Summary
この記事では、哺乳類の皮質から接線方向の平坦化されたセクションを取得し、皮質モジュールによる組織化学的および免疫組織化学的方法を視覚化する詳細な方法について説明します。
Abstract
哺乳類の大脳皮質は異なる部分やモジュールに parcellated です。皮質モジュールは通常そこに皮質のシートを平行し特定の組織化学的および免疫組織化学的方法で線引きすることができます。この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離し、皮質のシートに平行にセクションを取得するそれらを平坦化する方法を強調表示します。さらに、組織化学的選択したハイライト、これらを処理する免疫組織化学的方法は、皮質モジュールを可視化する接線方向のセクションを平坦化します。各種哺乳動物の体性感覚皮質では、体表や動物の体のさまざまな部分を表す皮質モジュールを明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学的研究を実行します。内側内嗅領皮質、グリッド セルの生成場所、領域は皮質のシートにグリッド パターンのいくつかの種の間で整理される遺伝のニューロンのモジュールを強調表示する免疫組織化学的方法を駆使します。全体的にみて、分離し、layer-wise を準備するためのフレームワーク皮質のセクションを平坦化、化学を用いた皮質モジュールとさまざまな哺乳類の脳での免疫組織化学的方法を視覚化を提供いたします。
Introduction
大脳皮質における系統間の頭脳の構造の最も重要な変更のいくつかを観察できます。重要な違いにもかかわらず動物の大脳皮質共通パターンに従います、レイヤーとエリア1では 2 つの異なる方法で大きく分類されます。皮質層はそこに脳の表面に平行と哺乳類の皮質1で 6 層に爬虫類野2の 3 レイヤーの数が異なります。皮質は一方で主など個別の機能に対応する大脳皮質の異なる領域、体性感覚野はタッチや視覚入力の処理の視覚皮質の感覚に関与します。これらの皮質頻繁に分割できますパッチまたはモジュール3、解剖学的構造は、基本的に脳の軟膜の表面に平行を見つけては繰り返し定期的にします。皮質モジュールが特定のレイヤー4に限られることがあります。 またはいくつかのレイヤー5に 。
脳の標準断面方法は、コロナや矢のような脳の表面に正常のセクションを含みます。皮質モジュールを可視化するこれらのメソッドを使用できますが、皮質のモジュールは、脳の表面に平行な平面で接線方向、視覚化されたときは、興味深い機能の多くを明らかになることができます。例えば、脳表面に垂直に視覚化されたときバレルとしてひげを表す齧歯動物の脳の体性感覚のモジュールが表示され、従って地域派生名バレル皮質。ただし、接線方向にバレルの視覚化の彼らは外部の体表面のひげの正確なレイアウトをミラーリング地形向きで配置されてバレルとウィスカ マップを明らかに。特定のケースでモジュール式の配置はかなりの期間のための検出をエスケープも非接線方法で視覚化されたとき。内側嗅は、グリッド セル、動物が環境を走査するとき規則的な六角形パターンで発射するニューロンの存在を知られています。にもかかわらず、最近では、パッチの有無や内側嗅細胞のモジュールまで大きく調査エリアは、6の六角形のパターンでレイアウトする物理的に検出を逃れていた。プレゼンスおよびラット脳におけるこれらのモジュールの配置は、内側嗅の接線方向のセクションを作ると、細胞構築を層ごとに調査によって促進されました。
断面後、皮質モジュールの可視化の特定の側面は、複数の方法で実現できます。従来、研究細胞密度や繊維レイアウト1に基づいてモジュールの輪郭を描いた。高い活動8の領域を明らかにするチトクロム酸化酵素組織化学を使用する人気のある方法です。新しいアプローチは、遺伝的に決定細胞型のタンパク質発現プロファイル6,8に基づいて区別を見ています。
