Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

doi: 10.3791/56999 Published: January 2, 2018

Summary

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Abstract

Talrijke pathofysiologische beledigingen kunnen schade toebrengen aan celmembranen en wanneer in combinatie met aangeboren gebreken in de celmembraan reparatie of integriteit, kunnen leiden tot ziekte. Inzicht in de moleculaire mechanismen rond celmembraan reparatie is daarom een belangrijke doelstelling voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor ziekten in verband met disfunctionele celmembraan dynamiek. Twee-foton laser ablatie veel in vitro en in vivo studies gericht op het begrijpen van de celmembraan opnieuw verzegelen in verschillende contexten van de ziekte gebruiken als maatstaf voor het bepalen van de functionele uitkomsten na experimentele behandelingen. In deze test, zijn celmembranen onderworpen aan verwonding met een twee-foton laser, waardoor de celmembraan breuk en fluorescente kleurstof te infiltreren in de cel. De intensiteit van de fluorescentie binnen de cel kan vervolgens worden gecontroleerd om te kwantificeren van de cel kunnen verzegelen zelf. Er zijn verschillende alternatieve methoden voor de beoordeling van de celmembraan reactie op schade, evenals de grote variatie in de twee-foton laser verwonden aanpak zelf, dus een enkele, uniforme model van cel verwonden beneficiair te verminderen zou dienen de het verschil tussen deze methoden. In dit artikel schetsen wij een eenvoudige twee-foton laser protocol voor de beoordeling van de celmembraan reparatie in vitro in beide gezond en dysferlinopathy patiënt fibroblast cellen transfected met of zonder een full-length dysferlin plasmide verwonden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het celmembraan van eukaryotische cellen bestaat uit een dubbele laag van eiwit-studded fosfolipiden die definieert het intra/extracellulaire milieu van de cel en is essentieel voor het behoud van cellulaire homeostase en cel overleven. Celmembraan verwondingen als gevolg van mechanische of chemische beledigingen zijn gemeengoed in verschillende zoogdieren celtypen, met inbegrip van skelet en hartspier, maag en longen cellen1,2,3,4. Naast Blessures gevolg van dagelijkse fysiologische functie, kunnen celmembranen ook worden beschadigd door milieu beledigingen, bacteriële toxines en ischemische reperfusie5. Niet verzegelen van breuken in de celmembraan leidt tot een ongecontroleerde toestroom van extracellulaire Ca2 +- samen met andere potentieel giftige componenten van de extracellulaire - in de cel, triggering stroomafwaarts signaal cascades die snel in cel resulteren kunnen dood1,4,5,6.

Tot op heden, zijn er verschillende voorgestelde modellen voor membraan reparatie in cellen. Verschillende herstelmechanismes kunnen worden geactiveerd afhankelijk van de grootte en de aard van de breuk van het membraan. Bijvoorbeeld, wordt voorgesteld dat celmembranen gebruik maken van kan laterale stroom of eiwit verstopping om te herstellen van kleine verstoringen (< 1 nm). De laterale fusion-model stelt dat membraan breuken zijn snel mended via laterale aanwerving van dysferlin-bevattende membraan7, terwijl het eiwit verstopping model suggereert dat kleine perforaties via eiwit aggregaties zijn mended (meestal annexins) 8. omgekeerd, grotere membraan laesies leiden tot Ca2 +-afhankelijk, dysferlin-gemedieerde vesikel kernversmelting en de vorming van een reparatie patch. In de reparatie patch model, een snelle Ca2 + toestroom in de cel activeert de aanwerving van meerdere eiwitten (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 en EDH eiwitten) die een complex of "patch", samen met een fusie van intracellulaire vesikels vormen of Lysosomen op de site van membraan beschadigen4,9,10,11,12. Het is belangrijk op te merken dat deze modellen elkaar niet noodzakelijkerwijs uitsluiten en in concert werken kunnen om reparatie van de membraan. Niet goed verzegelen celmembraan schade is gekoppeld aan meerdere ziekte staten, met inbegrip van spierdystrofie (dysferlinopathy - met inbegrip van Miyoshi myopathie, limb-girdle spierdystrofie type IIB en distale myopathie met anterior tibiale begin) 13, cardiomyopathie14, en Chediak-Higashi syndroom (CHS)15.

