Summary
Den retinale pigment epitel (ÅV) er et multi-funktionelle epitel af øjet. Her præsenterer vi en protokol for at oprette primære cellekulturer stammer fra den murine ÅV.
Abstract
Den retinale pigment epitel (ÅV) er en meget polariseret multi-funktionelle epitel, der ligger mellem neurale nethinden og årehinden i øjet. Det er et enkelt ark af pigmenterede celler, der er hexagonalt pakket og forbundet med stramme vejkryds. De vigtigste funktioner af ÅV omfatter absorption af lys, fagocytose af skur fotoreceptor ydre segmenter, rumlige buffering af ioner, transport af næringsstoffer, ioner og vand samt aktiv deltagelse i den visuelle cyklus. Med sådanne vigtige og forskelligartede funktioner er det afgørende vigtigt at studere biologi af ÅV celler. En række af ÅV cellelinjer har opstillet; dog er passaged og udødeliggjort celler kendt for at hurtigt miste nogle af de morfologiske og fysiologiske egenskaber af naturlige ÅV celler. Således, primærelementer er mere velegnede til at studere forskellige aspekter af ÅV cellebiologi og funktion. Musen primære ÅV cellekultur er meget nyttigt for forskere, da musemodeller er meget udbredt i biologiske undersøgelser, men indsamling ÅV celler fra musen er også meget udfordrende på grund af deres lille størrelse. Vi præsenterer her, en protokol til oprettelse af primære mus ÅV cellekulturer, der omfatter enucleation og dissektion af øjnene og isolation af ÅV ark til at give celler til dyrkning. Denne metode giver mulighed for effektiv celle opsving. ÅV celler fremstillet af to mus kan nå confluency på en 12 mm polyester membran Indsæt præinstalleret i kultur plade efter en uge af kultur og vise nogle af de oprindelige egenskaber af bona fide ÅV celler som sekskantet form og pigmentering efter to uger af kultur.
Introduction
Den retinale pigment epitel (ÅV) er en enkelt lag af polariseret epitelceller, der ligger mellem neurale nethinden og årehinden i øjet. Funktionaliteten af ÅV celler og integriteten af ÅV-éncellelag er afgørende for vision, fordi ÅV spiller en stor rolle i flere processer såsom opretholde den ydre blod-retinal barriere, transport af vand og ioner mellem nethinden og de plexus, lys absorption, beskyttelse mod oxidativ stress, kontrol af retinoid metabolisme og fagocytose af de ydre dele af fotoreceptorer1,2. Placeringen af ÅV bagest i øjet, såvel som dens barriere funktion forhindrer medicin administreres systemisk i at passere fra blodet til vitreum, gør det vanskeligt at studere kompleksiteten af ÅV funktion i vivo. Således er der et stort behov for etablering af ÅV cellekulturer at studere ÅV celler i en fleksibel, kontrolleret miljø3,4.
Findes en række etablerede ÅV cellelinjer, giver en nem og bekvem måde ved udtagning og opbevaring af celler; passaged celler har dog nogle ulemper i forhold til primærelementer2,3,4. Først, de er ofte karakteriseret ved ændringer i celle morfologi. For eksempel, fandtes ingen af de eksisterende cellelinjer for at være egnet til en pålidelig undersøgelse af ÅV barriereegenskaber på grund af tabet af celle polaritet fænotype og delvis forsvinden af stramme kryds4. Ud over tab af polaritet og ordentlig celle til celle forbindelser miste ÅV cellelinjer hurtigt deres pigmentering på grund af fravær af de centrale melanogenesis enzymer i voksen ÅV5. Pigmentering kan gendannes, men den omfattende analyse af mekanismen for fornyet pigmentering, som ville omfatte en kombination af transmissions Elektron Mikroskopi, gene expression analyse og kemiske assays til at bekræfte tilstedeværelsen af melanin har aldrig været udført6. En yderligere begrænsning er at ÅV cellelinjer har udvidet celle liv (undertiden - udødelighed) og under visse betingelser kan omdanne selv fornyelse Multipotente stamceller, der løsnes fra substrat og form flydende kolonier7, 8. denne begrænsning gør det umuligt at anvende cellelinjer til transplantation eksperimenter3.
I betragtning af ulemperne ved de etablerede ÅV cellelinjer, primære ÅV cellekulturer fremstillet af frisk væv kan tjene som en mere biologisk relevante model til at studere ÅV. Primære ÅV celler har været anvendt, ikke kun at studere ÅV-specifikke funktioner, såsom vitamin A stofskifte9, fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter10 og ion transport11, men også at studere grundlæggende cellebiologi som epitelial celle polaritet2 , lysosomale homøostase, og autophagy12,13.
I de sidste par år har der været en række publikationer om oprettelse af primære ÅV kulturer, viser en stigende interesse i dette område af forskning3,14,15. Mange protokoller for ÅV menneskeceller og ikke-menneskelige ÅV celler som kvæg og svin ÅV celler blev udgivet16,17,18,19. Det er imidlertid vanskeligere at håndtere musen ÅV celler på grund af deres meget mindre størrelse. Selvom ganske en række publikationer har beskrevet protokoller for at isolere ÅV celler fra mus14,20,21, er der stadig mange forskere kæmper for at isolere ÅV celler uden forurening af plexus celler eller af celler fra neurale nethinden debris. Her præsenterer vi protokollen til oprettelse af primære mus ÅV cellekultur, herunder at få øjnene fra mus, dissektion af øjnene og isolation af ÅV ark til at give celler til dyrkning. Denne video protokollen ville være særligt nyttigt for forskere, der er begyndt at arbejde med musen primære ÅV kulturer og har brug for vejledning om dissektion teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr emner er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Pittsburgh
1. Forbered løsninger
- Forberede vækstmediet af supplerende Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM), høje glukose 10% føtal bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, 2,5 mM L-glutamin og 1 x MEM uvæsentlige aminosyrer. Pre varm medier i 37 ° C inkubator før brug.
- Forberede 2% (wt/vol) dispase II brugsopløsning:
- Forberede en stamopløsning af 100 mg/mL dispase II ved at opløse 30 mg dispase II i 300 µL HEPES-bufferet saltvand (50 mM HEPES/KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Denne diskenhed er for 3-4 mus, det kan skaleres op eller ned baseret på antallet af mus til eksperimentet). Denne bestand kan opbevares i mindst 1 uge ved 4 ° C.
- Forbered brugsopløsning af 2% dispase ved at tilføje 300 µL af 100 mg/mL dispase II materiel til 1,2 mL sterilt DMEM, høje glukose og filtrering løsningen gennem et 0,22 µm filter. Dette trin skal udføres i laminar flow kabinet under sterile forhold. Pre varm rede dispase II i 37 ° C inkubator før brug.
2. at opnå mus øjne
- Aflive musen ved hjælp af en godkendt metode og placere den på en absorberende puden.
- Iført handsker, sætte tommel- og pegefinger omkring øjet og skub forsigtigt huden til proptose øjeæblet.
- Indsæt spidsen af vinklet saks mellem huden og øjeæblet og skær forsigtigt ud af øjet. For at undgå kontaminering, kort dyp øjet i 70% ethanol.
- Umiddelbart Placer øjet i phosphat bufferet saltvand (PBS) i en petriskål.
- Gentag trin 2.2-2.4 at fjerne det andet øje.
3. øje dissektion
- Fjern forsigtigt bindevæv fra øjet under dissekere mikroskop. Dette kan ske enten i PBS eller på den tørre petriskål.
- Bruge suturering pincet til at løfte bindevæv fra øjeæblet og klip dem ud ved hjælp af markriyor saks. Skær ikke sclera, fordi det er praktisk umuligt at opnå intakt posterior øjestykkerne hvis sclera er skåret.
- Efter rengøring af bindevæv, holde de resulterende øjne i PBS for næste vask trin.
Bemærk: Alle følgende trin skal udføres i laminar flow kabinet under sterile forhold.
- Vask øjnene to gange i pre varmede 37 ° C DMEM (høje glukose). Omhyggeligt overføre øjne ind i den pre varmede 37 ° C DMEM (høje glukose) ved hjælp af pincet. Opsug medium og overførsel øjne til frisk medium i en ny parabol.
- Opsug DMEM (høje glukose) medium og inkuberes øjne i pre varmede 2% (wt/vol) dispase II brugsopløsning for 45 min i 37 ° C inkubator.
Bemærk: I alle de følgende trin, sted og manipulere øjne eller øjestykker i vækstmediet, som vil beskytte væv og giver en god medium for dissektion. - Fjerne dispase II løsningen og vaske øjnene to gange i vækstmediet ved sugning den gamle medium og tilføje nye pre varmede 37 ° C vækstmediet (figur 1a).
Bemærk: Efter dissociation af dispase II, øjne blive bløde. - Hold øje med pincet og gøre et snit omkring ora serrata af hvert øje ved hjælp af markriyor saks dissekere mikroskopet placeret i laminar flow kabinet.
- Holder øjeæblet i løsningen, Fjern forsigtigt den forreste hornhinden ved at udvide snit omkring ora serrata omkreds og trækker den forreste hornhinden væk efter snittet er blevet fuldført.
- Fjern linsen kapsel og tilknyttede iris pigmenteret epitel ved forsigtigt at trække dem ud af øjestykket med teethed pincet (figur 1b, 1 c).
- Inkuber de resulterende posterior øjestykker i vækstmediet i 20 min. ved 37 ° C at lette adskillelsen af neurale nethinden fra ÅV.
- Skær de posteriore øjestykker i 4 kronblade dissekere mikroskopet placeret i laminar flow kabinet. Nedskæringerne skal være lang nok til at flade øjestykket, men kort nok til at holde kronblade forbundet (fig. 1 d).
- Flade øjestykket og fjerne de neurale nethinden af meget forsigtigt trække det med pincet mens du holder de resterende ÅV-choroid-sclera kompleks med en anden pincet (figur 1e). Begynde at trække fra kanterne ikke fra centrum.
- Overføre alle hvidternet væv i en ny steril kultur skål fyldt med pre varmede 37 ° C vækstmediet.
4. isolering af primære ÅV celler
- Holding et kronblad af hvidternet ÅV-choroid-sclera complex med fine super pincet, skrælle forsigtigt intakt plader af ÅV fra den underliggende basalmembranen (Bruchs membran) ved hjælp af en microsurgical Halvmåne kniv dissekere mikroskopet placeret i laminar flow kabinet (figur 1f).
- Overføre ÅV plader i den ny steril kultur skål indeholdende vækstmediet ved hjælp af en P200 mikropipette. Når du overfører ÅV ark, våd pipette tips med vækstmediet af pipettering flere gange at forhindre væv klistrer inde i spidsen. ÅV bliver tydeligt adskiller sig fra choroidea: ÅV ser mere brunlig, mens årehinden er mørkere og ser klæbrig og fluffy.
- Alternativt bruge enzymatisk fordøjelse og blid dissociation uden pincet løsrive ÅV fra den plexus14.
- Vaske ÅV ark 2 - 3 gange ved hjælp af pre varmede 37 ° C vækstmediet i sterile kultur parabol. Efter hver vask skridt, omhyggeligt indsamle ÅV ark samtidig undgå andre væv som nethinden snavs eller årehinden. I slutningen af den sidste vask indsamle ÅV ark med en P200 mikropipette og placere dem i en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
Bemærk: Der er ingen grund til at centrifugeres ÅV ark: de vil sediment af tyngdekraften inden for 1 min. - Fjerne ekstra vækstmediet ved hjælp af en P200 mikropipette. Resuspend celler i frisk pre varmede vækstmediet og forsigtigt hakkede dem ved hjælp af en P200 mikropipette. Undgå dannelsen af boblerne. En enkelt celle suspension er ideel, men også undgå for meget ændring, ellers ÅV celler er ikke i stand til at overleve. Vi anbefaler meget forsigtigt ændring for 40 - 50 gange.
5. dyrkning ÅV celler
- Plade celler på en kultur plade.
