Summary
Cellemembranen såret via to-foton laser er en meget udbredt metode til vurdering af membran genforsegling evne og kan anvendes til flere celletyper. Her, beskriver vi en protokol til in vitro- live-imaging membran lukning i dysferlinopathy patientens celler efter to-foton laser ablation.
Abstract
Mange patofysiologiske fornærmelser kan forårsage skader på cellemembranerne og, når kombineret med medfødte defekter i cellemembranen reparation eller integritet, kan resultere i sygdommen. Forstå de underliggende molekylære mekanismer omkring cellemembranen reparation er derfor en vigtig målsætning for udviklingen af nye terapeutiske strategier for sygdomme forbundet med dysfunktionelle cellemembranen dynamics. Mange in vitro og i vivo undersøgelser med henblik på forståelse af cellemembranen genlukning i forskellige sygdom sammenhænge udnytter to-foton laser ablation som en standard for bestemmelse af funktionelle resultater efter eksperimentelle behandlinger. I denne analyse underkastes cellemembraner såret med en to-foton laser, som forårsager cellemembranen til brud og fluorescerende farvestof til at infiltrere cellen. Intensiteten af fluorescens i cellen kan derefter overvåges for at kvantificere cellens evne til reseal selve. Der er flere alternative metoder til vurdering af cellemembranen reaktion på skade, samt stor variation i de to-foton laser såret tilgang, selv, derfor, en enkelt, ensartet model af celle såret ville gavnlig tjener til at mindske den variation mellem disse metoder. I denne artikel vil skitsere vi en simpel to-foton laser såret protokol for at vurdere cellemembranen reparation in vitro- i både sunde og dysferlinopathy patient fibroblast celler transfekteret med eller uden en fuld længde dysferlin plasmid.
Introduction
Cellemembranen af eukaryote celler består af et dobbelt-lag af protein-besat fosfolipider som definerer den intra/ekstracellulære miljø af cellen og er afgørende for at opretholde cellulære homøostase og celle overlevelse. Cellemembranen skader som følge af mekanisk eller kemisk fornærmelser er hverdagskost i forskellige pattedyr celletyper, herunder skelet og hjertemuskulaturen, mave og lunge celler1,2,3,4. Ud over skader deraf til daglige fysiologiske funktion, kan cellemembraner også blive beskadiget af miljømæssige fornærmelser, bakteriel toksiner og iskæmisk reperfusion5. Manglende evne til at forsegle bristninger i cellemembranen fører til en ureguleret tilstrømning af ekstracellulære Ca2 +- sammen med andre potentielt giftige ekstracellulære komponenter - ind i cellen, udløser downstream signal cascades, hvilket kan hurtigt resultere i celle død1,4,5,6.
Til dato har der været flere foreslåede modeller for membran reparation i celler. Forskellige reparations-mekanismer kan blive aktiveret alt efter størrelse og karakter af membran brud. For eksempel, det foreslås, at cellemembraner kan udnytte, laterale flow eller protein tilstopning for at reparere små forstyrrelser (< 1 nm). Den laterale sammensmeltning model foreslår at membran brister hurtigt bødet gennem laterale ansættelse af dysferlin-holdige membran7, mens protein tilstopning model tyder på, at små perforeringer er bødet gennem protein sammenlægninger (for det meste annexins) 8. derimod større membran læsioner udløse Ca2 +-afhængige, dysferlin-medieret vesikel fusion og dannelsen af en reparation patch. I reparation patch model, en hurtig Ca2 + tilstrømning ind i cellen udløser ansættelse af flere proteiner (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 og EDH proteiner), som udgør en kompleks eller "patch", sammen med en fusion af intracellulære blærer eller lysosomer i stedet for membran skade4,9,10,11,12. Det er vigtigt at bemærke, at disse modeller som ikke nødvendigvis udelukker og kan arbejde i fællesskab for at lette membran reparation. Manglende korrekt forsegle cellemembranerne skader er forbundet med flere sygdomstilstande, herunder muskeldystrofi (dysferlinopathy - herunder Miyoshi myopathy, led-bælte muskelsvind type IIB og distale myopathy med forreste tibial debut) 13, kardiomyopati14og Chediak-Higashi syndrom (CHS)15.
I betragtning af at rette celle membran integritet og genlukning spiller sådan en vigtig rolle i sundhed og sygdom, en dybere forståelse af de underliggende molekylære mekanismer af cellemembranen reparation ville være gavnlige i at finde nye terapeutiske strategier. Det er derfor nødvendigt at besidde relevante eksperimentelle teknikker til at overvåge kinetik og vurdere muligheden af cellemembranen reparation. Flere in vitro- metoder til modellering membran reparation er designet. Én strategi indebærer mekanisk skade, som kan fremmes gennem celle skrabe med en pipette/kirurgiske kniv/skraber eller ved at rulle glasperler over celler16. Men denne form for mekanisk skade genererer større læsioner, og skaber en høj grad af variation i celle skade, både inden for og mellem kulturer.
En anden metode til at generere membran sår er laser ablation af to-foton mikroskopi. I modsætning til traditionelle laser Konfokal mikroskopi, der beskæftiger enkelt foton excitation, bruger to-foton laser samtidig to lang bølgelængde, lav-energi fotoner til at lette excitation af en højenergi elektron17. Denne ikke-lineær proces resulterer i excitation udelukkende inden for brændplanet og ikke langs hele lys vej17 (figur 1). Dette reduceret excitation volumen hjælper med at minimere solskader, når imaging levende celler18,19. Forskere kan derfor generere præcis læsioner i cellemembranen og monitor membran genlukning i realtid ved hjælp af fluorescerende farvestoffer og observere ændringer i fluorescens-intensiteten som cellemembranen bristninger og derefter lukninger (reseals).
Denne tilgang er blevet brugt gentagne gange til at studere membran såret in vitro og i vivo og i flere celle typer20,21. For eksempel, membran reparere defekter i fibroblaster og myotubes stammer fra dysferlinopathy patienter blev vurderet ved hjælp af denne teknik22,23. Også, enkelt muskelfibre isoleret fra mus blev brugt til at overvåge reparation patch dannelse13,24,25. Flytning af fluorescently mærket proteiner kan også iagttages under membran reparation i enkelt muskelfibre9. Derudover kan processen med sarcolemmal reparation efter to-foton laser var blevet såret i zebrafisk embryoner observeres i realtid i vivo26.
I denne artikel vil skitsere vi en metode til vurdering af cellemembranen reparation dynamics i fibroblaster ved hjælp af to-foton laser såret, selv om denne metode kan anvendes på forskellige celletyper med henblik på at kvantificere plasma membran genforsegling evne i vitro. I denne metode, cellerne inkuberes med FM4-64, en lipofile, celle-vandtætte farvestof, der hurtigt fluorescerer da det binder sig til negativt ladede fosfolipider i cytoplasma ved ankomsten til cellen gennem membranen læsion (figur 2& 3). kvantificering af farvestof fluorescens støder op til membran læsion giver mulighed for at overvåge den tid, det tager for cellemembranen til reseal selve. For at eksemplificere nytten af denne metode, bruger vi dysferlinopathy patient fibroblaster transfekteret med normal god landbrugspraksis-konjugeret fuld længde dysferlin (DYSF) plasmider for at vurdere redning af cellemembranen reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige fibroblastceller, der anvendes i denne undersøgelse blev brugt med godkendelse fra den menneskelige etiske komité af lægevidenskabelige Fakultet og tandpleje på University of Alberta.
1. Transfektion af celler med fuld længde DYSF plasmid
- Kultur fibroblastceller i en T225 kolbe indeholdende 40 mL vækst medier - 36 mL Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM), 4 mL føtalt bovint serum (FBS) og 20 µL af penicillin/streptomycin (P/S) - i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
Bemærk: Celler bør være kulturperler til ca 70-80% confluency og må ikke blive helt sammenflydende. - For at forberede celler til såning, skyl celler med 40 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS) to gange, hvorefter der tilsættes 5 mL 0,05% trypsin Adskil celler. Returnere cellerne til 37 ° C CO2 inkubator og inkuberes celler i 5 min.
- Når cellerne er helt løsrevet, tilsættes 40 mL vækst medier at stoppe trypsin reaktion.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller en anden celle tælle enhed.
- Seed 2 mL af celler ved 1 x 105 celler/mL i 35 mm kollagen-belagt glas-bund retter. Inkuber celler natten over i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
Bemærk: Celler skal være omkring 50-60% sammenflydende næste dag. - Fjern vækst medie og Udskift det med 2 mL serum-berøvet medier (vækst medier uden FBS).
- Transfect celler med fuld længde dysferlin plasmid ved hjælp af lipotransfection.
- Forberede 150 µL serum-berøvet medier i en 1,5 mL tube (et rør til hver ret til at være transfekteret).
