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Genetics

Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

doi: 10.3791/56990 Published: December 25, 2017

Summary

Microinjection d’embryons Nasonia vitripennis est un procédé essentiel pour générer des modifications héréditaires génome. Décrite ici est une procédure détaillée pour la microinjection et la transplantation d’embryons Nasonia vitripennis , ce qui facilitera grandement la manipulation du génome futur chez cet organisme.

Abstract

La guêpe bijou Nasonia vitripennis a émergé comme un système modèle efficace pour l’étude des processus, y compris la détermination de sexe, sexe haplo-diploïde, synthèse de venin et des interactions hôte-symbiote, entre autres. Une limitation majeure de travailler avec cet organisme est l’absence de protocoles efficaces pour effectuer des modifications du génome dirigée. Une partie importante de la modification du génome est la fourniture de réactifs, y compris les molécules CRISPR/Cas9, dans des embryons par microinjection d’édition. Microinjection est bien établie dans de nombreux organismes de modèle, cette technique est particulièrement difficile d’effectuer chez N. vitripennis principalement en raison de sa taille de petit embryon et le fait que le développement embryonnaire s’effectue entièrement à un pupe de mouche à viande parasités. La procédure suivante permet de surmonter ces défis importants tandis que démontrant une procédure simplifiée, visuelle pour éliminer efficacement les embryons de guêpe de parasités nymphes de l’hôte, microinjecting, et repiquage soigneusement leur retour dans l’hôte pour la poursuite et l’achèvement du développement. Ce protocole permettra d’améliorer fortement la capacité des groupes de recherche pour effectuer des modifications avancées du génome chez cet organisme.

Introduction

La guêpe de bijou, N. vitripennis, est l’une des quatre espèces du genre Nasonia qui sont ectoparasitoïdes de mangeuse de mouches comme Sarcophaga bullata1. En raison de leurs périodes de jeûne-générationnelle, facilité d’élevage en laboratoire et une gamme de caractéristiques biologiques uniques et importants, N. vitripennis a fait l’objet pour le développement de plusieurs outils expérimentaux trouvés dans les organismes de modèle traditionnel . Par exemple, certains attributs biologiques uniques incluent un système de reproduction de haplo-diploïde2une relation avec parasites microbiens et génétique3,4et un surnuméraires (B) du chromosome5,6 ,,7. Pris ensemble, ces faire N. vitripennis un important système expérimental pour des expériences visant à élucider les aspects cellulaires et moléculaires de ces processus, en plus d’autres dont la production de venin8, 9, sexe détermination10,11et évolution et développement de l’axe modèle formation12,13,14. En outre, la boîte à outils génétique pour étudier la biologie de N. vitripennis a considérablement augmenté ces dix dernières années ou ainsi, avec le séquençage d’un génome à haute résolution15, l’expression des gènes plusieurs études16,17,18et le capacité de perturber fonctionnellement l’expression des gènes en se fondant sur l’interférence ARN (ARNi)19,20, qui ensemble ont amélioré les capacités de l’exécution de génétique inverse chez cet organisme et traçabilité.

Malgré les nombreuses avancées scientifiques importantes et élargi des toolkits dans cet organisme, à partir de l’état actuel des connaissances qu’un groupe a exécuté avec succès microinjections embryonnaires pour générer de modifications héréditaires génome21. C’est principalement en raison des difficultés de travailler avec des embryons de N. vitripennis car ils sont assez fragiles et petit, étant ~2/3 la taille d’embryons de drosophile , ce qui les rend généralement difficile à manipuler. En outre, N. vitripennis femelles pondent leurs œufs en nymphes de mouche à viande préalablement piqué, au sein de laquelle se produit l’intégralité de l’embryogenèse, larve et développement pupal. Par conséquent, pour des microinjections réussies, blastoderme avant scène, embryons doivent être efficacement prélevés sur pupes hôte, micro rapidement et immédiatement transplantées dans leurs hôtes pour le développement. Ces étapes nécessitent précision et dextérité pour éviter d’endommager les embryons microinjectés, ou les pupes hôtes, ce qui rend la technique exceptionnellement difficile. Nonobstant, il y a un protocole court publié plus de dix ans qui décrit N. vitripennis embryon microinjection22. Toutefois, cette procédure exige que les embryons fraîchement prévues être desséchées, il utilise un ruban adhésif pour ancrer les oeufs à la microinjection et n’inclut pas une démonstration visuelle de la technique. Par conséquent, décrit ici est un protocole de mise à jour et révisé, y compris une procédure visual, détaillant un protocole étape par étape amélioré des microinjections d’embryon N. vitripennis qui peut être suivi par tout laboratoire de base pour générer le génome héréditaire modifications de cet insecte modèle important.

Protocol

1. N. Vitripennis colonie d’élevage

  1. Mis en place plusieurs colonies (~ 3-5) en plaçant le 200-500 N. vitripennis adultes (avec un ratio de 3:1 de femelle : mâle) dans des cages de dortoir de bogue.
    NOTE : Plutôt que d’utiliser les dortoirs de bogue, guêpes peut également être multiplié multiples, petit verre éprouvettes bouchées avec du coton avec environ 15-20 guêpes/flacon.
    1. Maintenir les guêpes à 25 ± 1 ° C avec une humidité relative de 30 % et un cycle de lumière sombre 12:12, leur alimentation quotidienne avec des petites gouttelettes de 01:10 (v/v) solution de saccharose/eau.
      NOTE : Propagation des collections et des colonies de guêpes peut également être mise à température ambiante sans humidité contrôlée ; Cependant, les températures inférieures à 25 ° C fera baisser un peu le moment du développement des embryons.
  2. Permettre aux guêpes s’accoupler pendant au moins 4 jours avant les injections.
    1. Pour les deux premiers jours, permettent des femelles accouplées pour se nourrir sur la nouvelle S. bullata nymphes, mais aussi de petites gouttelettes d’un 01:10 (v/v) solution de saccharose/eau.
    2. Pour les deux jours suivants, retirez la pupe de mouche à viande pour priver les guêpes femelles d’un site de Ponte, ce qui les rend très gravides.

2. collecte et alignement des embryons au stade de pré blastoderme N. Vitripennis

  1. Permettre les guêpes femelles à parasiter (pondent leurs oeufs des embryons) dans les jeunes hôtes (nymphesS. bullata ). Pour conserver la fraîcheur des hôtes, stocker des hôtes à 4 ° C immédiatement après leur obtention et retirer seulement lorsque nécessaire.
    NOTE : Les jeunes hôtes peuvent être déterminés en ayant un puparium coloré rouge alors que les hôtes âgés possèdent un puparium de couleur plus foncée (Figure 1 a).
    1. Placer les frais individuels S. bullata pupes dans un bouchon de mousse avec un trou de la grosseur nymphes couper au centre. Exposer seulement ~ 0,2 cm de l’extrémité antérieure (site de Ponte privilégié) de l’hôte pour la concentration maximale de parasitisme et la collecte des embryons plus facile.
      Remarque : L’extrémité antérieure est arrondie, tandis que l’extrémité postérieure est plus épaisse et contient une ouverture « cratère-like » (Figure 1 b).
    2. Placez les nymphes de l’hôte (à peu près 5 nymphes hôte par 100 guêpes) dans cet arrangement dans la cage et attendre environ 45 min pour permettre les guêpes parasitent les eux (Figure 2- ii).
      Remarque : Il est très important que les embryons sont aussi jeunes que possible, idéalement au sein de la première heure d’être pondus, pour s’assurer qu’ils sont dans la phase pré blastoderme. Vieux embryons (> 1,5 h) ne doit pas être injecté.
    3. Supprimer des hôtes parasités en les extrayant manuellement et délicatement brossage/soufflant tout résidant de guêpes. Remplacez-les par des hôtes frais après chaque ~ 15 min pour continuer à recueillir dès le début mis en scène oeufs lors des injections.
  2. Retirez les hôtes parasités fraîchement de cage à la main. Sous un microscope à dissection, à l’aide de forceps, soigneusement Décollez l’extrémité postérieure (0,4 cm) de l’extérieur puparium (coquille pupal) pour exposer les oeufs N. vitripennis (Figure 2- iii).
    Remarque : Il faut pour éviter de percer la peau pupe ; dans ce cas, l’hémolymphe s’humidifiera les embryons de la guêpe, qui seront très difficiles à enlever pour le microinjection.
  3. Utiliser l’adhésif liquide pour coller une lamelle sur une lame de verre propre pour préparer une diapositive d’alignement embryon (Figure 3).
    Remarque : Un adhésif instantané haute performance est utilisé pour augmenter l’adhérence et vitesse de séchage, cependant n’importe quelle colle qui peut garder la lamelle de se déplacer sur la diapositive est acceptable.
  4. Bercé les embryons de l’hôte soigneusement avec un pinceau humide de fine pointe, faisant attention à ne pas endommager la peau molle de pupe de l’hôte.
    NOTE : un "embryon pick," qui est essentiellement une moitié d’une paire de pinces ultrafines, peut être utilisé au lieu d’un pinceau.
  5. Transfert ~ 20 embryons un par un sur le toboggan, juste à côté du côté de la lamelle avec un pinceau humide. Orientez l’extrémité antérieure de l’embryon contre le bord de la diapositive de la couverture de sorte que l’extrémité postérieure des embryons est pointée dans la même direction (Figure 2- iv). Ceci permettra une plus grande précision d’injection dans la même position parmi tous les embryons.
    NOTE : Cette technique améliorée ne nécessite pas de bande adhésive double-face pour fixer les embryons à la diapositive comme décrit plus haut21,22. En outre, ne pas dessécher les embryons, ou couvrir les œufs avec Huilehalocarbone pendant l’injection comme décrit plus haut pour N. vitripennis embryon microinjection22.

3. aiguille préparatifs Microinjections

  1. Placez un verre capillaire aluminosilicate dans un extracteur à aiguille.
    Remarque : Une aiguille est critique pour le succès N. vitripennis injections d’embryons. Les aiguilles d’injection devraient avoir un sharp et pointe fine pour permettre une pénétration facile à travers le chorion. Quartz et borosilicate aiguilles capillaires peuvent également être utilisés (Figure 4).
  2. Régler la chaleur à 605, la Vitesse à 130, le retard à 80, le tirer à 70 et la pression à 500 sur un extracteur d’aiguille.
    NOTE : Paramètres extracteur aiguille supplémentaire pour tirer les quartz et aiguilles de Borosilicate peuvent être vu dans le tableau 1; les paramètres peuvent varier pour les filaments et différents extracteurs.
  3. Activer l’extracteur d’aiguille pour créer l’aiguille correct. Répéter au besoin pour la production de plusieurs aiguilles.
    Remarque : Tiré d’aiguilles peuvent être stockés en les plaçant dans une boîte de Pétri contenant que parallèlement plusieurs rouleaux d’argile commercial modeler.
  4. La pointe de l’aiguille du biseau en touchant légèrement l’extrémité de la plaque abrasifs diamant autour de 10 s à 25 ° C (Figure 2- iii).
    NOTE : Les aiguilles à injection bénéficient de biseautage en favorisant l’entrée dans les embryons avec un minimum de dommages tout en améliorant le débit des régents à travers l’aiguille.

4. embryon Microinjection

  1. Préparer le mélange d’injection composé de réactifs de modification du génome (p. ex., transposon + helper transposase, ou réactifs CRIPSR, etc.) et gardez-le sur la glace.
  2. Charger l’aiguille d’injection avec 2 µL du mélange de l’injection à l’aide de conseils de microloader.
    Remarque : L’injection de mélange a démontré dans le protocole se compose de single-guide de l’ARN (sgRNA) (s) et la protéine recombinante Cas9 mélangés dans H2O.
  3. Placer la lame de verre avec les embryons doublées sur la scène d’un microscope composé.
  4. Insérer l’aiguille dans l’extrémité postérieure de l’embryon avec un angle vertical de 25-35 °.
Injecter 1-5 pL de l’injection de mélange (environ 2 à 10 % du volume de l’embryon) et faire en sorte que l’embryon semble légèrement gonfler car le mélange est injecté dedans (Figure 2- iv).
Remarque : Si trop d’injection de mélange est injectée dans l’embryon, elle peut éclater dissiper le cytoplasme de l’embryon. En outre, mal biseauté ou cassé les aiguilles avec trop grande d’une ouverture peut aussi causer la rupture de l’embryon.
  1. Essayez de re-taillante aiguilles en cas de colmatage. Le cytoplasme des embryons N. vitripennis est exceptionnellement visqueuse et collante, qui conduit à aiguille fréquente colmatage (injections de 1/25).
    Remarque : Il est important de garder les embryons humide pendant la période d’injection en ajoutant régulièrement de l’eau déminéralisée en utilisant le pinceau. La quantité d’eau sur le pinceau est la clé pour se déplacer les embryons et aligner en toute simplicité. Trop d’eau entraîne chez les embryons flottant et trop peu d’eau qui les rend difficiles à déplacer.
  2. Injecter des ~ 20 et 40 œufs à la fois (devrait prendre environ 10 min), puis s’arrête. Transférer les oeufs injectés avec un pinceau humide en touchant légèrement les œufs injectés et placez-les dans un hôte. Puis continuer par injection à l’aide une nouvelle nouvellement posées lot d’oeufs (> âgées de 1 h).
    NOTE : Idéalement ce protocole est plus efficace si une personne est en permanence collecte et alignant les oeufs, alors qu’une autre personne est injecter les éléments de modification du génome et transplanter des embryons injectées aux nymphes de l’hôte.

5. transplantation Injected G0 N. vitripennis embryons sur Pre-stung hôte

  1. Placer soigneusement les embryons de0 G injectés sur un déjà piqué S. bullata pupes (Figure 2- vi) avec un pinceau humide après microinjection.
    NOTE : Les pupes d’hôte utilisés pour collecter des embryons de microinjection vont travailler à cette fin. En outre, malgré des efforts considérables, il n’y a actuellement aucune alimentation artificielle disponible qui peut être utilisé22.
    1. Placez jusqu'à 40 embryons injectés un à la fois sur un seul hôte préalablement piqué d’éviter la concurrence de surpeuplement et larve.
      NOTE : Injection peut endommager les embryons ; imprudente transplantation d’embryons injectés pour les pupes hôte peut presser le composant injecté ou le jaune sur et entraîner la mort des embryons.
  2. Les pupes d’hôte dans une boîte de Pétri avec papier filtre humide et boules de coton et les incuber à 25 ° C, avec environ 70 % d’humidité jusqu'à éclosent des embryons injectées (environ 1 à 2 jours) (Figure 2- vii).
    NOTE : Ce qui est important, hôtes peuvent être laissés avec un Pelé puparium et le N. vitripennis oeufs développera normalement tant qu’ils sont incubés dans une chambre humidifiée (boîte de Pétri avec papier filtre humide et boules de coton) pour éviter la dessiccation. Incubation à température ambiante et avec une humidité de l’ouate humidifiée suffit au cas où l’humidité ne peut pas être contrôlée.
  3. Transférer les pupes d’hôte dans une nouvelle boîte de Pétri à 70 % d’humidité et de 25°C après l’éclosion de G0 embryons.
    1. Surveiller hôte nymphes et larves de0 G injectés tous les jours. Si les pupes d’hôte ont une odeur fétide, transférer les larves injectés à nouveau nymphes hôte sain.

6. dépistage des Modifications du génome

  1. Retirez chaque N. vitripennis nymphes de l’hôte à l’aide d’un pinceau fin ou un embryon pick. Les larves de0 G injectés devraient se transforment en pupes environ 8 jours post injection.
  2. Placez chaque nymphe enlevée dans un flacon de verre isolé bouché avec du coton et leur permettre de devenir des adultes de0 G, veiller à ce que les femelles écloses seront vierges qui aidera avec des croisements génétiques en aval.
    Remarque : Les femelles peuvent être triées de mâles par la longueur de l’aile : les femelles ont des ailes plus longues qui s’étendent au-delà du profil de corps quand tourné sur le côté. Toutes les nymphes femelles microinjectés peuvent être assemblés dans un flacon bouché, et il en va de même pour les nymphes mâles.
  3. Les personnes de0 écran G, après l’éclosion, soit PCR ou visuellement (si perturbant un gène phénotypique). Par exemple, si CRISPR est utilisé pour créer des destructions dans un gène donné, et le gène perturbé confère un phénotype visible, puis trier et conserver les individus avec une version mutante du phénotype touchée (Figure 2- viii)21. Si, toutefois, le gène affecté codant pour un phénotype non visibles, comme une mutante d’un gène essentiel, effectuer un programme de croisement (Croix G0 mâle avec une femelle type sauvage ou croix G0 femelle mâle type sauvage) pour récupérer et d’écran pour mutants héréditaires par dosage de létalité ou la stérilité.
    NOTE : Semblable à d. melanogaster, N. vitripennis adultes peut être immobilisé par l’exposition au CO2 permettant une manipulation simple. En outre, les femelles accouplées donneront lieu à 100 % couvées mâles haploïdes, ainsi donc qu'une femelle non accouplée mutante peut donner lieu à grand nombre de mâles mutants qui peut être utilisé pour une analyse ultérieure.
    Remarque : Mutations dans les gènes essentiels devra être conservé par accouplement survivant G0 injecté femelles (vraisemblablement hétérozygotes pour une mutation) mâles type sauvage ; dans ce cas précis, la moitié de la descendance mâle de1 G devrait mourir à cause de l’héritage de la mutation létale, alors que la moitié de la progéniture femelle de1 G seront porteurs de la mortelle.
  4. Croiser les adultes0 G et descendance1 écran G transgène d’insertions à l’aide de marqueurs de transgénèse si l’objectif est la transgénèse. Actuellement, transgenèse reste à être démontrée chez N. vitripennis.

Representative Results

Ce protocole fournit des instructions détaillées pour la colonie d’élevage, la collecte des embryons avant blastoderme, alignement, microinjection et transplantation ultérieure après l’injection et peut être utilisé pour le génie du génome efficace chez N. vitripennis. Comme illustré à la Figure 2, la séquence générale des marches pour une microinjection réussie en N. vitripennis comprennent : (i) qui permet à des adultes mâles et femelles s’accouplent (~ 4 jours), (ii) fournir des pupes de mouches hôte frais (S. bullata) placé dans un bouchon de mousse modifiés pour les femelles accouplées et permettant pour la ponte (~ 45 min), (iii) soigneusement épluchant loin la cuticule de pupes parasitées hôte pour exposer et de collecter des embryons au stade de l’avant blastoderme guêpe (~ 15 min), (iv) en alignant recueillies des embryons (~ 15 min), (v) microinjecting composants de modification du génome dans des embryons (~ 15 min), embryons injectés soigneusement mises (vi) de nouveau dans des hôtes préalablement piqués pour permettre au bon développement (~ 15 min), et (vii) prévenant la déshydratation de l’embryon/hôte injectée en transférant dans une chambre humidifiée avec environ 70 % d’humidité relative (~ 15 min). Hôtes parasités sont ensuite incubés pendant environ 14 jours permettre un développement complet des embryons N. vitripennis . Une fois injecté, adultes émergent de l’hôte (viii), isoler, s’accouplent et leur écran individuellement pour la présence de mutations attendues.

Pénétration de l’aiguille efficace et microinjection dans des embryons de N. vitripennis , plusieurs types d’aiguilles de verre capillaire avec filament dont les types de quartz, aluminosilicate et borosilicate sont testés. Il se trouve que la qualité de l’aiguille est essentielle pour éviter les bris/colmatage pendant l’injection et pour atteindre des taux élevés de fois efficacité de survie et de la transformation d’embryon. Pour chaque type de verre, un protocole efficace a été développé pour tirer les aiguilles afin d’avoir une longue hypodermique-comme désirée Astuce efficace pour N. vitripennis microinjection de l’embryon à l’aide des étireuses différentes (P-1000 et P-2000) (tableau 1 Figure 4).

Afin d’optimiser la procédure, les taux de survie sont mesurées après injection de quantités variables de composants de modification du génome. Les composants de modification du génome utilisées ici ont été mixte guide ARN et protéine Cas9 pour génome induite par CRISPR édition, qui a été démontré précédemment que fonctionnent bien dans N. vitripennis21. Similaire à ce qui était précédemment signalé, ici un sgRNA ciblant le gène de cinabre est conçu et synthétisé. En ciblant et en perturbant ce gène, un changement phénotypique facilement identifiable est visible dans la couleur des yeux de l’organisme19,21. Une injection de mélange combinant une variété de concentrations de sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 et 320 ng/µL) avec protéines Cas9 (0, 20, 40, 80, 160 et 320 ng/µL) est créé et injecté dans des embryons de type sauvage N. vitripennis. Taux de survie des embryons injectées se trouve être dose-dépendante (tableau 2)21. L’augmentation de la concentration de sgRNA et Cas9 protéine à une diminution de survie (tableau 2), peut-être en raison des effets additifs de hors-cible. Une humidité élevée (~ 70 %) s’avère également important pour la survie des embryons après la transplantation aux hôtes, comme le taux d’humidité faible (~ 10 %) a abouti à la mort de 100 % de tous les embryons injectées.

Figure 1
Figure 1 . Préparation des pupes hôte (S. bullata) pour N. vitripennis Ponte embryon. (A) Jeunes et vieux S. bullata pupes. Nymphes âgées ont une cuticule plus sombre alors que jeunes nymphes ont une teinte plus rougeâtre à leur cuticule. Plus jeunes nymphes sont préférés pour maximiser la ponte. Extrémité postérieure et antérieure de la pupe se distingue également par un « cratère-comme l’ouverture sur l’extrémité postérieure, tandis que l’extrémité antérieure est livré à un rond point. (B) hôte (S. bullata) chrysalide préparatifs Ponte d’embryon vitripennis N. . Insérer les pupes d’hôte dans un bouchon de mousse qui a eu une pupe taille trou creusé. Avoir le côté postérieur de la face de nymphes d’hôte à l’intérieur de la fiche alors que 0,2 cm de l’extrémité antérieure exposés afin de permettre une concentration maximale de ponte dans la zone antérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Calendrier pour la création de N. vitripennis mutants par microinjection. Chronologie de la collecte des embryons N. vitripennis CRISPR/Cas9 microinjection et procédures après l’injection. N. vitripennis adultes pouvaient s’accoupler en absence d’un site de Ponte pendant 4 jours (j’ai). Après, une fraîche, mouche à viande hôte pupes, S. bullata, placé à l’intérieur d’un bouchon de mousse quant à exposer seulement 0,5 cm de l’extrémité postérieure, a été introduite pour les femelles gravides durant 45 min permettant de parasitisme (ii). En même temps, matériel d’injection y compris les aiguilles de microinjection et CRISPR/Cas9 composants ont été préparés (iii). Embryons ont été collectés depuis l’hôte (iv), alignés (v) et injectés avec composants CRISPR/Cas9 (vi). Les embryons injectés ont été soigneusement transférés à un hôte préalablement piqué (vii) et incubés jusqu'à complètement développés (14 jours) (viii). Quand les adultes ont émergé, les mutants ont été criblés pour les phénotypes des attendus CRISPR/Cas9 induit des mutations du gène de la cible (ix). L’ensemble de la procédure dure généralement 19 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Lame de microscope modifiés pour le revêtement des embryons. (A) A lamelle couvre-objet. (B) une lame de microscope. (C) un dispositif d’alignement embryon.Un lamelle couvre-objet peut être collé sur une lame de microscope pour servir à des embryons de ligne pour injection. Le but de la lamelle est d’agir comme un bord pour permettre une manipulation facile et doublure d’embryons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Injektionspräparat aiguille. Exemples (A) des aiguilles de verre aluminosilicate de bonnes et mauvaises. (B) les conseils d’une aiguille biseautée encastrée, correctement biseautée et mal. Tubes capillaires de verre aluminosilicate étaient tirés par moyen d’un extracteur d’une micropipette. Les pointes d’aiguille produites étaient alors doucement ouvert et raffiné à l’aide d’un chaflanador. La bonne aiguille biseautée a un bout très pointu, et l’aiguille biseautée mauvais a une pointe émoussée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Type de verre capillaire SUTTER aiguille extracteur modèle Chaleur Filament Vitesse Delay Tirez Pression
Quartz P-2000 750 4 40 150 165 -
Aluminosilicates P-1000 605 - 130 80 70 500
Borosilicate P-1000 450 - 130 80 70 500

Le tableau 1. Paramètres pour l’extracteur de l’aiguille.
Remarque : Réglage de l’aiguille extracteur varie d’une machine à chaque laboratoire devrez optimiser leurs propres paramètres extracteur d’aiguille. Ce tableau a été modifié par Li et al. 21

sgRNA-1 Cas9 Embryons totales Transplantation (10 % d’humidité) Transplantation (70 % d’humidité)
Les larves survivants Les larves survivants Survivants adultes
Total (%) Total (%) Total (%)
Aucune injection Aucune injection 100 94 (94) 96 (96) 66 26 92 (92)
Eau Eau 100 0 (0) 78 (78) 44 32 76 (76)
20 ng/µL 20 ng/µL 100 0 (0) 74 (74) 34 34 68 (68)
40 ng/µL 40 ng/µL 100 0 (0) 67 (67) 30 32 62 (62)
80 ng/µL 80 ng/µL 100 0 (0) 53 (53) 24 22 46 (46)
160 ng/µL 160 ng/µL 100 0 (0) 41 (41) 16 22 38 (38)
320 ng/µL 320 ng/µL 100 0 (0) 25 (25) 10 10 20 (20)

Le tableau 2. Injection et transplantation survie et mutagenèse taux fondés sur les injections de différentes concentrations de sgRNA et Cas9. Ce tableau a été modifié par Li et al. 21

Discussion

Le récent séquençage du génome N. vitripennis a déclenché un important besoin d’outils moléculaires caractériser sur le plan fonctionnel des gènes inconnus au sein de cette espèce23. Le système CRISPR-Cas9 et nombreux autres gènes des outils d’édition, ont prouvé être précieux dans l’étude des fonctions des gènes pour un certain nombre d’organismes24. Cependant, pour générer des mutations héréditaires, ces outils nécessitent effectuant des microinjections de l’embryon. Démontré par conséquent, voici une technique visuelle détaillée qui inclut un certain nombre d’innovations qui permettent efficace microinjections embryon N. vitripennis .

Dans l’ensemble, cette technique détaillée offre un certain nombre d’innovations importantes, en ce qui concerne les méthodes23, qui permettent l’efficace microinjections embryon N. vitripennis . Par exemple, pour faciliter la collecte rapide d’embryons, un outil de Ponte (bouchon de mousse) est créé et utilisé pour limiter la ponte entièrement à l’extrémité postérieure de l’hôte (Figure 1), ce qui facilite grandement la collecte d’embryons de nombreux au sein de une courte période de temps. Techniques pour l’élevage des colonies de guêpe avec un grand nombre de recueillir un plus grand nombre de œufs sont également améliorées et définis. En outre, afin d’accélérer l’alignement de l’embryon, un dispositif d’alignement embryon qui permet pour les embryons d’être efficacement aligné et injecté sans avoir à utiliser la bande adhésive double-face pour garantir les embryons en place (Figure 3) est développé.

En outre, on trouve que, en gardant les embryons humide avec de l’eau pendant l’injection et non desséchant les embryons ou recouvrant d’huile amélioré les taux de survie. En outre, plusieurs types de verre capillaire sont testés et dépendent des paramètres de génération des aiguilles parfaits pour N. vitripennis microinjection (tableau 1, Figure 4). En outre, suivant la microinjection, survie des embryons taux sont en mesure d’augmenter considérablement en raison de l’incubation des œufs injectées chez les hôtes préalablement piqués placés dans des chambres de haut-humidité (70 %). Ces innovations permettent une procédure plus simple et plus efficace de microinjection pour N. vitripennis.

Des modifications mineures en ce qui concerne les appareils d’injection et procédures de l’élevage est possible à ce protocole, selon les préférences de l’utilisateur. Toutefois, un certain nombre d’étapes critiques sera essentiel pour générer avec succès les mutants dans N. vitripennis. Par exemple, travailler rapidement afin que les embryons injectés sont > 1 h vieux et veiller à ce que les aiguilles à injection sont assez nettes limiter les dégâts à l’embryon seront essentielles. Alors que ce protocole devrait être efficace pour générer des mutations dans les gènes nombreux (sinon tous), une limitation majeure est l’exigence de CRIPSR/Cas9 pour cibler une séquence de PAM (NGG) qui dictera la séquence cible.

En conclusion, cette technique améliorée peut servir à générer beaucoup de genres de modifications du génome, comme les mutations, délétions et peut-être même des insertions à l’aide de CRIPSR/Cas9 technologies21, ou même transgène insertions pour générer transgéniques N. vitripennis, qui devrait accélérer grandement la recherche fonctionnelle chez cet organisme.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par un généreux Université de Californie à Riverside (UCR) laboratoire démarrage fonds O.S.A, un USDA National Institute of Food et projet d’Agriculture (NIFA) trappe (1009509) à O.S.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bugdorm Bugdorm 41515 Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes Fisher Scientific 982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata Carolina Insects 144440
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) Sutter Instruments 104E
Micromanipulator World Precision Instruments Kite R
Femtojet Express programmable microinjector Eppendorf
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 or P-2000
Stereo Microscope Olympus SZ51
Compound Microscope Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) Sutter Instruments BF100-58-10 Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs JAECE L800-B Foam plugs
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-A3
Micro Cover glass VWR 48366045
Adhesive Aron Alpha AA471 For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush ZEM 2595
Ultra-fine tip forcep Fisher Scientific 16-100-121
Femtotips Microloader tips Fisher Scientific E5242956003

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References

  1. Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40, (2), 121-127 (1994).
  2. Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42, (3), 333-406 (1967).
  3. Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18, (18), 1409-1414 (2008).
  4. Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6, (4), 329-336 (2000).
  5. Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
  6. Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117, (1), 85-101 (2003).
  7. Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240, (4851), 512-514 (1988).
  8. Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2, (4), 494-516 (2010).
  9. de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
  10. Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328, (5978), 620-623 (2010).
  11. Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17, (12), 2854-2864 (2008).
  12. Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132, (16), 3705-3715 (2005).
  13. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, (7077), 728-732 (2006).
  14. Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216, (7-8), 493-498 (2006).
  15. Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327, (5963), 343-348 (2010).
  16. Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5, (12), 2647-2653 (2015).
  17. Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3, (9), 1597-1605 (2013).
  18. Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8, (12), e83984 (2013).
  19. Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
  20. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1, (1), 486-494 (2006).
  21. Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7, (1), 901 (2017).
  22. Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93, (3), 323-327 (1999).
  23. Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327, (5963), 343-348 (2010).
  24. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, (6213), 1258096 (2014).
Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome <em>Nasonia vitripennis</em>
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Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J. Vis. Exp. (130), e56990, doi:10.3791/56990 (2017).More

Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J. Vis. Exp. (130), e56990, doi:10.3791/56990 (2017).

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