Summary
두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
수많은 pathophysiological 모욕 세포 막에 손상을 줄 수 있다 그리고, 세포 막 복구 또는 무결성, 타고 난 결점과 결합 될 때 질병 귀 착될 수 있다. 세포 막 복구를 둘러싼 근본적인 분자 메커니즘 이해은, 그러므로, 세포 막 기능 장애 역학과 관련 된 질병에 대 한 새로운 치료 전략의 개발에 중요 한 목표. 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 이해 하는 다양 한 질병 상황에서 세포 막 resealing 겨냥 실험적 치료를 수행 하는 기능 결과 결정 하기 위한 표준으로 2 광자 레이저 절제를 사용 합니다. 이 분석 결과, 세포 막 세포 막 파열 및 형광 염료는 세포에 침투 하면 2 광자 레이저로 부상 대상이 됩니다. 셀 내에 형광의 강도 다음 자체를 봉인 하는 셀의 능력 척도를 모니터링할 수 있습니다. 세포 막 응답 부상, 뿐만 아니라 접근 자체를 부상 2 광자 레이저에 큰 변화를 평가 하기 위한 여러 다른 방법이 있다, 그러므로, 셀 부상의 통합 모델 것 군인이 감소 하는 이러한 방법론 사이 변화. 이 문서에서는, 우리는 간단한 2 광자 레이저 부상 세포 막 수리에서 생체 외에서 둘 다 건강에 고 dysferlinopathy 환자 fibroblast 세포 페 전체 길이 dysferlin 플라스 미드의 유무에 관계 없이 평가 하기 위한 프로토콜 개요.
Introduction
더블-레이어 인지질 단백질에 박 혀의 셀의 내부/세포 외 환경 정의 하 고 세포질 항상성 및 세포 생존을 유지 하기 위한 필수적 이다 진 핵 세포의 세포 막에 의하여 이루어져 있다. 세포 막 상해 기계적 또는 화학 모욕에서 발생 하는 다양 한 포유류 세포 유형에서 평범, 등 골격과 심장 근육, 위, 및 폐 세포1,2,,34. 매일 생리 기능에 따른 부상, 뿐만 아니라 세포 막도 환경 모욕, 세균 독 소, 그리고 허 혈 성 reperfusion5에 의해 손상 될 수 있습니다. 세포 막에 있는 파열을 봉인에 실패 리드의 extracellular 캘리포니아2 +-다른 잠재적으로 유독한 세포 외 구성 요소-함께 관계가 없는 유입에 셀에 셀에 신속 하 게 발생할 수 있습니다 다운스트림 신호 폭포를 트리거링 죽음1,4,,56.
날짜 하려면, 셀에 막 복구에 대 한 몇 가지 제안 된 모델 되었습니다. 다른 복구 메커니즘은 막 파열의 자연과 크기에 따라 활성화 될 수 있습니다. 예, 그것은 측면 흐름 또는 작은 중단 복구 막는 단백질 세포 막 사용할 수 제안 (< 1 nm). 측면 퓨전 모델 제안 막 파열 포함 하는 dysferlin의 측면 모집을 통해 급속 하 게 고치는 막7, 모델을 막는 단백질 단백질 집계를 통해 작은 구멍 고치는 제안 하는 동안 (주로 annexins) 8. 반대로, 큰 막 병 변을 일으킬 캘리포니아2 +-의존, dysferlin 중재 소포 융해 및 수리 패치의 형성. 수리 패치 모델에서 셀으로 빠른 Ca2 + 유입 트리거 복잡 한 또는 "패치", 융합 함께 세포내 vesicles의 형성 하는 여러 단백질 (dysferlin, annexins, mitsugumin-53, 및 EDH 단백질)의 채용 또는 막의 사이트에서 리소좀 손상4,,910,,1112. 그것은이 모델 반드시 상호 배타적이 고 막 수리를 촉진 하기 위하여 연주회에서 작동 수 있습니다 해야 합니다. 세포 막 손상 제대로 봉인에 실패는 근이 영양 증 (dysferlinopathy-미요시 myopathy, 등 다리 띠 근이 영양 증 유형 IIB, 전방 tibial 발병 원심 myopathy)를 포함 하 여 여러 질병 상태와 관련 13,14, 심근 그리고 Chediak-히가시 증후군 (CHS)15.
그 적절 한 세포 막의 무결성 및 놀이 resealing 건강과 질병에 중요 한 역할 세포 막 복구의 기본 분자 메커니즘에 대 한 깊은 이해 것에 도움이 될 새로운 치료 전략에 대 한 검색. 그것은, 그러므로, 활동을 모니터링 하 고 세포 막 수리 능력 평가를 적절 한 실험 기법을 보유 하는 데 필요한입니다. 막 복구를 모델링 하기 위한 여러 가지 생체 외에서 방법은 설계 되었습니다. 한 전략 셀 된다고 피 펫/외과 블레이드/면도기를 사용 하거나 셀16유리 구슬 롤링을 통해 촉진 될 수 있는 기계적 상해를 포함 한다. 그러나, 기계적 상해의이 유형은 더 큰 병 변, 생성 하 고 셀 부상, 내와 문화 사이에서 변이의 고차를 만듭니다.
막 상처를 생성 하는 또 다른 방법은 두 광자 현미경 검사 법에 의해 레이저 절제입니다. 전통적인 레이저 confocal 현미경 검사 법 단일 광자 여기를 고용 하 고, 달리 2 광자 레이저는 동시에 고 에너지 전자17의 흥분을 촉진 하기 위하여 두 긴 파장, 저 에너지 광자를 사용 합니다. 이 아닌-선형 프로세스 여기 초점 평면 내에서 독점적으로 그리고 전체 빛 경로17 (그림 1) 따라 하지 발생합니다. 이 때 라이브 셀18,19이미징 photodamage를 최소화 하기 위해 여기 볼륨 수 감소. 연구원은 따라서 정확한 병 변 세포 막 및 모니터 막 resealing 실시간으로 세포 막 파열 그리고 reseals로 형광 강도 변화를 관찰 하 고 형광 염료를 사용 하 여 생성할 수 있습니다.
이 이렇게는 반복적으로 막 부상 생체 외에서 그리고 vivo에서 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고 여러 셀에20,21종류. 예를 들어 막 섬유 아 세포 및 환자가 기술을22,23을 사용 하 여 평가 했다 dysferlinopathy에서 파생 된 myotubes 결함을 복구 합니다. 또한, 마우스에서 분리 한 근육 섬유 수리 패치 형성13,,2425를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 붙일 태그가 단백질의 움직임 또한 단일 근육 섬유9막 수리 하는 동안 관찰할 수 있습니다. 또한, sarcolemmal 수리 2 광자 레이저 zebrafish 태아에 부상 다음 과정 실시간 vivo에서26에 관찰할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는이 방법론은 원형질 막 resealing 능력 측정을 위해 다양 한 셀 형식에 적용 될 수 있지만 두 광자 레이저 부상를 사용 하 여 섬유 아 세포의 세포 막 수리 역학을 평가 하기 위한 방법론 개요 생체 외에서. 이 방법에서는, 세포는 인 큐베이 팅 FM4-64, 신속 하 게 그것을 부정적으로 결속으로 fluoresces 닥터지, 셀 스며들 지 않는 염료 충전 막 병 변 통해 셀 입력 시 세포질 내에서 인지질 (그림 2& 3). 염료 형광 막 병 변에 인접 한의 정량화 세포 막 자체를 봉인 하는 데 걸리는 시간을 모니터링 하기 위한 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티를 예증 하 사용 dysferlinopathy 환자 fibroblasts GFP 활용 전체 길이 dysferlin (DYSF) 플라스 미드와 페 세포 막 복구의 구조를 평가 합니다.
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Protocol
이 연구에 사용 된 인간 섬유 아 세포 세포는의 학부와 앨버타의 대학에 치과의 인간의 윤리 위원회에서 승인 된 사용 되었다.
1. 전체 길이 DYSF 플라스 미드를 가진 세포의 transfection
- 문화 fibroblast 세포 성장 미디어-36 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS)의 4 mL와 20 µ L의 페니실린/스 (P/S)-37 ° c.에 CO2 배양 기에서의 40 mL를 포함 하는 T225 플라스 크에
참고: 셀 약 70-80 %confluency 경작 해야 하 고 완전히 confluent 될 수 없다는. - 시드 셀 준비, 40 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 셀을 두 번, 린스 다음 셀을 분리를 0.05 %trypsin 5 mL을 추가 합니다. 2 보육 37 ° c 공동 셀을 반환 하 고 5 분에 대 한 셀을 품 어.
- 셀은 완벽 하 게 분리, 성장 미디어 트립 신 반응을 중지를 40 mL를 추가 합니다.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀 또는 다른 세포 장치를 계산 계산 합니다.
- 씨앗 1 x 105 셀/mL에서 세포의 2 mL 35mm 콜라겐 코팅 유리 하단 요리도. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어
참고: 셀 이어야 한다 약 50-60% 합칠 다음날. - 성장 매체를 제거 하 고 혈 청을 박탈 미디어 (FBS 없이 성장 매체)의 2 mL와 함께 그것을 대체.
- Lipotransfection를 사용 하 여 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 셀 transfect.
- 1.5 mL 튜브 (페 수를 각 요리에 대 한 1 개의 관)에서 혈 청을 박탈 미디어의 150 µ L를 준비 합니다.
- 혈 청을 박탈 미디어를 포함 하는 각 1.5 mL 튜브에 transfection 시 약의 3 µ L를 추가 합니다. 그것은 실내 온도에 적어도 5 분 품 어.
- 별도 1.5 mL 튜브에 175 µ L의 혈 청을 박탈 미디어와 플라스 미드 DNA의 3.5 µ g을 추가 합니다.
참고: 각 추가 요리 페 수를 위의 금액을 곱하면 됩니다. - 플라스 미드 DNA의 혈 청을 박탈 미디어와 transfection 시 약 150 µ L 튜브에 들어 있는 미디어의 150 µ L를 결합 한다. 실 온에서 20 분 동안 그것을 품 어.
- 균등 하 게 플라스 미드 및 transfection 시 미디어의 300 µ L 분산 접시. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 24 시간을 위한 요리를 품 어
- 혈 청을 포함 하는 신선한 성장 매체와 미디어를 교체 하 고 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 추가 24 h에 대 한 그것을 품 어
2. 셀 2 광자 부상 분석 결과 대 한 준비
- 미디어 pipetting 및 Tyrode의 솔루션의 1 mL와 함께 한 번 셀 린스 다음 신선한 Tyrode 솔루션 포함 된 2.5 m m FM 1 µ L의 1 mL을 추가 4-64 염료.
참고: FM 4-64 염료의 최종 농도 2.5. - 칼슘 고갈 환경에서 막 수리의 평가, 필요한 경우 1 mL의 PBS로 세포를 씻어 하 고 1mm EGTA를 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
참고: PBS 시간이 지남에 따라 분리 하는 세포를 일으킬 것입니다, 부상 분석 결과 가능한 한 빨리 완료 한다.
3. 2-광자 레이저 부상 분석 결과
- 거꾸로 confocal 현미경 및 관련된 프로그램 소프트웨어를 사용 하, 0.2 µ m x 2 µ m 대상 생성 하 고 대상 줄 중복 하 고 세포 막 (그림 2)의 방향에 수직인 거짓말 세포 막의 가장자리에 놓습니다.
- 543 nm HeNe 레이저를 사용 하 여 FM 염료 신호를 자극 하 고 600-760 nm에 대 한 검색 범위를 설정. 488 nm의 아르곤 레이저를 사용 하 여 GFP 신호 (그림 4)을 자극 하 고 500-550 nm에 대 한 검색 범위를 설정.
- 만들기 5 분 시간 일련의 연속 이미지 검사, 세포 이미징 모든 5 s.
- 생성 하려면 막 병 변, 820-nm, 15%를 사용 하 여 설정 2 광자 레이저를 사용 하 여 표 백제 셀 레이저 10 반복 출력 하 고 시계열의 시작 후 셀 25 s 표 백제.
- 척도 FM 4-64 염료 형광, 관심 (ROI) 6 µ m x 6 µ m 영역을 그리는 부상 위치 및 셀 (그림 3) 내 인접 배치 하는 소프트웨어를 사용 합니다.
참고:이 응용 프로그램에서 소프트웨어-"범위 표시기" 기능을 사용 하 여 샘플링 영역 픽셀 oversaturation의 방지, 빨강 픽셀 포화 픽셀을 나타냅니다. 통계 분석에 대 한 전자 스프레드 시트에 원시 형광 값을 내보냅니다. - 배경 값 (막 부상 이전 timepoints의 평균 형광 값)을 빼서 각 시간 지점에 대 한 상대적인 형광 값을 계산 하 고 t 값 형광으로 순 증가 나누는 = 0 (그림 5, 6) .
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Representative Results
건강 한 인간의 섬유 아 세포, 비 치료 dysferlinopathy 환자의 섬유 아 세포 및 환자 fibroblasts 전체 길이 dysferlin 시퀀스 2 광자 레이저 부상 능력 resealing 막 평가 대상이 됐다을 포함 하는 플라스 미드와 페 진짜 시간에서. 건강 한 인간의 fibroblast 세포 표시 레이저 부상 다음 FM 4-64 형광 활성화의 낮은 수준 및 비 치료 환자 fibroblasts 전시 상대 형광 강도 상해 다음의 높은 수준의 (그림 5& 6 ). 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 페 했다 환자 셀 보여 감소 상대적인 FM 4-64 형광 강도 비 치료 환자 컨트롤에 비해 건강 한 컨트롤 (그림에서 형광 값 비교 했다 5& 6).
그림 1 . 두 광자 현미경 검사 법에 대 한 광자. 전통적인 한 광자 현미경 시스템에서 하나의 고 에너지 광자 (UV 또는 보이는 스펙트럼) fluorophore (A)를 흥분 시키기 위해 사용 됩니다. 2 광자 시스템에서 두 낮은 에너지 광자 (적외선) 근처는 fluorophore (B)을 자극 하는 데 사용 됩니다. 어떻게 두 광자 레이저 시스템 여기를 집중할 수 있습니다 보여주는 초점면에 걸쳐 생성 된 형광 신호를 밖으로의 초점 비행기 (A)에서 특정 지역 (B) 및 제외 빛 내 빛을 실린더 내의 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 세포 막에는 대상 배치. 소프트웨어를 사용 하 여 0.2 µ m x 2 µ m 대상 그린 이며 중복 및 세포 막에 수직 배치. 화살표는 대상을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 그것은 FM 염료에서 형광 신호 침투 막 파열을 통해 셀. 세포 막 파열으로 닥터지 FM 4-64 염료 침투 셀 고 fluoresces으로 세포질 내에서 부정 청구 인지질 바인딩합니다. 소프트웨어를 사용 하 고 관심 (ROI)의 지역 그린된 (화이트 박스) 수 상자 내에서 형광 값 셀 내에 상대 형광 변화를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . GFP 활용 전체 길이 DYSF 플라스 미드에서 형광 신호. 플라스 미드 transfection, 다음 환자 fibroblast 세포는 전체 길이 DYSF 단백질을 표현 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 시간이 지남에 형광의 정량화. ROI 내에서 컴퓨터 소프트웨어에 의해 계산 하는 형광 값 상대 형광 각 치료 그룹에 대 한 시간이 지남에 변경 결정을 사용할 수 있습니다. 화살표는 레이저 절제의 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 변경 시간이 지남에 상대적 형광에. 각 시간 지점에 대 한 상대적 형광 (RF) 값은 주어진된 형광 값 (신호에서에서 (막 부상 이전 timepoints에서 형광 값의 평균으로 계산) 배경 형광 값을 빼서 계산 강도-배경 = δ) 하 고 t에서 형광 값 (δ)를 늘려 그물을 나누어 = 0 (F0). 따라서, RF = δ/F0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
세포 막의 2 광자 레이저 부상 resealing 에 체 외막의 역학을 평가 하기 위한 정확 하 고 다양 한 기술입니다. 이 문서에서는, 우리 세포 막 resealing 분석 결과 부상 2 광자 레이저를 사용 하 여 dysferlinopathy 환자 세포 능력을 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 결과 보여 dysferlinopathy 환자 세포는 세포 막 resealing, 결함이 있는 다른 연구자에 의해 연구 결과와 일치 하는 있는 추가 근육 사이의 역학 resealing 세포 막에 눈에 띄는 유사성을 강조 하 고 비 근육 세포 유형3,11,,1522. 우리는 또한 관찰 전체 길이 dysferlin 시퀀스를 포함 하는 플라스 미드와 페 환자 세포 표현 형, resealing 그들의 결함이 있는 막에서 구출 했다 그 전체 길이 dysferlin 플라스 미드 비 근육 표현 형을 구출 수 시연 셀 종류 뿐만 아니라 근육27에서.
함께, 우리의 결과 강화 측정에 골드 표준 세포 막 resealing 능력 체 외로 두 광자 막 부상 분석 결과의 신뢰성 및 타당성. 그러나, 비용 및 가용성 두 광자 현미경과 관련 된 분석 결과 부상 2 광자 멤브레인을 활용 하고자 하는 일부 연구 그룹에 대 한 요소를 제한 하는 잠재력 일 수 있었다. 또한, 우리의 설치에서 체 외 작업에 적합 하지만 덜 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다 거꾸로 confocal 현미경을 활용 합니다.
그것은 두 광자 레이저 맞춤의 정밀도 기술의 성공에 중요입니다. 우리의 경험에서 발생 하는 가장 일반적인 문제를 했다 레이저 정렬의 문제 해결. 레이저 부상 하는 동안 성공적인 명 중을 득점 하는 능력에 영향을 미칠 수 있는 다른 문제는 솔루션에 셀의 방향 뿐 아니라 무대에 유리 하단 접시의 레벨 링 포함 됩니다.
분석 결과는 세포 막의 무결성 또는 resealing 불안정은, 질병 상태를 조사 하는 현재와 미래의 연구 및 치료, 유전자 치료 등 도움이 될 것 이라고는 센스 oligonucleotide 기반 치료의 효능은 데에서 막 역학 새로운 치료 옵션이 될 수 있도록 특성화에 대 한 효과적인 분석 결과28,29탐험.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 의학 및 치과,이 친구의 개렛 Cumming 연구의 자 기금, HM Toupin 신경 과학 연구의 자 기금, 근 위축 증 캐나다, 캐나다 재단의 앨버타의 대학 교수진에 의해 혁신 (CFI) 지원 되었다 앨버타 고급 교육 및 기술 (AET), 건강 연구 (CIHR), 제시의 여행-유전자 및 세포 치료, 여성 및 아동 건강 연구소 (WCHRI)에 대 한 재단의 캐나다 학회 및 앨버타 혁신적인 건강 솔루션 (AIHS ).
우리는 박사 스티븐 발 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 함께 우리를 공급 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 기술 조언을 박사 가쓰야 미 야 케를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
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