Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56997

Summary

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС)-это многофункциональный эпителия глаза. Здесь мы представляем протокол для создания начальных клеточных культур, полученных из мышиных ПЭС.

Abstract

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) является крайне поляризованную многофункциональный эпителия, который расположен между нейронной сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Это один лист пигментных клеток, которые гексагонально упакованы и связаны плотные соединения. Основные функции НПП включают поглощение света, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных сарай, пространственной буферизации ионов, транспорт питательных веществ, ионов и воды, а также активное участие в круговороте визуального. С такие важные и разнообразные функции критически важно для изучения биологии клетки ПЭС. Был создан ряд НПП клеточных линий; Однако пассированный и увековечен клетки известны быстро потерять некоторые Морфологические и физиологические характеристики естественных клеток ПЭС. Таким образом Главные ячейки являются более подходящими для изучения различных аспектов НПП клеточной биологии и функции. Мышь первичной культуре клеток ПЭС является очень полезным для исследователей, поскольку мышь модели широко используются в биологических исследованиях, однако сбор НПП клетки мыши также является очень сложным из-за их малого размера. Здесь мы представляем протокол для создания основного мыши НПП клеточных культур, который включает Энуклеация и рассечение глаз и изоляции листов ПЭС произвести клетки для культивирования. Этот метод позволяет восстановления эффективного клеток. НПП клетки, полученные из двух мышей может достигать confluency на один 12 мм полиэстер мембраны вставьте предварительно загружаются в культуре пластины после одной недели культуры и отображения, некоторые из первоначальных свойств bona fide НПП клетки как гексагональной формы и пигментации после двух недели культуры.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) является один слой поляризованные эпителиальных клеток, расположенный между нейронной сетчатки и сосудистой оболочки глаза. Функциональность НПП клеток и целостность НПП монослоя имеют решающее значение для видения, потому что НПП играет важную роль в нескольких процессах, таких как поддержание внешний барьер кровь сетчатки, транспорта воды и ионов между сетчатки и Хориоидея, легкий поглощения, защита от окислительного стресса, контроля метаболизма ретиноидов и фагоцитоз внешних сегментов фоторецепторных клеток в1,2. Расположение НПП задней части глаза, а также ее барьерные функции предотвращения наркотиков систематически осуществляется от перехода из крови в стекловидное тело, сделать это трудно изучить сложности НПП функции в естественных условиях. Таким образом существует большая необходимость создания НПП клеточных культур для изучения НПП клетки в гибкой, управляемой среды3,4.

Существует целый ряд установленных НПП клеточных линий, обеспечивая простой и удобный способ получения и хранения клеток; Однако пассированный клетки имеют некоторые недостатки по сравнению с первичной клетки2,3,4. Во-первых они часто характеризуются изменения в морфологии клеток. Например ни один из существующих линий клетки были найдены пригодны для надежного исследование НПП барьерные свойства из-за потери фенотипа клетки полярности и частичного исчезновения плотных4. Помимо потери полярности и надлежащего соединения к ячейке НПП клеточных линий быстро теряют их пигментации из-за отсутствия ключа меланогенеза ферментов в взрослых НПП5. Пигментация может быть восстановлена, но всеобъемлющий анализ механизма повторной пигментации, который будет включать сочетание просвечивающей электронной микроскопии, выражение гена анализ и химических анализов для подтверждения наличия меланина никогда были выполненных6. Еще одно ограничение, что НПП клеточных линий у жизни расширенной клетки (иногда - бессмертие) и при определенных условиях можно превратить в самостоятельного обновления Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые отсоединить от субстрата и форму плавающей колонии7, 8. это ограничение делает невозможным использовать линии клеток для трансплантации экспериментов3.

Учитывая недостатки созданной НПП клеточных линий первичных культур клеток ПЭС, полученные из свежих тканей может служить более биологически соответствующую модель для изучения ПЭС. Основная НПП клетки были использованы не только для изучения ПЭС специальные функции, такие, как витамин А метаболизм9, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных10 и ионного транспорта11, но и для изучения основных клеточной биологии как эпителия Сотовый полярности2 , лизосомальных гомеостаза и autophagy12,13.

В последние несколько лет произошел ряд публикаций о создании первичного НПП культур указывая растущий интерес к этой области исследования3,14,15. Многочисленные протоколы для человека НПП клетки и клетки не человеческого ПЭС как говядину и свинину НПП клетки были опубликованы16,,1718,19. Однако это более трудным для обработки клеток мыши НПП из-за их гораздо меньшего размера. Даже несмотря на то, что целый ряд публикаций описал протоколы изолировать НПП клетки мыши14,20,21, есть еще многие исследователи пытаются изолировать НПП клетки без загрязнение сосудистое клетки или клетки от мусора нейронных сетчатки. Здесь мы представляем протокол для создания основного мыши НПП клеточной культуры, включая получение глаза от мыши, рассечение глаз и изоляции листов ПЭС произвести клетки для культивирования. Этот видео-протокол будет особенно полезно для исследователей, которые начинают работать с мышь первичной НПП культур и нуждаются в руководстве по методам рассечение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры с участием животных темы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете Питтсбурга

1. подготовить решения

  1. Подготовка среднего роста, дополняя Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), высокие глюкоза с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин/стрептомицина 1%, 2,5 мм L-глютамина и 1 x MEM заменимых аминокислот. Предварительно теплой СМИ в инкубаторе 37 ° C перед использованием.
  2. Приготовьте рабочий раствор 2% (wt/vol) dispase II:
    1. Подготовьте Стоковый раствор 100мг/мл dispase II, растворяя 30 мг dispase II в 300 мкл HEPES-амортизированное saline (50 мм HEPES/Кох рН 7,4, 150 мм NaCl). Этот объем для 3-4 мышей, он может быть масштабируется или вниз на основе числа мышей для эксперимента). Этот запас может храниться в течение по крайней мере за 1 неделю при 4 ° C.
    2. Подготовьте рабочий раствор 2% dispase, добавляя 300 мкл, 100 мг/мл dispase II акции 1,2 мл стерильной среде DMEM, высокой глюкозы и фильтрации решение через фильтр 0,22 мкм. Этот шаг должен выполняться в Ламинарный шкаф в стерильных условиях. Предварительно теплой подготовленный dispase II в инкубаторе 37 ° C перед использованием.

2. получение мыши глаза

  1. Усыпить мыши, используя любой утвержденной метод и поместите его на Впитывающим вкладышем.
  2. Ношение перчаток, поставьте большой палец и указательный палец вокруг глаз и аккуратно вставьте кожу proptose глазного яблока.
  3. Вставьте наконечник угловой ножницы между кожей и глазного яблока и аккуратно вырезать глаза. Чтобы избежать заражения, кратко окуните глаз в 70% этиловом спирте.
  4. Сразу же место глаз в фосфат амортизированное Saline (PBS) в чашку Петри.
  5. Повторите шаги 2.2-2.4 удалить второй глаз.

3. глаз рассечение

  1. Осторожно удалите соединительной ткани от глаз под микроскопом рассечения. Это можно сделать в PBS или на сухой Петри.
    1. Использование сшивания щипцы поднять соединительной ткани из глазного яблока и вырезают ножницами беззаботными. Не режьте склеры, потому что это практически невозможно получить нетронутыми задняя выкручиваются, если сократить склеры.
    2. После очистки соединительной ткани, сохраните полученный глаз в PBS для следующего шага стиральная.
      Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в Ламинарный шкаф в стерильных условиях.
  2. Промойте глаза дважды в подогретым 37 ° C DMEM (высокая глюкозы). Тщательно передачи глазного яблока в подогретым 37 ° C DMEM (высокая глюкозы) с помощью щипцов. Аспирационная среднего и передачи глазные яблоки свежие средний в новое блюдо.
  3. Аспирационная DMEM (высокая глюкозы) среднего и инкубировать глаза в рабочем растворе подогретым 2% (wt/vol) dispase II для 45 мин в инкубаторе 37 ° C.
    Примечание: Все следующие шаги, место и манипулировать глаза или окуляры в среднего роста, которые будут защищать ткани и обеспечить хорошую среду для рассечения.
  4. Удаление решения II dispase и мыть глаза дважды в среднего роста, аспирационных старый среднего и добавив новый среднего роста подогретым 37 ° C (рис. 1a).
    Примечание: После диссоциации, dispase II, глазные яблоки не станут мягкими.
  5. Держите глаза с щипцами и надрезают вокруг Ора Серрата каждого глаза с помощью ножниц беззаботными под микроскопом рассечения, помещены в Ламинарный шкаф.
    1. Сохраняя глазного яблока в растворе, осторожно удалите передней роговицы, расширяя разрез вокруг окружности Серрата Ора и отбирала передней роговицы после полного разреза.
    2. Удаление капсулы хрусталика и связанные Ирис пигментированные эпителия, осторожно потянув их из наглазник пинцетом teethed (рис. 1b, 1 c).
  6. Инкубируйте результате задняя окуляры в среднего роста для 20 минут при 37 ° C для облегчения разделения нейронных сетчатки из ПЭС.
  7. Нарежьте 4 лепестки под микроскопом рассечения, помещены в Ламинарный шкаф задняя окуляры. Сокращение должно быть достаточно долго сгладить наглазник, но достаточно коротким, чтобы лепестки подключен (рис. 1 d).
    1. Сгладить наглазник и удалить нейронных сетчатки, очень осторожно потянув их пинцетом удерживая остальные ПЭС Хориоидея склера комплекс с другой щипцами (Рисунок 1e). Начните потянув от края, а не из центра.
  8. Передача всех расквартированы тканей в новых стерильных культуры блюдо заполнены с подогретым 37 ° C рост среднего.

