Summary
双光子激光的细胞膜损伤是一种广泛应用的评价膜加盖能力的方法, 可应用于多种细胞类型。在这里, 我们描述了一个协议的体外活成像膜加盖在 dysferlinopathy 患者细胞后双光子激光消融。
Abstract
许多病理生理学的侮辱会对细胞膜造成损害, 当与细胞膜修复或完整性的先天缺陷相结合时, 会导致疾病。因此, 了解细胞膜修复的基本分子机制是一个重要的目标, 以发展新的治疗策略的疾病与功能失调细胞膜动力学。许多体外和体内研究旨在了解各种疾病背景下的细胞膜加盖, 利用双光子激光消融作为测定实验治疗后的功能性结局的标准。在这种方法中, 细胞膜受到双光子激光的伤害, 导致细胞膜破裂和荧光染料渗入细胞。细胞内的荧光强度可以被监测, 以量化细胞重新本身的能力。有几种可供选择的方法来评估细胞膜对损伤的反应, 以及双光子激光伤的方法本身的巨大变化, 因此, 一个单一的, 统一的细胞伤害模型将有利于减少这些方法之间的差异。在这篇文章中, 我们概述了一个简单的双光子激光伤人协议, 评估细胞膜修复在体外的健康和 dysferlinopathy 患者成纤维细胞转染或没有一个全长 dysferlin 质粒。
Introduction
真核细胞的细胞膜由一双层蛋白质镶嵌的磷脂组成, 它定义了细胞的内/外环境, 对于维持细胞的稳态和细胞的存活至关重要。由机械或化学侮辱引起的细胞膜损伤是常见的各种哺乳动物的细胞类型, 包括骨骼和心肌, 胃, 和肺细胞1,2,3,4。除了由于日常生理机能的损伤外, 细胞膜还可能受到环境侮辱、细菌毒素和缺血再灌注的损害5。在细胞膜上重新破裂导致不受管制的细胞外钙离子的流入, 以及其他可能有毒的胞外成分--进入细胞, 触发下游信号叶栅, 从而迅速导致细胞死亡1,4,5,6。
到目前为止, 已有几种模型的膜修复细胞。根据膜破裂的大小和性质, 可以激活不同的修复机制。例如, 建议细胞膜可以利用侧流或蛋白质堵塞来修复小的干扰 (和 #60; 1 nm)。侧向融合模型建议通过 dysferlin 膜的横向征募7快速修补膜破裂, 而蛋白质堵塞模型则表明通过蛋白质聚合修补小穿孔(主要 annexins)8. 反之, 较大的膜病变触发 Ca2 +依赖性, dysferlin 介导的囊泡融合和修复补丁的形成。在修复修补程序模型中, 快速的 Ca2流入该单元会触发多种蛋白质 (dysferlin、annexins、mitsugumin-53 和 EDH 蛋白) 的招募, 这些蛋白形成一个复杂的或 "补丁", 同时融合胞内泡或溶酶体在膜损伤的部位4,9,10,11,12。重要的是要注意, 这些模型不一定是互斥的, 并可能协同工作, 以促进膜修复。未正确重新细胞膜损伤与多种疾病状态有关, 包括肌营养不良 (dysferlinopathy-包括三好肌病、肢带肌营养不良型 IIB, 以及胫骨前开始的远端肌病变)13, 心肌病14, 和 Chediak-东综合征 (社区卫生)15。
鉴于适当的细胞膜完整性和加盖在健康和疾病中起着如此重要的作用, 对细胞膜修复的基本分子机制的更深的理解将有利于寻找新的治疗策略。因此, 有必要拥有适当的实验技术来监测动力学和评价细胞膜修复能力。设计了几种用于膜修复的体外方法。其中一个策略涉及机械损伤, 通过在细胞上使用吸管/外科刀片/剃刀或滚动玻璃珠在单元格上的刮擦, 可以方便地16。然而, 这种类型的机械损伤产生更大的损害, 并创造了高度的变化, 细胞损伤, 在内部和之间的文化。
另一种产生膜伤的方法是用双光子显微镜进行激光消融。与传统的激光共聚焦显微镜相比, 采用单光子激发, 双光子激光器同时使用两个长, 低能光子, 以促进高能电子17的激发。这个非线性的过程只在焦平面内产生激发, 而不是沿着整个光路17 (图 1)。当成像活细胞18,19时, 这种减少的励磁量有助于最小化光。因此, 研究人员能够在细胞膜上产生精确的病变, 并利用荧光染料实时监测细胞膜加盖, 并观察细胞膜破裂后封装的荧光强度变化。
这种方法已被反复用于研究膜伤的体外和在体内和多细胞类型20,21。例如, 利用此技术对 dysferlinopathy 患者的成纤维细胞和管的膜修复缺陷进行了评估22,23。此外, 从小鼠分离的单肌纤维被用来监测修复补丁形成13,24,25。在单肌纤维膜修复过程中也可以观察到荧光标记蛋白的运动9。此外, 在 real-time体内26中可以观察到斑马鱼胚胎双光子激光伤后的心肌修复过程。
