Summary
Cellemembranen såret via to-fotonet laser er en mye brukt metode for å vurdere membran resealing evne og kan brukes på flere celletyper. Her beskriver vi en protokoll for i vitro live bildebehandling av membran resealing i dysferlinopathy pasienten celler etter to-fotonet laser ablasjon.
Abstract
Mange patofysiologiske fornærmelser kan skade cellemembraner og når kombinert med medfødte mangler i cellemembranen reparasjon eller integritet, kan føre til sykdom. Forstå de underliggende molekylære mekanismene rundt cellemembranen reparasjon er derfor et viktig mål for utviklingen av romanen strategier for sykdommer forbundet med dysfunksjonelle cellemembranen dynamikk. Mange i vitro og i vivo studier rettet mot å forstå cellemembranen resealing i ulike sykdom sammenhenger benytte to-fotonet laser ablasjon som standard for å bestemme funksjonelle resultater etter eksperimentelle behandlinger. I denne analysen, er celle membraner utsatt for såret med en to-fotonet laser, som forårsaker cellemembranen brudd og fluorescerende farge å infiltrere cellen. Intensiteten av fluorescens i cellen kan deretter overvåkes for å kvantifisere cellenes evne til å forsegle selv. Det er flere alternative metoder for å vurdere celle membran svar på skader, samt stor variasjon i to-fotonet laser såret tilnærming selv, derfor en enkelt, enhetlig modell av cellen såret ville fordel tjene til å redusere den variasjon mellom disse metodene. I denne artikkelen skissere vi en enkel to-fotonet laser såret protokollen for å vurdere celle membran reparasjon i vitro i både sunn og dysferlinopathy pasienten fibroblast celler transfekterte med eller uten en full lengde dysferlin plasmider.
Introduction
Cellen membran av eukaryote celler består av en to-lags av protein-piggdekk fosfolipider som definerer intra/ekstracellulære miljøet i cellen og er avgjørende for å opprettholde mobilnettet homeostase og celle overlevelse. Cellemembranen skader som følge av mekanisk eller kjemikalie fornærmelser er vanlig i ulike pattedyr celletyper, inkludert skjelettlidelser og hjerte-muskelen, mage og lunge celler1,2,3,4. I tillegg til skader påfølgende daglig fysiologiske funksjon, kan celle membraner også bli skadet av miljømessige fornærmelser, bakteriell giftstoffer og iskemiske reperfusion5. Manglende evne til å forsegle brudd i cellemembranen fører til en uregulert strøm av ekstracellulære Ca2 +- sammen med andre potensielt giftig ekstracellulære komponenter - inn i cellen, utløser nedstrøms signal cascades som raskt kan resultere i cellen død1,4,5,6.
Hittil har det vært flere forslag modeller for membran reparasjon i celler. Forskjellige reparasjonsmekanismene kan aktiveres avhengig av størrelsen og karakteren av membran brudd. For eksempel er det foreslått at celle membraner kan benytte lateral flyt eller protein tilstopping for å reparere små forstyrrelser (< 1 nm). Lateral fusion modellen foreslår at membran brudd er raskt reparert gjennom lateral rekrutteringen av dysferlin inneholder membran7, mens protein tilstopping modellen antyder at små hullene er reparert gjennom protein samlinger (hovedsakelig annexins) 8. derimot større membran lesjoner utløse Ca2 +-avhengige, dysferlin-mediert vesicle fusion og dannelsen av en reparasjon oppdatering. Reparasjon oppdateringen modellen, utløser en rask Ca2 + tilstrømningen til cellen rekruttering av flere proteiner (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 og EDH proteiner) som utgjør en kompleks eller "patch", sammen med en blanding av intracellulær blemmer eller lysosomer på stedet av membran skade4,9,10,11,12. Det er viktig å merke seg at disse modellene er ikke utelukker og fungerer sammen å lette membran reparere. Unnlatelse av å riktig forsegle cellemembranen skade er forbundet med flere sykdom stater, inkludert muskeldystrofi (dysferlinopathy - inkludert Miyoshi muskeldystrofi, lem-belte muskeldystrofi type IIB og distale muskeldystrofi med fremre tibial innsettende) 13, kardiomyopati14og Chediak-Higashi syndrom (CHS)15.
