Summary
Mikroinjektion af Nasonia vitripennis embryoner er en vigtig metode til at generere arvelige genom ændringer. Beskrevet her er en detaljeret procedure for mikroinjektion og transplantation af Nasonia vitripennis embryoner, som vil i høj grad lette fremtidige genom manipulation i denne organisme.
Abstract
Juvel hveps Nasonia vitripennis har vist sig som en effektiv modelsystem for studiet af processer, herunder sex bestemmelse, haplo-diploid sex beslutsomhed, venom syntese og vært-symbiont interaktioner, blandt andre. En stor begrænsning af arbejde med denne organisme er manglen på effektive protokoller til at udføre styret genom ændringer. En vigtig del af genom ændring er levering af redigering reagenser, herunder CRISPR/Cas9 molekyler, i embryoner gennem mikroinjektion. Mens mikroinjektion er veletableret i mange modelorganismer, denne teknik er særligt udfordrende at udføre i N. vitripennis primært på grund af sin lille embryon, og det faktum, at embryonale udvikling forekommer helt inden for en parasitized blowfly puppe. Følgende procedure overvinder disse betydelige udfordringer, mens demonstrere en strømlinet visuel procedure til effektivt at fjerne hveps embryoner fra parasitized vært pupper, microinjecting dem, og omhyggeligt omplantning dem tilbage til værten for fortsættelsen og afslutningen af udvikling. Denne protokol vil kraftigt øge forskningsgrupper evne til at udføre avancerede genom ændringer i denne organisme.
Introduction
Juvel hveps, N. vitripennis, er en af de fire arter inden for slægten Nasonia , som er ectoparasitoids af kød at spise fluer som Sarcophaga bullata1. På grund af deres hurtige-generationsskifte perioder, lethed af opdræt i laboratoriet, og et udvalg af unikke og vigtige biologiske attributter, har N. vitripennis været i fokus for udviklingen af flere eksperimentelle værktøjer findes i traditionelle modelorganismer . For eksempel, omfatte nogle unikke biologiske egenskaber en haplo-diploid reproduktion system2, et forhold med mikrobielle og genetiske parasitter3,4, og en overtallige (B) kromosom5,6 ,7. Taget sammen, gør disse N. vitripennis en vigtig eksperimentel system for eksperimenter med henblik på at belyse de molekylære og cellulære aspekter af disse processer, ud over andre herunder venom produktion8, 9, sex bestemmelse10,11, og evolution og udvikling af akse mønster dannelse12,13,14. Desuden, den genetiske toolkit at studere biologi af N. vitripennis er vokset dramatisk i det sidste årti eller så, med sekventering af en høj opløsning genom15, flere genekspression undersøgelser16,17,18, og den evnen til at funktionelt forstyrre genekspression afhængige RNA-interferens (RNAi)19,20, som sammen har forbedret sporbarhed og kapaciteter til at udføre reverse genetik i denne organisme.
Trods de mange vigtige videnskabelige fremskridt og udvidet toolkits i denne organisme, som i den nuværende viden har kun én gruppe med held udført embryonale microinjections for at generere arvelige genom ændringer21. Dette er primært på grund af vanskeligheder med at arbejde med embryoner af N. vitripennis , som de er ganske skrøbelig og små, bliver ~2/3 størrelsen af Drosophila melanogaster embryoner, hvilket gør dem generelt vanskeligt at manipulere. Derudover deponere N. vitripennis hunner deres æg i pre stukket blowfly pupper, inden for hvilken helhed af embryogenese, larver, og puppe udvikling opstår. Derfor, for vellykket microinjections, før blastoderm stadium, embryoner skal effektivt indsamles fra værten pupper, hurtigt microinjected, og straks transplanteres tilbage til deres værter for udvikling. Disse trin kræver præcision og smidighed til at undgå at beskadige de microinjected embryoner eller de puppe værter, gør den teknik undtagelsesvis udfordrende. Uanset, der er en kort protokol udgivet over et årti siden, der beskriver N. vitripennis embryo mikroinjektion22. Men denne procedure kræver, at de frisk lagt embryoner blive udtørret, det bruger klistret tape til at forankre æg til mikroinjektion, og omfatter ikke en visuel demonstration af teknikken. Derfor beskrevet her er en opdateret og revideret protokol, herunder en visuel procedure, detaljering en forbedret trinvise protokol for N. vitripennis embryo microinjections, der kan følges af enhver grundlæggende lab til at generere arvelige genom ændringer i denne vigtige model insekt.
