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Immunology and Infection

सेल झिल्ली की मरंमत परख एक दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग

doi: 10.3791/56999 Published: January 2, 2018

Summary

कोशिका झिल्ली दो फोटॉन लेजर के माध्यम से घायल झिल्ली को सील करने की क्षमता का आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है और कई सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । यहां, हम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो dysferlinopathy रोगी कोशिकाओं में दो फोटॉन लेजर पृथक के बाद पुनः सील झिल्ली की लाइव-इमेजिंग ।

Abstract

कई pathophysiological अपमान कोशिका झिल्ली को नुकसान का कारण बन सकता है और, जब कोशिका झिल्ली की मरंमत या अखंडता में सहज दोषों के साथ युग्मित, रोग में परिणाम कर सकते हैं । अंतर्निहित आणविक कोशिका झिल्ली की मरंमत आसपास के तंत्र को समझना है, इसलिए, एक महत्वपूर्ण उद्देश्य रोग कोशिका झिल्ली गतिशीलता के साथ जुड़े रोगों के लिए उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए । कई विट्रो में और vivo अध्ययनों में कोशिका झिल्ली को समझने के उद्देश्य से विभिन्न रोग संदर्भों में पुनर्सील दो प्रयोगात्मक उपचार के बाद कार्यात्मक परिणामों का निर्धारण करने के लिए एक मानक के रूप में फोटॉन लेजर पृथक का उपयोग. इस परख में, कोशिका झिल्ली एक दो फोटॉन लेजर, जो कोशिका झिल्ली टूटना और फ्लोरोसेंट डाई सेल घुसपैठ करने के लिए कारण बनता है के साथ घायल करने के लिए अधीन हैं । कोशिका के भीतर प्रतिदीप्ति की तीव्रता तो कोशिका की क्षमता को फिर से सील करने की निगरानी की जा सकती है. चोट करने के लिए सेल झिल्ली प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए कई वैकल्पिक तरीके हैं, के रूप में अच्छी तरह से दो में महान भिन्नता-फोटॉन लेजर अपने दृष्टिकोण को घायल कर रहे हैं, इसलिए, सेल के एक एकल, एकीकृत मॉडल को कम करने के लिए लाभप्रद सेवा करेंगे घायल इन पद्धतियों के बीच भिंनता । इस अनुच्छेद में, हम दोनों स्वस्थ और dysferlinopathy रोगी fibroblast कोशिकाओं के साथ या एक पूर्ण लंबाई dysferlin प्लाज्मिड के बिना transfected में इन विट्रो में कोशिका झिल्ली की मरंमत का आकलन करने के लिए एक सरल दो फोटॉन लेजर घायल प्रोटोकॉल रूपरेखा ।

Introduction

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युकेरियोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली में प्रोटीन जड़ित फॉस्फोलिपिड की दोहरी परत होती है जो कोशिका के इंट्रा/extracellular वातावरण को परिभाषित करती है और सेलुलर homeostasis और सेल अस्तित्व को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । कोशिका झिल्ली यांत्रिक या रासायनिक अपमान से उत्पंन चोटों के कंकाल और हृदय की मांसपेशी, पेट सहित विभिंन स्तनधारी कोशिका प्रकार में आम हैं, और फेफड़ों की कोशिकाओं को1,2,3,4। दैनिक शारीरिक समारोह के फलस्वरूप चोटों के अलावा, कोशिका झिल्ली भी पर्यावरण अपमान से क्षतिग्रस्त हो सकता है, बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों, और कोरोनरी reperfusion5. कोशिका झिल्ली में टूटना करने के लिए विफलता extracellular Ca के एक अनियमित आमद की ओर जाता है2 +-अंय संभावित विषाक्त extracellular घटकों के साथ-कक्ष में, बहाव संकेत झरने जो जल्दी सेल में परिणाम कर सकते है ट्रिगर ृ1,4,5,6.

तिथि करने के लिए, वहां कोशिकाओं में झिल्ली की मरंमत के लिए कई प्रस्तावित मॉडल किया गया है । अलग मरंमत तंत्र झिल्ली टूटना के आकार और प्रकृति के आधार पर सक्रिय किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह सुझाव दिया है कि कोशिका झिल्ली पार्श्व प्रवाह या प्रोटीन कॉलेस्ट्रॉल का उपयोग करने के लिए छोटे व्यवधानों की मरंमत कर सकते है (& #60; 1 एनएम) । पार्श्व संलयन मॉडल का प्रस्ताव है कि झिल्ली टूटना तेजी से dysferlin-युक्त झिल्ली के पार्श्व भर्ती के माध्यम से सुधार कर रहे है7, जबकि प्रोटीन कॉलेस्ट्रॉल मॉडल पता चलता है कि छोटे छिद्रों प्रोटीन एकत्रीकरण के माध्यम से सुधार कर रहे है (ज्यादातर annexins) 8. इसके विपरीत, बड़ी झिल्ली घावों Ca2 +-निर्भर, dysferlin-मध्यस्थता पुटिका फ्यूजन और एक मरंमत पैच के गठन को ट्रिगर । मरंमत पैच मॉडल में, एक तेजी से Ca के सेल में2 + आमद एकाधिक प्रोटीन (dysferlin, annexins, mitsugumin-५३, और एध प्रोटीन) जो एक जटिल या "पैच" फार्म, intracellular के एक संलयन के साथ साथ की भर्ती चलाता है बुलबुले या झिल्ली क्षति के स्थल पर lysosomes4,9,10,11,12। यह ध्यान दें कि इन मॉडलों जरूरी पारस्परिक रूप से अनंय नहीं है और संगीत कार्यक्रम में काम करने के लिए झिल्ली की मरंमत की सुविधा हो सकती है महत्वपूर्ण है । ठीक से सील कोशिका झिल्ली क्षति करने के लिए विफलता पेशी dystrophy सहित कई रोग राज्यों के साथ जुड़ा हुआ है (dysferlinopathy-सहित Miyoshi मायोपथी, अंग-करधनी पेशी dystrophy प्रकार IIB, और पूर्वकाल मायोपथी शुरुआत के साथ बाहर का टिबियल) 13, cardiomyopathy14, और Chediak-हिगाशी सिंड्रोम (CHS)15.

यह देखते हुए कि उचित कोशिका झिल्ली अखंडता और फिर से सील स्वास्थ्य और रोग, कोशिका झिल्ली की मरंमत के अंतर्निहित आणविक तंत्र की गहरी समझ में इस तरह के एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए खोज में लाभप्रद होगा । इसलिए, कैनेटीक्स की निगरानी और कोशिका झिल्ली की मरंमत की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उचित प्रयोगात्मक तकनीक के अधिकारी के लिए आवश्यक है । कई विट्रो में मॉडलिंग झिल्ली की मरंमत के लिए तरीके डिजाइन किया गया है । एक रणनीति यांत्रिक चोट है, जो सेल के माध्यम से एक पिपेट/सर्जिकल ब्लेड/रेजर के साथ स्क्रैप या कोशिकाओं पर कांच मोती रोलिंग द्वारा सुविधा दी जा सकती है16। हालांकि, यांत्रिक चोट के इस प्रकार के बड़े घावों उत्पन्न करता है, और कोशिका की चोट में भिन्नता के एक उच्च डिग्री बनाता है, दोनों के भीतर और संस्कृतियों के बीच.

झिल्ली घाव पैदा करने की एक और विधि लेजर पृथक द्वारा दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी है । पारंपरिक लेजर फोकल माइक्रोस्कोपी के विपरीत है कि एकल फोटॉन उत्तेजना को रोजगार, दो फोटॉन लेजर एक साथ दो लंबी तरंग दैर्ध्य, कम ऊर्जा फोटॉनों का उपयोग करता है एक उच्च ऊर्जा इलेक्ट्रॉन के उत्तेजना की सुविधा17। इस गैर रेखीय प्रक्रिया उत्तेजना में विशेष रूप से फोकल विमान के भीतर और पूरे प्रकाश पथ17 (चित्रा 1) के साथ नहीं परिणाम । यह कम उत्तेजना मात्रा जब इमेजिंग लाइव सेल18,19धूप को कम करने में मदद करता है । शोधकर्ताओं इसलिए सेल झिल्ली में सटीक घावों को उत्पन्न करने और फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके और सेल झिल्ली टूटना के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन देख रही है और फिर फिर से सील कर के रूप में एक वास्तविक समय में फिर से सील झिल्ली की निगरानी कर रहे हैं ।

इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया गया है बार- इन विट्रो में और vivo में और एकाधिक सेल प्रकार20,21में घाव झिल्ली का अध्ययन । उदाहरण के लिए, fibroblasts और dysferlinopathy रोगियों से व्युत्पंन myotubes में झिल्ली की मरंमत दोष इस तकनीक का उपयोग कर22,23मूल्यांकन किया गया । इसके अलावा, एक मांसपेशी चूहों से अलग फाइबर मरंमत पैच गठन13,24,25की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया । फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के आंदोलन भी झिल्ली की मरंमत के दौरान एक मांसपेशी फाइबर9में देखा जा सकता है । इसके अलावा, दो-फोटॉन लेजर zebrafish भ्रूण में घायल sarcolemmal मरंमत की प्रक्रिया vivo26में वास्तविक समय में मनाया जा सकता है ।

इस अनुच्छेद में, हम fibroblasts में सेल झिल्ली की मरंमत की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक पद्धति रूपरेखा दो फोटॉन लेजर घायल का उपयोग कर, हालांकि इस पद्धति प्लाज्मा झिल्ली को सील करने की क्षमता को बढ़ाता है के प्रयोजन के लिए विभिंन प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता इन विट्रो में। इस विधि में, कोशिकाओं FM4-64 के साथ, एक lipophilic, कोशिका-अभेद्य डाई जो जल्दी fluoresces के रूप में यह झिल्ली घाव के माध्यम से सेल में प्रवेश करने पर फॉस्फोलिपिड के भीतर नकारात्मक कोशिका चार्ज करने के लिए बाइंड कर रहे हैं (चित्रा 2& #38; 3). ठहराव झिल्ली घाव से सटे डाई प्रतिदीप्ति की निगरानी के लिए समय है कि यह सेल झिल्ली के लिए खुद को फिर से सील करने के लिए लेता है की अनुमति देता है । इस विधि की उपयोगिता को उदाहरण करने के लिए, हम कोशिका झिल्ली की मरम्मत के बचाव का आकलन करने के लिए GFP-संयुग्मित पूर्ण लंबाई dysferlin (DYSF) plasmids के साथ dysferlinopathy रोगी fibroblasts transfected का उपयोग करते हैं ।

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Protocol

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मानव fibroblast इस अध्ययन में प्रयुक्त कोशिकाओं अलबर्टा विश्वविद्यालय में चिकित्सा और दंत चिकित्सा के संकाय की मानव नैतिकता समिति से अनुमोदन के साथ इस्तेमाल किया गया ।

1. पूर्ण लंबाई वाले कोशिकाओं की अभिकर्मक DYSF प्लाज्मिड

  1. एक T225 कुप्पी में कल्चर fibroblast कोशिकाएं जिसमें ग्रोथ मीडिया की ४० एमएल है-३६ एमएल Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM), (FBS) भ्रूण गोजातीय सीरम के 4 मिलीलीटर, और streptomycin (पी/एस) के 20 µ एल-37 डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में ।
    नोट: कोशिकाओं को लगभग 70-80% के लिए संस्कृति का प्रवाह किया जाना चाहिए और पूरी तरह से धाराप्रवाह बनने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए ।
  2. बोने के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) की ४० मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला दो बार, फिर कोशिकाओं को अलग करने के लिए ०.०५% trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c CO2 मशीन के लिए कोशिकाओं को लौटें और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    1. जब कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं, trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए वृद्धि मीडिया के ४० मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. किसी hemocytometer या किसी अन्य कक्ष की गणना डिवाइस का उपयोग करके कक्षों को गिनना.
  3. 1x10 में कोशिकाओं के बीज 2 मिलीलीटर5 कोशिकाओं/एमएल में ३५ mm कोलेजन-लेपित ग्लास-नीचे व्यंजन । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में रात भर कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: सेल अगले दिन लगभग 50-60% धाराप्रवाह होना चाहिए ।
  4. विकास मीडिया निकालें और यह सीरम के 2 मिलीलीटर-वंचित मीडिया (FBS के बिना विकास मीडिया) के साथ बदलें ।
  5. Transfect कोशिकाओं को पूर्ण लंबाई के साथ dysferlin प्लाज्मिड का उपयोग lipotransfection ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सीरम वंचित मीडिया के १५० µ एल तैयार (transfected होने के लिए प्रत्येक डिश के लिए एक ट्यूब) ।
    2. सीरम वंचित मीडिया युक्त प्रत्येक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए अभिकर्मक रिएजेंट के 3 µ एल जोड़ें । यह कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट की मशीन ।
    3. एक अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, सीरम वंचित मीडिया और ३.५ प्लाज्मिड डीएनए के µ जी के १७५ µ एल जोड़ें ।
      नोट: transfected होने के लिए प्रत्येक अतिरिक्त डिश के लिए उपरोक्त मात्रा को गुणा करें ।
    4. प्लाज्मिड डीएनए युक्त मीडिया के १५० µ एल का मिश्रण १५० सीरम के µ एल के साथ एक ट्यूब में-वंचित मीडिया और अभिकर्मक एजेंट । यह कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    5. समान रूप से पकवान भर प्लाज्मिड और अभिकर्मक रिएजेंट के साथ मीडिया के ३०० µ एल वितरित । 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में 24 ज के लिए व्यंजन की मशीन ।
  6. नए सिरे से वृद्धि सीरम युक्त मीडिया के साथ मीडिया की जगह और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए यह मशीन ।

2. दो फोटॉन घायल परख के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. pipetting द्वारा मीडिया को निकालें और Tyrode के समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं कुल्ला, तो २.५ mM एफएम 4-64 डाई के 1 µ एल युक्त ताजा Tyrode के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: एफएम 4-64 डाई के अंतिम एकाग्रता २.५ µ मीटर है ।
  2. एक कैल्शियम समाप्त वातावरण में झिल्ली की मरंमत का आकलन वांछित है, तो पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला कोशिकाओं और फिर 1 मिमी EGTA युक्त पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: के रूप में पंजाब के लिए समय के साथ अलग कोशिकाओं का कारण होगा, घायल परख के रूप में जल्दी संभव के रूप में पूरा किया जाना चाहिए ।

3. दो फोटॉन लेजर घायल परख

  1. एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप और जुड़े कार्यक्रम सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक ०.२ µm x 2 µm लक्ष्य बनाने के लिए और यह सेल झिल्ली के किनारे पर जगह इतनी है कि लक्ष्य लाइन ओवरलैप और सेल झिल्ली की दिशा में सीधा निहित है (चित्रा 2) ।
  2. एफएम डाई संकेत उत्तेजित और 600-760 एनएम के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए एक ५४३ एनएम HeNe लेजर का प्रयोग करें । एक ४८८ एनएम आर्गन लेजर का प्रयोग करें GFP संकेत उत्तेजित (चित्रा 4) और 500-550 एनएम के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित करते हैं ।
    1. अनुक्रमिक छवि स्कैन की 5 मिनट की समय श्रृंखला बनाएं, इमेजिंग कोशिकाओं हर 5 एस ।
    2. एक झिल्ली घाव उत्पन्न करने के लिए, ब्लीच कोशिकाओं एक दो फोटॉन लेजर ८२०-एनएम के लिए सेट का उपयोग कर, 10 पुनरावृत्तियों और ब्लीच कोशिकाओं के साथ 15% लेजर शक्ति का उपयोग कर समय श्रृंखला की शुरुआत के बाद 25 एस.
  3. एफएम 4-64 डाई प्रतिदीप्ति यों तो सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक 6 µm x 6 µm ब्याज की क्षेत्र (रॉय) आकर्षित और यह जगह जख्मी स्थान के बगल में और कोशिका के भीतर (चित्र 3) ।
    नोट: इस आवेदन में सॉफ्टवेयर में "रेंज संकेतक" समारोह का उपयोग करके पिक्सेल अधिक संतृप्ति के नमूना क्षेत्रों से बचें, लाल पिक्सल संतृप्त पिक्सल का प्रतिनिधित्व करते हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट में कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों को निर्यात करें ।
  4. पृष्ठभूमि मान (timepoints के प्रतिदीप्ति मान से पहले झिल्ली के घाव) को घटा कर प्रत्येक समय बिंदु के लिए सापेक्ष प्रतिदीप्ति मानों की गणना करें और शुद्ध वृद्धि को प्रतिदीप्ति मान द्वारा टी = 0 (चित्रा 5, 6) में विभाजित कर .

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Representative Results

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स्वस्थ मानव fibroblasts, गैर इलाज dysferlinopathy रोगी fibroblasts, और रोगी fibroblasts transfected युक्त एक प्लाज्मिड के साथ पूर्ण लंबाई dysferlin अनुक्रम के अधीन थे दो-फोटॉन लेजर घाव भरने की क्षमता का आकलन करने के लिए वास्तविक समय में । स्वस्थ मानव fibroblast कोशिकाओं एफएम 4-64 प्रतिदीप्ति सक्रियण के निम्न स्तर प्रदर्शित लेजर घायल और गैर इलाज रोगी fibroblasts चोट के बाद रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता के एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन (चित्रा 5& #38; 6 ). रोगी कोशिकाओं है कि पूर्ण लंबाई dysferlin प्लाज्मिड के साथ transfected थे कम सापेक्ष एफएम 4-64 प्रतिदीप्ति तीव्रता गैर के साथ तुलना में इलाज रोगी नियंत्रण दिखाया और प्रतिदीप्ति मूल्यों के साथ तुलनीय थे स्वस्थ नियंत्रण में मनाया (चित्रा 5& #38; 6).

Figure 1
चित्र 1 . एक-दो बनाम फोटॉन-फोटॉन माइक्रोस्कोपी. एक पारंपरिक एक फोटॉन माइक्रोस्कोप प्रणाली में, एक एकल उच्च ऊर्जा फोटॉन (यूवी या दिखाई स्पेक्ट्रम) एक fluorophore उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है (एक). एक दो फोटॉन प्रणाली में, दो कम ऊर्जा फोटॉनों (अवरक्त के पास) एक fluorophore (बी) उत्तेजित करने के लिए उपयोग किया जाता है । सिलिंडरों के भीतर दर्शाया गया है प्रतिदीप्ति फोकल विमान में उत्पंन संकेत है, का प्रदर्शन कैसे दो फोटॉन लेजर प्रणाली एक विशिष्ट क्षेत्र के भीतर उत्तेजना प्रकाश ध्यान केंद्रित कर सकते है (ख) और बाहर से प्रकाश के बाहर ध्यान विमानों (ए) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . सेल झिल्ली पर एक लक्ष्य रखकर । सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक ०.२ µm x 2 µm लक्ष्य तैयार किया है और अतिव्यापी और सीधा कोशिका झिल्ली के लिए रखा है । तीर लक्ष्य को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . प्रतिदीप्ति एफएम डाई से संकेत के रूप में यह झिल्ली टूटना के माध्यम से सेल घुसपैठ । कोशिका झिल्ली टूटना के रूप में, lipophilic एफएम 4-64 डाई कोशिका और fluoresces घुसपैठ के रूप में यह नकारात्मक-कोशिका के भीतर आरोप लगाया फॉस्फोलिपिड बांधता है । सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, ब्याज का एक क्षेत्र (ROI) आरेखित किया जा सकता है (सफेद बॉक्स) और बॉक्स के भीतर प्रतिदीप्ति मानों का उपयोग कक्ष में सापेक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तनों की गणना करने के लिए किया जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . प्रतिदीप्ति संकेत पासून GFP-संयुग्मित पूर्ण-तिची DYSF प्लाज्मिड. म् प्लाज्मिड अभिकर्मक, रोगी fibroblast कोशिकाओं व्यक्ती पूर्ण-तिची DYSF प्रोटीन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . समय के साथ प्रतिदीप्ति की ठहराव. प्रतिदीप्ति मान कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर द्वारा ROI के भीतर से परिकलित प्रत्येक उपचार समूह के लिए समय के साथ सापेक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तन निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । तीर लेजर पृथक के समय को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . समय के साथ सापेक्षिक प्रतिदीप्ति में परिवर्तन । सापेक्ष प्रतिदीप्ति (आरएफ) मान प्रत्येक समय बिंदु के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मान (प्रतिदीप्ति मान के माध्य के रूप में timepoints से पहले झिल्ली घायल) से दिए गए प्रतिदीप्ति मान (परिकलित के रूप में गणना) द्वारा परिकलित हैं (संकेत तीव्रता-पृष्ठभूमि = ΔF) और विभाजन शुद्ध वृद्धि (ΔF) द्वारा प्रतिदीप्ति मान पर t = 0 (F0) । इसलिए, ऊजा = ΔF/F0 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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कोशिका झिल्ली के घायल दो-फोटॉन लेजर एक सटीक और बहुमुखी तकनीक है झिल्ली की गतिशीलता को फिर से सील इन विट्रो मेंका आकलन करने के लिए । इस अनुच्छेद में, हम सेल झिल्ली dysferlinopathy रोगी कोशिकाओं में दो फोटॉन लेजर घायल परख का उपयोग करने की क्षमता को सील निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । हमारे परिणामों से पता चलता है कि dysferlinopathy रोगी कोशिकाओं कोशिका झिल्ली फिर से सील है, जो निष्कर्षों के साथ अन्य शोधकर्ताओं द्वारा संगत है और जो आगे की मांसपेशी और मांसपेशियों के बीच गतिशीलता को सील करने के बीच कोशिका झिल्ली में हड़ताली समानता पर प्रकाश डाला गया में दोषपूर्ण हैं गैर-स्नायु सेल प्रकार3,11,15,22. हम यह भी देखा है कि रोगी कोशिकाओं को एक पूर्ण लंबाई dysferlin अनुक्रम युक्त प्लाज्मिड के साथ transfected उनकी दोषपूर्ण झिल्ली phenotype से बचाव किया गया, प्रदर्शन है कि पूर्ण लंबाई dysferlin प्लाज्मिड गैर में phenotype बचाव कर सकते हैं-मांसपेशी सेल प्रकार के रूप में अच्छी तरह से पेशी में27

साथ में, हमारे परिणाम व्यवहार्यता और दो फोटॉन झिल्ली के एक सोने के रूप में कोशिका को मापने के रूप में परख घायल की विश्वसनीयता को सुदृढ़ सेल झिल्ली इन विट्रो मेंपुनः सील करने की क्षमता । हालांकि, लागत और दो के साथ जुड़े उपलब्धता-फोटॉन माइक्रोस्कोपी कुछ अनुसंधान समूहों के लिए दो फोटॉन झिल्ली घायल परख का उपयोग करने की मांग के लिए एक संभावित सीमित कारक हो सकता है । इसके अलावा, हमारे सेटअप एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप, जो अच्छी तरह से इन विट्रो काम करने के लिए अनुकूल है, लेकिन vivo इमेजिंग में के लिए कम उपयुक्त हो सकता है का उपयोग करता है ।

यह ध्यान रखें कि दो फोटॉन लेजर संरेखण की परिशुद्धता तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है महत्वपूर्ण है । हमारे अनुभव में, लेजर संरेखण के समस्या निवारण सबसे आम समस्या का सामना करना पड़ा था । अंय मुद्दों जो लेजर के दौरान सफल हिट स्कोर करने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है मंच पर गिलास नीचे पकवान के समतल शामिल हैं, साथ ही समाधान में कोशिकाओं के उंमुखीकरण ।

परख वर्तमान और भविष्य रोग राज्यों में कोशिका झिल्ली अखंडता या resealing परेशान है, और चिकित्सा की प्रभावकारिता, जैसे जीन थेरेपी और antisense oligonucleotide आधारित चिकित्सा, जो लाभ होगा जांच के लिए लागू है निस्र्पक झिल्ली गतिशीलता के लिए एक प्रभावी परख होने से इतना है कि उपंयास चिकित्सीय विकल्प28,29का पता लगाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चिकित्सा और दंत चिकित्सा के अलबर्टा विश्वविद्यालय के संकाय द्वारा समर्थित किया गया था, गैरेट कमिंग रिसर्च चेयर फंड के दोस्तों, एचएम Toupin स्नायविक विज्ञान अनुसंधान कुर्सी कोष, पेशी Dystrophy कनाडा, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI), अलबर्टा उंनत शिक्षा और प्रौद्योगिकी (AET), कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), यिशै यात्रा-जीन और सेल थेरेपी, महिला और बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (WCHRI) के लिए फाउंडेशन, और अलबर्टा स्वास्थ्य समाधान नया (AIHS ).

हम पूरी लंबाई dysferlin प्लाज्मिड के साथ हमें की आपूर्ति के लिए डॉ स्टीवन लवल शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी डॉ Katsuya मियाके तकनीकी सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

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References

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Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).More

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

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