- Tilføje 3 µL Transfektion reagens til hver 1,5 mL rør indeholdende serum-berøvet medier. Inkuber det mindst 5 min ved stuetemperatur.
- I en separat 1,5 mL tube, tilføje 175 µL serum-berøvet medier og 3,5 µg af plasmid DNA.
Bemærk: Formere de ovennævnte beløb for hver ekstra skål til at være transfekteret. - Kombinere 150 µL af medier indeholdende plasmid DNA ind i et rør med 150 µL serum-berøvet medier og Transfektion reagens. Inkuber det i 20 min ved stuetemperatur.
- Jævnt distribuere 300 µL af medier med plasmid og Transfektion reagens i hele fadet. Inkuber retter i 24 timer i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Erstatte medierne med friske vækst medier indeholdende serum og inkuberes i en yderligere 24 h i en CO2 inkubator ved 37 ° C.
2. forberedelse af celler for to-foton såret assay
- Fjerne medier af pipettering og skyl cellerne en gang med 1 mL af Tyrodes løsning, derefter tilsættes 1 mL frisk Tyrode opløsning indeholder 1 µL af 2,5 mM FM 4-64 farvestof.
NOTE: Den endelige koncentration af FM 4-64 farvestof er 2,5 µM. - Hvis vurderingen af membran reparation i en calcium-forarmet miljø ønskes, skyl celler med 1 mL PBS og derefter tilsættes 1 mL PBS, som indeholder 1 mM EGTA.
Bemærk: Som PBS vil bevirke, at cellerne at løsne sig over tid, såret analysen bør være afsluttet så hurtigt som muligt.
3. to-foton laser såret assay
- Brug en inverteret Konfokal mikroskop og tilhørende program software, skabe en 0,2 µm x 2 µm mål og placere det på kanten af cellemembranen, således at target line overlapper og ligger vinkelret på cellemembranen (figur 2).
- Brug en 543-nm HeNe laser til at ophidse FM farvestof signal og indstille registreringsområde for 600-760 nm. Brug en 488 nm Argon laser til at ophidse normal god landbrugspraksis signal (figur 4) og indstille registreringsområde for 500-550 nm.
- Oprette en 5 min gang række sekventielle billede scanninger, imaging celler hver 5 s.
- For at generere en membran læsion, blegemiddel celler ved hjælp af en to-foton laser indstillet til 820-nm, med 15% laser power med 10 gentagelser og blege celler 25 s efter begyndelsen af tidsserien.
- For at kvantificere FM 4-64 farvestof fluorescens, skal du bruge softwaren til at tegne en 6 µm x 6 µm region af interesse (ROI) og placere den tilstødende såret placeringen og inden for cellen (figur 3).
Bemærk: Undgå prøveudtagning områder af pixel oversaturation ved hjælp af funktionen "Rækkevidde indikator" i software - i dette program, røde pixels repræsenterer overmættede pixels. Eksportere rå fluorescens værdier i et elektronisk regneark til statistiske analyser. - Beregne relative fluorescens værdier for hvert tidspunkt ved at trække værdien baggrund (gennemsnitlig fluorescens værdien af timepoints inden membran såret) og dividere den nettoforøgelse af fluorescens værdi ved t = 0 (figur 5, 6) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunde humane fibroblaster, ubehandlede dysferlinopathy patient fibroblaster og patient fibroblaster transfekteret med et plasmid som indeholder fuld længde dysferlin sekvens blev udsat for to-foton laser såret for at vurdere membran genforsegling evne i realtid. Sunde humane fibroblastceller vises lave niveauer af FM 4-64 fluorescens aktivering efter laser blevet såret og ikke-behandlede patient fibroblaster udstillet en høj grad af relative fluorescens intensitet efter skade (figur 5& 6 ). Patientens celler, der blev transfekteret med fuld længde dysferlin plasmid viste reduceret relative FM 4-64 fluorescens intensitet sammenlignet med ikke-behandlede patient kontrol og var sammenlignelig med fluorescens værdier overholdes i kontrolelementet sund (figur 5& 6).
Figur 1 . One-foton versus to-foton mikroskopi. I en traditionel en-foton mikroskop system bruges en enkelt høj energi fotoner (UV eller synlige spektrum) til at vække en fluorophore (A). I en to-foton system bruges to lavere-energi fotoner (nær infrarød) til at vække en fluorophore (B). Afbildet i flaskerne er fluorescens signalet genereret i hele brændplanet, demonstrerer, hvordan to-foton laser system kan fokusere excitation lys til inden for en bestemt region (B) og udelukke lys fra ud-af-fokus fly (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Placere et mål på cellemembranen. Ved hjælp af software, er en 0,2 µm x 2 µm mål tegnet og placeret overlappende og vinkelret på cellemembranen. Pilen angiver målet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Fluorescens signalet fra FM farvestof som det infiltrerer celle gennem membranen ruptur. Som cellemembranen bristninger, lipofile FM 4-64 farvestof infiltrerer cellen og fluorescerer da det binder negativt ladede fosfolipider i cytoplasmaet. Ved hjælp af software, en region af interesse (ROI) kan være trukket (hvid boks) og fluorescens værdier i boksen kan bruges til at beregne relative fluorescens ændringer inden for cellen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Fluorescens signal fra normal god landbrugspraksis-konjugeret fuld længde DYSF plasmid. Efter plasmid Transfektion udtrykke patient fibroblastceller fuld længde DYSF protein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Kvantificering af fluorescens tidens. Fluorescens værdierne beregnet af computersoftware fra inden for ROI kan bruges til at bestemme relative fluorescens ændrer sig over tid for hver behandling. Pilen angiver tidspunktet for laser ablation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Ændring i relative fluorescens tidens. Relative fluorescens (RF) værdier for hvert tidspunkt beregnes ved at fratrække baggrund fluorescens (beregnet som gennemsnittet af fluorescens værdier fra timepoints før membran såret) fra de givne fluorescens værdier (Signal Intensitet - baggrund = ΔF) og dividere nettet øge (ΔF) af fluorescens værdien ved t = 0 (F0). Derfor, RF = ΔF/F0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To-foton laser såret af cellemembranen er en præcis og alsidig teknik til vurdering af dynamikken i membranen genforsegling in vitro. I denne artikel beskrev vi en protokol til bestemmelse af cellemembranen genforsegling evne i dysferlinopathy patientens celler ved hjælp af to-foton laser såret assay. Vores resultater viser, at dysferlinopathy patienten celler er defekt i cellemembranen lukning, som er i overensstemmelse med resultaterne af andre forskere og som yderligere fremhæver de slående ligheder i cellemembranen genforsegling dynamik mellem muskel og ikke-muskel celle typer3,11,15,22. Vi bemærkede også, at patientens celler transfekteret med et plasmid som indeholder fuld længde dysferlin sekvens blev reddet fra deres defekte membran genforsegling fænotype, demonstrerer, at fuld længde dysferlin plasmid kan redde fænotype i ikke-muskel celletyper såvel som i muskel27.
Sammen, styrke vores resultater gennemførligheden og pålideligheden af den to-foton membran såret assay som en guld-standard i måling af cellens membran genforsegling evne in vitro. Men omkostningerne og tilgængeligheden forbundet med to-foton mikroskopi kunne være en potentiel begrænsende faktor for nogle forskningsgrupper forsøger at udnytte den to-foton membran såret assay. Derudover udnytter vores setup en inverteret Konfokal mikroskop, som er velegnet til in vitro arbejde men kan være mindre hensigtsmæssigt, i vivo billeddannelse.
Det er vigtigt at bemærke at præcisionen af to-foton laser justeringen er afgørende for succes af teknikken. Vores erfaring var fejlfinding af laser justering det mest almindelige problem oplevet. Andre spørgsmål, som kan påvirke evnen til at score vellykket hits under laser såret omfatter udjævning af glas-bund fad på scenen samt orientering af celler i løsning.
Analysen kan anvendes til nuværende og fremtidige studier undersøger sygdomstilstande hvor celle membran integritet eller lukning er rystet, og effekten af behandlingsformer såsom genterapi og antisense oligonukleotid-baseret terapi, som ville gavne fra at have udforskede en effektiv analyse for kendetegner membran dynamik, således at nye terapeutiske muligheder kan være28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af University of Alberta Fakultet for medicin og tandpleje, The venner af Garrett Cumming stol forskningsfond, HM Toupin neurologiske videnskab forskning stol fond, muskelsvind Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta avanceret uddannelse og teknologi (AET), canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR), Jesses rejse - grundlaget for gen og celleterapi, kvinder og børns sundhed Research Institute (WCHRI), og Alberta innoverer sundhed løsninger (AIHS ).
Vi vil gerne takke Dr. Steven Laval til forsyne os med fuld længde dysferlin plasmid. Vi vil også gerne takke Dr. Katsuya Miyake for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