Gezien de juiste cel membraan integriteit en opnieuw verzegelen speelt zo'n belangrijke rol in gezondheid en ziekte, een dieper begrip van de moleculaire mechanismen van celmembraan reparatie gunstig zou zijn in de zoektocht naar nieuwe therapeutische strategieën. Het is daarom noodzakelijk te beschikken over passende experimentele technieken om te controleren de kinetiek en evalueren van het vermogen van de celmembraan reparatie. Verscheidene in vitro methoden voor de modellering van de reparatie van de membraan zijn ontworpen. Een strategie gaat om mechanische schade, die kan worden vergemakkelijkt door de cel schrapen met een pipet/chirurgisch mes/scheermes of door glaskralen kantelen de cellen16. Echter dit soort mechanische schade grotere laesies genereert en creëert een hoge mate van variatie in cel letsel, zowel binnen als tussen culturen.

Een andere methode voor de opwekking van membraan wonden is laser ablatie door twee-foton microscopie. In tegenstelling tot traditionele laser confocal microscopie die gebruikmaakt van één foton excitatie, gebruikt de laser twee-foton gelijktijdig twee lange golflengte, lage-energie fotonen ter vergemakkelijking van de excitatie van een hoog-energetische elektronen17. Dit niet-lineaire proces resulteert in excitatie uitsluitend binnen het brandvlak en niet langs de gehele lichtpad17 (Figuur 1). Dit verminderde excitatie volume helpt bij het minimaliseren van photodamage wanneer imaging levende cellen18,19. Daarom zijn onderzoekers kunnen produceren nauwkeurige laesies in de celmembraan en monitor membraan opnieuw verzegelen in real-time met behulp van fluorescente kleurstoffen en observeren van wijzigingen in de intensiteit van de fluorescentie als de celmembraan breuken en vervolgens verzegelingen.

Deze aanpak is herhaaldelijk gebruikt om studeren membraan verwonding in vitro en in vivo en in meerdere cel typen20,21. Bijvoorbeeld membraan herstellen gebreken in fibroblasten en myotubes afgeleid van dysferlinopathy patiënten werden beoordeeld met behulp van deze techniek22,23. Ook werden enkele spiervezels geïsoleerd van muizen gebruikt om de reparatie patch vorming13,24,25te controleren. De beweging van fluorescently tagged eiwitten kan ook worden waargenomen tijdens membraan reparatie in enkele spiervezels9. Bovendien, het proces van sarcolemmal reparatie na twee-foton laser verwonding in zebrafish embryo's kan worden waargenomen in real-time in vivo26.

In dit artikel duidelijk naar voren komt een methodologie voor de beoordeling van de dynamiek van de reparatie van de celmembraan in fibroblasten met behulp van twee-foton laser verwonden, hoewel deze methode kan worden toegepast op verschillende celtypen, met het oog op het kwantificeren van plasmamembraan opnieuw verzegelen van vermogen in vitro. Bij deze methode worden de cellen geïncubeerd met FM4-64, een lipofiele, cel-ondoordringbare kleurstof die snel licht als het bindt aan negatief geladen fosfolipiden in het cytoplasma bij binnenkomst in de cel door de membraan-laesie (Figuur 2& 3). kwantificering van kleurstof fluorescentie grenzend aan de laesie membraan zorgt voor controle van de tijd die nodig is voor de celmembraan te verzegelen zelf. Om te illustreren het nut van deze methode, gebruiken we dysferlinopathy patiënt fibroblasten transfected met plasmiden GFP-geconjugeerde full-length dysferlin (DYSF) te beoordelen van de redding van de celmembraan reparatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Menselijke fibroblast cellen die worden gebruikt in deze studie werden gebruikt met goedkeuring van de menselijke ethische commissie van de faculteit geneeskunde en tandheelkunde bij de Universiteit van Alberta.

