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Genetics

भ्रूण Microinjection और प्रत्यारोपण तकनीक Nasonia vitripennis जीनोम हेरफेर के लिए

doi: 10.3791/56990 Published: December 25, 2017

Summary

Microinjection के Nasonia vitripennis भ्रूण heritable जीनोम संशोधनों पैदा करने के लिए एक आवश्यक तरीका है । यहां वर्णित microinjection और Nasonia vitripennis भ्रूण है, जो बहुत इस जीव में भविष्य जीनोम हेरफेर की सुविधा होगी के प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया है ।

Abstract

गहना ततैया Nasonia vitripennis सेक्स संकल्प, haplo-द्विगुणित सेक्स संकल्प, विष संश्लेषण, और दूसरों के बीच मेजबान symbiont बातचीत सहित प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है । इस जीव के साथ काम करने का एक प्रमुख सीमा प्रभावी के जीनोम संशोधनों का निर्देश प्रदर्शन प्रोटोकॉल की कमी है । जीनोम संशोधन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा CRISPR/Cas9 अणुओं सहित संपादन रिएजेंट, microinjection के माध्यम से भ्रूण में वितरण है । जबकि microinjection अच्छी तरह से कई मॉडल जीवों में स्थापित है, इस तकनीक विशेष रूप से अपने छोटे भ्रूण के आकार के कारण मुख्य रूप से एन. vitripennis में प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, और तथ्य यह है कि भ्रूण विकास पूरी तरह से एक के भीतर होता है parasitized blowfly pupa. निंनलिखित प्रक्रिया इन महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करते हुए एक सुव्यवस्थित, प्रभावी ढंग से parasitized मेजबान कोषस्थों से ततैया भ्रूण को हटाने के लिए दृश्य प्रक्रिया का प्रदर्शन, उंहें microinjecting, और ध्यान से उंहें वापस में प्रत्यारोपण मेजबान निरंतरता और विकास के पूरा होने के लिए । इस प्रोटोकॉल दृढ़ता से अनुसंधान समूहों की क्षमता बढ़ाने के लिए इस जीव में उंनत जीनोम संशोधनों प्रदर्शन करेंगे ।

Introduction

गहना ततैया, एन vitripennis, जीनस Nasonia के भीतर चार प्रजातियों में से एक है कि मांस खाने के ectoparasitoids है जैसे Sarcophaga bullata1के रूप में मक्खियों । उनकी तेजी से पीढ़ी के समय के कारण, प्रयोगशाला में पालन की आसानी, और अद्वितीय और महत्वपूर्ण जैविक विशेषताओं की एक श्रृंखला, एन vitripennis पारंपरिक मॉडल जीवों में पाया कई प्रयोगात्मक उपकरणों के विकास के लिए ध्यान दिया गया है . उदाहरण के लिए, कुछ अद्वितीय जैविक विशेषताओं में शामिल है एक haplo-द्विगुणित प्रजनन प्रणाली2, माइक्रोबियल और आनुवंशिक परजीवी के साथ एक रिश्ता3,4, और एक supernumary (बी) गुणसूत्र5,6 ,7. साथ में ले लिया, इन N. vitripennis इन प्रक्रियाओं के आणविक और सेलुलर पहलुओं elucidating के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण प्रायोगिक प्रणाली, विष उत्पादन सहित दूसरों के अलावा8, 9, सेक्स दृढ़ संकल्प10,11, और विकास और अक्ष पैटर्न गठन12,13,14। इसके अलावा, आनुवंशिक toolkit के जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए Nvitripennis नाटकीय रूप से पिछले एक दशक में वृद्धि हुई है या तो, एक उच्च संकल्प जीनोम15के अनुक्रमण के साथ, कई जीन अभिव्यक्ति अध्ययन16,17,18, और कार्यात्मक आरएनए हस्तक्षेप (RNAi)19,20है, जो एक साथ इस जीव में रिवर्स आनुवंशिकी प्रदर्शन की क्षमता और क्षमताओं में सुधार हुआ है पर निर्भर जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने की क्षमता ।

कई महत्वपूर्ण वैज्ञानिक प्रगति और इस जीव में विस्तार toolkit के बावजूद, वर्तमान ज्ञान के रूप में केवल एक ही समूह सफलतापूर्वक भ्रूण microinjections प्रदर्शन किया है heritable जीनोम संशोधन21उत्पंन करते हैं । यह मुख्य रूप से एन vitripennis के भ्रूण के साथ काम करने की कठिनाइयों के कारण के रूप में वे काफी नाजुक और छोटे हैं, जा रहा है ~ 2/3 Drosophila melanogaster भ्रूण के आकार, उंहें आम तौर पर मुश्किल में हेरफेर कर । इसके अतिरिक्त, एन vitripennis मादा पूर्व में अपने अंडे जमा-नीतिश blowfly कोषस्थों, जिसके भीतर embryogenesis, लार्वा, और ुपाल विकास की संपूर्णता होती है. इसलिए, सफल microinjections, पूर्व blastoderm चरण के लिए, भ्रूण कुशलतापूर्वक मेजबान कोषस्थों से एकत्र किया जाना चाहिए, जल्दी microinjected, और तुरंत विकास के लिए अपने मेजबान में वापस प्रत्यारोपित । इन कदमों सटीक और निपुणता microinjected भ्रूण, या ुपाल मेजबान, हानिकारक तकनीक असाधारण चुनौतीपूर्ण बनाने से बचने के लिए की आवश्यकता है । बावजूद, वहां एक लघु एक दशक पहले कि एन vitripennis भ्रूण microinjection22का वर्णन करता है पर प्रकाशित प्रोटोकॉल है । हालांकि, इस प्रक्रिया की आवश्यकता है कि हौसले से रखी भ्रूण शुष्क हो, यह चिपचिपा टेप का उपयोग करता है microinjection के लिए अंडे लंगर, और तकनीक का एक दृश्य प्रदर्शन शामिल नहीं है । इसलिए, यहां वर्णित एक अद्यतन और संशोधित प्रोटोकॉल, एक दृश्य प्रक्रिया सहित, एक बेहतर कदम-दर- N. vitripennis भ्रूण microinjections कि किसी भी बुनियादी प्रयोगशाला द्वारा heritable जीनोम उत्पंन करने के बाद किया जा सकता है के लिए कदम प्रोटोकॉल का ब्यौरा है इस महत्वपूर्ण मॉडल कीट में संशोधन ।

Protocol

१. एन. Vitripennis कॉलनी उभारले आहे.

  1. 200-500 N. vitripennis वयस्कों (महिला के एक 3:1 अनुपात के साथ: पुरुष) बग छात्रावास पिंजरों में रखकर कई कॉलोनियों (~ 3-5) सेट करें ।
    नोट: बग के छात्रावास का उपयोग करने के लिए वैकल्पिक, ततैया भी कई में प्रचारित किया जा सकता है, छोटे गिलास परीक्षण ट्यूबों लगभग 15-20 ततैया के साथ कपास के साथ खामियों को दूर/
    1. 30% सापेक्ष आर्द्रता और एक 12:12 प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर ततैया को बनाए रखने, उन्हें 1:10 की छोटी बूंदों के साथ दैनिक खिला (वी/वी) सुक्रोज/पानी समाधान ।
      नोट: ततैया कालोनियों और संग्रह का प्रचार भी नियंत्रित आर्द्रता के बिना कमरे के तापमान पर आयोजित किया जा सकता है; हालांकि, तापमान 25 से कम डिग्री सेल्सियस थोड़ा भ्रूण के विकास के समय कम हो जाएगा ।
  2. इंजेक्शन के लिए पहले से कम 4 दिन के लिए मेट के लिए ततैया की अनुमति दें ।
    1. पहले दो दिनों के लिए, के रूप में अच्छी तरह से एक 1:10 (v/वी) सुक्रोज/पानी के समाधान की छोटी बूंदों के रूप में, साथ ही bullata कोषस्थों पर फ़ीड करने के लिए साथी महिलाओं की अनुमति दें ।
    2. निम्नलिखित दो दिनों के लिए, एक oviposition साइट की मादा ततैया को वंचित करने के लिए blowfly कोषस्थों को दूर करें, जिससे उन्हें बहुत gravid.

2. N. Vitripennis पूर्व blastoderm स्टेज भ्रूण का संग्रह और संरेखण

  1. युवा मेजबान (एस. bullata कोषस्थों) में मादा ततैया को परजीवी (oviposit भ्रूण) की अनुमति दें. मेजबानों को ताजा रखने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर मेजबान उंहें प्राप्त करने के बाद तुरंत और केवल हटाने जब जरूरत है ।
    नोट: युवा मेजबान एक लाल रंग puparium होने से निर्धारित किया जा सकता है जबकि पुराने मेजबान एक गहरा रंग का puparium है (चित्र 1a).
    1. एक फोम डाट में एक कोषस्थों-केंद्र में कटौती छेद आकार के साथ व्यक्तिगत ताजा एस bullata कोषस्थों प्लेस । parasitization और आसान भ्रूण संग्रह की अधिकतम एकाग्रता के लिए पूर्वकाल अंत (पसंदीदा oviposition साइट) की मेजबान के केवल ~ ०.२ सेमी बेनकाब ।
      नोट: पूर्वकाल अंत गोल है, जबकि पीछे अंत मोटा है और ' की तरह एक गड्ढा ' खोलने (चित्र 1b) शामिल है ।
    2. प्लेस मेजबान कोषस्थों (लगभग 5 १०० ततैया प्रति मेजबान कोषस्थों) पिंजरे में इस व्यवस्था में और लगभग ४५ मिनट प्रतीक्षा करने के लिए ततैया उंहें परजीवी (चित्रा 2- द्वितीय) अनुमति देते हैं ।
      नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है कि भ्रूण के रूप में संभव के रूप में युवा हैं, आदर्श oviposited होने के पहले घंटे के भीतर, यह सुनिश्चित करें कि वे पूर्व blastoderm चरण में हैं । पुराने भ्रूण (& #62; १.५ ज) का इंजेक्शन नहीं लगाना चाहिए ।
    3. उंहें हाथ से प्राप्त करने और धीरे से ब्रश करने से parasitized मेजबान निकालें/ उंहें हर ~ 15 मिनट के बाद ताजा मेजबान के साथ बदलें इंजेक्शन के दौरान जल्दी मंचन अंडे का संग्रह जारी है ।
  2. हौसले से parasitized संगे को पिंजरे से हाथ से हटा लें । एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश का उपयोग कर, ध्यान से दूर पीछे अंत (बाहरी puparium के ०.४ सेमी) छील (ुपाल शैल) के लिए एन vitripennis अंडे (चित्रा 2 iii) बेनकाब ।
    ध्यान दें: ुपाल त्वचा puncturing से बचने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए; यदि ऐसा होता है, hemolymph ततैया भ्रूण, जो बहुत microinjection के लिए दूर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा गीला हो जाएगा ।
  3. तरल चिपकने वाला एक साफ गिलास स्लाइड पर एक coverslip गोंद के लिए एक भ्रूण संरेखण स्लाइड तैयार करने के लिए (चित्रा 3) का उपयोग करें ।
    नोट: एक उच्च प्रदर्शन तुरंत चिपकने वाला बंधन शक्ति और सुखाने की गति बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन किसी भी गोंद है कि स्लाइड पर चारों ओर बढ़ने से coverslip रख सकते है स्वीकार्य है ।
  4. ब्रश-बंद मेजबान से भ्रूण एक गीला ठीक टिप तूलिका के साथ ध्यान से, यकीन है कि मेजबान की नरम ुपाल त्वचा को नुकसान नहीं कर रही ।
    नोट: एक ' भ्रूण उठाओ, ' जो मूलतः ultrafine संदंश की एक जोड़ी के एक आधा है, बजाय एक तूलिका का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. स्थानांतरण ~ 20 भ्रूण एक-एक करके स्लाइड पर, तुरंत एक गीली तूलिका के साथ coverslip के पक्ष के बगल में । ओरिएंट कवर स्लाइड एज के खिलाफ भ्रूण के पूर्वकाल अंत इतना है कि भ्रूण के पीछे अंत एक ही दिशा में बताया है (चित्रा 2 iv) । यह सभी भ्रूण के बीच एक ही स्थिति में इंजेक्शन के उच्च परिशुद्धता के लिए अनुमति देगा ।
    नोट: यह बेहतर तकनीक डबल पक्षीय चिपचिपा टेप की आवश्यकता नहीं है के रूप में पहले21,22वर्णित स्लाइड को भ्रूण ठीक । इसके अतिरिक्त, भ्रूण desiccate नहीं है, या इंजेक्शन के दौरान halocarbon तेल के साथ अंडे कवर के रूप में एन vitripennis भ्रूण microinjection22के लिए पहले वर्णित है ।

3. Microinjections के लिए सुई तैयारी

  1. एक सुई खींचने में एक aluminosilicate केशिका गिलास रखें ।
    नोट: एक अच्छा सुई सफल एन vitripennis भ्रूण इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है । इंजेक्शन सुई एक तेज और ठीक-टिप को चोरियों के माध्यम से आसानी से प्रवेश की अनुमति होनी चाहिए । क्वार्ट्ज और borosilicate केशिका सुई भी (चित्रा 4) इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. ६०५ के लिए गर्मी सेट, १३० के लिए वेग , ८० के लिए देरी , ७० करने के लिए पुल , और एक सुई खींचने पर ५०० करने के लिए दबाव .
    नोट: क्वार्ट्ज और Borosilicate सुई खींच के लिए अतिरिक्त सुई खींचने सेटिंग्स तालिका 1में देखा जा सकता है; पैरामीटर अलग खींचने और रेशा के लिए भिन्न हो सकते हैं ।
  3. सुई खींचने के लिए सक्रिय सही सुई बनाने के लिए । कई सुइयों के उत्पादन के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएँ.
    नोट: खींच सुई वाणिज्यिक मॉडलर मिट्टी के कई समानांतर रोल युक्त एक पेट्री डिश में उन्हें रखने के द्वारा संग्रहीत किया जा सकता है.
  4. थोड़ा 25 ° c (चित्रा 2- iii) पर 10 एस के आसपास हीरे घर्षण प्लेट को टिप छू द्वारा सुई टिप बेवल ।
    नोट: इंजेक्शन सुई के साथ ही सुई के माध्यम से रीजेंट्स के प्रवाह को बढ़ाने, जबकि न्यूनतम क्षति के साथ भ्रूण में प्रवेश को बढ़ावा देने के द्वारा बेवलिंग से लाभ.

4. भ्रूण Microinjection

  1. इंजेक्शन जीनोम संशोधन एजेंट से मिलकर मिश्रण तैयार (उदा, transposon + हेल्पर transposase, या CRIPSR रिएजेंट, आदि), और यह बर्फ पर रहते हैं ।
  2. microloader सुझावों का उपयोग करके इंजेक्शन मिश्रण के 2 µ एल के साथ इंजेक्शन सुई लोड ।
    नोट: इंजेक्शन मिश्रण प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया एकल गाइड आरएनए (sgRNA) के होते हैं और संयोजक Cas9 प्रोटीन एच2ओ में मिश्रित ।
  3. एक यौगिक माइक्रोस्कोप के मंच पर लाइन में खड़ा भ्रूण के साथ कांच स्लाइड प्लेस ।
  4. ध्यान से 25-35 डिग्री के एक ऊर्ध्वाधर कोण के साथ भ्रूण के पीछे अंत में सुई डालें ।
इंजेक्शन मिश्रण के 1-5 पी एल इंजेक्शन (भ्रूण की मात्रा के लगभग 2-10%) और यह सुनिश्चित करें कि भ्रूण थोड़ा प्रफुल्लित करने के रूप में यह मिश्रण में इंजेक्ट किया जाता है (चित्रा 2- iv) प्रकट होता है ।
नोट: यदि बहुत ज्यादा इंजेक्शन मिश्रण भ्रूण में इंजेक्शन है यह भ्रूण से कोशिका को उत्तेजित कर फट सकता है । इसके अतिरिक्त, एक खोलने के बहुत बड़े के साथ अनुचित तरीके से बेवल या टूटी हुई सुई भी भ्रूण टूटना पैदा कर सकता है ।
  1. यदि कॉलेस्ट्रॉल होती है तो फिर से बेवलिंग सुई का प्रयास करें । एन vitripennis भ्रूण के कोशिका असामान्य रूप से चिपचिपा और चिपचिपा है, जो अक्सर सुई कॉलेस्ट्रॉल (1/25 इंजेक्शन) की ओर जाता है ।
    नोट: यह इंजेक्शन अवधि के दौरान नियमित रूप से de-जल तूलिका का उपयोग कर पानी जोड़ने के द्वारा भ्रूण नम रखने के लिए महत्वपूर्ण है । ब्रश पर पानी की मात्रा के आसपास भ्रूण स्थानांतरित और आसानी से संरेखित करने के लिए महत्वपूर्ण है । बहुत अधिक पानी के परिणाम चल भ्रूण में और बहुत कम पानी उंहें चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए मुश्किल बनाता है ।
  2. एक समय में ~ 20-40 अंडे इंजेक्षन (लगभग 10 मिनट ले जाना चाहिए), तो बंद करो । एक गीला तूलिका के साथ हल्के से इंजेक्शन अंडे को छूने और उंहें एक मेजबान में जगह के साथ इंजेक्शन अंडे स्थानांतरण । फिर अंडे की एक ताजा नव रखी बैच का उपयोग कर फिर से इंजेक्शन जारी (& #62; 1 एच पुराने) ।
    नोट: आदर्श रूप से इस प्रोटोकॉल सबसे प्रभावी है अगर एक व्यक्ति को लगातार इकट्ठा कर रहा है और अंडे अस्तर है, जबकि एक अंय व्यक्ति जीनोम संशोधन घटकों इंजेक्शन और प्रत्यारोपण भ्रूण कोषस्थों मेजबान को इंजेक्ट कर रहा है ।

5. रोपाई इंजेक्शन जी0 N. vitripennis भ्रूण पूर्व पर बिफरे मेजबान

  1. ध्यान से एक पहले नीतिश एस bullata कोषस्थों (चित्रा 2- vi) microinjection के बाद एक गीली तूलिका के साथ पर इंजेक्शन जी0 भ्रूण जगह ।
    नोट: मेजबान कोषस्थों microinjection के लिए भ्रूण इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल इस उद्देश्य के लिए काम करेंगे । इसके अलावा, महत्वपूर्ण प्रयास के बावजूद, वहां वर्तमान में नहीं उपलब्ध कृत्रिम आहार है कि22इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. ४० को एक समय में एक ही पूर्व पर एक बार में भ्रूण इंजेक्शन एक-नीतिश मेजबान को भीड़ और लार्वा प्रतियोगिता से बचने के लिए जगह है ।
      नोट: इंजेक्शन भ्रूण को नुकसान का कारण होगा; मेजबान कोषस्थों को इंजेक्शन भ्रूण के लापरवाह प्रत्यारोपण इंजेक्शन घटक या जर्दी बाहर निचोड़ कर सकते हैं, और भ्रूण की मौत के लिए सीसा ।
  2. नम फिल्टर कागज और कपास की गेंदों के साथ एक पेट्री डिश में मेजबान कोषस्थों प्लेस, और उंहें 25 डिग्री सेल्सियस पर लगभग ७०% आर्द्रता के साथ इंजेक्शन भ्रूण हैच (लगभग 1-2 दिन) (चित्रा 2- vii) ।
    नोट: महत्वपूर्ण रूप से, मेजबान के साथ छोड़ दिया जा सकता है एक खुली बंद puparium और N. vitripennis अंडे सामांय रूप से इतने लंबे समय के रूप में वे एक humidified कक्ष (नम फिल्टर कागज और कपास गेंदों के साथ पेट्री डिश) में तैयार कर रहे है विकसित होगा सुखाना को रोकने के लिए । कमरे के तापमान पर और भीगा हुआ कपास गेंदों से नमी के साथ गर्मी के मामले में नमी को नियंत्रित नहीं किया जा सकता पर्याप्त है ।
  3. ७०% आर्द्रता और 25डिग्रीसेल्सियस में जी0 भ्रूण हैच के बाद एक नया पेट्री डिश में मेजबान कोषस्थों स्थानांतरण ।
    1. मेजबान कोषस्थों और इंजेक्शन जी0 लार्वा दैनिक मॉनिटर । यदि मेजबान कोषस्थों एक गलत गंध है, नए स्वस्थ मेजबान कोषस्थों के लिए इंजेक्शन लार्वा स्थानांतरण ।

6. जीनोम संशोधनों के लिए स्क्रीनिंग

  1. या तो एक ठीक तूलिका या भ्रूण उठाओ का उपयोग कर मेजबान से प्रत्येक N. vitripennis कोषस्थों निकालें । इंजेक्टेड जी0 लार्वा करीब 8 दिन पोस्ट इंजेक्शन कोषस्थ चाहिए ।
  2. एक अलग कांच की शीशी में एक हटा pupa प्लेस कपास के साथ खामियों को दूर किया और उंहें जी के रूप में उभरने के लिए अनुमति0 वयस्कों, यह सुनिश्चित करना है कि रची महिलाओं कुंवारी हो जाएगा जो बहाव आनुवंशिक पार के साथ मदद मिलेगी ।
    नोट: महिलाओं विंग लंबाई द्वारा पुरुषों से हल किया जा सकता है: महिलाओं अब पंख जो शरीर प्रोफ़ाइल पिछले विस्तार जब पक्ष पर बदल दिया है । सभी microinjected मादा कोषस्थों एक प्लग की शीशी में एक साथ रखा जा सकता है, और एक ही पुरुष कोषस्थों पर लागू होता है ।
  3. स्क्रीन जी0 व्यक्तियों, eclosion के बाद, या तो पीसीआर या नेत्रहीन द्वारा (यदि एक phenotypic जीन बाधित) । उदाहरण के लिए, यदि CRISPR किसी दिए गए जीन और बाधित जीन में विलोपन बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है एक दिखाई phenotype, तो तरह और प्रभावित phenotype के उत्परिवर्ती संस्करण (चित्रा 2- viii)21के साथ व्यक्तियों रखो । अगर, तथापि, एक गैर के लिए प्रभावित जीन encodes-दिखाई phenotype, जैसे एक आवश्यक जीन के उत्परिवर्ती के रूप में, एक पार योजना (पार जी0 पुरुष जंगली प्रकार के साथ महिला, या पार जी जंगली प्रकार के पुरुष के साथ0 महिला) के लिए ठीक है और स्क्रीन के लिए heritable म्यूटेंट के माध्यम से मृत्यु दर या बांझपन परख ।
    नोट: D. melanogasterके समान, N. vitripennis वयस्कों के लिए जोखिम से मैटीरियल किया जा सकता है सह2 सीधी हेरफेर के लिए अनुमति दी । इसके अलावा, unअगुणित महिलाओं १००% वृद्धि पुरुष सोच को जंम देना होगा, इसलिए एक उत्परिवर्ती unमहिला उत्परिवर्ती पुरुषों की बड़ी संख्या में वृद्धि दे सकते है कि बाद में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: आवश्यक जीन में उत्परिवर्तनों जी0 इंजेक्शन महिलाओं (शायद एक उत्परिवर्तन के लिए heterozygous) जंगली प्रकार पुरुषों के लिए संभोग द्वारा रखा जा करने के लिए की आवश्यकता होगी; इस विशेष मामले में, जी1 पुरुष संतान के आधे घातक उत्परिवर्तन के भाग के कारण मर जाना चाहिए, जबकि जी1 महिला संतान का आधा वाहक घातक होगा ।
  4. transgenesis मार्कर का उपयोग कर transgene सम्मिलन के लिए जी0 वयस्कों और स्क्रीन जी1 संतान को पार अगर लक्ष्य transgenesis है. वर्तमान में transgenesis रहता है के लिए एन vitripennisमें प्रदर्शन किया ।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल कॉलोनी पालन, पूर्व blastoderm भ्रूण संग्रह, संरेखण, microinjection, और इंजेक्शन के बाद बाद प्रत्यारोपण के लिए विस्तृत दिशानिर्देश प्रदान करता है और N. vitripennisमें कुशल जीनोम इंजीनियरिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, एन vitripennis में एक सफल microinjection के लिए कदम के सामांय अनुक्रम में शामिल हैं: (i) मेट (~ 4 दिन) के लिए पुरुष और महिला वयस्कों की अनुमति, (द्वितीय) की आपूर्ति ताजा मेजबान मक्खी कोषस्थों (एस bullata) में रखा एक संशोधित फोम महिलाओं के लिए मेट और oviposition के लिए अनुमति (~ ४५ मिनट), (iii) ध्यान से दूर parasitized मेजबान कोषस्थों छल्ली छीलने को बेनकाब और पूर्व blastoderm मंच ततैया भ्रूण (~ 15 मिनट), (iv) एकत्र भ्रूण संरेखित (~ 15 मिनट), (v इकट्ठा) microinjecting भ्रूण में जीनोम संशोधन घटकों (~ 15 मिनट), (vi) ध्यान से पूर्व में भ्रूण वापस इंजेक्शन रखने-नीतिश मेजबान उचित विकास के लिए अनुमति देने के लिए (~ 15 मिनट), और (सातवीं) इंजेक्शन भ्रूण की निर्जलीकरण को रोकने/ उंहें लगभग ७०% सापेक्ष आर्द्रता (~ 15 मिनट) के साथ एक humidified चैंबर में । Parasitized मेजबान तो मोटे तौर पर 14 दिनों के लिए मशीन के लिए एन vitripennis भ्रूण के पूर्ण विकास के लिए अनुमति देते हैं । एक बार इंजेक्शन, वयस्कों के मेजबान से उभरने (viii), अलग, दोस्त, और उंहें व्यक्तिगत रूप से स्क्रीन की उंमीद उत्परिवर्तनों की उपस्थिति के लिए ।

प्रभावी सुई प्रवेश के लिए और एन vitripennis भ्रूण में microinjection के लिए, क्वार्ट्ज, aluminosilicate सहित रेशा के साथ केशिका ग्लास सुई के कई प्रकार, और borosilicate प्रकार का परीक्षण कर रहे हैं । यह पाया गया है कि सुई की गुणवत्ता टूटना से बचने के लिए महत्वपूर्ण है/कॉलेस्ट्रॉल इंजेक्शन के दौरान, और दोनों भ्रूण अस्तित्व और परिवर्तन दक्षता की उच्च दर को प्राप्त करने के लिए. प्रत्येक ग्लास प्रकार के लिए, एक प्रभावी प्रोटोकॉल के लिए सुइयों खींचने के लिए विकसित किया गया था क्रम में एक वांछित hypodermic लंबी टिप के लिए प्रभावी एन vitripennis भ्रूण microinjection अलग micropipette खींचने का उपयोग (पी-१०००, और पी २०००) (तालिका 1 , चित्रा 4) ।

प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए, अस्तित्व दरों जीनोम संशोधन घटकों की मात्रा बदलती के बाद इंजेक्शन मापा जाता है । जीनोम संशोधन घटक यहां इस्तेमाल किया गाइड RNAs और CRISPR के लिए Cas9 प्रोटीन-मध्यस्थता जीनोम संपादन, जो पहले से प्रदर्शन किया गया में अच्छी तरह से काम करने के लिए मिश्रित थे N vitripennis21। क्या पहले की सूचना दी थी, यहां एक cinnabar जीन लक्ष्यीकरण sgRNA डिजाइन और संश्लेषित किया गया है । इस जीन को लक्षित और बाधित करके, एक आसानी से पहचाने जाने योग्य phenotypic परिवर्तन जीव19,21की आंखों के रंग में देखा जाता है । एक इंजेक्शन मिश्रण sgRNA की सांद्रता की एक किस्म के संयोजन (0, 20, ४०, ८०, १६०, और ३२० एनजी/µ एल) Cas9 प्रोटीन के साथ (0, 20, ४०, ८०, १६०, और ३२० एनजी/µ एल) बनाया है और जंगली प्रकार के भ्रूण में इंजेक्शन है N. vitripennis। इंजेक्शन भ्रूण के जीवित रहने की दर को खुराक पर निर्भर (तालिका 2)21पाया जाता है । sgRNA और Cas9 प्रोटीन की वृद्धि की एकाग्रता में कमी जीवित रहने की दर (तालिका 2) के लिए सीसा, शायद बंद-लक्ष्य प्रभाव additive के कारण । उच्च आर्द्रता (~ ७०%) भी प्रत्यारोपण के बाद भ्रूण अस्तित्व के लिए मेजबान के लिए महत्वपूर्ण हो पाया है, के रूप में कम आर्द्रता (~ 10%) सभी इंजेक्शन भ्रूण के लिए १००% मौत के परिणामस्वरूप ।

Figure 1
चित्र 1 . एन. vitripennis भ्रूण oviposition के लिए मेजबान कोषस्थों (एस. bullata) की तैयारी. () पुढच्या आणि जुने एस. bullata कोषस्थों. पुराने कोषस्थों एक गहरा छल्ली जबकि युवा कोषस्थों उनके छल्ली के लिए एक और अधिक लाल रंग है । कमसिन कोषस्थों को अधिकतम oviposition के लिए पसंद कर रहे हैं. कोषस्थों के पीछे और पूर्वकाल के छोर भी एक "गड्ढा द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है पीछे अंत पर खोलने की तरह, जबकि पूर्वकाल अंत एक गोल बिंदु पर आता है । () यजमान (एस. bullata) pupa एन. vitripennis भ्रूण oviposition के लिए तैयारी एक फोम प्लग है कि एक कोषस्थों था बाहर नक्काशीदार छेद आकार में मेजबान कोषस्थों डालने । प्लग के अंदर मेजबान कोषस्थों चेहरे के पीछे की ओर है, जबकि पूर्वकाल के अंत में ०.२ सेमी के पूर्वकाल क्षेत्र में oviposition की अधिकतम एकाग्रता के लिए अनुमति उजागर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . microinjection द्वारा N. vitripennis म्यूटेंट बनाने के लिए समयरेखा । एन vitripennis भ्रूण संग्रह, CRISPR/Cas9 microinjection, और पोस्ट इंजेक्शन प्रक्रियाओं की समयरेखा । N. vitripennis वयस्कों के लिए 4 दिनों (मैं) के लिए एक oviposition साइट के अभाव में मेट की अनुमति दी गई । निंनलिखित, एक ताजा, मांस मक्खी कोषस्थों, एस bullata, एक फोम डाट के अंदर रखा के रूप में केवल पीछे अंत के ०.५ cm बेनकाब, ४५ मिनट के लिए gravid महिलाओं को पेश किया गया था parasitization (द्वितीय) के लिए अनुमति देते हैं । microinjection सुई और CRISPR/Cas9 घटक सहित समवर्ती इंजेक्शन सामग्री (iii) तैयार थे । भ्रूण मेजबान (iv), गठबंधन (v), और CRISPR/Cas9 घटकों (vi) के साथ इंजेक्शन से एकत्र किए गए । इंजेक्शन भ्रूण ध्यान से एक पूर्व के लिए वापस स्थानांतरित कर रहे थे नीतिश मेजबान (सातवीं) और पूरी तरह से विकसित (14 दिन) (viii) तक मशीन । जब वयस्कों उभरा, म्यूटेंट की उंमीद की phenotypes के लिए जांच की गई CRISPR/Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तनों लक्ष्य जीन (ix) में । पूरी प्रक्रिया में आम तौर पर 19 दिन लगते हैं पूरा करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . अस्तर भ्रूण के लिए संशोधित माइक्रोस्कोप स्लाइड । () एक coverslip. (B) एक माइक्रोस्कोप स्लाइड । () एक भ्रूण संरेखण डिवाइस ।एक coverslip एक खुर्दबीन स्लाइड पर चिपके हुए इंजेक्शन के लिए भ्रूण लाइन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । coverslip का उद्देश्य आसान हेरफेर और भ्रूण के अस्तर के लिए अनुमति देने के लिए एक किनारे के रूप में कार्य करने के लिए है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . इंजेक्शन सुई तैयारी । () अच्छे और बुरे aluminosilicate शीशे की सुइयों के उदाहरण. (B) किसी unबेवल्ड, सही ढंग से बेवल्ड, और खराब बेवल्ड सुई के सुझाव । Aluminosilicate ग्लास केशिका ट्यूबों एक micropipette खींचने का उपयोग करके खींच लिया गया था । उत्पादित सुई सुझावों फिर धीरे खोला और एक बेवली का उपयोग परिष्कृत किया गया । अच्छा chamfer सुई एक बहुत तेज टिप है, और बुरा chamfer सुई एक कुंद टिप है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

केशिका ग्लास प्रकार Sutter सुई खींचने मॉडल गर्मी रेशा वेग देरी खींच दबाव
क्वार्ट्ज P-२००० ७५० 4 ४० १५० १६५ -
aluminosilicate P-१००० ६०५ - १३० ८० ७० ५००
Borosilicate P-१००० ४५० - १३० ८० ७० ५००

तालिका 1. सुई खींचने के लिए सेटिंग्स ।
नोट: प्रत्येक प्रयोगशाला अपनी खुद की सुई खींचने सेटिंग्स का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगी तो सुई खींचने की सेटिंग मशीन से मशीन के लिए बदलती हैं । इस तालिका को Li et al से संशोधित किया गया है । 21

sgRNA-1 Cas9 कुल भ्रूण ट्रांसप्लांटेशन (10% आर्द्रता) ट्रांसप्लांटेशन (७०% आर्द्रता)
लार्वा बचे लार्वा बचे वयस्क बचे
कुल (%) कुल (%) कुल (%)
कोई इंजेक्शन कोई इंजेक्शन १०० ९४ (९४) ९६ (९६) ६६ 26 ९२ (९२)
पानी पानी १०० 0 (0) ७८ (७८) ४४ ३२ ७६ (७६)
20 एनजी/µ एल 20 एनजी/µ एल १०० 0 (0) ७४ (७४) ३४ ३४ ६८ (६८)
४० एनजी/µ एल ४० एनजी/µ एल १०० 0 (0) ६७ (६७) 30 ३२ ६२ (६२)
८० एनजी/µ एल ८० एनजी/µ एल १०० 0 (0) ५३ (५३) 24 22 ४६ (४६)
१६० एनजी/µ एल १६० एनजी/µ एल १०० 0 (0) ४१ (४१) 16 22 ३८ (३८)
३२० एनजी/µ एल ३२० एनजी/µ एल १०० 0 (0) 25 (25) 10 10 20 (20)

तालिका 2. इंजेक्शन और प्रत्यारोपण उत्तरजीवी और sgRNA और Cas9 के विभिंन सांद्रता के इंजेक्शन के आधार पर mutagenesis दरों । इस तालिका ली एट अल से संशोधित किया गया है । 21

Discussion

एन vitripennis जीनोम के हाल ही में अनुक्रमण आणविक उपकरण के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को कार्यात्मकता इस प्रजाति के भीतर अज्ञात जीन विशेषताएं23दिलाई है । CRISPR-Cas9 प्रणाली, और कई अंय जीन संपादन उपकरण, जीवों की एक संख्या के लिए जीन कार्यों की जांच में24मूल्यवान साबित कर दिया है । हालांकि, heritable उत्परिवर्तनों उत्पंन करने के लिए, इन उपकरणों भ्रूण microinjections प्रदर्शन की आवश्यकता है । इसलिए, यहां का प्रदर्शन एक विस्तृत दृश्य तकनीक है कि नवाचारों की एक संख्या है कि कुशल एन vitripennis भ्रूण microinjections के लिए अनुमति भी शामिल है ।