在这篇文章中, 我们概述了一种方法, 评估细胞膜修复动力学的双光子激光伤, 虽然这种方法可以用于各种细胞类型的目的, 以量化等离子膜加盖能力体外。在这种方法中, 细胞的孵育与 FM4-64, 一个亲油性, 细胞不透水染料, 迅速荧光, 因为它结合在细胞质内的负电荷磷脂通过膜病变进入细胞 (图 2和 #38;3). 对膜病变附近的染料荧光进行量化, 可以监测细胞膜重新本身所需的时间。为了说明这一方法的效用, 我们使用 dysferlinopathy 患者成纤维细胞转染 GFP-共轭全长 dysferlin (DYSF) 质粒, 以评估挽救细胞膜修复。
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Protocol
本研究中使用的人成纤维细胞在阿尔伯塔大学医学和牙科学院人类伦理委员会的批准下使用。
1. 全长 DYSF 质粒的细胞转染
- 培养成纤维细胞的 T225 瓶含有40毫升的生长培养基-36 毫升 Dulbecco 氏改良鹰培养基 (DMEM), 4 毫升的胎儿牛血清 (FBS), 和20µL 青霉素/链霉素 (P/s)-在一个 CO2孵化器在37° c。
注意: 细胞应培养到约 70-80% 70-100, 不应允许成为完全汇合。 - 要准备细胞播种, 用40毫升磷酸缓冲盐水 (PBS) 冲洗两次细胞, 然后加入5毫升的0.05% 胰蛋白酶分离细胞。将电池返回到37° c CO2孵化器, 并孵育5分钟的细胞。
- 当细胞完全分离时, 加入40毫升的生长培养基来停止胰蛋白酶反应。
- 使用例或其他单元计数设备对单元格进行计数。
- 种子2毫升的细胞在 1x105细胞/毫升成35毫米胶原涂层的玻璃底部的菜肴。在37° c 的 CO2培养箱中过夜孵育细胞。
注意: 细胞应该是大约50-60% 汇合的第二天。 - 去除培养基, 用2毫升无血清的培养基 (无 FBS 的培养基) 取代。
- 用 lipotransfection 染了全长 dysferlin 质粒的细胞。
- 在1.5 毫升的试管中制备150µL 的无血清培养基 (每道要转染的一根管子)。
- 将3µL 的转染试剂添加到每1.5 毫升含有血清剥夺介质的管中。在室温下孵育至少5分钟。
- 在一个单独的1.5 毫升管, 增加175µL 的血清剥夺培养基和3.5 µg 质粒 DNA。
注: 将上述金额乘以每增加的菜品进行转染。 - 将含有质粒 DNA 的培养基中的150µL 与150µL 的血清剥夺培养基和转染试剂相结合。在室温下孵育20分钟。
- 均匀分布300µL 介质与质粒和转染试剂在盘中。在37° c 的 CO2孵化器中孵育24小时的盘子。
- 用含有血清的新鲜培养基取代培养基, 在37° c 的 CO2培养箱中孵育另外24小时。
2. 双光子伤试验细胞的制备
- 通过移去除介质, 用1毫升 Tyrode 溶液冲洗细胞一次, 然后加入1毫升的新鲜 Tyrode 溶液, 其中含有1µL 2.5 mM FM 4-64 染料。
注: FM 4-64 染料的最终浓度为2.5 µM。 - 如果需要评估在钙耗尽的环境中的膜修复, 冲洗细胞与1毫升 pbs, 然后加入1毫升 pbs 含有1毫米 EGTA。
注意: 由于 PBS 将导致细胞分离随着时间的推移, 伤人化验应尽快完成。
3. 双光子激光致伤法
- 使用倒置共焦显微镜和相关程序软件, 创建一个0.2 µm x 2 µm 目标, 并将其放置在细胞膜的边缘, 使目标线重叠, 并与细胞膜的方向垂直 (图 2)。
- 使用543纳米氖激光器激发 FM 染料信号, 并将检测范围设置为 600-760 nm。使用 488 nm 氩激光激发 GFP 信号 (图 4), 并将检测范围设置为 500-550 nm。
- 创建一个5分钟序列图像扫描, 成像细胞每5秒。
- 为了产生一个膜病变, 漂白细胞使用双光子激光器设置为 820 nm, 使用15% 激光功率与10迭代和漂白细胞二十五年代后的时间序列的开始。
- 为了量化 FM 4-64 染料荧光, 使用该软件绘制一个6µm x 6 µm 感兴趣的区域 (ROI), 并把它毗邻受伤的位置和细胞内 (图 3)。
注意: 在软件此应用程序中使用 "范围指示器" 功能, 避免像素会的取样区域, 红色像素表示饱和像素。将原始荧光值导出到电子表格中进行统计分析。 - 通过减去背景值 (膜伤前 timepoints 的平均荧光值) 和在 t = 0 (图 5, 6) 上的荧光值除以净增量, 计算每个时间点的相对荧光值.
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Representative Results
健康的人成纤维细胞, 处理 dysferlinopathy 患者成纤维细胞, 和转染的质粒含有全长 dysferlin 序列的患者成纤维细胞受到双光子激光损伤, 以评估膜加盖能力实时。健康的人成纤维细胞显示低水平的 FM 4-64 荧光激活后, 激光伤和处理患者成纤维细胞表现出高度的相对荧光强度后受伤 (图 5和 #38; 6).转染全长 dysferlin 质粒的患者细胞显示, 相对于处理患者的对照组, 相关的 FM 4-64 荧光强度降低, 并与健康控制中观察到的荧光值相媲美 (图5和 #38; 6)。
图 1.单光子与双光子显微镜.在传统的单光子显微镜系统中, 使用单一的高能光子 (UV 或可见光谱) 来激发荧光 (a)。在双光子系统中, 两个低能光子 (近红外线) 被用来激发荧光 (B)。在气缸内描绘的是在整个焦平面上产生的荧光信号, 演示了双光子激光系统如何将励磁光聚焦到特定区域 (B) 中, 并将光从焦平面中排除 (a)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.在细胞膜上放置一个靶.使用软件, 0.2 µm x 2 µm 目标是绘制和放置重叠和垂直的细胞膜。箭头指示目标。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.荧光信号从 FM 染料, 因为它浸润细胞通过膜破裂.当细胞膜破裂时, 亲油性 FM 4-64 染料渗入细胞和荧光, 因为它在细胞质中束缚了负电荷磷脂。利用软件, 一个感兴趣的区域 (ROI) 可以绘制 (白盒) 和荧光值的盒子内可以用来计算相对荧光变化的细胞内。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.荧光信号从 GFP-共轭全长 DYSF 质粒.继质粒转染后, 患者成纤维细胞表达全长 DYSF 蛋白。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.荧光定量的时间.由计算机软件在 ROI 范围内计算出的荧光值可用于确定各治疗组的相对荧光变化。箭头表示激光消融的时间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6.随着时间的推移, 相对荧光的变化.每个时间点的相对荧光 (RF) 值是通过从给定的荧光值中减去背景荧光值 (计算为在膜伤前 timepoints 的荧光值的平均值) 计算出来的 (信号强度-背景 = δ) 和除以荧光值在 t = 0 (F0) 的净增加 (δ)。因此, RF = δ/F0。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
双光子激光损伤细胞膜是一种精确而多用途的技术, 用于评估膜加盖的动力学体外。本文介绍了用双光子激光损伤法测定 dysferlinopathy 患者细胞细胞膜加盖能力的协议。我们的结果表明, dysferlinopathy 患者细胞是有缺陷的细胞膜加盖, 这是与其他研究人员的发现相一致, 进一步突出了惊人的相似之处细胞膜加盖动力学之间的肌肉和肌肉单元格类型3,11,15,22。我们还观察到, 转染含有全长 dysferlin 序列的质粒的病人细胞从其有缺陷的膜加盖表型中抢救出来, 证明全长 dysferlin 质粒能在肌肉中拯救表型。单元格类型以及肌肉27。
同时, 我们的研究结果增强了双光子膜伤法测定细胞膜加盖能力的可行性和可靠性体外。然而, 与双光子显微镜相关的成本和可用性可能是一个潜在的限制因素, 一些研究小组试图利用双光子膜伤试验。此外, 我们的设置利用倒置共焦显微镜, 这是非常适合的在体外工作, 但可能不太适合体内成像。
重要的是要注意, 双光子激光对准的精度是关键的成功的技术。在我们的经验中, 激光对准的故障排除是最常见的问题。其他可能影响在激光伤害中取得成功命中的能力的其他问题包括在舞台上的玻璃底盘的平整度以及溶液中细胞的取向。
该方法适用于目前和未来的研究, 调查的疾病状态, 细胞膜完整性或加盖是扰动, 以及治疗的功效, 如基因治疗和反义 oligonucleotide-based 治疗, 这将有利于从有一个有效的方法来表征膜动力学, 使新的治疗方案可以探索28,29。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了阿尔伯塔大学医学院和牙科学院的支持, 加勒特卡明研究主席基金的朋友, HM Toupin 神经科学研究椅子基金, 肌肉萎缩症加拿大, 加拿大创新基金会 (CFI),艾伯塔高级教育和技术 (AET), 加拿大卫生研究院 (研究院), 杰西的旅程-基因和细胞治疗的基础, 妇女和儿童健康研究所 (WCHRI) 和艾伯塔省创新健康解决方案 (AIHS).
我们要感谢 Dr. 史蒂芬拉伐尔为我们提供了全长 dysferlin 质粒。我们还要感谢 Dr. 冈田克三宅一生的技术咨询。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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