Summary
網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.
Abstract
網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある高い偏光多機能上皮です。六角にパックされ、タイトな接合で接続されている色素細胞の単一のシートです。RPE の主な機能には、視覚サイクル ライト、小屋視細胞外側セグメントの貪食能、イオンの空間バッファリング、栄養素、イオン水と積極的な関与の輸送の吸収があります。このような重要かつ多様な機能を持つ網膜色素上皮細胞の生物学を研究する重要です。RPE 細胞の数が確立しています。しかし、すぐに自然の網膜色素上皮細胞の形態学的および生理学的な特性のいくつかを失う継代と不死化細胞が知られています。したがって、一次電池は RPE 細胞生物学と機能のさまざまな側面を勉強に適しています。マウス培養網膜色素上皮細胞は研究者に非常に有用なのでマウス モデルは、生物学研究で広く使用されて、しかしマウスから細胞の RPE の収集もその小さなサイズのために非常に挑戦です。ここでは、眼球摘出と目の郭清と培養細胞を生成する RPE シートの分離を含むプライマリ マウス網膜色素上皮細胞の培養を確立するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、効率的な細胞回復をできます。2 つのマウスから得られた網膜色素上皮細胞は文化の真正な RPE の元のプロパティのいくつかは六角形と 2 つの後の色素沈着など細胞の表示 1 週間後培養プレートにあらかじめロード 1 つ 12 mm ポリエステル膜挿入時の密度に達することができます。文化週間。
Introduction
網膜色素上皮 (RPE) は、神経網膜と眼の脈絡膜の間にある偏光上皮細胞の単一の層です。網膜色素上皮細胞の機能と網膜色素上皮の膜の整合性、ビジョンの重要な RPE 外側血液網膜関門、水と網膜の間のイオンの輸送の管理などの複数のプロセスで主要な役割を果たしているので、脈絡膜、光吸収、酸化ストレス、レチノイド代謝の制御と光受容体1,2の外側のセグメントの貪食作用から保護します。硝子体液を血液から渡すから全身投与薬を防ぐバリアー機能と同様に、目の後ろに RPE の場所で、RPE 関数は、生体内の複雑性を研究することが難しくなっています。したがって、柔軟な制御環境3,4の網膜色素上皮細胞を研究する RPE 細胞培養の確立のための大きい必要があります。
取得し、セルを格納する簡単で便利な方法を提供する確立された RPE 細胞の数が存在します。しかし、継代細胞初代培養細胞2,3,4と比較していくつかの欠点があります。まず、彼らはしばしば、細胞形態の変化によって特徴付けられます。たとえば、既存の細胞のどれも細胞極性表現型の損失とタイトな接合4の部分的な消失により網膜色素上皮のバリア性の信頼性の高い研究に適していること発見されました。極性と適切な細胞間の接続の損失に加えて網膜色素上皮細胞はすぐにアダルト RPE5キー メラニン合成酵素の不在のために色素沈着を失います。色素沈着を復元することができます、しかし、透過型電子顕微鏡の組み合わせを含んでいる再色素沈着のメカニズムの包括的な分析、メラニンの存在を確認する遺伝子表現の分析と化学試金は決して実行される6をされて。1 つ以上の制限は RPE 細胞拡張セル寿命 (時に - 不滅)、特定の条件下で基板と植民地7,をフローティング フォームからデタッチ自己更新の多能性幹細胞に変形できます。8します。 この制限は移植実験3のセルの行を使用することは不可能になります。
確立された RPE 細胞の短所を考慮して新鮮な組織から得られる主な RPE 細胞培養は RPE を勉強するより生物学的に関連するモデルとして役立つかもしれない。など基本の細胞生物学の研究にもビタミン A 代謝9、貪食受容外側セグメント10とイオンの輸送11の RPE に固有の機能を学習するだけでなく、プライマリの網膜色素上皮細胞が使用されている上皮細胞極性2 、ライソゾームの恒常性とオートファジー12,13。
RPE の初代培養の確立に関する出版物の数がずっとある年の最後のカップルで研究3,14,15のこの分野での関心の高まりを示します。人間の網膜色素上皮細胞、ウシおよびブタの網膜色素上皮細胞などの非人間の網膜色素上皮細胞の多数のプロトコルが公開された16,17,18,19。しかし、はるかに小さいサイズのためマウス網膜色素上皮細胞を処理するより困難です。なしの網膜色素上皮細胞を分離するために苦労している多くの研究者はまだにもかかわらず、出版物のかなりの数は、マウス14,20,21から網膜色素上皮細胞を分離するためのプロトコルを記述して、脈絡膜細胞または神経網膜の残骸からのセルの汚染。ここでプライマリ マウス網膜色素上皮細胞培養、マウス、目の解剖および培養細胞を生成する RPE シートの分離から目の取得などを確立するためのプロトコルを提案する.このビデオ プロトコル マウス初代 RPE 培養し解離手法に関するガイダンスを必要とし始めている者に特に有用であります。
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Protocol
動物を対象とする手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ピッツバーグ大学によって承認されています。
1. ソリューションを準備します。
- 成長媒体によって補間ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM), 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 mM L-グルタミン 1 x メモリ必須でないアミノ酸と高グルコースを準備します。あらかじめ使用前に 37 ° C の定温器でメディアを温めます。
- 2% (重量/巻) 当期 II 作業ソリューションを準備します。
- 当期 II 300 μ L HEPES 緩衝生理食塩水 (50 mM HEPES/島 pH 7.4 では、150 mM の NaCl) での 30 mg を溶解して 100 mg/mL dispase II の原液を準備します。このボリュームは、3-4 マウス、スケール アップまたはダウン、実験用マウスの数に基づいてできる)。この株式は、4 ° C で少なくとも 1 週間に保存できます。
- 1.2 mL 滅菌 DMEM、高グルコース、0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルタ リングに当期 II 在庫 100 mg/mL の 300 μ L を追加することによって 2% 当期の作業ソリューションを準備します。層流無菌条件の下でキャビネットでこの手順を実行する必要があります。事前準備当期 II で使用する前に 37 ° C の定温器を温めます。
2. マウスの目の取得についてください。
- すべての承認されたメソッドを使用してマウスを安楽死させるし、吸収パッドの上に置きます。
- 手袋、親指と人差し指、目の周りを入れて、proptose 眼球に皮膚を優しくプッシュします。
- 皮膚と眼球の間の角度のはさみの先端を挿入し、目を慎重にカットします。汚染を避けるためには、70% エタノールで目を簡単にディップします。
- すぐに目のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ペトリ皿でを配置します。
- 2.2 2.4 2 番目の目を削除する手順を繰り返します。
3. 目の解剖
- 結合組織を解剖顕微鏡の下で目から慎重に取り外します。これは、PBS または乾いたシャーレのいずれか行うことができます。
- 縫合鉗子を使用して、眼球から結合組織を持ち上げて Vannas はさみを使用してそれらをカットします。強膜を切る場合にそのまま後方のアイカップを得ることは事実上不可能だから強膜をカットしないでください。
- 結合組織を洗浄した後で、次の PBS で生じる眼球がステップに洗い続けます。
注: すべての次の手順は、層流無菌条件の下でキャビネットに行わなければなりません。
- 予め温めておいた 37 ° C DMEM (高血糖) で 2 回目を洗浄します。慎重に鉗子を使用して予め温めておいた 37 ° C (高血糖) DMEM に眼球を転送します。新しい料理で新鮮な媒体に媒体と転送の眼球を吸引します。
- DMEM (高血糖) 培地を吸引し、37 ° C の定温器で 45 分間に予め温めておいた 2% (重量/巻) 当期 II 使用液で目を孵化させなさい。
注: すべての次の手順で配置、目や成長中の組織を保護し、解剖の良い媒体を提供するアイカップを操作します。 - 当期 II ソリューションを削除し、古い培地を吸引し、新しい 37 ° C に予め温めておいた成長培地 (図 1 a) を追加して培地に 2 回目を洗ってください。
注: dispase II による解離後、眼球にソフト。 - 鉗子で目を押し又はコナラの周り層流にキャビネットを配置解剖顕微鏡の下で Vannas はさみを使用してそれぞれの目の切開を行います。
- 慎重にソリューションに眼球を維持、拡張又はコナラのまわりをカットとカットが完了したら、前方の角膜を引き離し前方の角膜を取り外します。
- 優しく teethed 鉗子 (図 1 b、 1 c)、アイカップからそれらを引き出して、水晶体カプセルと関連付けられた虹彩色素上皮を削除します。
- RPE から神経網膜の分離を容易にする 37 ° C で 20 分間培地に結果として得られる後部アイカップを孵化させなさい。
- 層流にキャビネットを配置解剖顕微鏡の下で 4 花びらに後部のアイカップをカットします。カットは花びらの接続 (図 1 d) を保つために十分に短いが、アイカップを平らにするのに十分な長さであるべきです。
- アイカップを平らにし、残りを保持しながら鉗子で引いて非常に穏やか、神経網膜を削除 (図 1e) 別の鉗子で強膜網膜色素上皮-脈絡膜複合体。引き中心ではなくエッジから開始します。
- すべての四つの組織を 37 ° C に予め温めておいた培地でいっぱい新しい培養皿に転送します。
4 主な網膜色素上皮細胞の分離
- 四つの強膜網膜色素上皮-脈絡膜の複合体の 1 つの花びらを保持鉗子を超微粉、解剖顕微鏡顕微鏡クレッセント ナイフを使用して、基になる基底膜 (脈絡膜) からそのまま網膜色素上皮シートをそっとはがします(図 1 階)、層流をキャビネットに配置されます。
- P200 ピペットを使用して、成長培地を含む新しい培養皿に網膜色素上皮シートを転送します。RPE シートを転送する際は、数回ピペッティングによる培地でピペット チップを濡れている組織が先端部に付着するを防ぐために。RPE は脈絡膜から明確に区別される: RPE 見えるより茶色、脈絡膜が暗いと付箋とフワフワになります。
- また、14脈絡膜から網膜色素上皮をデタッチするのに酵素消化と鉗子のない穏やかな解離を使用します。
- 2-3 回使用して 37 ° C に予め温めておいた RPE シートを洗って滅菌培養皿の成長培地。各洗浄工程後注意深く破片網膜や脈絡膜などの他の組織を避けながら RPE シートを収集します。最後の洗浄の最後に P200 ピペットと RPE シートを収集し、新しい 1.5 mL 遠心チューブにそれらを置きます。
注: RPE シートを遠心分離する必要はありません: 1 min 以内で重力によって堆積してしまいます。 - P200 ピペットを使用して余分な成長媒体を削除します。予め温めておいた新鮮な培地に細胞を再懸濁し、軽く P200 ピペットを使用してそれらのカップを刻んだ。気泡の形成を避けるため。単一細胞懸濁液が最適です、また、あまりにも多くの製粉を避ける、それ以外の場合網膜色素上皮細胞が生き残ることができません。非常に優しく製粉 40 - 50 回をお勧めします。
5. 網膜色素上皮細胞の培養
- 細胞培養プレート上にプレートします。
- 網膜色素上皮細胞のダウン ストリーム アプリケーションでは、極性の保持を必要とする場合 12 ウェル培養皿にあらかじめ読み込まれている 1 つの 12 mm ポリエステル膜挿入 2 マウスからプレート、RPE の細胞します。その場合に網膜色素上皮細胞は六角形や色素沈着など、元のプロパティを維持することができるため、高密度に細胞をめっきが望まれます。
- プレートを移動しない、または最初の 72 時間培養の成長媒体を変更します。3 日後、古い媒体を予め温めておいた、新鮮な成長媒体に置き換えます。その後一日おきに培養培地を変更します。網膜色素上皮細胞が合流に得れば、培地に FBS を 2% に削減します。
注: セルは、0.25% トリプシンを使用して分割することができます。ただし、分割後は、セルは、六角形の形状とその後通路で色素沈着に失う可能性があります。我々 は、セルの分割はお勧めしませんが、文化の下流のアプリケーションで必要とされる場合一次電池できません無期限に継代すること注意してください: 5-7 通路後解除区別するために知られています。
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Representative Results
マウス プライマリ RPE 文化文化で 1 週間後 12 mm ポリエステル膜挿入に達する 90-95% の confluency に 2 マウスから設立されました。文化の 2 週間後のセルは 100% の confluency に達して、六角形、色素、および bi 核細胞のモザイクを形成し始めた。培養、細胞形状と色素沈着、形成を続けて 3 週間でしかし、4 週間後に細胞の部分得た沈着 (図 2)。
主な網膜色素上皮細胞培養の純度 (レチノイド isomerohydrolase、すべてトランス レチノール エステルの中に 11-シス-レチノールへの変換を可能にする脊椎動物の視覚サイクルで重要な酵素の RPE65 抗体を用いた免疫染色によって評価されます。光伝導) (図 3赤)。細胞間結合の整合性と六角形の存在は、phalloinin 染色 (図 3緑) を使用して示すことが。また、ZO 1 蛋白質、タイトな接合の重要なコンポーネントの表現は西部しみが付く (図 4) または免疫染色を使用して検証できます。
得られたマウス初代 RPE 培養増殖、色素沈着、六角形とタイトな接合を保持、RPE65 など機能的なマーカーを表現することができる結果を示します。
図 1.主な RPE を取得する目解剖の手順が異なる細胞培養。(、) 培地に 2% 当期の解離後、眼を洗った。(b)後部のアイカップは、角膜と水晶体を除去することによって取得されます。(c)結果のアイカップは関連付けられているアイリスを外してきれいにさらに色素上皮です。(d)培地に培養後アイカップはカット放射状の領域を生成します。(e)残りの強膜網膜色素上皮-脈絡膜複合体から神経網膜を剥離します。(f) 、網膜色素上皮シートは優しく、ブルッフ膜から区切られます。注 RPE より茶色 (矢印)、脈絡膜中に見えることは暗いと非常に粘着性があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.12 mm ポリエステル膜挿入時の培養 3 週間の古いマウスからプライマリの網膜色素上皮細胞は、12 ウェル培養皿にあらかじめロードします。マウス プライマリ RPE 文化文化 () の 1 週間後、2 マウスから 12 mm ポリエステル膜挿入に達する 90-95% の confluency に設立されました。文化の 2 週間後のセルは 100% の confluency に達して、六角形、色素、双核細胞 (b) のモザイクを形成し始めた。図形と色素沈着 (c) を形成する細胞を続けた文化の 3 週間は、しかし、4 週間後に細胞の部分得た沈着 (d)。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.網膜色素上皮細胞のマーカー、RPE65 は、プライマリ マウス網膜色素上皮細胞検出します。プライマリ マウス網膜色素上皮細胞培養 4 週間後 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で固定、負の制御 (NC) として RPE65 抗体またはブロック バッファーで孵化します。ファロイジン (緑) と (青) の DAPI は細胞膜と核の染色にも加えられました。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.マーカー タイトな接合の ZO 1 はプライマリの網膜色素上皮細胞で表されます。プライマリ マウス網膜色素上皮細胞 (mRPE) 培養 3 週間後収穫し、細胞ライセートの 8 μ g が西部のしみを実行しました。ARPE 19 セル (市販安定した網膜色素上皮細胞株) の相当額は、ネガティブ コントロールとして使用されました。ZO 1 ARPE 19 セルから欠席しながら主の網膜色素上皮細胞で高発現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
提示された詳細なプロトコルは、マウス初代 RPE 培養 1 週間後の confluency に到達、六角形、2 週間後に色素沈着など主な RPE 特性の信頼性確立をできます。得られた網膜色素上皮細胞は、ビタミン A 代謝9、視細胞外側セグメント10の貪食能およびイオン輸送11、上皮細胞極性2、ライソゾームなどの下流のアプリケーションの数の使用ことができます。恒常性とオートファジー12,13。下流のアプリケーションに応じて伝送による派生文化の形態を検証できる、走査電子顕微鏡観察に従って細部他14。文化の成熟上皮電気抵抗 (TEER) を含める可能性がありますを示すため追加のアッセイ法を網膜色素上皮細胞の極性を示す、4,22、機能テスト (食作用の試金の透磁率23) とドームの形成。
我々 の経験では、よくよりの confluency 表現型でメッキがより多くの細胞。このプロトコルでは 1 つの 12 mm 挿入 2 マウスから網膜色素上皮細胞の種をまいた。ただし、2 マウスから網膜色素上皮細胞を入れて良い confluency と TEER を取得する 1 つの 6.5 mm 挿入不可能ですも。多くの研究で網膜色素上皮細胞培養用プレートは、マトリゲルやラミニンとコーティングされています。我々 は RPE 細胞付着これらの船はコーティングの有無に有意差を見なかった。さらより良い結果を達成するために、培地の FBS の割合を変更可能性があります。10 %fbs の confluency に到達するため通常良いですが、網膜色素上皮分化・成熟14,17にとって有益であると思われる以下の FBS にドロップします。
このメソッドの主な制限は、他の眼組織由来細胞で交差汚染なし RPE 細胞回復の最大効率を保証するための目の解剖を行う者の正確なトレーニングの必要性です。クロス汚染を避けるためには、研究者はこの手順の重要なステップをマスターする必要があります: 続く網膜剥離、網膜色素上皮の高精度分離脈絡膜から注意してください。得られた文化の純度は、RPE 固有の免疫染色を使用して検証できます。視覚サイクル、バリアとトランスポート機能、代謝、食、メラニン形成15に関与する遺伝子を含む RPE 文化の評価には RPE マーカーの数があります。
別の制限は、文化を取得する同時に処理することができます目の数です。一般に、勧めしません以上 2 マウスでの作業時に。網膜色素上皮細胞の生存を確保するため、できるだけ早く目を解剖する必要があります。ユーザーは、もっと上手になる後、は、インキュベーション時間を交互によりマウスを処理することが可能です。
全体的に、いくつかのメソッドが公開されているプライマリ マウス RPE 文化3,14,15確立、ただし、最初に提案する完全なプロトコルのビデオ版。このプロトコルは、目の解剖技術に関するガイダンスとして使用できます。しかし、練習だけで高速と解剖に必要な精度の最適なバランスを実現できます。
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Disclosures
DS は、バイエル ヘルスケア社、ドイツ、f ・ ホフマン ・ ラ ・ ロシュ、スイス連邦共和国からの資金の研究を受けています。残りの著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。この作品は、失明の防止 (ピッツバーグ大学ウィルマー眼研究所に制限されていない補助金) に研究によってサポートされます。 この仕事は、眼科、ピッツバーグ大学から DS にスタートアップ資金に支えられています。
Acknowledgments
本研究は、部分的 (DS) に BrightFocus 財団によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
References
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