Summary
Membrane cellulaire blessant par deux photons laser est une méthode largement utilisée pour évaluer la capacité de fermeture membrane et peut être appliquée à plusieurs types de cellules. Nous décrivons ici un protocole pour in vitro en direct-imagerie de membrane réapposition de sceau sur dysferlinopathy patients cellules après l’ablation de deux photons laser.
Abstract
Nombreuses insultes physiopathologiques peuvent causer des dommages aux membranes cellulaires et, lorsqu’il est couplé avec des défauts innées dans la réparation de la membrane cellulaire ou l’intégrité, peuvent entraîner la maladie. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents qui entourent la réparation de la membrane cellulaire est donc un objectif important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies liées à la dynamique de la membrane de cellules dysfonctionnelles. De nombreuses études in vitro et in vivo , afin de comprendre la membrane cellulaire rescellage dans divers contextes de maladie utilisent ablation laser deux photons comme une norme pour la détermination des résultats fonctionnels après des traitements expérimentaux. Dans cet essai, membranes cellulaires subissent coups et blessures avec un laser à deux photons, qui provoque la membrane cellulaire se rompre et colorant fluorescent s’infiltrer dans la cellule. L’intensité de la fluorescence au sein de la cellule peut être ensuite surveillée afin de quantifier la capacité de la cellule à se refermer. Il existe plusieurs autres méthodes pour évaluer la réponse de membrane cellulaire à des blessures, ainsi que grande variation dans le deux photons laser blessant approche lui-même, par conséquent, un modèle unifié de cellule blessant servirait avantageusement pour diminuer la variation entre ces méthodes. Dans cet article, nous décrivons un laser à deux photons simple blessant protocole pour évaluer la membrane cellulaire réparation in vitro à la fois sain et dysferlinopathy patients fibroblastes cellules transfectées avec ou sans un plasmide dysferline pleine longueur.
Introduction
La membrane cellulaire des cellules eucaryotes est constitué d’une double couche de phospholipides parsemées de protéine qui définit l’environnement intra/extracellulaire de la cellule et est essentielle pour maintenir la survie cellulaire de l’homéostasie et de la cellule. Membrane cellulaire blessures dus aux insultes mécaniques ou chimiques sont monnaie courante dans les divers types de cellules de mammifères, y compris squelettique et muscle cardiaque, estomac et poumon cellules1,2,3,4. En plus des blessures consécutives à une fonction physiologique quotidienne, membranes cellulaires peuvent également être endommagés par insultes environnementales, des toxines bactériennes et ischémie reperfusion5. Défaut de refermer les ruptures dans la membrane cellulaire conduit à un afflux non réglementé d’extracellulaire Ca2 +- ainsi que d’autres composants extracellulaires potentiellement toxiques - dans la cellule, cascades de signal en aval qui peuvent se traduire rapidement par cellule de déclenchement mort1,4,5,6.
A ce jour, il y a eu plusieurs modèles proposés pour la réparation de membrane de cellules. Les mécanismes de réparation différents peuvent être activés selon la taille et la nature de la rupture des membranes. Par exemple, il est suggéré que les membranes cellulaires peut utiliser écoulement latéral ou protéine colmatage pour réparer les petites perturbations (< 1 nm). Le modèle de fusion latérale propose que les ruptures de la membrane sont rapidement mandés par le biais de recrutement latéral dysferline contenant de la membrane7, tandis que la protéine colmatage modèle suggère que les petites perforations sont mandées par agrégations de protéine (surtout ANNEXINES) 8. à l’inverse, déclenchent des lésions plus grandes de membrane Ca2 +-la fusion des vésicules dépendants, dysferline médiation et formation d’un patch de réparation. Dans le modèle de patch de réparation, un influx de Ca2 + rapid dans la cellule déclenche le recrutement de plusieurs protéines (dysferline, ANNEXINES, mitsugumin-53 et protéines EDH) qui forment un complexe ou la « tache », ainsi qu’une fusion des vésicules intracellulaires ou lysosomes sur le site de membrane endommagent4,9,10,11,12. Il est important de noter que ces modèles ne sont pas nécessairement mutuellement exclusifs et peuvent travailler de concert afin de faciliter la réparation de la membrane. Défaut de resceller correctement les dommages de la membrane cellulaire est associée à plusieurs états pathologiques, y compris la dystrophie musculaire (dysferlinopathy - y compris la myopathie Miyoshi, ceintures dystrophie musculaire type IIB et myopathie distale avec apparition tibiale antérieure) 13,14de la cardiomyopathie et syndrome de Chediak-Higashi syndrome (CHS)15.
Compte tenu de cette intégrité de la membrane de la cellule appropriée et rescellage fois un rôle si important dans la santé et la maladie, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la membrane cellulaire de réparation serait bénéfique à la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il est, par conséquent, nécessaire de posséder des techniques expérimentales appropriées pour suivre la cinétique et d’évaluer la capacité de réparation de la membrane cellulaire. Plusieurs méthodes in vitro pour la modélisation de réparation de membrane ont été conçus. Une stratégie implique une lésion mécanique, qui peut être facilitée par la cellule gratter avec un lame pipette/chirurgie/rasoir ou en faisant rouler les billes de verre sur les cellules16. Toutefois, ce type de lésion mécanique génère des lésions plus grandes et crée un haut degré de variation dans les lésions des cellules, aussi bien au sein et entre les cultures.
Une autre méthode de génération des plaies de la membrane est ablation laser par microscopie biphotonique. Contrairement à la microscopie confocal laser traditionnel qui emploie l’excitation monophotonique, le deux photons laser utilise simultanément deux photons de longueur d’onde, faible consommation d’énergie pour faciliter l’excitation d’un électron à haute énergie17. Ce processus non linéaire aboutit à excitation exclusivement dans le plan focal et non pas suivant le trajet de la lumière toute17 (Figure 1). Cela réduit l’excitation volume contribue à réduire le photovieillissement lors de l’imagerie de cellules vivantes18,19. Les chercheurs sont donc en mesure de générer des lésions précises dans la membrane cellulaire et moniteur membrane rescellage en temps réel en utilisant des colorants fluorescents et en observant les changements dans l’intensité de fluorescence, les ruptures de la membrane cellulaire, puis rescellages.
Cette approche a été utilisée à plusieurs reprises pour étudier la membrane blessant in vitro et in vivo et dans la cellule plusieurs types20,21. Par exemple, membrane réparer les défauts de fibroblastes et de myotubes, dérivés de dysferlinopathy, les patients ont été évalués à l’aide de cette technique22,23. Également, les fibres musculaires simples isolés de souris ont été utilisées pour contrôler réparation patch formation13,24,25. La circulation des protéines fluorescent étiquetées peut également être observée lors de la réparation de la membrane en fibres musculaires simples9. En outre, le processus de réparation du sarcolemme, suite à deux photons laser blessant dans des embryons de poisson-zèbre s’observe en temps réel en vivo26.
Dans cet article, nous décrivons une méthode d’évaluation dynamique de réparation de membrane cellulaire dans les fibroblastes en utilisant deux photons laser blessant, bien que cette méthodologie peut être appliquée à différents types de cellules dans le but de quantifier la membrane plasmique rescellage capacité in vitro. Dans cette méthode, les cellules sont incubées avec FM4-64, un colorant lipophile, cellule-imperméable qui rapidement produit une fluorescence tel qu’il se lie à négativement chargé des phospholipides dans le cytoplasme en entrant dans la cellule par l’intermédiaire de la lésion de la membrane (Figure 2& 3). quantification de la fluorescence de colorant adjacente à la lésion de la membrane permet de contrôler le temps qu’il faut pour la membrane de la cellule à se refermer. Pour illustrer l’utilité de cette méthode, nous utilisons dysferlinopathy patient fibroblastes transfectées avec les plasmides de conjugaison GFP pleine longueur dysferline (DYSF) pour évaluer le sauvetage de réparation de la membrane cellulaire.
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Protocol
Cellules fibroblastiques humaines utilisées dans cette étude ont été utilisés avec l’approbation de la Commission d’éthique humaine de la faculté de médecine et de dentisterie de l’Université de l’Alberta.
1. la transfection des cellules avec le plasmide DYSF pleine longueur
- Cellules fibroblastes en culture dans un flacon de T225 contenant 40 mL de milieux de culture - Eagle modifié (DMEM) de 36 mL Dulbecco, 4 mL de sérum fœtal (SVF) et 20 µL de pénicilline/streptomycine (P/S) - dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
Remarque : Les cellules doivent être cultivés à environ 70-80 % confluence et ne puissent pas devenir complètement confluentes. - Pour préparer des cellules pour l’amorçage, rincer les cellules avec 40 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois, puis ajouter 5 mL de 0.05 % trypsine pour détacher les cellules. Retourner les cellules à 37 ° C CO2 incubateur et incuber les cellules pendant 5 min.
- Lorsque les cellules sont complètement détachés, ajouter 40 mL de milieux de culture pour arrêter la réaction de la trypsine.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou une autre cellule, dispositif de comptage.
- Graine 2 mL de cellules à 1 x 105 cellules/mL en boîtes de fond en verre enduit de collagène de 35 mm. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
Remarque : Les cellules doivent être environ 50-60 % anastomosé le lendemain. - Retirez le support de croissance et remplacez-le par 2 mL de médias privés de sérum (milieux de culture sans FBS).
- Transfecter les cellules avec le plasmide dysferline pleine longueur à l’aide de lipotransfection.
- Préparer 150 µL des médias privés de sérum dans un tube de 1,5 mL (un tube pour chaque plat à transfecter).
- Ajouter 3 µL de réactif de transfection dans chaque tube de 1,5 mL contenant des médias privés de sérum. Incuber-il au moins 5 min à température ambiante.
- Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajoutez 175 µL des médias privés de sérum et 3,5 µg d’ADN plasmidique.
Remarque : Multipliez les montants ci-dessus pour chaque plat supplémentaire à transfecter. - Mélanger 150 µL de milieux contenant l’ADN de plasmide dans un tube avec 150 µL de médias privés de sérum et réactif de transfection. Il incuber pendant 20 min à température ambiante.
- Répartir uniformément 300 µL des médias avec le réactif de plasmide et transfection dans le plat. Incuber les plats pendant 24 h dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
- Remplacer les médias avec des milieux de culture fraîche contenant du sérum et il incuber pendant 24 h supplémentaires dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
2. préparation des cellules pour dosage blessant deux photons
- Retirez le support de pipetage et rincer les cellules une fois avec 1 mL d’une solution de Tyrode, puis ajouter 1 mL de solution de Tyrode frais contenant 1 µL de 2,5 mM FM 4-64 colorant.
Remarque : La concentration finale de colorant 4-64 FM est de 2,5 µM. - Si l’évaluation de la réparation de la membrane dans un milieu appauvri en calcium est souhaitée, rincer les cellules avec 1 mL de PBS et puis ajouter 1 mL de PBS contenant 1 mM EGTA.
Remarque : PBS qui provoquerait les cellules à se détacher au fil du temps, le blessant dosage doit être établie dès que possible.
3. deux photons laser blessant dosage
- À l’aide d’un microscope confocal inversé et le programme associé logiciels, créer une cible de 0,2 µm x 2 µm et placez-le au bord de la membrane cellulaire, afin que la ligne cible chevauche et se trouve perpendiculaire à la direction de la membrane cellulaire (Figure 2).
- Utiliser par un laser HeNe 543 nm pour exciter le signal FM colorant et définir la plage de détection pour 600-760 nm. Utiliser un laser à Argon 488 nm pour exciter signal GFP (Figure 4) et définir la plage de détection de 500 à 550 nm.
- Créer une série de temps de 5 min d’analyses séquentielles image, imagerie de cellules toutes les 5 s.
- Pour générer une lésion de la membrane, les cellules d’eau de Javel à l’aide d’un laser à deux photons 820 nm, à l’aide de 15 % la valeur laser puissance avec 10 itérations et cellules 25 s d’eau de Javel après le début de la série temporelle.
- Afin de quantifier FM fluorescence colorant 4-64, utilisez le logiciel pour dessiner un 6 µm x 6 µm région d’intérêt (ROI) et placez-le adjacent à l’emplacement des blessure et au sein de la cellule (Figure 3).
Remarque : Éviter les zones d’échantillonnage de sursaturation de pixel en utilisant la fonction « Indicateur de gamme » dans le logiciel - dans la présente demande, pixels rouges représentent les pixels sursaturées. Exporter les valeurs brutes de fluorescence dans un chiffrier électronique pour l’analyse statistique. - Calculer les valeurs de la fluorescence relative pour chaque point dans le temps en soustrayant la valeur background (fluorescence moyenne valeur de points avant la membrane blessant) et en divisant l’augmentation nette de la fluorescence de valeur à t = 0 (Figure 5, 6) .
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Representative Results
Les fibroblastes humains en bonne santé, fibroblastes de patients non traités dysferlinopathy et patients fibroblastes transfectées avec un plasmide contenant la séquence de la dysferline pleine longueur ont été soumis à deux photons laser blessant pour évaluer la membrane rescellage capacité en temps réel. Cellules de fibroblaste humain sain affichent faibles niveaux d’activation de fluorescence FM 4-64 après laser blessant et de fibroblastes de patients non traités présentaient un haut degré d’intensité de la fluorescence relative après une blessure (Figure 5& 6 ). Cellules de patients qui ont été transfectées avec les plasmides dysferline pleine longueur a montré FM relative réduite 4-64 intensité de la fluorescence par rapport aux témoins de patients non traités et étaient comparable aux valeurs de fluorescence observées dans le contrôle sain (Figure 5& 6).
Figure 1 . Un photon par rapport à la microscopie biphotonique. Dans un système traditionnel de microscope un photon, un photon unique de haute énergie (UV ou spectre visible) est utilisé pour exciter un fluorophore (A). Dans un système à deux photons, deux photons de faible énergie (proche infrarouge) servent à exciter un fluorophore (B). Représenté dans les cylindres est le signal de fluorescence généré dans le plan focal, démontrant comment le système de deux photons laser peut se concentrer à excitation légère à dans une région spécifique (B) et exclure léger d’out-of-focus planes (A). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Placer une cible à la membrane cellulaire. À l’aide de logiciels, une cible de µm de 0,2 µm x 2 est dessinée et placée qui se chevauchent et perpendiculairement à la membrane cellulaire. La flèche indique la cible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Signal de fluorescence du colorant FM telle qu’elle s’infiltre dans la cellule par le biais de la rupture des membranes. Comme les ruptures de la membrane cellulaire, lipophiles FM 4-64 colorant s’infiltre dans la cellule et émet une fluorescence car elle lie la charge négative des phospholipides dans le cytoplasme. À l’aide de logiciels, une région d’intérêt (ROI) peut être étiré (boîte blanche) et valeurs de fluorescence dans la boîte peuvent être utilisés pour calculer les changements de fluorescence relative au sein de la cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Signal de fluorescence de GFP-conjugués du plasmide DYSF. Après transfection de plasmide, cellules de fibroblaste patients expriment la protéine pleine longueur de DYSF. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Quantification de la fluorescence au fil du temps. Fluorescence de valeurs calculées par un logiciel informatique de dans le retour sur investissement peut être utilisées pour déterminer la fluorescence relative change au fil du temps pour chaque groupe de traitement. La flèche indique le temps de l’ablation laser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Changement de fluorescence relative au fil du temps. Les valeurs de fluorescence relative (RF) pour chaque point dans le temps sont calculés en soustrayant la valeur de fluorescence de fond (calculée comme la moyenne des valeurs de la porté avant membrane blessant fluorescence) les valeurs de fluorescence donnée (Signal Intensité - fond = ΔF) et divisant le net augmenter (ΔF) par la valeur de fluorescence à t = 0 (F0). Par conséquent, RF = ΔF/F0. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Deux photons laser blessant de la membrane cellulaire est une technique précise et polyvalente pour évaluer la dynamique de la membrane rescellage in vitro. Dans cet article, nous avons décrit un protocole pour déterminer la membrane de la cellule rescellement de capacité dans les cellules de patients dysferlinopathy en utilisant le deux photons laser blessant dosage. Nos résultats montrent que les patients cellules dysferlinopathy sont défectueuses dans la membrane cellulaire de réapposition de sceau, qui est conforme aux conclusions tirées par d’autres chercheurs et qui souligne davantage les similitudes frappantes dans la membrane de la cellule réapposition de sceau sur la dynamique entre le muscle et types de cellules non musculaires3,11,15,22. Nous avons également observé que patients cellules transfectés avec un plasmide contenant la séquence de la dysferline pleine longueur ont été sauvés de leur membrane défectueuse rescellage phénotype, démontrant que ce plasmide dysferline pleine longueur peut sauver phénotype dans non musculaires types de cellules aussi bien que dans le muscle27.
Ensemble, nos résultats renforcent la faisabilité et la fiabilité du test blessant deux photons membrane comme un étalon-or en mesurant cell membrane fermeture capacité in vitro. Toutefois, le coût et la disponibilité associée à la microscopie biphotonique pourraient être un facteur pour certains groupes de recherche qui cherchent à utiliser la membrane de deux photons blessant essai limitatif potentiel. En outre, notre programme d’installation utilise un microscope confocal inversé, qui est bien adapté aux travaux in vitro , mais peut être moins approprié pour l’imagerie in vivo .
Il est important de noter que la précision de l’alignement de deux photons laser est essentielle à la réussite de la technique. Dans notre expérience, dépannage de l’alignement laser a été le plus commun problème rencontré. Autres questions qui pourraient affecter la capacité de marquer hits avec succès au cours de laser blessant incluent la mise à niveau du plat fond en verre sur la scène, ainsi que l’orientation des cellules dans la solution.
L’essai est applicable aux études actuelles et futures des états pathologiques dans lequel l’intégrité membranaire de la cellule ou rescellage est perturbé et l’efficacité des thérapies, comme la thérapie génique et antisense oligonucleotide thérapie, qui bénéficierait d’avoir un dosage efficace pour caractériser la dynamique membranaire afin que de nouvelles options thérapeutiques peuvent être explorées28,29.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Université de l’Alberta Faculté de médecine et dentisterie, les amis de Garrett Cumming Président fonds de recherche, HM Toupin neurologiques Science Research Chair Fund, dystrophie musculaire Canada, Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), voyage de Jesse - la Fondation pour la génétique et thérapie cellulaire, les femmes et Health Research Institute enfants (WCHRI), et Alberta Innovates Health Solutions (AIHS ).
Nous tenons à remercier le Dr Steven Laval pour nous alimenter avec le plasmide dysferline pleine longueur. Nous tenons également à remercier le Dr Katsuya Miyake pour des conseils techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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