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Immunology and Infection

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

doi: 10.3791/56999 Published: January 2, 2018

Summary

Zellmembran Verwundung über zwei-Photonen-Laser ist eine weit verbreitete Methode für die Bewertung der Membran Wiederverschließen Fähigkeit und kann auf mehrere Zelltypen angewendet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- live-Aufnahmen von Membran Wiederverschließen in Dysferlinopathie Patientenzellen nach zwei-Photonen-Laser-Ablation.

Abstract

Zahlreichen pathophysiologische Beleidigungen können Zellmembranen schädigen und Verbindung mit angeborenen Defekten in Zellmembran Reparatur oder Integrität, können zu Krankheit führen. Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die umgebenden Zellmembran Reparatur ist daher ein wichtiges Ziel für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Erkrankungen, die mit dysfunktionalen Zellmembran Dynamik. Viele in Vitro und in Vivo Studien zum Ziel zu verstehen, Zellmembran Wiederverschließen Krankheit Kontexten nutzen zwei-Photonen-Laser-Ablation als Standard für die Bestimmung der funktionellen Ergebnisse nach experimentellen Behandlungen. In diesem Assay unterliegen Zellmembranen Verwundung mit einem zwei-Photonen-Laser, wodurch die Zellmembran zu Bruch und fluoreszierenden Farbstoff in die Zelle einzudringen. Die Intensität der Fluoreszenz in der Zelle kann dann überwacht werden, um die Fähigkeit der Zelle zu verschließen sich quantifizieren. Gibt es mehrere alternative Methoden für die Beurteilung der Zellmembran als Reaktion auf Verletzungen, als auch große Unterschiede in der zwei-Photonen-Laser Verwundung Ansatz selbst, daher würde ein einheitliches Modell der Zelle Verwundung nutzbringend zu verringern dienen der Unterschiede zwischen den beiden Methoden. In diesem Artikel beschreiben wir einen einfache zwei-Photonen-Laser Verwundung Protokoll für die Beurteilung der Zellmembran Reparatur in Vitro in beide gesund und Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten, Zellen mit oder ohne ein in voller Länge Dysferlin-Plasmid transfiziert.

Introduction

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Die Zellmembran der eukaryotischen Zellen besteht aus einer Doppelschicht Protein besetzte Phospholipide, die definiert der Intra-/extrazellulären Umgebung der Zelle und ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der zelluläre Homöostase und Zelle überleben. Zellmembran Verletzungen infolge mechanischer oder chemischer Beleidigungen sind an der Tagesordnung in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten, einschließlich Skelett- und Herzmuskulatur, Magen und Lunge Zellen1,2,3,4. Neben Verletzungen konsequente tägliche physiologische Funktion können Zellmembranen auch durch ökologische Beleidigungen, bakterielle Toxine und ischämische Reperfusion5beschädigt werden. Brüche in der Zellmembran verschließen führt zu einem unregulierten Zustrom von extrazellulären Ca2 +- zusammen mit anderen potentiell toxischen extrazellulären Komponenten - in die Zelle auslösen nachgeschalteter Signalkaskaden, die schnell in Zelle führen kann Tod,1,4,5,6.

Bisher gab es mehrere vorgeschlagenen Modelle für Membran-Reparatur in den Zellen. Je nach Größe und Art der Membran Ruptur können verschiedene Reparaturmechanismen aktiviert werden. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, Zellmembranen lateral Flow oder Protein um kleine Störungen beheben Verstopfung nutzen kann (< 1 nm). Die laterale Fusion-Modell schlägt vor, dass Membran Brüche durch die seitliche Einstellung des Dysferlin-haltigen schnell geflickt sind Membran7, während das Protein Verstopfung Modell schlägt vor, dass kleine Perforationen durch Protein Aggregationen geflickt werden (meist Polymerasen) 8. dagegen größere Membran Läsionen auslösen Ca2 +-abhängige, Dysferlin-vermittelten Vesicle Fusion und Bildung eines Reparatur-Patch. In der Reparatur-Patch-Modell löst ein schnelle Ca2 + Zustrom in die Zelle die Rekrutierung von mehrere Proteine (Dysferlin Polymerasen, Mitsugumin-53 und EDH Proteine) bilden ein komplexes oder "Patch", zusammen mit einer Fusion von intrazellulären Vesikeln oder Lysosomen an der Stelle der Membran beschädigt werden4,9,10,11,12. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Modelle nicht notwendigerweise gegenseitig ausschließen sind und in Konzert funktionieren, Membran-Reparatur zu erleichtern. Nichtbeachtung der Zellmembran Schäden ordnungsgemäß zu verschließen ist verbunden mit mehreren Krankheitszuständen, einschließlich Muskeldystrophie (Dysferlinopathie - einschließlich Miyoshi Myopathie, Gliedmaßen-Gürtel Muskeldystrophie Typ IIB und distalen Myopathie mit vorderen tibiale einsetzen) 13, Kardiomyopathie14und Chediak-Higashi-Syndrom (CHS)15.

In Anbetracht, dass richtige Zellmembran Integrität und Wiederverschließen spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, ein tieferes Verständnis für die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Zellmembran Reparatur nützlich bei der Suche nach neue therapeutische Strategien wäre. Deshalb ist es notwendig, geeignete experimentelle Techniken zur Überwachung der Kinetics und bewerten die Fähigkeit der Zellmembran Reparatur zu besitzen. Mehrere in-vitro- Methoden zur Modellierung von Membran-Reparatur sind entworfen worden. Eine Strategie beinhaltet die mechanische Verletzungen, die durch die Zelle zu kratzen, mit einer Pipette/chirurgische Messer/Rasiermesser oder durch die Zellen16Glasperlen überrollen erleichtert werden kann. Jedoch diese Art von mechanischen Verletzungen erzeugt größere Läsionen, und schafft ein hohes Maß an Variation Zelle Verletzung, sowohl innerhalb als auch zwischen den Kulturen.

Eine weitere Methode zur Generierung von Membran Wunden ist Laser-Ablation durch zwei-Photonen-Mikroskopie. Im Gegensatz zu traditionellen konfokale Lasermikroskopie, das einzelne Photon Erregung beschäftigt, nutzt die zwei-Photonen-Laser gleichzeitig zwei langwellige, Niedrigenergie-Photonen, um die Anregung einer hochenergetischen Elektronen17zu erleichtern. Diese nichtlinearen Prozess führt zu Erregung ausschließlich in der Brennebene und nicht entlang der gesamten Lichtweg17 (Abbildung 1). Dies reduziert Erregung Volumen hilft lichtbedingten minimieren beim lebenden Zellen18,19abbilden. Forscher sind daher in der Lage, präzise Läsionen in der Zellmembran und Monitor Membran Wiederverschließen in Echtzeit durch die Verwendung von fluoreszierender Farbstoffen und Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität als die Zellmembran Brüche und dann Sicherheitsventilen zu generieren.

Dieser Ansatz wurde wiederholt verwendet, um die Membran Verwundung in Vitro und in Vivo zu untersuchen und mehrere Zelle eingibt20,21. Z. B. Membran reparieren defekte in Fibroblasten und Myotubes, abgeleitet von Dysferlinopathie, die Patienten wurden anhand dieser Technik22,23. Darüber hinaus wurden einzelne Muskelfasern von Mäusen isoliert verwendet, um Reparatur Patch Bildung13,24,25zu überwachen. Die Bewegung der Gewebekulturen tagged Proteine kann auch während der Reparatur der Membran in einzelnen Muskelfasern9beobachtet werden. Darüber hinaus kann der Prozess der sarcolemmal Reparatur nach zwei-Photonen-Laser Verwundung in den Zebrafish Embryos in Echtzeit in Vivo26beobachtet werden.

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methodik für die Bewertung der Zellmembran Reparatur Dynamik in Fibroblasten mit zwei-Photonen-Laser verletzt wurden, obwohl diese Methodik zu verschiedenen Zelltypen zur Quantifizierung der Plasmamembran Wiederverschließen Fähigkeit angewendet werden können in Vitro. Bei dieser Methode werden mit FM4-64 Zellen inkubiert, ein lipophiler, Zelle-undurchlässigen Farbstoff, der schnell fluoresziert wie es an negativ bindet aufgeladen Phospholipide im Zytoplasma beim Eintritt in der Zelle durch die Membran-Läsion (Abbildung 2& 3). Quantifizierung der Farbstoff Fluoreszenz angrenzend an die Membran Läsion ermöglicht eine Überwachung der Zeit, die für die Zellmembran zu selbst zu verschließen. Um das Dienstprogramm dieser Methode zu veranschaulichen, verwenden wir Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten transfiziert mit GFP konjugiert in voller Länge Dysferlin (DYSF) Plasmide um die Rettung der Zellmembran Reparatur zu beurteilen.

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Protocol

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In dieser Studie verwendete menschlichen Fibroblastenzellen wurden mit Zustimmung der menschlichen Ethik-Kommission der Fakultät für Medizin und Zahnmedizin an der Universität von Alberta eingesetzt.

1. die Transfektion von Zellen mit durchgehender DYSF plasmid

  1. Kultur-Fibroblastenzellen in einem T225 Kolben mit 40 mL Wachstumsmedien - 36 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), 4 mL des fetalen bovine Serum (FBS) und 20 µL von Penicillin/Streptomycin (P/S) - in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C.
    Hinweis: Zellen kultiviert, ca. 70-80 % Konfluenz soll und darf nicht vollständig konfluierende geworden.
  2. Um Zellen für die Saat vorzubereiten, spülen Sie die Zellen mit 40 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, dann fügen Sie 5 mL 0,05 % Trypsin, die Zellen zu lösen. Rückkehr der Zellen auf 37 ° C CO2 Inkubator und die Zellen für 5 min inkubieren.
    1. Wenn die Zellen vollständig getrennt sind, fügen Sie 40 mL Wachstumsmedien, die Trypsin-Reaktion zu stoppen.
    2. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer oder einer anderen Zelle Zähleinrichtung.
  3. Samen Sie 2 mL der Zellen bei 1 x 105 Zellen/mL in 35 mm Kollagen beschichtet Glasboden Gerichte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in eine CO2 Inkubator bei 37 ° c
    Hinweis: Zellen sollte ca. 50-60 % Zusammenfluss am nächsten Tag sein.
  4. Entfernen Sie die Wachstumsmedien zu und ersetzen Sie es mit 2 mL Serum beraubt Medien (Wachstum ohne FBS).
  5. Transfizieren Sie Zellen mit Full-length Dysferlin-Plasmid mit Lipotransfection.
    1. Bereiten Sie 150 µL Serum beraubt Medien in einem 1,5 mL Röhrchen (eine Röhre für jedes Gericht zu transfiziert werden).
    2. Fügen Sie 3 µL Transfection Reagens zu je 1,5 mL Röhrchen mit Serum-beraubt Medien hinzu. Inkubieren Sie es mindestens 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Fügen Sie in eine separate 1,5 mL-Tube 175 µL Serum beraubt Medien und 3,5 µg Plasmid DNA.
      Hinweis: Multiplizieren Sie die oben genannten Beträge für jedes weitere Gericht zu transfiziert werden.
    4. 150 µL Medium mit Plasmid DNA in ein Rohr mit 150 µL Serum beraubt Medien und Transfection Reagens zu kombinieren. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Verteilen Sie gleichmäßig 300 µL der Medien mit Plasmid und Transfection Reagens über das Gericht. Inkubieren Sie die Gerichte für 24 h in einem CO2 Inkubator bei 37 ° c
  6. Ersetzen Sie die Medien mit frischen Wachstumsmedien mit Serum und weitere 24 h in einem CO2 Inkubator bei 37 ° c inkubieren

2. Vorbereitung der Zellen für verletzte zwei-Photonen-assay

  1. Entfernen Sie das Medium durch pipettieren und die Zellen einmal mit 1 mL der Tyrode Lösung spülen, dann fügen Sie 1 mL frisch Tyrode-Lösung mit 1 µL 2,5 mM FM 4-64 Farbstoff.
    Hinweis: Die Endkonzentration von FM 4-64 Farbstoff ist 2,5 µM.
  2. Bewertung der Membran-Reparatur in einer Kalzium-abgereicherte Umgebung gewünscht, spülen Sie Zellen mit 1 mL PBS und fügen Sie 1 mL PBS mit 1 mM EGTA.
    Hinweis: Als PBS die Zellen dadurch, die im Laufe der Zeit zu lösen, sollte der verletzte Test so schnell wie möglich abgeschlossen werden.

3. zwei-Photonen-laser verletzte assay

  1. Mit einer invertierten confocal Mikroskop und zugeordnete Programmsoftware, erstellen Sie ein 0,2 µm 2 µm Ziel und am Rande der Zellmembran zu platzieren Sie, so dass die Ziellinie überlappt und senkrecht zur Richtung der Zellmembran (Abbildung 2 liegt).
  2. Verwenden Sie 543-nm-HeNe-Laser zum FM Farbstoff Signal zu begeistern und Festlegen des Erfassungsbereichs für 600-760 nm. Benutzen Sie einen 488 nm Argonlaser zu begeistern GFP Signal (Abbildung 4) und legen Sie den Erfassungsbereich für 500-550 nm.
    1. 5 min Zeit mehrere sequenzielle Bild-Scans, imaging-Zellen erstellen, alle 5 s.
    2. Um eine Membran-Läsion zu generieren, Bleichmittel Zellen mit einem zwei-Photonen-Laser setzen auf 820 nm, mit 15 % Laserleistung mit 10 Wiederholungen und bleichen Zellen 25 s nach dem Beginn der Zeitreihe.
  3. Zur Quantifizierung FM 4-64 Farbstoff Fluoreszenz verwenden Sie die Software auf einer 6 µm X 6-µm-Region of Interest (ROI) zu ziehen und platzieren Sie es neben an die verletzte Stelle und innerhalb der Zelle (Abbildung 3).
    Hinweis: Vermeiden Sie Probenahme Bereiche der Pixel Übersättigung mit der "Range Indicator" Funktion in der Software - in dieser Anwendung, rote Pixel repräsentieren übersättigten Pixel. Exportieren Sie roh Fluoreszenz-Werte in eine elektronische Tabelle für statistische Analysen.
  4. Relative Fluoreszenz-Werte für jeden Zeitpunkt durch Subtrahieren der Background-Wert (Mittelwert Fluoreszenz Wert der Zeitpunkte vor Verwundung Membran) berechnen und teilt die Netto-Zunahme durch die Fluoreszenz value-at-t = 0 (Abbildung 5, 6) .

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Representative Results

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Gesunde menschliche Fibroblasten, unbehandelten Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten und Patienten Fibroblasten transfiziert mit einem Plasmid mit die Full-length Dysferlin-Sequenz ausgesetzt waren zwei-Photonen-Laser Verwundung Membran Wiederverschließen Fähigkeit zu bewerten in Echtzeit. Gesunde menschliche Fibroblastenzellen angezeigt niedrigen Niveau von FM 4-64 Fluoreszenz Aktivierung nach Laser Verwundung und unbehandelten Patienten Fibroblasten zeigte ein hohes Maß an relativen Fluoreszenzintensität nach Verletzung (Abbildung 5& 6 ). Patienten Zellen, die mit Full-length Dysferlin-Plasmid transfiziert wurden zeigten geringere relative FM 4-64 Fluoreszenzintensität im Vergleich zu unbehandelten Patienten Kontrollen und waren vergleichbar mit Fluoreszenz-Werte beobachtet in der gesunden Kontrolle (Abbildung 5& 6).

Figure 1
Abbildung 1 . Ein Photon im Vergleich zu zwei-Photonen-Mikroskopie. In einem traditionellen ein-Photonen Mikroskopsystem wird ein einzelnes Hochenergie Photon (UV oder sichtbaren Spektrums) verwendet, um einen Fluorophor (A) zu begeistern. In einem zwei-Photonen-System sind zwei energieärmeren Photonen (nahes Infrarot) verwendet, um einen Fluorophor (B) zu begeistern. Dargestellt in den Zylindern ist das Fluoreszenzsignal generiert in der Brennebene, demonstrieren, wie die zwei-Photonen-Laser-System Erregung konzentrieren kann leicht, um innerhalb einer bestimmten Region (B) und leichte ausschließen von Out-of-Focus Flugzeuge (A). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Platzieren ein Ziel an der Zellmembran. Mit Software ist ein 0,2 µm 2 µm Ziel gezeichnet und platziert sich überschneidenden und senkrecht an der Zellmembran. Der Pfeil zeigt das Ziel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Fluoreszenzsignal von FM Farbstoff als es dringt in die Zelle durch die Membran Bruch. Als die Zellmembran Brüche lipophile FM 4-64 Farbstoff dringt in die Zelle und fluoresziert es negativ geladene Phospholipide im Zytoplasma bindet. Mit Software, eine Region of Interest (ROI) kann sein gezeichnet (weißes Feld) und Fluoreszenz-Werte innerhalb der Box können verwendet werden, um relative Fluoreszenz Änderungen innerhalb der Zelle zu berechnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Fluoreszenzsignal von GFP-konjugiert in voller Länge DYSF Plasmid. Nach Plasmid Transfection ausdrücken Patienten Fibroblastenzellen in voller Länge DYSF Protein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Quantifizierung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit. Fluoreszenz-Werte berechnet, indem Computersoftware innerhalb der ROI können verwendet werden, um festzustellen, dass relative Fluoreszenz ändert sich im Laufe der Zeit für jede Behandlungsgruppe. Der Pfeil zeigt die Zeit der Laserablation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 . Änderung der relativen Fluoreszenz im Laufe der Zeit. Relative Fluoreszenz (RF) Werte für jeden Zeitpunkt errechnen sich durch Subtraktion den Hintergrundwert Fluoreszenz (berechnet als Mittelwert der Fluoreszenz-Werte aus der Zeitpunkte vor Verwundung Membran) von den gegebenen Fluoreszenz-Werten (Signal Intensität - Hintergrund = ΔF) und teilt das Netz zu erhöhen (ΔF) durch die Fluoreszenz-Wert bei t = 0 (F0). Daher, RF = ΔF/F0. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Zwei-Photonen-Laser Verwundung der Zellmembran ist eine genaue und vielseitige Technik für die Beurteilung der Dynamik der Membran Wiederverschließen in Vitro. In diesem Artikel beschriebenen wir ein Protokoll für die Bestimmung der Zellmembran Wiederverschließen Fähigkeit in Dysferlinopathie Patientenzellen mit dem zwei-Photonen-Laser Verwundung Assay. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Dysferlinopathie Patienten Zellen Defekt in Zellmembran Wiederverschließen, das steht im Einklang mit Ergebnissen von anderen Forschern und weitere highlights, die die auffallenden Ähnlichkeiten in Zellmembran Wiederverschließen Dynamik zwischen Muskel und nicht-Muskel Zelltypen3,11,15,22. Wir auch beobachtet, dass Patienten Zellen mit einem Plasmid mit dem Full-length Dysferlin-Sequenz transfiziert gerettet wurden, von ihrer defekten Membran Wiederverschließen Phänotyp, demonstrieren, dass Full-length Dysferlin-Plasmid Phänotyp in nicht-Muskel retten können Zelltypen sowie Muskel-27.

Unsere Ergebnisse verstärken zusammen, die Machbarkeit und Zuverlässigkeit des zwei-Photonen-Membran verletzte Assays wie ein Gold-Standard bei der Messung der Zell-Membran Wiederverschließen Fähigkeit in Vitro. Kosten und Verfügbarkeit verbunden mit zwei-Photonen-Mikroskopie könnte jedoch ein Potenzial begrenzender Faktor für einige Forschungsgruppen, die zwei-Photonen-Membran Verwundung Assay nutzen wollen. Darüber hinaus nutzt unser Setup eine invertierte confocal Mikroskop, die ist gut geeignet für in-vitro- Arbeit, aber möglicherweise weniger geeignet für in-Vivo Bildgebung.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Genauigkeit der zwei-Photonen-Laser-Ausrichtung entscheidend für den Erfolg der Technik ist. Nach unserer Erfahrung war der Laserausrichtung Fehlerbehebung das häufigste Problem gestoßen. Andere Themen, die die Fähigkeit, erfolgreiche Treffer während Laser Verwundung Gäste beeinträchtigen könnten gehören die Nivellierung der Glasboden Schale auf der Bühne, als auch die Ausrichtung der Zellen in Lösung.

Der Test gilt für aktuelle und zukünftige Studien zur Untersuchung von Krankheitszuständen, die in denen Zellmembran Integrität oder Wiederverschließen gestört ist und die Wirksamkeit von Therapien, wie Gentherapie und antisense-Oligonukleotid-basierte Therapie, die profitieren würden ein effektive Assay zur Charakterisierung Membran Dynamik, so dass neuartige Therapiemöglichkeiten erforscht von mit28,29.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Universität von Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, die Freunde von Garrett Cumming Stuhl Forschungsfonds, HM Toupin neurologische Forschung Stuhl Wissenschaftsfonds, muskulöse Dystrophie Kanada, Canada Foundation für Innovation (CFI) unterstützt, Alberta erweiterte Bildung und Technologie (AET), kanadische Institute der Gesundheitsforschung (CIHR), Jesse Reise - die Grundlage für gen und Zelltherapie, die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) und Alberta Health Solutions (AIHS erneuert ).

Wir möchten Dr. Steven Laval danken für die Bereitstellung von uns mit dem Full-length Dysferlin-Plasmid. Wir möchten auch Dr. Katsuya Miyake für technische Beratung bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

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References

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Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).More

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

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