1. de transfectie van cellen met full-length DYSF plasmide

  1. Cultuur fibroblast cellen in een T225 kolf met 40 mL groei media - 36 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), 4 mL van foetale runderserum (FBS) en 20 µL van penicilline/streptomycine (P/S) - in een CO2 incubator bij 37 ° C.
    Opmerking: Cellen moeten worden gekweekt tot ongeveer 70-80% confluentie en mogen niet tot volledig confluent.
  2. Als voorbereiding op cellen zaaien, spoel de cellen met 40 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal, dan Voeg 5 mL 0,05% trypsine loskoppelen van de cellen. Terug van de cellen naar de 37 ° C CO2 incubator en Incubeer de cellen gedurende 5 minuten.
    1. Wanneer de cellen volledig vrijstaand, voeg 40 mL groei media om te stoppen met de trypsine reactie.
    2. De cellen met behulp van een hemocytometer of een andere cel tellen apparaat tellen.
  3. Zaad van 2 mL van de cellen bij 1 x 105 cellen/mL in 35 mm collageen-gecoate glazen-bodem gerechten. Incubeer de cellen overnachting in een CO2 incubator bij 37 ° C.
    Opmerking: Cellen moet ongeveer 50-60% heuvels de volgende dag.
  4. Verwijder het medium van de groei en 2 mL serum-beroofd media (groei media zonder FBS) te vervangen.
  5. Transfect de cellen met full-length dysferlin plasmide met behulp van lipotransfection.
    1. 150 µL van de serum-beroofd media in een tube van 1,5 mL (één buis voor elk gerecht om te zijn transfected) voor te bereiden.
    2. Voeg 3 µL van transfectiereagens aan elke 1,5 mL-buis met serum-beroofd media. Incubeer het minstens 5 min bij kamertemperatuur.
    3. Voeg in een afzonderlijke 1,5 mL-buis, 175 µL van de serum-beroofd media en 3,5 µg plasmide DNA.
      Opmerking: Vermenigvuldigt de bovenstaande bedragen voor elk extra gerecht om te zijn transfected.
    4. 150 µL van media met plasmide DNA in een buis met 150 µL van de serum-beroofd media en transfectiereagens combineren. Incubeer het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gelijkmatig verdelen 300 µL van media met plasmide en transfectie reagens over de schotel. Incubeer de gerechten gedurende 24 uur in een CO2 incubator bij 37 ° C.
  6. De media te vervangen door nieuwe groei media met serum en Incubeer het voor een aanvullende 24 h in een CO2 incubator bij 37 ° C.

2. voorbereiding van cellen voor twee-foton verwonden assay

  1. Verwijder het medium door pipetteren en spoel de cellen een keer met 1 mL van de Tyrode oplossing, voeg vervolgens 1 mL van de verse Tyrode oplossing met 1 µL van 2,5 mM FM 4-64 kleurstof.
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van FM 4-64 kleurstof is 2,5 µM.
  2. Desgewenst beoordeling van membraan reparatie in een omgeving van calcium-uitgeput is spoel cellen met 1 mL PBS en voeg vervolgens 1 mL PBS, met 1 mM EGTA.
    Opmerking: Als PBS veroorzaken de cellen om na verloop van tijd los te maken zal, de verwonding bepaling moet worden ingevuld zo snel mogelijk.

3. twee-foton laser verwonden assay

  1. Met behulp van een omgekeerde confocal microscoop en bijbehorende programmasoftware, maak een 0,2 µm x 2 µm doel en plaats deze aan de rand van de celmembraan zodat de target-lijn overlapt en loodrecht op de richting van de celmembraan (Figuur 2 ligt).
  2. Gebruik een 543-nm HeNe laser FM kleurstof signaal prikkelen en instellen van het registratiebereik voor 600-760 nm. Gebruik een 488-nm Argon laser excite GFP signaal (Figuur 4) en het instellen van het registratiebereik voor 500-550 nm.
    1. 5 min tijdreeksen van opeenvolgende beeld scans, imaging cellen maken elke 5 s.
    2. Voor het genereren van een membraan laesie, bleekmiddel cellen met behulp van een twee-foton laser ingesteld op 820-nm, met behulp van 15% laser macht met 10 herhalingen en bleekmiddel cellen 25 s na het begin van de tijdreeks.
  3. Om te kwantificeren FM 4-64 kleurstof fluorescentie, door de software te gebruiken om te tekenen een 6 µm x 6 µm regio van belang (ROI) en het aangrenzende plaatsen naar de verwonding locatie en binnen de cel (Figuur 3).
    Opmerking: Vermijd bemonstering gebieden van pixel overbelichtingseffecten met behulp van de "Bereik Indicator"-functie in de software - in deze aanvraag, rode pixels vertegenwoordigen oververzadigde pixels. Ruwe fluorescentie waarden exporteren naar een elektronische spreadsheet voor statistische analyse.
  4. Relatieve fluorescentie waarden voor elk punt van tijd berekenen door af te trekken van de waarde van de achtergrond (de waarde van de gemiddelde fluorescentie van timepoints voorafgaand aan membraan verwonden) en delen van de netto stijging door de fluorescentie waarde op t = 0 (Figuur 5, 6) .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gezonde menselijke fibroblasten, dysferlinopathy niet-behandelde patiënten fibroblasten en patiënt fibroblasten transfected met een plasmide met de full-length dysferlin volgorde werden onderworpen aan twee-foton laser verwonden om te beoordelen membraan opnieuw verzegelen van vermogen in real-time. Gezonde menselijke fibroblast cellen weergegeven lage niveaus van FM 4-64 fluorescentie activering na laser verwonden en niet-behandelde patiënten fibroblasten tentoongesteld een hoge mate van intensiteit van de relatieve fluorescentie na letsel (Figuur 5& 6 ). Patiënt cellen transfected waren met full-length dysferlin plasmide toonde verminderde relatieve FM 4-64 fluorescentie intensiteit in vergelijking met niet-behandelde patiënten besturingselementen en waren vergelijkbaar met fluorescentie waarden waargenomen in het gezonde besturingselement (figuur 5& 6).

Figure 1
Figuur 1 . Één-foton versus twee-foton microscopie. In een traditionele één-foton microscoop systeem, wordt een enkele hoge energie-foton (UV- of zichtbare spectrum) gebruikt voor het wekken van een fluorophore (A). In een twee-foton systeem, worden twee lage-energie fotonen (nabij infrarood) gebruikt voor het opwekken van een fluorophore (B). Binnen de cilinders is afgebeeld is het signaal van de fluorescentie gegenereerd in de hele van het brandvlak, aan te tonen hoe het lasersysteem van twee-foton excitatie kan concentreren binnen een specifieke regio (B) en uitsluiten licht licht van out-of-focus vlakken (A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Plaatsen van een doel op het celmembraan. Met behulp van software, is een 0,2 µm x 2 µm doelgroep getrokken en overlappende en loodrecht op de celmembraan geplaatst. De pijl geeft het doel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Fluorescentie signaal van FM kleurstof als het infiltreert de cel door een membraan breuk. Als de celmembraan breuken, lipofiele FM 4-64 kleurstof infiltreert de cel en fluoresceert zoals het bindend negatief geladen fosfolipiden in het cytoplasma. Met behulp van software, een regio van belang (ROI) kan worden getrokken (witte vak) en fluorescentie waarden binnen het vak kunnen worden gebruikt voor de berekening van de relatieve fluorescentie veranderingen binnen de cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Fluorescentie signaal van GFP-geconjugeerde full-length DYSF plasmide. Na plasmide transfectie express patiënt fibroblast cellen full-length DYSF eiwit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Kwantificering van fluorescentie na verloop van tijd. Fluorescentie waarden berekend door computersoftware van binnen de ROI kunnen worden gebruikt om te bepalen van de relatieve fluorescentie verandert na verloop van tijd voor alle behandelde groepen. De pijl geeft de tijd van laser ablatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Verandering in de relatieve fluorescentie na verloop van tijd. Relatieve fluorescentie (RF) waarden voor elk punt van tijd worden berekend door de achtergrond fluorescentie waarde (berekend als het gemiddelde van de waarden van de fluorescentie van de timepoints voorafgaand aan membraan verwonden) af te trekken van de waarde van bepaalde fluorescentie (signaal Intensiteit - achtergrond = ΔF) en delen van het net (ΔF) te verhogen met de waarde van de fluorescentie op t = 0 (F0). Daarom, RF = ΔF/F0. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Twee-foton laser verwonden van de celmembraan is een nauwkeurige en veelzijdige techniek voor de beoordeling van de dynamiek van membraan opnieuw verzegelen in vitro. In dit artikel beschreven we een protocol voor het bepalen van de celmembraan opnieuw verzegelen vermogen in dysferlinopathy patiënten cellen met behulp van de laser van de twee-foton assay verwonden. Onze resultaten tonen aan dat dysferlinopathy patiënt cellen met gebreken in het celmembraan opnieuw verzegelen zijn, die strookt met de bevindingen van andere onderzoekers en die verdere hoogtepunten de opvallende gelijkenissen in de celmembraan opnieuw verzegelen dynamiek tussen spier en niet-spier cel typen3,11,15,22. Wij ook waargenomen dat patiënt cellen transfected met een plasmide met de full-length dysferlin volgorde werden gered uit hun membraan defect opnieuw verzegelen fenotype, aan te tonen dat full-length dysferlin plasmide kan redden fenotype in niet-spier celtypes zo goed zoals in spier27.

Samen versterken onze resultaten de haalbaarheid en de betrouwbaarheid van de twee-foton membraan verwonden bepaling als een gouden standaard bij de waardering van cel membraan opnieuw verzegelen vermogen in vitro. Echter, de kosten en de beschikbaarheid die zijn gekoppeld aan twee-foton microscopie zou een potentiële factor voor sommige onderzoeksgroepen willen gebruik maken van het membraan van de twee-foton verwonden van de bepaling te beperken. Bovendien, onze opstelling maakt gebruik van een omgekeerde confocal microscoop, die is geschikt voor in vitro werk maar wellicht minder geschikt voor in vivo imaging.

Het is belangrijk op te merken dat de precisie van de twee-foton laser uitlijning cruciaal voor het succes van de techniek is. In onze ervaring was oplossen van laser uitlijning het meest voorkomende probleem ondervonden. Andere kwesties die van invloed kunnen zijn op de mogelijkheid om de score van succesvolle hits tijdens het verwonden van de laser bevatten de nivellering van de glazen-bodem schotel op het podium, evenals de oriëntatie van de cellen in oplossing.

De bepaling is van toepassing op de huidige en toekomstige studies onderzoeken ziekte staten waarin de integriteit van de celmembraan of opnieuw verzegelen is verstoord, en de doeltreffendheid van de therapieën, zoals gentherapie en antisense oligonucleotide gebaseerde therapie, die zouden profiteren van het hebben van een effectieve assay voor het karakteriseren van membraan dynamiek, zodat nieuwe therapeutische opties kunnen worden onderzocht28,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Alberta faculteit geneeskunde en tandheelkunde, de vrienden van Garrett Cumming stoel onderzoeksfonds, HM Toupin neurologische wetenschap stoel onderzoeksfonds, spierdystrofie Canada, Canada Stichting voor innovatie (CFI), Alberta geavanceerde onderwijs en technologie (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - de Stichting voor gen- en celtherapie, de vrouwen en kinderen Health Research Institute (WCHRI), en Alberta innoveert Health Solutions (AIHS ).

Voor het verstrekken van ons met de plasmide full-length dysferlin bedank wij Dr. Steven Laval. Ook bedank wij Dr. Katsuya Miyake voor technisch advies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312, (3), L371-L391 (2017).
  2. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
  3. McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96, (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
  4. McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (6), 499-505 (2005).
  5. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95, (4), 1205-1240 (2015).
  6. Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261, (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
  7. McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28, (8), 3660-3670 (2014).
  8. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, (Unit 4), 11-24 (2013).
  9. Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213, (6), 705-718 (2016).
  10. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140, (5), 1097-1109 (1992).
  11. Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137, (1), 93-104 (1997).
  12. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, (2), 157-169 (2001).
  13. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, (6936), 168-172 (2003).
  14. Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117, (7), 1805-1813 (2007).
  15. Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (48), 16795-16800 (2004).
  16. Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
  17. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  18. Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3, (3), 231-237 (2000).
  19. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, (5), 1808-1817 (2003).
  20. McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4592-4597 (2003).
  21. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
  22. Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
  23. Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
  24. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, (1), 56-64 (2009).
  25. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (16), 6004-6009 (2014).
  26. Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22, (3), 515-529 (2012).
  27. Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287, (33), 27629-27636 (2012).
  28. Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Springer Japan. 87-102 (2016).
  29. Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17, (9-10), 875-882 (2011).
Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).More

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter