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Neuroscience

चपटा स्तनधारी Cortices में Cortical मॉड्यूल का दृश्य

Published: January 22, 2018 doi: 10.3791/56992
Automatic Translation
*1, 1, 1,2,3, *1
1Bernstein Center for Computational Neuroscience, Humboldt University of Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, 3German Center for Neurodegenerative Diseases
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख स्तनधारी cortices से चपटा स्पर्श वर्गों को प्राप्त करने और histochemical और immunohistochemical तरीकों का उपयोग cortical मॉड्यूल कल्पना करने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन है ।

Abstract

स्तनधारी दिमाग के प्रांतस्था अलग उपसंरचनाओं या मॉड्यूल में parcellated है । Cortical मॉड्यूल आम तौर पर Cortical शीट के समानांतर झूठ, और कुछ histochemical और immunohistochemical तरीकों से delineated जा सकता है । इस अध्ययन में, हम स्तनधारी दिमाग से प्रांतस्था को अलग करने और cortical शीट के समानांतर वर्गों को प्राप्त करने के लिए उन्हें समतल करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डाला. हम आगे cortical मॉड्यूल कल्पना करने के लिए इन चपटा स्पर्श वर्गों की प्रक्रिया के लिए चयनित histochemical और immunohistochemical तरीकों पर प्रकाश डाला । विभिंन स्तनधारियों के somatosensory प्रांतस्था में, हम cytochrome oxidase histochemistry प्रदर्शन के लिए शरीर के नक्शे या cortical जानवर के शरीर के विभिंन भागों का प्रतिनिधित्व मॉड्यूल प्रकट करते हैं । औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था में, एक क्षेत्र है जहां ग्रिड कोशिकाओं उत्पन्न कर रहे हैं, हम immunohistochemical तरीकों का उपयोग करने के लिए आनुवंशिक रूप से निर्धारित न्यूरॉन्स जो एक ग्रिड में व्यवस्थित कर रहे हैं के मॉड्यूल को उजागर करने के लिए कई प्रजातियों में cortical शीट में पैटर्न. कुल मिलाकर, हम परत-वार चपटा cortical अनुभागों को अलग और तैयार करने के लिए एक ढांचा प्रदान करते हैं, और स्तनधारी दिमाग की एक विस्तृत विविधता में histochemical और immunohistochemical विधियों का उपयोग करके cortical मॉड्यूल विज़ुअलाइज़ करते हैं ।

Introduction

मस्तिष्क संरचना में फाइलोजेनी भर में सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन मस्तिष्क प्रांतस्था में देखा जा सकता है । महत्वपूर्ण मतभेदों के बावजूद, पशुओं के प्रांतस्था एक आम पैटर्न इस प्रकार है और मोटे तौर पर दो अलग तरीकों से विभाजित किया जा सकता है, परतों और क्षेत्रों के द्वारा1। Cortical परतों मस्तिष्क की सतह के समानांतर झूठ और सांप cortices में 3 परतों से संख्या में भिंनता2 स्तनधारी cortices1में 6 परतों । दूसरी ओर Cortical क्षेत्रों प्रांतस्था जो काफी हद तक अलग कार्यक्षमताओं के अनुरूप है, के विशिष्ट क्षेत्रों रहे हैं, उदाहरणके लिए, somatosensory प्रांतस्था स्पर्श की अनुभूति या दृश्य आदानों प्रसंस्करण में दृश्य प्रांतस्था में शामिल है. इन cortical क्षेत्रों अक्सर पैच या मॉड्यूल3में विभाजित किया जा सकता है, जो नियमित रूप से शारीरिक संरचनाओं दोहरा रहे हैं, मूलतः मस्तिष्क की pial सतह के समानांतर पाया. Cortical मॉड्यूल एक विशेष परत4तक ही सीमित हो सकता है, या कई परतों भर में विस्तार5।

मस्तिष्क के मानक खंड तरीकों मस्तिष्क की सतह के लिए सामान्य वर्गों को शामिल, राज्याभिषेक या sagittal की तरह. इन तरीकों cortical मॉड्यूल कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि cortical मॉड्यूल मस्तिष्क की सतह के समानांतर एक विमान में, tangentially कल्पना कर रहे हैं जब दिलचस्प सुविधाओं की एक भीड़ से पता चला जा सकता है. उदाहरण के लिए, somatosensory को कुतर दिया मस्तिष्क में मॉड्यूल, जब मस्तिष्क की सतह के लिए सामांय visualized बैरल के रूप में दिखाई देते हैं, और इस प्रकार क्षेत्रों नाम बैरल प्रांतस्था प्राप्त है । हालांकि, एक स्पर्श उंमुखीकरण में बैरल visualizing पर, वे एक मूंछ-नक्शा पता चलता है, बैरल के साथ एक स्थलाकृतिक बाहरी शरीर की सतह पर मूंछ की सटीक लेआउट मिररिंग अभिविंयास में रखी जा रही है । कुछ मामलों में, मॉड्यूलर व्यवस्था भी काफी समय के लिए पता लगाने से बच गया है, जब एक गैर-स्पर्श तरीके से visualized । औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था, ग्रिड कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जाना जाता है, न्यूरॉन्स जो एक नियमित रूप से षट्कोण पैटर्न में आग जब एक जानवर एक वातावरण को पार कर रहा है. हालांकि यह एक भारी जांच क्षेत्र है, हाल ही में जब तक, पैच या औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था है, जो शारीरिक रूप से एक षट्कोण पैटर्न में बाहर रखी है में कोशिकाओं के मॉड्यूल की उपस्थिति6, पता लगाने से बच गया था । इन मॉड्यूल की उपस्थिति और व्यवस्था, चूहे मस्तिष्क में, औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था के स्पर्श वर्गों बनाने और एक परत वार तरीके से cytoarchitecture की जांच की सुविधा थी ।