この研究では、哺乳類の脳の皮質を分離、平面的な接線方向のセクションを取得およびチトクロム酸化酵素組織化学および細胞型特定の蛋白質の免疫組織化学に基づいて大脳皮質のモジュールを可視化する方法を強調表示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての実験の手順は、ローカル倫理委員会 (LaGeSo) の監督の下で動物福祉に関するドイツのガイドラインに従って行われました。人間バット脳データはナウマンらから派生した、5雄 Wistar ラットに次の手順を実行 (ひずみ: RJHan:WI)。
1. 血流と脳領域抽出
注: 既存固定と血液-無料脳を得るために動物の transcardial 潅流推奨されています、残血は染色中に非特異的バック グラウンド信号を増加。それにもかかわらず、それも非灌流標本からフラットなセクションを取得し、それらを染色可能です。試料の取り扱いの容易さは、使用される定着剤の濃度によって異なります。あまり固定の平坦化、切削、高すぎる濃度平坦化のための柔軟性と染色の信号の品質を下げるしながら脳への損傷のリスクが高まります。
- Transcardially は、23 G 針を使用して、動物を灌流します。詳細なガイドは、ゲージらを参照してください。9
- リン酸バッファー生理食塩水10 (PBS; 0.02 M; pH 7.4) 脳と動物の体から血を洗い流すために使用します。注入液が明確な少なくとも 150 ml の PBS 血管系を介して注入されて表示されるまで続行します。
注: 最良の結果が灌流されている動物の生理的血圧の範囲に類似した圧力で達成が (例えばラット: 120-130 mmHg)。必要に応じて、血液凝固11を避けるためにソリューションにヘパリン (10 U/mL) を追加します。 - 脳を修正する transcardially を吹き込む 100 mL パラホルムアルデヒド12の最小値 (4 %pfa で 0.1 M のリン酸バッファー (PB)13) 動物の首が硬いまで。
注意: PFA は、潜在的な発がん性物質です。
注: 組織化学的活性染色、チトクロム酸化酵素などのように最高の結果を達成、2% を使用する場合 PFA。他の染色、免疫組織化学など 4 %pfa が好ましい。
- リン酸バッファー生理食塩水10 (PBS; 0.02 M; pH 7.4) 脳と動物の体から血を洗い流すために使用します。注入液が明確な少なくとも 150 ml の PBS 血管系を介して注入されて表示されるまで続行します。
- 頭蓋骨から脳を抽出します。
注: 表示計ら詳細については9 。- 大きなはさみまたは骨鋏を使用して頭を分離します。
- 良いはさみを使用して鼻に首から正中線に沿って皮膚をカットしました。頭蓋骨を公開する肌を離れて引っ張る。首と罰金のはさみを使用して筋を削除します。
- 頭頂骨まで後頭から始まって interparietal の骨を切って正中線を作る。
- Interparietal 骨をはがすには、Rongeurs を使用します。矢状縫合線に沿って高級ハサミをスライドさせ、頭頂の後端から、頭骨の前方の端にカットします。
- 頭頂と頭骨をはがす、Rongeurs を使用します。また、鉗子を使って骨を持ち上げて取り外します。スプーンを使用して、腹側神経索を切断して脳を外します。脳を PB (0.1 M; pH 7.4) に転送します。
- 4% 浸漬によって非灌流脳を修正 4 ° C で 1-3 h の PFA (脳の大きさとプローブによって: じゃじゃ馬: ~ 1 h、人間: 〜 3 h)。
: 注大規模な人間のような gyrencephalic 脳分離固定時間を減らすために関心のある領域を切り取ると。 - セクションで大きな皮質領域を得るためには、さらに後固定; する前に脳を平らにします。手順 2 に進みます。内側嗅のような領域に到達するための困難のセクションを取得する修正 4% 脳後手順 2 に進む前に 24 h の PFA。
2. 脳の解剖と平坦化
- かみそりの刃 (lissencephalic 頭脳) またはメス (gyrencephalic 脳) を使用して脳の半球を区切ります。
注: 脳を後解決されていない場合、処理による損傷を受けやすいです。 - 以降のセクションの登録と収縮の推定を支援するための省略可能な手順:
- 35 G 針は皮質表面に垂直で、非金利部皮質を穿刺します。2 回皮質シートに沿って定義された距離で手順を繰り返します。皮質のシートに沿った距離を決定するため (例えば、5 mm) 固定長でカット済みスレッドを使用し、穿刺のポイントを決定する大脳皮質の表面に沿ってレイアウトします。
- Lissencephalic 脳: 解離性ヘラを使用して皮質下構造を削除します。重要: 脳の全体の手順中 PB (0.1 M; pH 7.4) と潤いを保ちます。
- 小脳に脳を保持、脳梁で郭清の面を開くにヘラをゆっくり挿入します。ヘラの先丸は、大脳皮質から指摘しなければなりません。
- さらにヘラをスライドさせ、へらは視床と皮質の間まで丁寧に引き抜きます。動を傷の独立した皮質下構造。
- でも厚さの半球を検査します。
注: 任意の不均一な領域のトランス レイヤー グラデーションに断面中とあります。接線断面、脳をきれいにカットをする接線方向のセクションを希望する地域の軟膜表面に平行にメスを使用します。 - 統合化の品質を改善するためにオプションの手順:
- 横方向領域の皮質の厚さは増加するので、線条体、側坐核、眼窩前頭皮質、きれいにカットをします。また、皮質の内側部分の展開を可能にする前頭前野の内側の領域の基地で緩和のカットを追加します。
- スライド ガラスの半球 (前野下向き) を配置します。2.6 の手順に進みます。
- Gyrencephalic 脳: 下前を展開する白質を削除 (詳細なプロトコルを参照してください: 染色ら14;Tootell、シルバーマンの15)。重要: 使用 PB (0.1 M; pH 7.4) 脳を湿った保つことすべての時。
- 上向き皮質と大型ペトリ皿で湿らせたろ紙に関心のある分野を置きます。
- クモ膜と 2 つの鉗子を使用して pia を取り外します。
- 湿った綿棒を使用して、優しく脳回の間の癒着をデタッチするそれぞれの溝に挿入します。
- 別の湿らせたろ紙を使用して脳を好転します。
- 1 つの脳回を展開するのに 2 つの湾曲したマイクロ ヘラを使用します。回の凹面の端に到達するまで離れて白質をいじめるにヘラの凸側を使用します。湿った綿棒を使用して、前回の凹面の端に達する旋回運動に進みます。
- 離れて 1 つの脳回をいじめます。必要であれば、テンションが高すぎる場合にカット小さな緩和を追加します。
- ペトリ皿または類似のコンテナーに展開された脳を平らにします。
- 地域乾かさないように、フィルター紙のスポンジに大きな脳を必要に応じて、配置します。
- 両側に粘土の 2 つの圧延作品を配置します。重大: 粘土の厚さどのくらい半球を平坦化することが定義されているように、粘土が 10-20% である非平坦化された皮質よりも薄い。
- 半球が完全にフラットになるまでに大脳皮質を軽く第 2 ガラス スライド/小さなシャーレを押してください。目的の地域の最高の結果を得るためには、それぞれの区域の最初ガラス スライドを配置します。Lissencephalic 脳の最良の結果を得るためには、まず外側部分にスライド ガラスを接線方向配置し、この地域に集中して圧力をかけます。
- ガラス スライド/シャーレに (例えば、セラミック時計ガラス) 体重をかけるし、PB の 4 ° C で 3-5 h の半球を平らに。
- ポスト固定圧力を解放し、ガラス スライドを削除します。4 ° C でシェーカーの PFA (浮遊) に 24 h の平たい半球を置く
注: 1% を使用する場合、組織化学的活性染色の最良の結果を達成、PFA。他の染色、免疫組織化学、非灌流脳、PFA を使用ことができます 2% など。
図 1: ラット大脳皮質半球と体性感覚野におけるモジュールの可視化の平坦化のためのワークフローの略図。マウスの脳の解剖 transcardial 潅流後 (A)。皮質下構造除去し、皮質のリン酸バッファー (B) の 2 つのガラス スライド間フラット化されました。平たい半球 (C) だった後固定、接線方向断面およびチトクロム酸化酵素活性 (D) のステンド グラスします。スケール バー = 1 cm。 r: c: Caudal Rostral l: 横、m: 内側。Lauer 氏らから適応図23この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. 切削接線セクション
注: プロトコルを汚すの要件に応じて切削手順と厚み合わせることができます。80-150 μ m でさらに組織化学的処理 (手順 3.2) の半球をカットする、vibratome を使いました。ただし、免疫組織化学的処理薄いセクションが望まれ、凍結ミクロトームを用いて断面 (3.3) でステップ 10-60 μ m。ビデオ 1を参照してください。
- PB でフラットな半球を洗う (0.1 m; pH 7.4) 15 分。
- Vibratome に半球をカットします。
- 半球をスライス ホルダーに接線方向に配置します。必要に応じて、もう一度を押します (例えば、瞬間接着剤で) の位置に固定する前にスライド グラスで軽く。
注: は、平面的な半球の小さい厚さのため切削アイテム可能性がありますので接着剤の使用量を最小化します。 - 必要な厚さに薄く終盤 (前方、後方はこちら) より厚くより安定した端から半球をカットします。3.4 の手順に進みます。
注: 固定の低濃度が使用された場合遅い速度と高振幅でカットします。
- 半球をスライス ホルダーに接線方向に配置します。必要に応じて、もう一度を押します (例えば、瞬間接着剤で) の位置に固定する前にスライド グラスで軽く。
- 凍結ミクロトームに半球をカットします。
- Cryoprotect まで (PB) で 30% ショ糖溶液に浸漬することによって脳は沈みます。
注: cryoprotected をされている組織のサイズ、に応じてソリューションに沈むまで数時間から数日。大きな脳の代替に対する凍害保護作用方法が考えられる (Roseneらを参照してください。16)。 - 氷の脳をマウントする凍結ミクロトームの基本を形成します。凍結ミクロトームのブロックの顔に PB を凍結して氷の基本を構築します。重要: は、氷の基地の表面はミクロトームの刃に平行を確認します。これを行うには、空の氷をミクロトームの刃を使用して切削表面に平行氷の基地が正確に整列するは基本のカットに。
- 凍結中の脳を埋め込み、ブロック面に平行の関心の領域にミクロトームのブロックの顔にそれをマウントします。ミクロトームのブロックの顔に向かって脳の軟膜表面に直面します。重要: サンプル サイズに応じて凍結温度を調整します。高い温度は、断面中より良いセクションの整合性を確保するが、大きいセクションには、サンプルを均一に固定するのには低温が必要があります。
- 接線方向 (セクションの最高品質、低速かつ一定の切削速度) 必要な厚さで脳をカットします。
- Cryoprotect まで (PB) で 30% ショ糖溶液に浸漬することによって脳は沈みます。
- PB のシェーカーで 15 分間のセクションを洗います。
ビデオ 1: 接線断面ラット内側嗅と parasubicular と嗅内皮質モジュールのレイアウトからのスケマティック ビデオ。齧歯動物の脳の内側嗅皮質の後部の端にある、内側と腹側に向かって傾いています。接線方向のセクションを取得するには、この角度でナイフを定位します。その結果、適切な細胞型特異染色内側嗅と隣接する parasubiculum のモジュラー構造を明らかにします。ビデオ レイとブレヒトの8から適応。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
4. チトクロム酸化酵素染色を用いた皮質モジュールの可視化
注: 異なるプロトコルを汚すウォン ライリー17 例えば、チトクロム酸化酵素活性の組織化学的検出のため開発され Divacらによって後で変更18このプロトコル Divacらによるものに基づいて18、硫酸ニッケル アンモニウム (NiAS) を使用するのでより高いコントラストと汚された皮質領域でより良い定義されたモジュールの結果します。
- チトクロム酸化酵素染色液の準備 (Divacらを参照してください。18). 溶液 10 mL、追加: 10 mL HEPES 緩衝液 (pH 7.4 0.1 M) 400 mg ショ糖、12.5 mg、ニアス 2 mg シトクロム C、6 mg ジアミノベンジジン (軽打)。
注意: DAB とニアス発癌性があります。
注: セクションの孵化直前に軽打を追加します。 - 15 分のシェーカーに HEPES 緩衝液 (0.1 M、pH 7.4) のセクションを洗います。
- シェーカーで室温で染色液でセクションを孵化させなさい。
注: は、染色速度を観察します。目に見える反応がない場合は 37 ° C で培養に変更します。固定量に応じて染色観察できますまたはいくつかの時間で 10 分後。 - 4% の追加によって反作用を停止 PFA;不要な再死ぬとバック グラウンド信号の増加がなくなります。
- HEPES 緩衝液を使用して 10 分の 3 つのセクションを洗います。
- マウントし、スライド ガラス上のセクションを乾燥します。
- 増加のアルコール行とセクションを脱水します。
- 80% エタノールで、96% のエタノールでスライドを洗う 1 分 2 分 3 分 5 分 5 分のキシレンでスライドを洗うためにイソプロパノールでスライドを洗うために 100% エタノールでスライドを洗うためのスライドを 1分間洗浄 60% エタノールでスライドに洗ってください。
- すぐに、迅速な硬化取付中と観察を追加します。重要: はニアスが洗い流される染色が低下すると、この水ベース マウント メディアは使用しないでください。
- 長期的なストレージ 4 ° C でのセクションを保ちます。
5. 免疫組織化学染色を用いた皮質モジュールの可視化
注: 複数のプロトコル、免疫組織化学、最適な試料とプローブの種類にことがあります。適応を行うことができます必要に応じて、さまざまな濃度の抗体、構造のエージェント、およびインキュベーション時間によって。次のプロトコルは、蛍光プローブによる抗体と可視化の広い範囲を検出するための良い結果に します。
- 15 分間 (0.1 M; pH 7.4) PBS のセクションを洗います。
- オプション: (焦らに基づく水槽を併用したエピトープの正体を暴露する抗原検索を実行します。19;代替方法は、Pileriらを参照してください。20)。
- 80 ° C の水浴を予熱します。三ナトリウム クエン酸バッファー19 (pH 8.0) を準備し、80 ° C の水浴で予熱
- セクションをトライ ナトリウム クエン酸バッファーに転送します。80 ° C で 30 分のセクションを孵化させなさい
- 部屋の温度の下にセクションを冷却します。
- 15 分のための PBS でセクションを洗います。
- 2 回で PBS X セクションを洗う (0.5 %0.1 M PBS でトリトン X) 15 分。
- 2 h のウシ血清アルブミン (BSA; 2.5%) とトリトン X (0.75%) を PBS でのソリューションのセクションの孵化によって不明確なエピトープをブロックします。
- 一次抗体を例えばカルビンジン-D28k のセクションを孵化させなさい (1:5, 000 PBS x 1 %bsa)、4 ° C でシェーカーの 2-3 日間
注: 一次抗体の希釈使用特定の抗体に依存します。特定の抗体の希釈条件を入手する製造元の情報を参照してください。複数の抗体は一緒に使用することができますが、別の種に対して提起する必要があります。 - 3 回 15 分 PBS でセクションを洗います。
- 二次抗体 (1: 200、PBS で 1 %bsa) シェーカーの 4 ° c で一晩セクションを孵化させなさい。
注: 複数の二次抗体は複数の一次抗体を使用した場合、異なるスペクトルで使用できます。 - 3 回 10 分ずつの PBS でセクションを洗浄することにより二次抗体を洗浄します。
- マウント、顕微鏡用スライド ガラス上のセクションを乾燥します。
注: セクションは、coverslip をマウントする前に湿ったはずです。 - 組織切片を蛍光染料に適したメディアをマウントを適用し、観察を適用します。
- 1 h のセクションを乾燥させます。
- 長期的なストレージ、マニキュアを使用 coverslip のシールし、4 ° C で暗闇の中で保持
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
様々 な脳の体性感覚野の皮質のセクションを平らを, チトクロム酸化酵素組織化学別の身体の部分を表現するシミュレーション モジュールを可視化するためにそれらを処理します。この比較のアプローチにより、その形状野、例えば、齧歯動物および兎のバレル21 (図 2) mystacial ヒゲの非常に節約された表現を示す進化の力を勉強します。対照的に、足と性器など他の体の部分を示し、彼らの親類のバリエーション サイズ生態学的ニッチまたは性選択22,23特殊化を反映します。
内側嗅のアーキテクチャを理解するには、軟膜表面に平行なセクションを得た。これは主に、マウス、ラット、およびエジプトのフルーツ バットの内側嗅の接線断面によって達成されました。ヒトでは、かなり大きなサイズと内嗅領皮質より起伏のため優しくを平らにした後嗅皮質の接した切口を作る皮質。その後、すべての脳を凍結保存され、60 のクライオスタットの断面 μ m. 免疫抗カルビンジン抗体、内側嗅内皮質にカルビンジン正ピラミッド型電池モジュールを可視化すると得られたセクションに行った野5 (図 3)。内嗅領皮質カルビンジン モジュールはこれらすべての脳の間で顕著な周期性を示し全体で 10 の要因だけでサイズが変化 ~ 脳の 20,000-fold 変異のサイズ5。
図 2: チトクロム酸化酵素組織化学によって識別される哺乳類の間でバレル皮質モジュールの地形のレイアウト。非常に節約されたシミュレーションとしてバレルを示す層 IV (A) マウス、スナネズミ (B)、(C) ラット、(D) degu、ハムスター (E)、(F) ウサギの体性感覚野からの接線方向のセクションmystacial ヒゲの表現。スケール バー = 500 μ m. m: c: Caudal; r: Rostral, l: 外側内側A の方向は B e. にも適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 内側嗅皮質モジュール カルビンジン免疫によって識別される哺乳類間での定期的なレイアウトします。(A) マウス、ラット (B)、(C) エジプトのフルーツ バット、(D) 人間、カルビンジン正ピラミッド型電池モジュールの保存された定期的なレイアウトを示すの内側嗅の II 層から接線方向のセクション。スケール バー = 250 μ m. m: 内側、l: 横、d: 背, v: 腹、r: Rostral、c: Caudal;ニ方向は、B、C にも適用されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
大脳皮質のモジュールは、さまざまな技術を使用して識別されています。早いいずれかの可視化による研究通常識別される皮質モジュール セルの密集した地域または繊維1の不在。それ以降のメソッドは、有無樹状束24、25の特定の領域からの求心性神経の神経伝達物質26の充実に活用しています。ここで 2 つの技術、(i) チトクロム酸化酵素組織化学的研究 (ii) 免疫組織化学染色を示します。
チトクロム酸化酵素染色皮質モジュールを視覚化する最も人気のある方法のいずれかをされているし、一次感覚野27,28で広く使用されています。高いミトコンドリア活性17、それにより実質的な機能の反応を誘発する解剖学的モジュールのためのプロキシとしての領域のために暗いの汚損によってモジュールを可視化します。このメソッドは、体性感覚皮質モジュール (図 2) と大脳皮質視覚野27モジュールを視覚化するために使用されています。
伝統的な組織化学的手法の欠点の 1 つは、明視野光学顕微鏡検査によって彼らの典型的な可視化が同時に視覚化することができるモジュールの数を制限することです。ただし、蛍光可視化プローブとの抱合の免疫組織化学的方法は、特定のタンパク質や、大脳皮質のモジュールを特定するにも利用できます。例えば、求心系の視床感覚野へのシミュレーション方法でプロジェクトします。したがって、これらの求心性神経を可視化、VGluT2 陽性を使用しても使用できます我々 が可視化した一次体性感覚野における体表を視覚化するチトクロム酸化酵素活性 (図 2) を利用しました。遺伝的に定義されているセルのグループを識別するために、選択的蛋白質を細胞のマーカーとして使用もできます。免疫組織化学を使用して、我々 はカルビンジン6 (図 3) カルシウム結合蛋白質を表現する内側内嗅領皮質錐体細胞のクラスターを識別し、この特定のクラスターは遺伝的に決定を決定セルのグループは、進化5を示す彼らの機能の基礎となる共通の局所回路における原則の間で保存されます。複数の同時を使用して、我々 も区切られた内側嗅皮質26、補完的なモジュールの空間記憶の根底にある並列回路を示します。
歴史的に、脳は体は、矢状、冠状、または水平方向の位置に垂直な平面で切断されています。体性感覚野の4バレル フィールドのような皮質のモジュールの同定も求め、接線に沿って、その後平坦化された皮質製剤29、断面あったがこのような断面の孤立した症例多くの以前の30,31を観察しました。バレル野の同定後、他の皮質のモジュールはまた主の体部位再現表現完全体地図32の存在と同様、一次視覚野27、識別されました。体性感覚野は。ネコ視覚野の平坦化されたセクションには、追加再構成33を必要とせず方位選択性コラムの地形の組織も明らかにしました。皮質のモジュールは、海馬傍皮質、前海および parasubiculum26,34内側嗅皮質6などで実証されています。フラット マップ35に湾曲した地球の表面の突起の多数によって観察することができます - 層流地形の歪みを誘発する通常の曲線オブジェクトをフラット化します。フラット化し、平坦化した後それらの間の距離を測定する前に定義された距離で基準点を導入することは部分的にこれらの歪みを補正する比較的単純な方法です。これらのマークだけでなくフラット化によって導入された歪みの定量的推定に生後、連続したセクションを配置する参照しやすいポイントも提供します。さらに層流の忠実度を維持するための重要な側面、セクションを渡って均一な平坦化を確実に含めるし、皮質層流のセクションを最適化された最終的に取得する層流のレイアウトに丁度接線断面します。
接線方向の平坦化されたセクション内の皮質のモジュールの可視化は、大脳皮質の魅惑的な構造と機能の関係を明らかに重要な役割を果たしています。一次体性感覚野のひげや体の部分の地形表現と平面的な接線方向の皮質セクションで機能グリッド セルを生成する回路の解剖学的なグリッドの存在は、複雑な回路を明らかにします。詳細は他の方向から理解するは難しいだろう。しかし、私達の現在の技術は、これらの本質的に 3次元モジュールの二次元スライスのみを提供します。蛍光免疫測定法と組織法36,37をクリア使用して、それは全体としてこれらの皮質のモジュールを視覚化し、おそらくさらに皮質地図とモジュールの私達の理解への洞察力を明らかにすることが可能でしょう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。
Acknowledgments
この作品は、神経変性疾患 (DZNE) は、ドイツ連邦教育省および研究 (BMBF、Förderkennzeichen の zu ベルリンのフンボルト大学, 計算の神経科学のベルリンのための Bernstein の中心, ドイツ語センターによって支えられました。01GQ1001A)、NeuroCure とゴットフリート ・ ヴィルヘルム ・ ライプニッツ賞 DFG。優れたグラフィック デザインの平石山とユリアーネ Diederichs の優秀なテクニカル サポートに感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