4. изоляция первичных клеток НПП

  1. Проведение один лепесток расквартированы ПЭС Хориоидея склера комплекса с супер штраф щипцы, Аккуратно отделите нетронутыми листы НПП от базового базальной мембраны (мембрана Бруха) с использованием микрохирургической серповидный нож под микроскопом рассечения помещены в Шкаф ламинарный поток (Рисунок 1f).
    1. Перенесите НПП листы в новых стерильных культуры блюдо, содержащие среднего роста с помощью микропипеткой Р200. При передаче НПП листы, мокрой наконечники с среднего роста, закупорить несколько раз для предотвращения прилипания внутрь кончик ткани. НПП будет четко отличимы от сосудистое: НПП выглядит более буроватые, в то время как Хориоидея темнее и выглядит липкий и пушистый.
    2. Кроме того используйте ферментативный пищеварения и нежный диссоциации не щипцов для отсоединения НПП сосудистое14.
  2. Вымойте НПП листов, 2 - 3 раза с помощью подогретым 37 ° C среднего роста в стерильных культуры блюдо. После каждой стирки шаг тщательно Соберите НПП листы, избегая других тканей сетчатки мусора или сосудистое. В конце последнего мыть собирать НПП листы с микропипеткой Р200 и поместите их в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    Примечание: Существует не нужно центрифуга НПП листы: они будут осадок самотеком в течение 1 мин.
  3. Удалите дополнительный рост среднего, с помощью микропипеткой P200. Ресуспензируйте клетки в свежих подогретым роста среднего и аккуратно нарезанных их с помощью микропипеткой P200. Избегайте образования пузырьков. Подвеска одной ячейки является идеальным, но также избегать слишком много Тритурация, иначе НПП клетки не способны выжить. Мы рекомендуем очень осторожно Тритурация для 40 - 50 раз.

5. Культивирование клеток НПП

  1. Пластина клетки на табличке культуры.
    1. Если нисходящие приложения НПП клетки требуют, сохраняя их полярности, плита НПП клетки от 2 мышей в одном 12 мм полиэстер мембраны Вставка предварительно загружаются в 12-ну культуры пластин. Покрытие клетки на высокой плотности желательно, потому что в этом случае НПП клетки способны сохранить исходные свойства, например гексагональной формы и пигментации.
  2. Не двигаться пластину или изменить среднего роста для первых 72 ч культивирования. После 3 дней Замените старый средних свежих подогретым роста среднего. После этого изменения культуры среднего каждый день. Как только НПП клетки confluency, уменьшите FBS в средство роста до 2%.
    Примечание: Клетки можно разделить с помощью трипсин 0.25%. Однако после разделения клетки могут потерять их шестиугольной формы и пигментации в последующих проходах. Мы не рекомендуем, разделение клетки, но если это требуется по течению приложений культуры, имейте в виду, что главные ячейки не может бесконечно пассированной: они известны де дифференцировать после 5-7 ходов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мышь первичной НПП культура создана от 2 мышей в 12 мм полиэстер мембраны Вставка достигает 90-95% confluency после 1 недели в культуре. После 2 недель культуры клетки достигли 100% confluency и начал формироваться мозаику гексагональной, пигментированный и Би тому клеток. 3 недели культуры, клетки, по-прежнему образуют форму и пигментации, однако, после 4 недель часть клеток получил гиперпигментированных (рис. 2).