Protocol
1. N. Vitripennis koloni opdræt
- Oprette flere kolonier (~ 3-5) ved at placere 200-500 N. vitripennis voksne (med et 3:1 forholdet mellem kvinde: mand) i bug dorm bure.
Bemærk: Alternativ til at bruge bug sovesale, hvepse kan også overføres i flere, små glas reagensglas med bomuld med ca 15-20 hvepse/vial.- Vedligeholde hvepse på 25 ± 1 ° C med 30% relativ fugtighed og en 12:12 lys mørke cyklus, fodre dem dagligt med små dråber af 1:10 (v/v) opløsning i saccharose/vand.
Bemærk: Formering af hveps kolonier og samlinger kan også udføres ved stuetemperatur uden kontrolleret fugtighed; men temperaturer lavere end 25 ° C bliver lidt lavere udviklingsmæssige timingen af embryoner.
- Vedligeholde hvepse på 25 ± 1 ° C med 30% relativ fugtighed og en 12:12 lys mørke cyklus, fodre dem dagligt med små dråber af 1:10 (v/v) opløsning i saccharose/vand.
- Tillad hvepse at parre i mindst 4 dage før injektioner.
- De første to dage, tillade skytterne hunner at fodre på frisk S. bullata pupper, såvel som små dråber i en 1:10 (v/v) opløsning i saccharose/vand.
- De følgende to dage, Fjern blowfly pupper for at fratage de kvindelige hvepse af en oviposition websted, hvilket gør dem meget fælderne.
2. samling og justering af N. Vitripennis præ blastoderm fase embryoner
- Tillade kvindelige hvepse til parasitize (oviposit embryoner) til unge værter (S. bullata pupper). For at holde værter friske, lagre værter i 4 ° C umiddelbart efter at have indhentet dem og tag kun når det er nødvendigt.
Bemærk: Unge værter kan bestemmes ved at have en rød farvet puparium, der henviser til, at ældre værter har en mørkere farvet puparium (figur 1A).- Placere enkelte friske S. bullata pupper ind i en skum prop med en pupper mellemstore hul skåret i midten. Afsløre kun ~ 0,2 cm vært for maksimal koncentration af parasitization og lettere embryonopsamlingsteam forreste afslutning (foretrukne oviposition site).
Bemærk: Den forreste ende er afrundet, mens den bageste ende er tykkere og indeholder en 'kraterlignende' åbning (figur 1B). - Placer vært pupper (ca 5 vært pupper pr. 100 hvepse) i denne ordning ind i buret og vent ca 45 min til at tillade hvepse at parasitize dem (figur 2- ii).
Bemærk: Det er meget vigtigt, at embryonerne er så unge som muligt, ideelt inden for den første time efter at være oviposited, for at sikre, at de er i stadiet før blastoderm. Gamle embryoner (> 1,5 h) bør ikke sprøjtes. - Fjerne parasitized værter ved at hente dem i hånden og forsigtigt børste/blæser off enhver bosat hvepse. Erstatte dem med friske værter efter hver ~ 15 min til at fortsætte med at indsamle tidligt iscenesat æg under injektioner.
- Placere enkelte friske S. bullata pupper ind i en skum prop med en pupper mellemstore hul skåret i midten. Afsløre kun ~ 0,2 cm vært for maksimal koncentration af parasitization og lettere embryonopsamlingsteam forreste afslutning (foretrukne oviposition site).
- Fjerne de frisk parasitized værter fra bur i hånden. Under en dissekere mikroskop, bruge pincet, skræl forsigtigt væk den bageste ende (0,4 cm) af den udvendige puparium (puppe shell) til at eksponere N. vitripennis æg (figur 2- iii).
Bemærk: Der skal udvises forsigtighed at undgå punktering puppe huden; Hvis dette sker, vil hemolymph fugtes hveps embryoner, som vil være meget vanskeligt at fjerne for mikroinjektion. - Bruge flydende lim til at lime en coverslip på et rent glas dias til at forberede en embryo justering dias (figur 3).
Bemærk: En højtydende instant klæbestof bruges til at øge bindingsstyrke og tørring hastighed, men enhver lim, der kan holde coverslip i at bevæge sig på diaset er acceptabelt. - Brush-off embryoner fra værten omhyggeligt med en våd bøde-tip pensel, og sørg for ikke at skade den bløde puppe hud af værten.
Bemærk: ' embryo pick,' som er det væsentlige en halvdel af et par af ultrafine pincet, kan bruges i stedet for en pensel. - Overføre ~ 20 embryoner én efter én diaset umiddelbart støder op til siden af coverslip med en våd pensel. Orientere den forreste slutningen af embryo mod diasset dække kanten, således at den bageste ende af embryoner er pegede i samme retning (figur 2- iv). Det giver mulighed for højere præcision af indsprøjtning i den samme position blandt alle embryoner.
Bemærk: Denne forbedrede teknik kræver ikke dobbelt-sidet klistret tape til at fastsætte embryoner til dias som tidligere beskrevet21,22. Derudover ikke udtørre embryoner eller dække æggene med halocarbon olie under injektion som beskrevet tidligere for N. vitripennis embryo mikroinjektion22.
3. needle forberedelse til Microinjections
- Placere et aluminiumsilikat kapillær glas i en nål puller.
Bemærk: En god nål er afgørende for vellykket N. vitripennis embryoner injektioner. Injektion nåle bør have en skarp og fine-tip til at give nem indtrængen gennem chorion. Kvarts og borosilicate kapillær nåle også kan være brugt (figur 4). - Sæt varme til 605, hastighed til 130, forsinkelse til 80,- trække til 70, og pres til 500 på en nål puller.
Bemærk: Yderligere nål puller indstillinger til at trække kvarts og Borosilicate nåle kan ses i tabel 1; parametrene kan variere for forskellige pullers og filamenter. - Aktivere nål aftrækker for at skabe den rigtige nål. Gentag for produktion af flere nåle.
Bemærk: Trak nåle kan gemmes ved at placere dem i en petriskål, som indeholder flere parallelle ruller af kommercielle modeler ler. - Facet nål-spids af lidt rørende tip til diamond slibende pladen omkring 10 s ved 25 ° C (figur 2- iii).
Bemærk: Injektion nåle fordel beveling ved at fremme adgang til embryoner med minimal skade samtidig samtidig øge strømmen af regents gennem nålen.
4. embryo mikroinjektion
- Forbered injektion blanding bestående af genom ændring reagenser (fx transposon + helper transposase, eller CRIPSR reagenser, osv.), og hold det på køl.
- Indlæse injektion nålen med 2 µL af injektion blandingen ved hjælp af microloader tips.
Bemærk: Injektion blandingen demonstreret i protokollen består af enkelt-guide RNA (sgRNA) (s) og rekombinante Cas9 protein blandet i H2O. - Placer glas dias med foret embryoner på scenen af en sammensat mikroskop.
- Omhyggeligt indsætte nålen ind i den bageste ende af fosteret med en lodret vinkel af 25-35 °.
Bemærk: Hvis for meget injektion blandingen sprøjtes ind i embryoet kan det briste at bortvejre cytoplasma fra embryonet. Derudover, forkert skrå eller brudt nåle med for stor af en åbning kan også forårsage embryo brud.
- Prøv igen beveling nåle, hvis tilstopning opstår. Cytoplasma af N. vitripennis embryoner er usædvanligt tyktflydende og klistret, hvilket fører til hyppige nål tilstopning (1/25 indsprøjtninger).
Bemærk: Det er vigtigt at holde embryonerne fugtig periode injektion af regelmæssigt tilføjer afioniseret vand ved hjælp af pensel. Mængden af vand på penslen er nøglen til at flytte embryoner rundt og Juster med lethed. Alt for megen vand resulterer i embryoner flydende og for lidt vand gør dem vanskelige at bevæge sig rundt. - Injicere ~ 20-40 æg ad gangen (bør tage ca 10 min), derefter stoppe. Overføre de injicerede æg med en våd pensel ved let rører de injicerede æg og læg dem i en vært. Derefter fortsætte indsprøjtning igen ved hjælp af en frisk nyligt lagt parti af æg (> 1 h gamle).
Bemærk: Ideelt set denne protokol er mest effektiv hvis en person konstant indsamling og foring op æg, mens en anden person indsprøjtning genom ændring komponenter og omplantning injiceres embryoner til vært pupper.
5. omplantning indsprøjtet G0 N. vitripennis embryoner på Pre-stung vært
- Omhyggeligt placere de injicerede G0 embryoner på en tidligere stukket S. bullata pupper (figur 2- vi) med en våd pensel efter mikroinjektion.
Bemærk: Vært pupper bruges til at indsamle embryoner til mikroinjektion vil arbejde for dette formål. Også, trods betydelige indsats, der er i øjeblikket ingen tilgængelige kunstig kost, der kan være brugt22.- Placere op til 40 injiceres embryoner én ad gangen på en enkelt pre stukket vært at undgå overfyldte og larver konkurrence.
Bemærk: Injektion vil forårsage skade på embryoner; skødesløs transplantation af injicerede embryoner til vært pupper kan klemme den injicerede komponent eller æggeblomme ud og føre til døden af embryoner.
- Placere op til 40 injiceres embryoner én ad gangen på en enkelt pre stukket vært at undgå overfyldte og larver konkurrence.
- Placere vært pupper i en petriskål med fugtigt filtrerpapir og bomuld bolde, og Inkuber dem ved 25 ° C med ca 70% fugtighed til injiceres embryoner udklækkes (ca 1-2 dage) (figur 2- vii).
Bemærk: Vigtigere, værter kan stå med en flåede off puparium og N. vitripennis æg vil udvikle normalt så længe de er udruget i en fugtig kammer (petriskål med fugtigt filtrerpapir og bomuld bolde) for at forhindre udtørring. Inkubere ved stuetemperatur og med fugtighed fra afdæmpet bomuld bolde er tilstrækkelig i tilfælde af luftfugtighed ikke kan kontrolleres. - Overføre vært pupper ind i en ny petriskål ved 70% fugt og 25°C efter G0 embryoner hatch.
- Overvåge vært pupper og injiceres G0 larver dagligt. Hvis værten pupper har en dårlig lugt, overføre de injicerede larver til ny sund vært pupper.
6. screening for genom ændringer
- Fjern hvert N. vitripennis pupper fra værten ved hjælp af enten en fin pensel eller embryo pick. Injiceres G0 larver bør forpupper ca 8 dage post injektion.
- Sted hver fjernet puppe i en isoleret hætteglasset tilsluttet med bomuld og tillade dem at fremstå som G0 voksne, sikre, at de skraverede hunner jomfru som vil hjælpe med downstream genetiske Kors.
Bemærk: Hunner kan sorteres fra hannerne af wing længde: kvinder har længere vinger, som udvider forbi kroppen profil når tændt siden. Alle microinjected kvindelige pupper kan placeres sammen til et tilsluttet hætteglas, og det samme gælder for mandlige pupper. - Skærmen G0 personer, efter eclosion, af enten PCR eller visuelt (hvis forstyrre et fænotypiske gen). For eksempel, hvis CRISPR bruges til at oprette sletninger i et givent gen og forstyrret genet giver en synlig fænotype, derefter sortere og holde personer med et mutant version af de berørte Fænotypen (figur 2- viii)21. Hvis imidlertid det berørte genet koder for en ikke-synlige fænotype, såsom en mutant af et vigtigt gen, udføre en passage ordning (cross G0 mandlige med vildtype kvinde, eller cross G0 kvindelige med vildtype mand) for at genoprette og screene for arvelige mutanter gennem boltpistoler dødelighed eller sterilitet.
Bemærk: Svarende til D. melanogaster, N. vitripennis voksne kan være immobiliseret af eksponering til CO2 giver mulighed for simpel manipulation. Desuden vil unmated hunner give anledning til 100% haploide mandlige yngel, så derfor en mutant unmated kvinde kan give anledning til store antal mutant hanner, der kan bruges til efterfølgende analyse.
Bemærk: Mutationer i væsentlige gener skal opbevares af parring overlevende G0 injiceres hunner (formentlig heterozygous for en mutation) til vildtype hanner; i dette tilfælde skal halvdelen af G1 mandlige afkom dør på grund af nedarvning af dødelig mutation, mens halvdelen af G1 kvindelige afkom vil være bærere af den dødelige. - Krydses G0 voksne og skærmen G1 afkommet for transgen indrykninger ved hjælp af transgenese markører, hvis målet er transgenese. I øjeblikket stadig transgenese påvises i N. vitripennis.
Representative Results
Denne protokol indeholder detaljerede retningslinjer for kolonien opdræt, før blastoderm indsamlingsstedet, justering, mikroinjektion og efterfølgende transplantation efter injektion og kan bruges til effektiv genom engineering i N. vitripennis. Som vist i figur 2, den generelle sekvensen af trin for en vellykket mikroinjektion i N. vitripennis omfatter: (i) tillader mandlige og kvindelige voksne at parre (~ 4 dage), (ii) leverer friske vært flyve pupper (S. bullata) placeret i en modificeret skum plug til skytterne hunner og giver mulighed for oviposition (~ 45 min.), (iii) omhyggeligt peeling væk parasitized vært pupper hårstrået for at afsløre og samle præ blastoderm fase hveps embryoner (~ 15 min), (iv) tilpasse indsamlet embryoner (~ 15 min), (v) microinjecting genom ændring komponenter i embryoner (~ 15 min), (vi) omhyggeligt placere injiceres embryoner tilbage i pre stukket værter til at give mulighed for korrekt udvikling (~ 15 min), og (vii) forhindrer dehydrering af den injicerede embryo/vært ved at overføre dem i en fugtig kammer med omtrent 70% relativ luftfugtighed (~ 15 min). Parasitized værter er derefter inkuberes i omtrent 14 dage for at give til fuldstændig udvikling af N. vitripennis embryoner. Når injiceres, voksne emerge fra værten (viii), isolere, mate og skærm dem individuelt for tilstedeværelsen af forventede mutationer.
For effektiv nål penetration og mikroinjektion i N. vitripennis embryoner testet flere typer af kapillar glas nåle med glødetråd herunder quartz, aluminiumsilikat og borosilicate typer. Det konstateres, at kvaliteten af nålen er afgørende for at undgå brud/tilstopning under injektion, og for at opnå høje priser af begge embryo overlevelse og transformation effektivitet. For hvert glas type, en effektiv protokol blev udviklet for at trække nåle for at få en ønskede hypodermic-lignende lang spids effektiv for N. vitripennis embryo mikroinjektion ved hjælp af forskellige mikropipette pullers (P-1000 og P-2000) (tabel 1 Figur 4).
For at optimere proceduren, målt overlevelsesrater efter injektion af varierende mængder af genom ændring komponenter. Genom ændring komponenter, der bruges her var blandet guide RNA'er og Cas9 protein for CRISPR-medieret genom-redigering, der blev vist tidligere for at fungere godt i N. vitripennis21. Svarende til hvad der tidligere rapporteret her en sgRNA rettet mod cinnober genet er designet og syntetiseret. Ved at målrette og afbryde dette gen, ses en let identificerbare fænotypiske forandringer i øjenfarve organisme19,21. En injektion blanding, der kombinerer en række forskellige koncentrationer af sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 og 320 ng/µL) med Cas9 protein (0, 20, 40, 80, 160 og 320 ng/µL) er oprettet og injiceres embryoner af vildtype N. vitripennis. Overlevelsesraten for injiceres embryoner er fundet for at være dosisafhængig (tabel 2)21. Den øgede koncentration af sgRNA og Cas9 protein føre til nedsat overlevelsesrater (tabel 2), måske på grund af tilsætningsstoffet off target effekter. Høj luftfugtighed (~ 70%) er også fundet for at være vigtig for embryo overlevelse efter transplantation til værter, som lav luftfugtighed (~ 10%) resulterede i 100% døden til alle injiceres embryoner.
Figur 1 . Forberedelse af vært pupper (S. bullata) for N. vitripennis embryo oviposition. (A) Unge og gamle S. bullata pupper. Ældre pupper har en mørkere kutikula, mens yngre pupper har en mere rødlig farve til deres neglebånd. Yngre pupper foretrækkes for at maksimere oviposition. Posterior og anterior enderne af pupper kan også være kendetegnet ved en "kraterlignende åbning i den bageste ende, mens den forreste ende kommer til et punkt, afrundede. (B) vært (S. bullata) puppe forberedelse til N. vitripennis embryo oviposition. Indsætte vært pupper i et skum-stik, der har haft en pupper størrelse hul skåret ud. Har den bageste side af vært pupper ansigt inde i stikket, mens 0,2 cm af den forreste ende udsættes for giver mulighed for maksimal koncentration af oviposition i den forreste område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Tidslinjen for at skabe N. vitripennis mutanter af mikroinjektion. Tidslinjen af N. vitripennis indsamlingsstedet, CRISPR/Cas9 mikroinjektion og efter indsprøjtning procedurer. N. vitripennis voksne fik lov til at parre i mangel af et oviposition websted for 4 dage, (jeg). Efter, en frisk, kødet flyve vært pupper, S. bullata, placeret inde en skum prop, kun udsætte 0,5 cm i den bageste ende, blev introduceret til fælderne hunnerne for 45 min til parasitization (ii). Samtidig blev indsprøjtning materialer herunder mikroinjektion nåle og CRISPR/Cas9 komponenter udarbejdet (iii). Embryoner blev indsamlet fra værten (iv), justeret (v) og injiceres med CRISPR/Cas9 komponenter (vi). De injicerede embryoner blev omhyggeligt overføres tilbage til en pre stukket vært (vii) og inkuberes indtil fuldt udviklet (14 dage) (viii). Når voksne opstået, blev mutanter screenet for fænotyper af forventede CRISPR/Cas9 induceret mutationer i target-genet (ix). Hele proceduren tager normalt 19 dage at fuldføre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Modificerede objektglas til foring embryoner. (A) A coverslip. (B) en objektglas. (C) en embryo justering enhed.En coverslip kan klæbes på et objektglas anvendes til linje embryoner til injektion. Formålet med coverslip er at fungere som en kant til at tillade let manipulation og foring af embryoner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Injektion nål forberedelse. (A) eksempler på gode og dårlige aluminiumsilikat glas nåle. (B) tips af en hævet, korrekt skrå og dårligt skrå nål. Aluminosilikatsyre glas kapillarrør blev trukket ved hjælp af en mikropipette puller. Producerede nål tips blev derefter åbnet forsigtigt og raffineret ved hjælp af en beveler. God afskårne nålen har en meget skarp spids, og dårlig afskårne nålen har en stump spids. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kapillar glas Type | Sutter nål Puller Model | Varme | Glødetrådens | Hastighed | Forsinkelse | Trække | Pres |
| Kvarts | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| Aluminosilikatsyre | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| Borosilicate | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
Tabel 1. Indstillinger for nål puller.
Bemærk: Nål puller indstilling varierer fra maskine til maskine, så hver lab bliver nødt til at optimere deres egen nål puller indstillinger. Denne tabel er ændret fra Li et al. 21
| sgRNA-1 | Cas9 | Samlede embryoner | Transplantation (10% fugtighed) | Transplantation (70% fugtighed) | |||
| Larverne overlevende | Larverne overlevende | Voksen overlevende | |||||
| Alt (%) | Alt (%) | ♂ | ♀ | Alt (%) | |||
| Ingen indsprøjtning | Ingen indsprøjtning | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| Vand | Vand | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 ng/µL | 20 ng/µL | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 ng/µL | 40 ng/µL | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 ng/µL | 80 ng/µL | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 ng/µL | 160 ng/µL | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 ng/µL | 320 ng/µL | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
Tabel 2. Injektion og transplantation efterladte og mutagenese satser baseret på injektioner af sgRNA og Cas9 i forskellige koncentrationer. i denne tabel er ændret fra Li et al. 21
Discussion
Den seneste sekventering af N. vitripennis genom har udløst et vigtigt behov for Molekylær værktøjer til funktionelt karakterisere ukendt gener inden for denne art23. CRISPR-Cas9 system, og mange andre gen redigeringsværktøjer, har vist sig for at være værdifuld i efterforskningen af genet funktioner for en række af organismer24. Men for at generere arvelige mutationer, disse værktøjer kræver udfører embryo microinjections. Derfor viste her er en detaljeret visuel teknik, der omfatter en række nyskabelser, der giver mulighed for effektiv N. vitripennis embryo microinjections.
Samlet set denne detaljerede teknik tilbyder en række væsentlige nyskabelser med hensyn til eksisterende metoder23, der giver mulighed effektiv N. vitripennis embryo microinjections. For eksempel, for at lette en hurtig indsamling af embryoner, oprettes og bruges til at begrænse æglægning helt til den bageste ende af værten (figur 1), som i høj grad letter samling af talrige embryoner i en oviposition værktøj (skum prop) en kort periode. Teknikker for opdræt hveps kolonier i stort tal til at indsamle større antal æg er også forbedret og defineret. Derudover for at fremskynde embryo justering, er et embryo justering enhed, som giver mulighed for embryoner skal effektivt justeret og sprøjtes uden at skulle bruge dobbeltsidet klistret tape til at sikre embryoner på plads (figur 3) udviklet.
Det er også konstateret, at ved at holde embryonerne fugtig med vand under injektion og ikke tørrende embryoner eller dækker dem med olie forbedret overlevelsesrate. Derudover flere kapillær glas typer er testet og parametre til at konstruere de perfekte nåle til N. vitripennis mikroinjektion (tabel 1, figur 4) bestemmes. Desuden følgende mikroinjektion, embryo overlevelse priser er i stand til at stige betydeligt på grund af inkubere injiceres æg i pre stukket værter placeret i høj fugtighed (70%) kamre. Disse nyskabelser giver mulighed for en mere strømlinet og vellykket mikroinjektion procedure for N. vitripennis.
Kan foretages mindre ændringer i form af indsprøjtning apparater, og opdræt procedurer til denne protokol, afhængigt af brugerens præferencer. Imidlertid bliver en række vigtige skridt afgørende for korrekt generere mutanter i N. vitripennis. For eksempel arbejder hurtigt så at injiceres embryoner er > 1 h gamle, og sikre, at injektion nåle er skarpe nok til at minimere skader fosteret vil både være afgørende. Mens denne protokol skal være effektiv til at generere mutationer i gener, mange (hvis ikke alle), er en stor begrænsning CRIPSR/Cas9 krav til at målrette en PAM (NGG) sekvens, som vil diktere target sekvens.
Afslutningsvis, kan dette forbedret teknik bruges til at generere mange slags genom ændringer, såsom mutationer, sletninger og måske endda indrykninger ved hjælp af CRIPSR/Cas9 teknologier21, eller endda transgen indsættelser til at generere transgene N. vitripennis, som kraftigt bør fremskynde funktionelle forskning i denne organisme.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en generøs University of California, Riverside (UCR) laboratorium start-up fonden til O.S.A, en USDA National Institute for fødevarer og landbrug (NIFA) Hatch projekt (1009509) til O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