- Hvis downstream programmer af ÅV celler kræver fastholdelse af deres polaritet, celler plade af ÅV fra 2 mus i en 12 mm polyester membran indsætte præinstalleret i 12-og kultur plader. Plating celler med høj tæthed ønskes fordi i så fald ÅV celler er i stand til at holde de oprindelige egenskaber, såsom sekskantet form og pigmentering.
- Ikke flytte pladen eller ændre vækstmedium for de første 72 h dyrkning. Efter 3 dage, skal du erstatte den gamle medium med friske pre varmede vækstmediet. Efter at ændre næringssubstratet hver anden dag. Når ÅV celler får confluency, reducere FBS i vækstmediet til 2%.
Bemærk: Cellerne kan opdeles ved hjælp af 0,25% trypsin. Men efter opdeling cellerne kan miste deres sekskantet form og pigmentering i de efterfølgende afsnit. Vi anbefaler ikke opdele celler, men hvis det kræves af de downstream anvendelser af kultur, Husk på at primærelementer ikke kan være passaged på ubestemt tid: de er kendt for at differentiere efter 5-7 passager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen primære ÅV kultur etableret fra 2 mus i 12 mm polyester membran Indsæt når 90-95% confluency efter 1 uge i kultur. Efter 2 uger af kultur, cellerne nåede 100% confluency og begyndte at danne en mosaik af sekskantede, pigmenteret og bi-nukleeret celler. 3 uger i kultur, cellerne fortsatte med at danne form og pigmentering, men fik efter 4 uger en del af celler Hyperpigmenteret (figur 2).
Renheden af den primære ÅV cellekultur kan vurderes ved immunfarvning med RPE65 antistof (retinoid isomerohydrolase, en kritisk enzym i hvirveldyr visuel cyklus, der muliggør konvertering af all-trans-retinylestre estere til 11-cis-retinol under phototransduction) (figur 3, red). Integriteten af celle til celle vejkryds og tilstedeværelsen af sekskantet form kan påvises ved hjælp af phalloinin farvning (figur 3, grøn). Derudover kan udtryk af ZO-1 protein, en vigtig komponent af stram vejkryds, valideres ved hjælp af Western blotting (figur 4) eller immunfarvning.
Vores resultater viser, at opnåede musen primære ÅV kulturer er i stand til at formere sig, fastholde pigmentering, sekskantet form og stramme kryds og express funktionelle markører som RPE65.
Figur 1 . Forskellige trin i øjet dissektion at opnå primære ÅV celle kulturer. (en) efter dissociation i 2% dispase, øjet er vasket i vækstmediet. (b) den posteriore øjestykket er opnået ved at fjerne hornhinden og linsen. (c) den resulterende øjestykket er yderligere rengøres ved at fjerne den tilknyttede iris pigmenteret epitel. (d) efter yderligere inkubation i vækstmediet, øjestykket er skåret radialt til at generere kvadranter. (e) Neurale nethinden er pillet ud fra de resterende ÅV-choroid-sclera kompleks. (f) The ÅV ark er forsigtigt adskilt fra Bruchs membran. Bemærk at ÅV ser mere brunlig (pile), mens årehinden er mørkere og meget klistret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Primære ÅV celler fra en 3 - uger gamle mus kulturperler på en 12 mm polyester membran indsætte pre-belæsset i 12-og kultur plader. Musen primære ÅV kultur etableret fra 2 mus i 12 mm polyester membran Indsæt når 90-95% confluency efter 1 uge i kultur (en). Efter 2 uger af kultur, cellerne nåede 100% confluency og begyndte at danne en mosaik af sekskantede, pigmenteret og bi-nukleeret celler (b). Af 3 ugers kultur cellerne fortsatte med at danne form og pigmentering (c), men fik efter 4 uger en del af celler Hyperpigmenteret (d). Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . ÅV celle markør, RPE65, kan påvises i primære mus ÅV celler. Primære mus ÅV celler efter 4 ugers kultur var fast i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og inkuberes med enten RPE65 antistof eller blokerende buffer som den negative kontrol (NC). Phalloidin (grøn) og DAPI (blå) blev også tilføjet for at plette cellemembraner og kerner. Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Markør af stram vejkryds, ZO-1 udtrykkes i de primære ÅV celler. Primære mus ÅV celler (mRPE) blev høstet efter 3 uger af kultur og 8 µg af cellen lysate blev kørt på en vestlige skamplet. Det tilsvarende beløb i ARPE-19 celler (kommercielt tilgængelige stabil ÅV cellelinje) blev brugt som en negativ kontrol. ZO-1 var stærkt udtrykt i de primære ÅV celler samtidig at være fraværende fra ARPE-19 celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremlagt detaljerede protokollen giver mulighed for pålidelige etablering af musen primære ÅV kulturer, der nå confluency efter 1 uge og præsentere de vigtigste ÅV karakteristika såsom sekskantet form og pigmentering efter 2 uger. De opnåede ÅV celler kan bruges til en række downstream applikationer såsom vitamin A stofskifte9, fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter10 og ion transport11, epitelcelle polaritet2, lysosomale homøostase, og autophagy12,13. Afhængigt af programmet downstream morfologi af de afledte kulturer kan blive valideret af transmission og scanning elektronmikroskopi som beskrevet i detaljer andetsteds14. Yderligere assays til at demonstrere modning kulturer kan omfatte transepithelial elektrisk modstand (TEER) assay for at demonstrere polariteten af ÅV celler, permeabilitet undersøgelser vedrørende4,22, funktionelle tests (fagocytose 23) og dome dannelse.
Vores erfaring, at flere celler, der er forgyldt i en brønd, jo bedre confluency og fænotype. I denne protokol seedede vi ÅV celler fra 2 mus på en 12 mm skær. Det er dog også muligt at sætte ÅV celler fra 2 mus i én 6.5 mm insert for at få bedre confluency og TEER. I mange undersøgelser, er plader til ÅV cellekulturer belagt med Matrigel eller laminin. Vi har ikke set en betydelig forskel i ÅV celle tilknytning til disse fartøjer med eller uden belægning. Derudover kan procentdelen af FBS i dyrkningsmediet ændres for at opnå bedre resultater. 10% FBS er normalt gode til at nå confluency, men falder til mindre FBS synes at være gavnlig for ÅV differentiering/modning14,17.
Den største begrænsning af denne metode er behov for præcise uddannelse af den person, der udfører øje dissektioner at sikre maksimal effektivitet af ÅV celle opsving uden kontaminering med celler, der stammer fra andre okulære væv. For at undgå krydskontaminering, forskeren bør beherske den kritiske trin i denne procedure: omhyggelig med peeling off nethinden efterfulgt af præcis adskillelse af ÅV fra choroidea. Renheden af de opnåede kulturer kan valideres ved hjælp af ÅV-specifikke immunfarvning. En række af ÅV markører er tilgængelige for karakterisering af ÅV kulturer, herunder gener involveret i visuel cyklus, barriere og transport funktion, metabolisme, fagocytose og melanogenesis15.
En anden begrænsning er antallet af øjne, der kan behandles samtidigt for at opnå kulturerne. Vi anbefaler i almindelighed ikke arbejder med mere end 2 mus ad gangen. For at sikre levedygtigheden af ÅV celler, bør blive dissekeret øjne så hurtigt som muligt. Når brugeren bliver mere kyndig, er det muligt at håndtere flere mus ved vekslende inkuberingstider.
Samlet set en række metoder har været offentliggjort på etablering af primære musen ÅV kulturer3,14,15, men for første gang, vi præsenterer en video version af den komplette protokol. Denne protokol kan bruges som vejledning i øjet dissektion teknikker. Den optimale balance mellem høj hastighed og præcision kræves til dissektion kan dog opnås kun med praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DS har modtaget forskningsstøtte fra Bayer HealthCare, Tyskland og F. Hoffmann-La Roche, Schweiz. De resterende Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser. Dette arbejde støttes af forskning for at forebygge blindhed (ubegrænset tilskud til Wilmer Eye Institute og University of Pittsburgh). Dette arbejde er også understøttet af start-up midler til DS fra oftalmologi, University of Pittsburgh.
Acknowledgments
Denne undersøgelse var delvist finansieret af The BrightFocus Foundation (til DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