Чистоту первичной культуре клеток ПЭС можно оценить по иммуноокрашивания с помощью RPE65 антител (isomerohydrolase ретиноидов, критических фермента в позвоночных визуальные цикла, который позволяет преобразование всех транс Ретинил эфиры 11-СНГ ретинол во время phototransduction) (рис. 3, красный). Целостность соединения к ячейке и присутствие гексагональной формы можно продемонстрировать с помощью phalloinin окрашивание (рис. 3, зеленый). Кроме того выражение ZO-1 белок, важным компонентом плотные соединения, может быть проверена с помощью западных blotting (Рисунок 4) или иммуноокрашивания.

Наши результаты показывают, что полученные мышь первичной НПП культур способны размножаться, сохранять пигментации, гексагональной формы и плотных и Экспресс функциональная маркеров, например RPE65.

Figure 1
Рисунок 1 . Различные этапы глаз диссекции для получения первичной НПП клеточные культуры. () после диссоциации в 2% dispase, глаза промывают в среднего роста. (b) задняя наглазник получается путем удаления роговица и хрусталик. (c) , которые далее результирующее наглазник очищается путем удаления связанных Ирис пигментированные эпителия. (d) после дальнейшей инкубации в среднего роста, наглазник режется радиально сформировать квадрантах. (e) Нейронные сетчатки снимают от оставшихся ПЭС Хориоидея склера комплекса. (f) НПП листы мягко отделены от мембраны Бруха. Обратите внимание что НПП выглядит более буроватые (стрелки), пока Хориоидея темнее и очень липким. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Первичный НПП клетки от 3 - неделя старый мыши, культивируемых на 12 мм полиэстер мембраны вставьте предварительно загружаются в 12-ну культуры пластин. Мышь первичной НПП культура создана от 2 мышей в 12 мм полиэстер мембраны Вставка достигает 90-95% confluency после 1 недели в культуре (). После 2 недель культуры клетки достигли 100% confluency и начал формироваться мозаику гексагональной, пигментных и Би тому клетки (b). 3 недели культуры клетки по-прежнему образуют форму и пигментации (c) Однако, после 4 недель часть клеток получил гиперпигментированных (d). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . НПП ячейке маркер, RPE65, обнаруживаемая в клетках первичной мыши ПЭС. НПП клетки мыши после 4 недель культуры были зафиксированы в параформальдегида 4% (PFA) и инкубировали с RPE65 антитела или блокирующий буфер как отрицательный контроль (НК). Фаллоидин (зеленый) и DAPI (синий) были также добавлены пятно клеточных мембран и ядер. Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Маркер туго развязок, ZO-1 выражается в первичных клеток ПЭС. Клетки первичной мыши ПЭС (mRPE) были собраны после 3 недель культуры и 8 мкг lysate клетки был запущен на западную помарку. Эквивалентное количество клеток ARPE-19 (коммерчески доступных стабильных НПП клеточная линия) были использованы в качестве отрицательного контроля. ZO-1 высоко была выражена в первичных клеток НПП будучи отсутствует из клеток ARPE-19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представлен подробный протокол обеспечивает надежное создание мышь первичной НПП культур, которые достигают confluency после 1 недели и представить основные характеристики НПП гексагональной формы и пигментации после 2 недель. Полученные клетки ПЭС может использоваться для ряда течению приложений, таких как витамин А метаболизм9, фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных10 и ионного транспорта11, эпителиальных клеток полярности2, лизосомальных гомеостаз и autophagy12,13. В зависимости от вниз по течению морфология производного культур могут быть проверены путем передачи и растровая электронная микроскопия как описано в разделе подробно других14. Дополнительные анализы продемонстрировать что созревания культур может включать transepithelial электрическое сопротивление (ТЕЕР) пробирного продемонстрировать полярности НПП клеток, проницаемость assays4,22, функциональные тесты (фагоцитоз 23) и купол формирования.

По нашему опыту, чем больше клеток, которые покрыты в колодец, тем лучше confluency и фенотип. В этом протоколе мы посеян НПП клетки от 2 мышей на одном 12 мм пластин. Однако это также возможно положить НПП клетки от 2 мышей в один 6,5 мм вставка, чтобы получить лучше confluency и ТЕЕР. Во многих исследованиях пластин для культур клеток НПП покрыты Matrigel или Ламинин. Мы не видели существенную разницу в НПП клеток привязанность к этим судам, с или без покрытия. Кроме того доля FBS в среде культуры могут быть изменены для достижения лучших результатов. 10% FBS обычно хорошо для достижения confluency, но снижается до менее FBS, как представляется, быть полезным для ПЭС дифференциации/созревания14,17.

Главное ограничение этого метода является необходимость точной подготовки лица, выполняющего Анатомирование глаза для обеспечения максимальной эффективности восстановления клеток НПП без перекрестного загрязнения с клетки, полученные от других глазных тканей. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, исследователь должен овладеть критический шаг этой процедуры: тщательно отшелушивающим сетчатки следуют точные разделение НПП из сосудистое. Чистоту полученные культур могут быть проверены с помощью ПЭС конкретных иммуноокрашивания. Количество маркеров НПП доступны для характеризации НПП культур, в том числе генов участвуют в визуальные цикла, барьер и функции транспорта, метаболизм, фагоцитоз и меланогенеза15.

Еще одним ограничением является количество глаз, которые могут одновременно обрабатываться для получения культур. В целом мы не рекомендуем работать с более чем 2 мыши одновременно. Для обеспечения жизнеспособности клеток ПЭС, глаза следует расчлененный как можно быстрее. После того, как пользователь становится более опытным, он позволяет обрабатывать более мышей, чередуя инкубации раз.

В целом, были опубликованы несколько методов на создание основного мыши НПП культур3,14,15, однако, в первый раз, мы представляем видео версия полный протокол. Этот протокол может использоваться в качестве руководства по методам рассечение глаз. Однако оптимальный баланс между высокой скоростью и точностью, которая требуется для вскрытия может быть достигнуто только с практикой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DS получила финансирование от Bayer HealthCare и F. Hoffmann-La Roche, Германии и Швейцарии исследований. Остальные авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов. Эта работа поддерживается исследования, чтобы предотвратить слепоту (неограниченный гранты Вильмер глаз институт и Университет Питтсбурга).  Эта работа также поддерживается запуск средств DS от офтальмологии, Университет Питтсбурга.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось частично BrightFocus фонд (DS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
2~3-week old wildtype mice
Name Company Catalog Number Comments
reagents
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose GIBCO 11965092
Dispase II Sigma D4693
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F4135
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) GIBCO 15140122
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) GIBCO 11140050
Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 GIBCO 10010023
HEPES Cellgro 61-034
KOH Sigma-Aldrich 1310-58-3
NaCl Ambion AM9759
L-Glutamine (200 mM) GIBCO 25030-081
Ethyl Alcohol Fisher Scientific 111000200
RPE65 antibody A gift from Dr. Michael Redmond
Fluorescein Phalloidin                                                            Invitrogen F432
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568                     Invitrogen A11011            
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Invitrogen D1306
Paraformaldehyde (PFA) Polysciences, Inc 00380
ZO-1 Polyclonal Antibody ThermoFisher Scientific 40-2200
Name Company Catalog Number Comments
instruments and equipments
Laminar flow cabinet Baker SterilGARD SG403A
Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) Nikon SMZ1500
CO2 incubator with hot air sterilization Binder C150
Centrifuge Eppendorf 5702
Petri dishes Fisher Scientific 0875712
12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile Corning Incorporated COR-3460
Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp STEPHENS instruments S7-1320
Castroviejo suturing forceps 0.12mm Stroz Ophthalmic Instruments E1796
Crescent straight knife Beaver-Visitec International 373808
Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar World Precision Instruments 500233
Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard World Precision Instruments 500260
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGL0250S
Syringe, 5 mL BD 309632
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED  Leica 
Pipette Gilson
Barrier and non-filtered pipette tips Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
  2. Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
  3. Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
  4. Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
  5. Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
  6. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
  7. Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
  8. Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
  9. Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
  10. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  11. Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
  12. Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
  13. Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
  14. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
  15. Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
  16. Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
  17. Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
  18. Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
  19. Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
  21. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
  22. Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
  23. Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).

Tags

Биология выпуск 133 пигментный эпителий сетчатки культуры главной ячейки глазной клеточных линий глаз рассечение изоляции тканей глаза офтальмологии мышь
Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose,More

Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, Jr., J. S., Sinha, D. Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (133), e56997, doi:10.3791/56997 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter