откладки яиц (пена пробкой) создается и используется для ограничения откладки яиц полностью к концу задняя узла (рис. 1), что значительно облегчает совокупность многочисленных эмбрионы в течение короткий период времени. Методы воспитания осы колоний с большим числом собрать большее количество яиц также улучшена и определены. Кроме того чтобы ускорить выравнивание эмбриона, разрабатывается эмбриона выравнивание устройство, которое позволяет эмбрионы эффективно согласовать и вводится без необходимости использования двухсторонняя клейкая лента для обеспечения эмбрионов в месте (рис. 3).
Кроме того выяснилось, что, сохраняя эмбрионы влажные с водой во время инъекций и не осушающий эмбрионы или покрывая их с маслом улучшение выживаемости. Кроме того несколько типов капиллярных стекла тестируются и определяются параметры для создания идеальной иглы для N. vitripennis микроинъекции (Таблица 1, рис. 4). Кроме того следующие микроинъекции, выживаемости эмбрионов, что цены могут значительно увеличить благодаря инкубации вводят яйца в предварительно задело хостов размещены в камерах высокой влажности (70%). Эти нововведения позволяют для более рациональной и успешных микроинъекции процедуры для н. vitripennis.
Можно внесены незначительные изменения с точки зрения инъекции аппарат и воспитания процедуры к настоящему Протоколу, в зависимости от предпочтений пользователя. Однако ряд критических шагов будет существенно важное значение для успешного создания мутантов в н. vitripennis. Например, работая быстро, так что эмбрионы вводят > 1 h старого и обеспечить достаточно острым свести к минимуму ущерб для эмбриона инъекционным иглам оба будет необходимым. Хотя этот протокол должен быть эффективным для генерации мутации в генах, многих (если не все), одним из основных ограничений является требование CRIPSR/Cas9 для PAM (НЭС) последовательность, которая будет диктовать последовательности целевого объекта.
В заключение Этот улучшенный метод может использоваться для создания различных модификаций генома, например мутации, удаления и возможно даже вставки с использованием технологии CRIPSR/Cas921, или даже трансген вставок для создания трансгенных Н. vitripennis, который следует значительно ускорить функциональные исследования в этом организме.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана щедрой университет Калифорнии, Риверсайд (УЦР) Лаборатория начальный фонд O.S.A, USDA национального института продовольствия и сельского хозяйства (НИФА) Люк проекта (1009509) O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