अनुभाग के बाद, cortical मॉड्यूल के दृश्य के विशेष पहलू भी कई मायनों में महसूस किया जा सकता है । प्रतिष्ठित, अध्ययन सेल घनत्व या फाइबर लेआउट1पर आधारित delineated मॉड्यूल है । एक अंय लोकप्रिय दृष्टिकोण cytochrome oxidase histochemistry, जो उच्च गतिविधि8के क्षेत्रों से पता चलता है का उपयोग होता है । नए दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से निर्धारित सेल प्रकार, उनके प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल6,8के आधार पर प्रतिष्ठित देख शामिल हैं ।

इस अध्ययन में, हम स्तनधारी दिमाग से प्रांतस्था को अलग करने के तरीकों पर प्रकाश डाला, चपटा स्पर्श वर्गों प्राप्त है, और cytochrome oxidase histochemistry और सेल प्रकार विशिष्ट प्रोटीन के immunohistochemistry के आधार पर cortical मॉड्यूल कल्पना ।

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Protocol

स्थानीय नैतिकता समितियों (LaGeSo) के पर्यवेक्षण के अंतर्गत पशु कल्याण पर जर्मन दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं निष्पादित की गईं । मानव और चमगादड़ मस्तिष्क डेटा Naumann एट अल से व्युत्पंन किया गया । 5 निंनलिखित प्रक्रिया एक पुरुष वयस्क Wistar चूहा (तनाव: RJHan: WI) पर किया जाता है ।

1. छिड़काव और मस्तिष्क निष्कर्षण

नोट: एक homogenously निश्चित और रक्त मुक्त मस्तिष्क को प्राप्त करने के लिए, पशु के transcardial छिड़काव अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है, के रूप में अवशिष्ट रक्त धुंधला के दौरान विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत बढ़ जाती है । फिर भी, यह संयुक्त राष्ट्र perfused नमूना से चपटा वर्गों को प्राप्त करने और उन्हें दाग करने के लिए संभव है । नमूने से निपटने की आसानी का इस्तेमाल किया निर्धारण की एकाग्रता के साथ बदलता रहता है । बहुत कम निर्धारण समतल और काटने के दौरान मस्तिष्क को नुकसान से निपटने का खतरा बढ़ जाता है, जबकि बहुत अधिक सांद्रता समतल और धुंधला संकेत की गुणवत्ता के लिए लचीलापन कम ।

  1. Transcardially perfuse पशु, एक 23G सुई का उपयोग कर । एक अधिक विस्तृत गाइड के लिए, देखें पण एट अल. 9
    1. फॉस्फेट बफर खारा का प्रयोग करें10 (पंजाबियों; ०.०२ एम; पीएच ७.४) मस्तिष्क और पशु के शरीर से खून निकलवाने के लिए. जारी रखें जब तक अर्क तरल स्पष्ट प्रतीत होता है, के साथ कम से १५० मिलीलीटर पंजाब संवहनी प्रणाली के माध्यम से संचार किया जा रहा है ।
      नोट: उत्तम परिणाम जानवर perfused जा रहा है की शारीरिक रक्तचाप की सीमा के समान दबाव में प्राप्त कर रहे है (उदा., चूहा: 120-130 mmHg) । वैकल्पिक रूप से, रक्त जमावट11से बचने के लिए समाधान के लिए हेपरिन (10 U/एमएल) जोड़ें ।
    2. मस्तिष्क को ठीक करने के लिए, transcardially १०० मिलीलीटर paraformaldehyde12 (पीएफए, 4%; में ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर (पंजाब)13) की एक न्यूनतम संचार जब तक पशु की गर्दन कड़ी है ।
      सावधानी: पीएफए एक संभावित यलो है ।
      नोट: histochemical गतिविधि धुंधला के लिए सर्वश्रेष्ठ परिणाम, जैसे cytochrome oxidase के लिए, प्राप्त कर रहे हैं, जब 2% पीएफए का उपयोग कर । अंय धुंधला के लिए, जैसे immunohistochemistry, 4% पीएफए पसंद है ।
  2. खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें ।
    नोट: देखें पण एट अल. 9 विवरण के लिए ।
    1. बड़ी कैंची या अस्थि कतरनों का उपयोग कर सिर को अलग ।
    2. ठीक कैंची का प्रयोग, गर्दन से नाक को midline साथ त्वचा में कटौती । खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा के अलावा खींचो । गर्दन और लौकिक मांसपेशियों ठीक कैंची का उपयोग कर निकालें ।
    3. interparietal हड्डी फोरमेन मैग्नम से शुरू करने के लिए पार्श्विका हड्डी के माध्यम से एक midline कटौती बनाओ ।
    4. Rongeurs का उपयोग करने के लिए बंद interparietal हड्डी छील । स्लाइड sagittal टांका के साथ ठीक कैंची और ललाट हड्डियों के पूर्वकाल अंत करने के लिए पार्श्विका के पीछे अंत से काट ।
    5. पार्श्विका और ललाट हड्डियों को छील करने के लिए Rongeurs का प्रयोग करें । वैकल्पिक रूप से, हड्डियों दूर लिफ्ट संदंश का उपयोग कर । ventral तंत्रिका डोरियों में कटौती और मस्तिष्क को दूर करने के लिए एक चंमच का प्रयोग करें । पंजाब के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण (०.१ एम; पीएच ७.४) ।
  3. 4% पीएफए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 घंटे के लिए में विसर्जन द्वारा अन-perfused दिमाग फिक्स (मस्तिष्क के आकार और जांच पर निर्भर करता है: छछूंदर: ~ 1 h, मानव: ~ 3 एच) ।
    नोट: मनुष्य की तरह बड़े और gyrencephalic दिमाग के लिए, अलग और ब्याज के क्षेत्र को काट कर निर्धारण समय को कम करने के लिए ।
  4. एक खंड में बड़े cortical क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए, आगे के बाद निर्धारण करने से पहले मस्तिष्क समतल; चरण 2 पर आगे बढ़ें । हालांकि, के वर्गों को प्राप्त करने के लिए कठिन औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था जैसे क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए, पोस्ट-4 कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 24 ज के लिए% पीएफए में मस्तिष्क ठीक ।

2. मस्तिष्क विच्छेदन और समतल

  1. एक उस्तरा ब्लेड (lissencephalic दिमाग) या स्केलपेल (gyrencephalic दिमाग) का उपयोग करके मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग ।
    नोट: यदि मस्तिष्क के बाद तय नहीं किया गया है, यह हैंडलिंग से नुकसान की संभावना है ।
  2. अनुवर्ती धारा पंजीकरण और संकोचन अनुमान सहायता के लिए वैकल्पिक कदम:
    1. गैर-ब्याज के एक क्षेत्र में प्रांतस्था पंचर, एक 35G सुई cortical सतह के लिए सामांय के साथ । cortical शीट के साथ परिभाषित दूरी पर कदम दो बार दोहराएं । cortical शीट के साथ दूरी का निर्धारण करने के लिए, एक निश्चित लंबाई पर एक पूर्व काट धागे का उपयोग करें (उदा, 5 mm) और पंचर के अंक निर्धारित करने के लिए इसे cortical सतह के साथ रखना ।
  3. Lissencephalic दिमाग: एक विदारक रंग का उपयोग करके subcortical संरचनाओं को हटा दें । महत्वपूर्ण: पूरे प्रक्रिया के दौरान पंजाब (०.१ एम; पीएच ७.४) के साथ मस्तिष्क नम रखें ।
    1. सेरिबैलम द्वारा मस्तिष्क पकड़ो और धीरे कोष महासंयोजिका में एक विच्छेदन विमान खोलने के लिए रंग डालें. रंग के दौर टिप प्रांतस्था से दूर बिंदु चाहिए ।
    2. रंग आगे स्लाइड और धीरे खींच जब तक रंग thalamus और प्रांतस्था के बीच है । खरोंच गति के साथ अलग subcortical संरचनाओं ।
    3. यहां तक कि मोटाई के लिए गोलार्द्ध का निरीक्षण ।
      नोट: किसी भी असमान क्षेत्रों को एक ट्रांस-लेयर ग्रैडिएंट में अनुभाग के दौरान परिणाम हो सकता है । स्पर्श अनुभाग के लिए, मस्तिष्क के माध्यम से एक साफ कट बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, क्षेत्र के pial सतह के समानांतर जिसमें से स्पर्श वर्गों वांछित हैं ।
    4. समतल गुणवत्ता में सुधार करने के लिए वैकल्पिक कदम:
      1. striatum, नाभिक accumbens, और orbitofrontal प्रांतस्था के माध्यम से एक साफ कट बनाओ, क्योंकि वे पार्श्व क्षेत्र में प्रांतस्था की मोटाई में वृद्धि । इसके अलावा, आकडे प्रांतस्था, जो प्रांतस्था के औसत दर्जे का भागों का खुलासा करने की अनुमति देता है के भीतरी क्षेत्र के आधार पर एक राहत कटौती जोड़ें ।
    5. एक गिलास स्लाइड पर गोलार्द्ध (प्रांतस्था का सामना करना पड़) प्लेस । २.६ चरण के लिए आगे बढ़ें ।
  4. Gyrencephalic दिमाग: सफेद पदार्थ gyri प्रकट करने के लिए निकालें (विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, देखें: Sincich एट अल. 14; Tootell और Silverman15) । क्रिटिकल: प्रयोग पंजाब (०.१ मी., पीएच ७.४) हर समय मस्तिष्क नम रखने के लिए ।
    1. एक बड़े पेट्री डिश में एक नम फिल्टर कागज पर ब्याज के क्षेत्र रखो, ऊपर का सामना करना पड़ प्रांतस्था के साथ ।
    2. रेशेदार झिल्ली और पिया दो संदंश का उपयोग कर निकालें ।
    3. एक नम कपास झाड़ू का प्रयोग करें और प्रत्येक sulcus में धीरे डालने के लिए gyri के बीच आसंजन अलग ।
    4. एक और नम फिल्टर कागज का उपयोग करके चारों ओर मस्तिष्क बारी ।
    5. एकल gyri का खुलासा करने के लिए दो घुमावदार माइक्रो spatulas का प्रयोग करें । spatulas के उत्तल पक्ष का उपयोग करने के अलावा सफेद बात को चिढ़ाने के लिए गाइरस के गुफा अंत के करीब तक पहुंचने तक । एक नम कपास झाड़ू का प्रयोग करें और घूमता गति के साथ आगे बढ़ना गाइरस के गुफा अंत तक पहुंचने के लिए ।
    6. चिढ़ाने के अलावा एकल gyri । यदि आवश्यक हो, तो तनाव बहुत अधिक है, तो छोटे राहत कटौती जोड़ें ।
    7. पेट्री डिश या एक समान कंटेनर में खुलासा मस्तिष्क समतल ।
  5. वैकल्पिक रूप से, एक फिल्टर कागज पर बड़ा दिमाग जगह स्पंज कवर, यह सुनिश्चित करने के लिए कि क्षेत्रों सूख नहीं है ।
  6. दोनों पक्षों पर मिट्टी के दो लुढ़का टुकड़े प्लेस । महत्वपूर्ण: मिट्टी की मोटाई को परिभाषित करता है के रूप में कितना गोलार्द्ध समतल किया जा सकता है, सुनिश्चित करें कि मिट्टी 10-20% संयुक्त राष्ट्र के समतल प्रांतस्था से पतले है ।
  7. धीरे गोलार्द्ध पूरी तरह से सपाट है जब तक प्रांतस्था पर एक दूसरे ग्लास स्लाइड/छोटे पेट्री डिश दबाएँ । एक वांछित क्षेत्र के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, कांच स्लाइड पहले संबंधित क्षेत्र पर रखें । lissencephalic दिमाग के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, पार्श्व भाग में पहले कांच स्लाइड tangentially जगह है और इस क्षेत्र पर केंद्रित दबाव लागू होते हैं ।
  8. एक वजन रखो (जैसे, एक सिरेमिक घड़ी ग्लास) कांच स्लाइड पर/पेट्री डिश और 3-5 ज के लिए गोलार्द्ध में 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में समतल ।
  9. पद-निर्धारण के लिए दबाव जारी करें और काँच की स्लाइड्स निकालें. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर 24 घंटे के लिए पीएफए (मुक्त अस्थायी) में चपटा गोलार्द्ध रखो ।
    नोट: 1% पीएफए का उपयोग करते समय histochemical गतिविधि के दाग के लिए सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त होते हैं । अंय दाग, जैसे immunohistochemistry के लिए, संयुक्त राष्ट्र के perfused दिमाग के लिए, 2% पीएफए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक चूहा cortical गोलार्द्ध और somatosensory प्रांतस्था में मॉड्यूल के दृश्य के समतल के लिए कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । transcardial छिड़काव के बाद, एक चूहे के मस्तिष्क (ए) विदारक था । Subcortical संरचनाओं हटा दिया गया था और प्रांतस्था फॉस्फेट बफर में दो ग्लास स्लाइड के बीच चपटा था (ख) । चपटा गोलार्द्ध (C) के बाद स्थिर, tangentially खोदी गई थी, और cytochrome oxidase गतिविधि (D) के लिए दाग थी । स्केल बार्स = 1 cm. R: Rostral, C: Caudal, L: पार्श्व, M: औसत दर्जे का । चित्रा Lauer एट अल से अनुकूलित । 23 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. काटना स्पर्श वर्गों

नोट: धुंधला प्रोटोकॉल की आवश्यकताओं के आधार पर, काटने की प्रक्रिया और मोटाई अनुकूलित किया जा सकता है । 80-150 µm पर आगे histochemical प्रोसेसिंग (step ३.२) के लिए गोलार्द्धों को काटने के लिए एक vibratome का प्रयोग किया गया । हालांकि, immunohistochemical प्रसंस्करण के लिए, पतले वर्गों वांछित हैं और एक ठंड microtome 10-60 µm पर खंड (चरण ३.३) के लिए इस्तेमाल किया गया था । वीडियो 1देखें ।

  1. 15 मिनट के लिए पंजाब में चपटा गोलार्द्ध (0.1 m; pH ७.४) को धो लें ।
  2. गोलार्द्ध को किसी vibratome पर काटें ।
    1. गोलार्द्ध tangentially को टुकड़ा करने की क्रिया धारक पर रखें । वैकल्पिक, स्थिति में यह तय करने से पहले एक गिलास स्लाइड के साथ धीरे से फिर से प्रेस (उदा, superglue के साथ) ।
      नोट: इस्तेमाल किया गोंद की मात्रा को कम करने, क्योंकि काटने कलाकृतियों समतल गोलार्द्धों की छोटी मोटाई के कारण परिणाम सकता है ।
    2. आवश्यक मोटाई में पतले अंत (पूर्वकाल के पीछे, यहां) की ओर मोटा और अधिक स्थिर अंत से गोलार्द्ध में कटौती । ३.४ चरण के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: यदि कम निर्धारण सांद्रता इस्तेमाल किया गया, यह एक धीमी गति से और एक उच्च आयाम में कटौती ।
  3. गोलार्द्ध को जमने microtome पर काटें ।
    1. यह डूब जब तक एक 30% सुक्रोज समाधान में (पंजाब में) डूब द्वारा मस्तिष्क Cryoprotect ।
      नोट: ऊतक के आकार पर निर्भर करता है cryoprotected जा रहा है, समाधान में डूब कुछ घंटों से कुछ दिनों के लिए रेंज कर सकते हैं । बड़े दिमाग के लिए वैकल्पिक cryoprotection तरीकों पर विचार किया जा सकता है (Rosene एट अल देखें । 16).
    2. मस्तिष्क माउंट करने के लिए ठंड microtome पर एक बर्फ का आधार फार्म । ठंड microtome के ब्लॉक चेहरे पर ठंड पंजाब द्वारा बर्फ के आधार का निर्माण । महत्वपूर्ण: यह सुनिश्चित करें कि बर्फ के आधार की सतह microtome ब्लेड के समानांतर है । ऐसा करने के लिए, खाली बर्फ microtome ब्लेड का उपयोग करने के लिए बिल्कुल बर्फ काटने की सतह के समानांतर आधार संरेखित करें आधार काट ।
    3. मध्यम ठंड में मस्तिष्क एंबेड और ब्लॉक चेहरा करने के लिए समानांतर ब्याज के क्षेत्र के साथ microtome के ब्लॉक चेहरे को माउंट । microtome के ब्लॉक चेहरे की ओर मस्तिष्क की pial सतह का सामना । महत्वपूर्ण: नमूना आकार के आधार पर ठंड तापमान समायोजित; उच्च तापमान अनुभाग के दौरान बेहतर अनुभाग अखंडता सुनिश्चित करते हैं, लेकिन बड़े वर्गों को समान रूप से नमूना फ्रीज करने के लिए कम तापमान की आवश्यकता होती है ।
    4. आवश्यक मोटाई में मस्तिष्क tangentially कटौती (सबसे अच्छा खंड गुणवत्ता में धीमी और वर्दी काटने गति परिणाम) ।
  4. एक शेखर पर 15 मिनट के लिए पंजाब में वर्गों धो लो ।

Video Snapshot
वीडियो 1: एक चूहे औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था और parasubicular और entorhinal मॉड्यूल के लेआउट से स्पर्श अनुभाग के योजनाबद्ध वीडियो । एक कुतर मस्तिष्क के औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था प्रांतस्था के पीछे के छोर पर स्थित है और औसत दर्जे का और ventral पक्ष की ओर झुका हुआ है । स्पर्श वर्गों इस कोण के साथ एक चाकू ओरिएंट द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । नतीजतन, उपयुक्त सेल प्रकार विशिष्ट धुंधला औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था और आसपास के parasubiculum में मॉड्यूलर संरचनाओं से पता चलता है । रे और Brecht8से वीडियो अनुकूलित । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

4. Cortical मॉड्यूल का दृश्य Cytochrome Oxidase धुंधला का उपयोग

नोट: अलग दाग प्रोटोकॉल cytochrome oxidase गतिविधि के histochemical का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है, उदा, वोंग द्वारा पहले-रिले17 और बाद में Divac एट अल द्वारा संशोधित । 18 यह प्रोटोकॉल Divac एट अल द्वारा एक पर आधारित है । 18, के बाद से निकल-अमोनियम सल्फेट (NiAS) के उपयोग के परिणाम में एक उच्च विपरीत और बेहतर परिभाषित मॉड्यूल में दाग cortical क्षेत्रों ।

  1. cytochrome oxidase धुंधला समाधान तैयार करें (Divac एट अल देखें. 18). समाधान के 10 मिलीलीटर के लिए, जोड़ें: 10 मिलीलीटर HEPES बफर (०.१ मीटर, पीएच ७.४), ४०० मिलीग्राम सुक्रोज, १२.५ मिलीग्राम NiAS, 2 मिलीग्राम cytochrome सी, 6 मिलीग्राम diaminobenzidine (ढाब) ।
    सावधानी: ढाब और NiAS यलो हैं ।
    नोट: ढाब बस वर्गों की मशीन से पहले जोड़ें ।
  2. 15 मिनट के लिए एक शेखर पर HEPES बफर (०.१ मीटर, पीएच ७.४) में वर्गों धो लो ।
  3. एक शेखर पर कमरे के तापमान पर धुंधला समाधान में वर्गों की मशीन ।
    नोट: धुंधला की गति का निरीक्षण करें । यदि कोई दिखाई प्रतिक्रिया नहीं है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए बदल जाते हैं । निर्धारण की मात्रा के आधार पर, दाग 10 मिनट के बाद या कई घंटे में मनाया जा सकता है ।
  4. 4% पीएफए जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें; यह अवांछित पुनः मर रहा है और पृष्ठभूमि संकेत की वृद्धि को रोकता है ।
  5. 10 मिनट के लिए HEPES बफर का उपयोग कर तीन बार वर्गों धो लें ।
  6. माउंट और कांच स्लाइड पर वर्गों सूखी ।
  7. एक बढ़ती हुई शराब पंक्ति के साथ वर्गों निर्जलीकरण:
    1. 1 मिनट के लिए ६०% इथेनॉल में स्लाइड धो लो । 1 मिनट के लिए ८०% इथेनॉल में स्लाइड धो लो । 2 मिनट के लिए ९६% इथेनॉल में स्लाइड धो लें । स्लाइड 3 मिनट के लिए १००% इथेनॉल में धो लो । isopropanol में स्लाइड को धोकर 5 मिनट के लिए xylene में स्लाइड धो लें ।
  8. तुरंत एक त्वरित सख्त बढ़ते माध्यम जोड़ने के लिए, और एक coverslip जोड़ें । महत्वपूर्ण: पानी आधारित बढ़ते माध्यमों का उपयोग नहीं करते हैं, के रूप में NiAS बाहर धोया जाएगा और दाग नीचा ।
  9. सेक्शन को लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।