कुल मिलाकर, इस विस्तृत तकनीक महत्वपूर्ण नवाचारों की एक संख्या प्रदान करता है, मौजूदा तरीकों23के संबंध में, कि कुशल एन vitripennis भ्रूण microinjections के लिए अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, भ्रूण, एक oviposition उपकरण (फोम डाट) के तेजी से संग्रह की सुविधा के लिए बनाया है और करने के लिए मेजबान के पीछे के अंत तक पूरी तरह से अंडे बिछाने (चित्रा 1), जो बहुत भीतर कई भ्रूण के संग्रह की सुविधा सीमित इस्तेमाल किया समय की एक छोटी अवधि । अंडे की अधिक से अधिक संख्या को इकट्ठा करने के लिए बड़ी संख्या के साथ ततैया कालोनियों के पालन के लिए तकनीक भी सुधार और परिभाषित कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, भ्रूण संरेखण में तेजी लाने के लिए, एक भ्रूण संरेखण डिवाइस जो भ्रूण के लिए अनुमति देता है कुशलता से गठबंधन किया जा करने के लिए और डबल पक्षीय चिपचिपा टेप का उपयोग करने के लिए जगह में भ्रूण सुरक्षित बिना इंजेक्शन (चित्रा 3) विकसित की है ।

इसके अलावा, यह पाया जाता है कि इंजेक्शन के दौरान पानी के साथ भ्रूण नम रखने के द्वारा और desiccating नहीं भ्रूण या उन्हें कवर तेल के साथ जीवित रहने की दर में सुधार. इसके अतिरिक्त, कई केशिका कांच प्रकार का परीक्षण कर रहे हैं और मापदंडों N. vitripennis microinjection (तालिका 1, चित्रा 4) के लिए सही सुई का निर्माण करने के लिए निर्धारित कर रहे हैं. इसके अलावा, microinjection निंनलिखित, भ्रूण जीवित रहने की दरों में काफी पूर्व में अंडे इंजेक्शन की वजह से वृद्धि करने में सक्षम है नीतिश उच्च आर्द्रता में रखा मेजबान (७०%) मंडलों । ये नवाचार N. vitripennisके लिए अधिक सुव्यवस्थित और सफल microinjection प्रक्रिया के लिए अनुमति देते हैं ।

इंजेक्शन तंत्र के मामले में मामूली संशोधन, और पालन प्रक्रियाओं उपयोगकर्ता वरीयताओं पर निर्भर करता है, इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है । हालांकि, N. vitripennisमें सफलतापूर्वक म्यूटेंट जनरेट करने के लिए कई महत्वपूर्ण चरण आवश्यक होंगे । उदाहरण के लिए, जल्दी से काम इतना है कि इंजेक्शन भ्रूण कर रहे हैं & #62; 1 एच पुराने, और सुनिश्चित करना है कि इंजेक्शन सुई पर्याप्त तेज करने के लिए भ्रूण को नुकसान कम कर रहे हैं दोनों आवश्यक हो जाएगा. हालांकि इस प्रोटोकॉल कई में उत्परिवर्तनों पैदा करने के लिए प्रभावी होना चाहिए (यदि नहीं सभी) जीन, एक प्रमुख सीमा CRIPSR/Cas9 आवश्यकता के लिए एक पाम (NGG) अनुक्रम जो लक्ष्य अनुक्रम हुक्म होगा लक्ष्य है ।

अंत में, इस तकनीक में सुधार इस तरह के उत्परिवर्तनों, विलोपन के रूप में जीनोम संशोधनों के कई प्रकार उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संभवतः भी CRIPSR/Cas9 टेक्नोलॉजीज21का उपयोग कर, या यहां तक कि सम्मिलन transgene ट्रांसजेनिक उत्पन्न करने के लिए एन. vitripennis, जो बहुत इस जीव में कार्यात्मक अनुसंधान में तेजी लाने चाहिए ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कैलिफोर्निया के एक उदार विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, नदी के किनारे (UCR) प्रयोगशाला शुरू करने के लिए निधि ओ. एस. ए, एक USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान (निफा) हैच परियोजना (१००९५०९) को O.S.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bugdorm Bugdorm 41515 Insect Rearing Cage
Glass Test Tubes Fisher Scientific 982010
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata Carolina Insects 144440
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV10
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) Sutter Instruments 104E
Micromanipulator World Precision Instruments Kite R
Femtojet Express programmable microinjector Eppendorf
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 or P-2000
Stereo Microscope Olympus SZ51
Compound Microscope Leica DM-750
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) Sutter Instruments BF100-58-10 Can also use Borosilicate or Quartz
Identi-Plugs JAECE L800-B Foam plugs
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-A3
Micro Cover glass VWR 48366045
Adhesive Aron Alpha AA471 For glueing coverslip onto microscope slide
Fine-tip paintbrush ZEM 2595
Ultra-fine tip forcep Fisher Scientific 16-100-121
Femtotips Microloader tips Fisher Scientific E5242956003

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References

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भ्रूण Microinjection और प्रत्यारोपण तकनीक <em>Nasonia vitripennis</em> जीनोम हेरफेर के लिए
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Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J. Vis. Exp. (130), e56990, doi:10.3791/56990 (2017).More

Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J. Vis. Exp. (130), e56990, doi:10.3791/56990 (2017).

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