5. Cortical मॉड्यूल का दृश्य Immunohistochemical धुंधला का उपयोग

नोट: एकाधिक प्रोटोकॉल immunohistochemistry, नमूना और जांच के प्रकार के लिए अनुकूलित के लिए उपलब्ध हैं । रूपांतरों एंटीबॉडी, permeabilizing एजेंटों की सांद्रता अलग, और गर्मी के समय के रूप में आवश्यक बनाया जा सकता है । निंनलिखित प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट जांच द्वारा एंटीबॉडी और दृश्य की एक बड़ी रेंज का पता लगाने के लिए अच्छे परिणाम की ओर जाता है ।

  1. 15 मिनट के लिए पंजाब (०.१ मीटर, पीएच ७.४) में वर्गों धो लें ।
  2. वैकल्पिक: एक जल स्नान का उपयोग कर एक epitope बेपर्दा करने के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन (Jiao एट अल पर आधारित. 19; वैकल्पिक तरीकों के लिए, Pileri एट अल देखें. 20).
    1. ८० ° c के लिए एक पानी स्नान कचौरी । त्रि-सोडियम साइट्रेट बफर19 (पीएच ८.०) तैयार है और ८० डिग्री सेल्सियस के लिए पानी के स्नान में यह कचौरी ।
    2. त्रि-सोडियम साइट्रेट बफ़र के लिए अनुभागों को स्थानांतरित करें । ८० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए वर्गों की मशीन
    3. वर्गों शांत कमरे के तापमान के लिए नीचे
    4. 15 मिनट के लिए पंजाब में वर्गों धो लो ।
  3. 15 मिनट के लिए, पंजाब-एक्स (०.५% ट्राइटन-x, ०.१ मीटर पंजाबियों में) दो बार वर्गों धो लें ।
  4. ब्लॉक विशिष्ट epitopes गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA; २.५%) और ट्राइटन-X (०.७५%) के लिए पंजाब में 2 ज के समाधान में वर्गों की मशीन द्वारा ।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी में वर्गों की मशीन, जैसे, Calbindin-D28k (1:5000, पंजाब में 1% BSA-X), 2-3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर ।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने विशिष्ट एंटीबॉडी इस्तेमाल पर निर्भर करता है । एक विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने मानदंड प्राप्त करने के लिए निर्माता की जानकारी देखें । एकाधिक एंटीबॉडी एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन विभिन्न प्रजातियों के खिलाफ उठाया जाना चाहिए ।
  6. 15 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाब में तीन बार वर्गों धो लो ।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी में रातोंरात वर्गों की मशीन (1:200, पंजाब में 1% BSA) एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: एकाधिक प्राथमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया गया था, तो कई माध्यमिक एंटीबॉडी अलग स्पेक्ट्रा पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाब में तीन बार वर्गों धुलाई द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी से धो लें ।
  9. माउंट और सूक्ष्म के लिए एक गिलास स्लाइड पर वर्गों सूखी ।
    नोट: वर्गों अभी भी coverslip बढ़ते से पहले नम होना चाहिए ।
  10. बढ़ते मध्यम ऊतक वर्गों पर प्रतिदीप्ति रंजक के लिए उपयुक्त लागू करें और एक coverslip लागू होते हैं ।
  11. 1 h के लिए अनुभागों को सुखाएं ।
  12. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, नेल पॉलिश का उपयोग कर coverslip सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रहते हैं ।

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Representative Results

हम somatosensory प्रांतस्था के दिमाग की एक किस्म में चपटा cortical वर्गों प्राप्त है, और उंहें cytochrome oxidase histochemistry के लिए संसाधित करने somatotopic विभिंन शरीर के अंगों का प्रतिनिधित्व मॉड्यूल कल्पना । यह तुलनात्मक दृष्टिकोण विकासवादी बलों के अध्ययन की अनुमति देता है कि आकार प्रांतस्था, उदा, mystacial vibrissae के अत्यधिक संरक्षित प्रतिनिधित्व दिखा रहा है और बैरल के रूप में lagomorpha21 (चित्रा 2) । इसके विपरीत, ऐसे पंजे और जननांगों के रूप में शरीर के अंय भागों में अपने रिश्तेदार के आकार में बदलाव दिखाने के लिए और एक पारिस्थितिकी आला या यौन चयन22,23के लिए विशेषज्ञता को प्रतिबिंबित ।

औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था की वास्तुकला को समझने के लिए, हम pial सतह के समानांतर वर्गों प्राप्त किया । यह मुख्य रूप से चूहों, चूहों, और मिस्र के फल चमगादड़ में औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था के स्पर्श अनुभाग द्वारा प्राप्त किया गया था । मनुष्यों में, क्योंकि काफी बड़ा आकार और entorhinal प्रांतस्था में और अधिक लहरदार, हम धीरे entorhinal प्रांतस्था का एक स्पर्श काट बनाने के लिए बाद प्रांतस्था चपटा । बाद में, सभी दिमाग cryopreserved थे और ६० µm. Immunohistochemistry पर एक cryostat पर खोदी गई एक विरोधी calbindin एंटीबॉडी के साथ प्राप्त वर्गों पर प्रदर्शन किया था, calbindin-सकारात्मक पिरामिडीय सेल मॉड्यूल में औसत दर्जे का entorhinal कल्पना प्रांतस्था५ (चित्रा ३). calbindin-entorhinal प्रांतस्था में मॉड्यूल इन सभी दिमाग में एक उल्लेखनीय समय-अवधि दिखाने के लिए, और केवल एक कारक द्वारा आकार में भिंनता 10 भर ~ २०,०००-मस्तिष्क में भिन्नता गुना5।

Figure 2
चित्रा 2: बैरल प्रांतस्था मॉड्यूल के स्थलाकृतिक लेआउट cytochrome oxidase histochemistry द्वारा की पहचान की स्तनधारियों भर में । (A) माउस के somatosensory प्रांतस्था से लेयर IV के स्पर्शात्मक अनुभाग, (ख) मंगोल गर्बिल, (ग) चूहा, (घ) degu, (ई) हंसटर, (च) खरगोश, एक उच्च संरक्षित somatotopic के रूप में बैरल दिखा mystacial vibrissae का निरूपण । स्केल पट्टियां = ५०० µm. M: औसत दर्जे का, L: पार्श्व, R: Rostral, C: Caudal; एक में अभिविन्यास भी बी-ई पर लागू होता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: calbindin immunoreactivity द्वारा पहचाने गए स्तनधारियों भर में औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था मॉड्यूल के आवधिक लेआउट. (एक) माउस के औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था की परत द्वितीय से स्पर्श वर्गों, (ख) चूहा, (ग) मिस्र के फलों के बल्ले, और (घ) मानव, calbindin के एक संरक्षित आवधिक लेआउट दिखा-सकारात्मक हवामहल सेल मॉड्यूल । स्केल पट्टियां = २५० µm. M: औसत दर्जे का, एल: पार्श्व, डी: पृष्ठीय, वी: Ventral, आर: Rostral, सी: Caudal; D में ओरिएंटेशन भी लागू होता है B, C. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

सेरेब्रल प्रांतस्था में मॉड्यूलर तकनीक की एक किस्म का उपयोग कर पहचान की गई है । सबसे जल्द अध्ययनों से आम तौर पर या तो कल्पना सेल घने क्षेत्रों, या फाइबर की एक अनुपस्थिति द्वारा cortical मॉड्यूल की पहचान1। बाद के तरीकों वृक्ष बंडलों की उपस्थिति का उपयोग किया है24, एक विशेष क्षेत्र25, या न्यूरोट्रांसमीटर26के संवर्धन से afferents. यहां हम दो तकनीकों का प्रदर्शन, (i) cytochrome oxidase histochemistry और (ii) immunohistochemical धुंधला ।

Cytochrome oxidase धुंधला cortical मॉड्यूल कल्पना करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक रहा है, और व्यापक रूप से प्राथमिक संवेदी cortices27,28में इस्तेमाल किया गया है । यह उच्च mitochondrial गतिविधि17के क्षेत्रों के लिए गहरा धुंधला द्वारा मॉड्यूल visualizes, जिससे शारीरिक मॉड्यूल के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में अभिनय जो काफी कार्यात्मक प्रतिक्रियाएं बटोरना । इस विधि दृश्य प्रांतस्था27में somatosensory cortical मॉड्यूल (चित्रा 2) और cortical मॉड्यूल कल्पना करने के लिए उपयोग किया गया है ।

पारंपरिक histochemical तकनीकों की कमियां में से एक यह है कि उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने विशिष्ट दृश्य मॉड्यूल है कि एक साथ visualized किया जा सकता है की संख्या को सीमित करता है । हालांकि, immunohistochemical तरीकों, फ्लोरोसेंट दृश्य जांच के साथ विकार में भी विशेष रूप से प्रोटीन को देखने और cortical मॉड्यूल की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । मसलन, thalamic afferents में संवेदी cortices परियोजना को somatotopic तरीके से पेश करना. इस प्रकार, इन afferents visualizing, VGluT2 immunoreactivity का उपयोग भी प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था जो हम cytochrome oxidase गतिविधि (चित्रा 2) का उपयोग कर visualized है में शरीर के नक्शे कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चुनिंदा प्रोटीन भी सेलुलर मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से परिभाषित कोशिकाओं के समूहों की पहचान । immunohistochemistry का प्रयोग, हम औसत दर्जे का entorhinal में पिरामिड कोशिकाओं के समूहों की पहचान की प्रांतस्था कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन व्यक्त,6 (चित्रा 3) और निर्धारित किया है कि इस विशेष आनुवंशिक रूप से निर्धारित की क्लस्टर कोशिकाओं के समूह विकास5भर में संरक्षित हैं, उनके समारोह अंतर्निहित आम microcircuit सिद्धांतों का संकेत. एकाधिक fluorophores का प्रयोग, हम भी औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था में पूरक मॉड्यूल delineated26, समानांतर microcircuits जो स्थानिक स्मृति आबाद का प्रदर्शन ।

ऐतिहासिक, मस्तिष्क एक विमान में खोदी गई है शरीर में अपनी स्थिति के लिए सामांय, या तो sagittal, राज्याभिषेक, या क्षैतिज झुकाव में । cortical मॉड्यूल की पहचान, somatosensory प्रांतस्था में प्रति बैरल क्षेत्रों की तरह4 भी एक स्पर्श और बाद में समतल cortical तैयारी29में अनुभाग के साथ कहा, हालांकि इस तरह के अनुभाग के अलग मामलों थे बहुत पहले देखा30,31। बैरल प्रांतस्था की पहचान के बाद, अंय cortical मॉड्यूल भी प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में पहचाने गए थे27, साथ ही साथ एक पूरा शरीर के नक्शे की उपस्थिति३२ प्राथमिक में एक somatotopic प्रतिनिधित्व के साथ somatosensory प्रांतस्था. बिल्ली दृश्य प्रांतस्था के चपटा वर्गों को अतिरिक्त पुनर्निर्माण के लिए३३की आवश्यकता के बिना ओरिएंटेशन कॉलम के स्थलाकृतिक संगठन का भी पता चला । Cortical मॉड्यूलरता भी parahippocampal cortices में प्रदर्शित किया गया है, presubiculum और parasubiculum26,३४ और औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था6सहित । आमतौर पर एक घुमावदार वस्तु समतल लामिना स्थलाकृति में विकृतियों लाती है-के रूप में एक फ्लैट मानचित्र३५पर घुमावदार पृथ्वी की सतह के अनुमानों की भीड़ द्वारा मनाया जा सकता है । एक अपेक्षाकृत सरलीकृत विधि आंशिक रूप से इन विकृतियों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए समतल से पहले परिभाषित दूरी पर संदर्भ अंक शुरू करने से है, और फिर समतल करने के बाद उन दोनों के बीच की दूरी को मापने । ये मार्क्स तो न केवल मात्रात्मक रूप से समतल द्वारा शुरू की गई विकृतियों का आंकलन करते हैं, बल्कि लगातार वर्गों को संरेखित करने के लिए एक आसान संदर्भ बिंदु भी प्रदान करते हैं । लामिना निष्ठा के संरक्षण के लिए आगे महत्वपूर्ण पहलुओं को सुनिश्चित करने में शामिल समरूप अनुभाग भर में सपाट है, और अंत में वास्तव में लामिना लेआउट को स्पर्श अनुभाग अनुकूलित लामिना cortical वर्गों को प्राप्त करने के लिए ।

चपटा स्पर्श वर्गों में cortical मॉड्यूल के दृश्य के मस्तिष्क प्रांतस्था में आकर्षक संरचना-समारोह संबंधों को खुलासा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था में मूंछ और शरीर के अंगों की स्थलाकृतिक प्रतिनिधित्व और microcircuits पैदा करने में एक संरचनात्मक ग्रिड की उपस्थिति समतल स्पर्श cortical वर्गों में कार्यात्मक ग्रिड कोशिकाओं जटिल microcircuits प्रकट विवरण जो अंय झुकाव से समझना मुश्किल होगा । हालांकि, हमारे वर्तमान तकनीक इन अनिवार्य रूप से तीन आयामी मॉड्यूल के केवल एक दो आयामी टुकड़ा प्रदान करते हैं । इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों और ऊतक समाशोधन तरीकों का प्रयोग३६,३७, यह एक पूरे के रूप में इन cortical मॉड्यूल कल्पना संभव होगा और शायद cortical नक्शे और मॉड्यूल की हमारी समझ में आगे अंतर्दृष्टि प्रकट ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि अनुसंधान किसी भी व्यावसायिक या वित्तीय संबंधों कि ब्याज की एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है के अभाव में आयोजित किया गया ।

Acknowledgments

यह काम पीरु Universität zu बर्लिन, अभिकलन तंत्रिका विज्ञान बर्लिन, Neurodegenerative रोगों के लिए जर्मन केंद्र (DZNE), जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय के लिए केंद्र (BMBF, Förderkennzeichen द्वारा समर्थित किया गया था) 01GQ1001A), NeuroCure, व द Gottfried विल्हेम लाइबनिट्स पुरस्कार दि DFG. हम उत्कृष्ट ग्राफिक डिजाइन और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जूलियन Diederichs के लिए Shimpei Ishiyama धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochrome oxidase staining
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C2506
3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637
D(+)-Saccharose Carl Roth  4621.1
Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich A1827
HEPES Carl Roth  9105.4
Name Company Catalog Number Comments
Antigen retrieval
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909
Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth 3904.2
Sodium chloride Carl Roth 9265.1
Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate Carl Roth 4984.3
Paraformaldehyde Carl Roth 0335.3
TRITON-X 100 Carl Roth 3051.3
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal Swant RRID: AB_10000347
Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal Swant RRID: AB_10000340
Albumin Fraction V, biotin free Carl Roth 0163.4
Name Company Catalog Number Comments
Mounting or freezing media
Fluoromount (immunofluorescence) Sigma-Aldrich F4680
Eukitt (histochemistry) Sigma-Aldrich 03989
Tissue freezing medium Leica Biosystems NC0696746
Name Company Catalog Number Comments
Alcohol dehydration
Ethanol 100% Carl Roth 9065.3
Ethanol 96% Carl Roth P075.3
2-Propanol Carl Roth 6752.4
Xylene substitute Fluka 78475
Name Company Catalog Number Comments
Devices/tools
Microm HM 650V Thermo Scientific
Jung RM2035 Leica Biosystems
Dumont #55 Forceps - Inox Fine Science Tools 11255-20
Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip Fine Science Tools 11252-00
Bone Shears - 24 cm Fine Science Tools 16150-24
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14
Blunt Scissors Fine Science Tools 14000-18
Surgical Scissors - Large Loops Fine Science Tools 14101-14
Surgical Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Fine Iris Scissors Fine Science Tools 14094-11

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३१ समतल स्पर्श cytochrome oxidase calbindin somatosensory प्रांतस्था औसत दर्जे का entorhinal प्रांतस्था
चपटा स्तनधारी Cortices में Cortical मॉड्यूल का दृश्य
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Lauer, S. M., Schneeweiß, U., Brecht, M., Ray, S. Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices. J. Vis. Exp. (131), e56992, doi:10.3791/56992 (2018).

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