Gitt at riktig cellemembranen integritet og resealing spiller så viktig rolle i helse og sykdom, en dypere forståelse av underliggende molekylære mekanismer av cellemembranen reparasjon ville være gunstig i Søk etter romanen strategier. Det er derfor nødvendig å ha eksperimentelle teknikker for å overvåke kinetics og vurdere muligheten av cellemembranen reparasjon. Flere i vitro metoder for modellering membran reparasjon er utformet. En strategi innebærer mekanisk skade som kan ordnes gjennom cellen skraping med en pipette/kirurgisk blad/barberhøvel eller ved å rulle glassperler over celler16. Men denne typen mekanisk skade genererer større lesjoner, og oppretter en høy grad av variasjon i celle skade, både innenfor og mellom kulturer.
En annen metoden å generere membran sår er laser ablasjon av to-fotonet mikroskopi. I motsetning til tradisjonelle laser AC confocal mikroskopi som sysselsetter enkelt Foton eksitasjon, bruker to-fotonet laser samtidig to lang-bølgelengde, lav-energi fotoner for å lette magnetisering av en høy-energi elektron17. Denne ikke-lineære prosessen resulterer i eksitasjon utelukkende innenfor fokalplanet og ikke langs hele lys banen17 (figur 1). Dette reduserte eksitasjon volum bidrar til å redusere photodamage når imaging lever celler18,19. Forskere er derfor kunne generere nøyaktige lesjoner i cellemembranen og skjermen membran resealing i sanntid ved å bruke fluorescerende fargestoffer og observerer endringer i fluorescens intensiteten som cellemembranen brudd og deretter reseals.
Denne tilnærmingen er brukt gjentatte ganger å studere membran såret i vitro og i vivo og flere cellen skriver20,21. For eksempel membran reparere fibroblaster og myotubes Hentet fra dysferlinopathy pasienter ble vurdert ved hjelp av denne teknikken22,23. Også ble enkelt muskelfibre isolert fra mus brukt til å overvåke reparasjon oppdateringen formasjon13,24,25. Bevegelsen av fluorescently merket proteiner kan også observeres under membranen reparasjon i enkelt muskelfibre9. Videre kan prosessen med sarcolemmal reparasjon etter to-fotonet laser såret i sebrafisk embryoer observeres i sanntid i vivo26.
I denne artikkelen skissere vi en metodikk for å vurdere celle membran reparasjon dynamikk i fibroblaster med to-fotonet laser såret, men denne metoden kan brukes på ulike celletyper for å kvantifisere plasma membran resealing evne i vitro. I denne metoden celler er ruges med FM4-64, en lipofile, celle-ugjennomtrengelig fargestoff som raskt fluoresces som det binder seg til negativt ladet fosfolipider i cytoplasma ved å skrive inn cellen gjennom membranen lesjonen (figur 2& 3). kvantifisering av fargestoff fluorescens tilstøtende membran lesjonen tillater overvåking tiden det tar for celle membran å reseal selv. Du eksemplifiserer nytten av denne metoden, bruker vi dysferlinopathy pasienten fibroblaster transfekterte med GFP-konjugerte full lengde dysferlin (DYSF) Plasmidene for å vurdere redning av cellemembranen reparasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige fibroblast celler som brukes i denne studien ble brukt med godkjennelse fra den menneskelige etikk fakultet og odontologi ved University of Alberta.
1. hva celler med full lengde DYSF plasmider
- Kultur fibroblast celler i en T225 bolle som inneholder 40 mL vekst medier - 36 mL Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM), 4 mL av fetal bovin serum (FBS) og 20 µL av penicillin/streptomycin (P/S) - i en CO2 inkubator på 37 ° C.
Merk: Celler skal kulturperler til ca 70-80% confluency, og skal ikke tillates å bli helt confluent. - For å forberede celler såing, skyll cellene med 40 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) to ganger, og deretter legge 5 mL av 0,05% trypsin koble cellene. Hjem cellene til 37 ° C CO2 inkubator ruge celler for 5 min.
- Når cellene er helt løsrevet, Legg 40 mL av veksten mediene å stoppe trypsin reaksjonen.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en annen celle teller enhet.
- Frø 2 mL av celler på 1 x 105 celler/mL i 35 mm kollagen-belagt glass bunn retter. Inkuber cellene over natten i en CO2 inkubator på 37 ° C.
Merk: Celler bør være ca 50-60% confluent neste dag. - Fjerne vekst media og erstatte den med 2 mL serum-belastede media (vekst medier uten FBS).
- Transfect cellene med full lengde dysferlin plasmider bruker lipotransfection.
- Forberede 150 µL serum-belastede medium i en 1,5 mL tube (en tube for hver rett til å være transfekterte).
- Legge 3 µL av transfection reagens til hver 1,5 mL tube som inneholder serum-belastede media. Inkuber det minst 5 minutter ved romtemperatur.
- I en separat 1,5 mL tube, legge 175 µL av serum-belastede media og 3,5 µg av plasmider DNA.
Merk: Multiplisere over beløpene for hver ekstra rett til å være transfekterte. - Kombinere 150 µL av mediet som inneholder plasmider DNA i et rør med 150 µL serum-belastede media og hva reagens. Inkuber det for 20 min ved romtemperatur.
- Jevnt fordele 300 µL av media med plasmider og transfection reagens i fatet. Inkuber retter for 24 timer i en CO2 inkubator på 37 ° C.
- Ombytte media med fersk veksten mediet som inneholder serum og ruge det for en ekstra 24 h i en CO2 inkubator på 37 ° C.
2. forberedelse av celler for to-fotonet såret analysen
- Fjerne media ved pipettering skyll cellene gang med 1 mL Tyrode's, og legge til 1 mL av fersk Tyrode løsning som inneholder 1 µL av 2,5 FM 4-64 fargestoff.
Merk: Den siste konsentrasjonen av FM 4-64 fargestoff er 2,5 µM. - Hvis vurdering av membran reparasjon i et kalsium-utarmet miljø, skyll celler med 1 mL av PBS og legger 1 mL av PBS med 1 mM EGTA.
Merk: Som PBS vil føre cellene koble over tid, såret analysen skal være ferdig så raskt som mulig.
3. to-fotonet laser såret analysen
- Bruker en invertert AC confocal mikroskop og tilknyttede programmet programvare, lage en 0,2 µm x 2 µm mål og plasser den på kanten av cellemembranen slik at målet linje overlapper og ligger vinkelrett retning av cellemembranen (figur 2).
- Bruk en 543-nm HeNe laser til å opphisse FM fargestoff signal og angi gjenkjenning for 600-760 nm. Bruk en 488-nm Argon laser til å opphisse GFP signal (Figur 4) og angi gjenkjenning for 500-550 nm.
- Opprette en 5 min tid rekke sekvensielle image skanner, imaging celler hver 5 s.
- Vil generere en membran leksjonen, blekemiddel celler ved hjelp av en to-fotonet laser satt til 820-nm, med 15% laser makt med 10 gjentakelser og bleke celler 25 s etter begynnelsen av tiden serien.
- For å kvantifisere FM 4-64 fargestoff fluorescens, bruke programvaren til å tegne en 6 µm x 6 µm region av interesse (ROI) og plassere den tilstøtende til såret plasseringen og i cellen (Figur 3).
Merk: Unngå prøvetaking områder av pixel oversaturation ved hjelp av funksjonen "Området indikator" i programvaren - i dette programmet, røde pixels forestiller oversaturated piksler. Eksporter rå fluorescens verdier til et elektronisk regneark for statistisk analyse. - Beregne relative fluorescens verdier for hvert punkt ved å trekke bakgrunn verdien (mener fluorescens verdien timepoints før membran såret) og dele den netto økningen i fluorescens verdien ved t = 0 (figur 5, 6) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunn menneskelig fibroblaster, ikke-behandlede dysferlinopathy pasienten fibroblaster og pasienten fibroblaster transfekterte med en plasmider inneholder full lengde dysferlin sekvensen ble utsatt for to-fotonet laser såret å vurdere membran resealing evne i sanntid. Sunn menneskelig fibroblast celler vises lave nivåer av FM 4-64 fluorescens aktivisering etter laser såret og ikke-behandlede pasienter fibroblaster utstilt en høy grad av relativ fluorescens intensiteten etter skade (figur 5& 6 ). Pasienten celler som var transfekterte med full lengde dysferlin plasmider viste redusert relative FM 4-64 fluorescens intensitet sammenlignet med ikke-behandlede pasienter kontroller og var sammenlignbar med fluorescens verdiene i kontrollen sunn (figur 5& 6).
Figur 1 . En-fotonet mot to-fotonet mikroskopi. I en tradisjonell en-fotonet mikroskop system brukes et enkelt høy energi Foton (UV eller synlige spekteret) å opphisse en fluorophore (A). I en to-fotonet system brukes to nedre-energi fotoner (nær infrarød) å opphisse en fluorophore (B). Avbildet i sylindrene er fluorescens signalet generert gjennom fokalplanet, demonstrere hvordan to-fotonet Lasersystemet kan fokusere eksitasjon lett til i en bestemt region (B) og utelukke lys fra ut-av-fokus fly (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Plassere et mål på cellemembranen. Bruker programvaren, er 0,2 µm x 2 µm mål trukket og overlappende og vinkelrett cellemembranen. Pilen viser målet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Fluorescens signalet fra FM fargestoff som infiltrerer cellen gjennom membranen ruptur. Cellemembranen brudd, lipofile FM 4-64 fargestoff infiltrerer cellen og fluoresces som det binder negativt ladet fosfolipider i cytoplasma. Bruker programvaren, et område av interesse (ROI) kan være trukket (hvit boks) og fluorescens verdier i boksen kan brukes til å beregne relative fluorescens endringer i cellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Fluorescens signalet fra GFP-konjugerte full lengde DYSF plasmider. Etter plasmider transfection uttrykke pasienten fibroblast celler full lengde DYSF protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Kvantifisering av fluorescens over tid. Fluorescens verdiene beregnes av programvare fra i Avkastningen kan brukes til å angi relativ fluorescens endringer over tid for hver behandling. Pilen viser tidspunktet for laser ablasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Endring i relativ fluorescens over tid. Relativ fluorescens (RF) verdier for hvert punkt beregnes ved å trekke bakgrunn fluorescens verdien (beregnet som gjennomsnittet av fluorescens verdiene fra timepoints før membran såret) gitt fluorescens verdier (Signal Intensitet - bakgrunn = ΔF) og dele nettet øker (ΔF) med fluorescens verdien t = 0 (F0). Derfor RF = ΔF/F0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To-fotonet laser sårer cellemembranen er en presis og allsidig teknikk for å vurdere dynamikken i membranen resealing i vitro. I denne artikkelen beskrev vi en protokoll for å bestemme cellemembranen resealing evne i dysferlinopathy pasienten celler ved hjelp av to-fotonet laser såret analysen. Våre resultater viser at dysferlinopathy pasienten celler er mangelfulle i cellemembranen resealing, hvilke er gjennomført med funn av andre forskere og noe som ytterligere understreker de slående likhetene i cellemembranen resealing dynamikken mellom muskel og ikke-muskel celle typer3,11,15,22. Vi også observert at pasienten celler transfekterte med en plasmider med full lengde dysferlin sekvensen ble reddet fra defekt membran resealing fenotype, demonstrere at full lengde dysferlin plasmider kan redde fenotypen i ikke-muskel celletyper samt som muskel27.
Sammen forsterke resultatene det gjennomførbarhet og pålitelig to-fotonet membran såret analysen som en gullstandard måle celle membran resealing evne i vitro. Imidlertid kan kostnadene og tilgjengeligheten knyttet to-fotonet mikroskopi være en potensiell begrensende faktor for noen forskningsgrupper som søker å utnytte to-fotonet membranen såret analysen. Videre benytter våre oppsett en invertert AC confocal mikroskop, som er velegnet til i vitro arbeid, men kanskje være færre passende for i vivo bildebehandling.
Det er viktig å merke seg at presisjonen for to-fotonet laser justeringen er avgjørende for suksess for teknikken. I vår erfaring var feilsøking av laser justering vanligste problemet oppstod. Andre problemer som kan påvirke muligheten til å score vellykket treff under laser såret med planering av glass-bottom rett på scenen, samt retningen på cellene i løsningen.
Analysen gjelder nåværende og fremtidige studier undersøker sykdom stater der cellemembranen integritet eller resealing opprørt og effekten av behandlinger, som gene terapi og antisense oligonucleotide-basert terapi, som ville ha nytte fra å ha utforskes en effektiv analyse for å karakterisere membran dynamics slik at romanen behandlingsalternativer kan28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av University of Alberta fakultet medisin og odontologi, den venner av Garrett Cumming Research stol Fund, HM Toupin nevrologiske Science Research stol Fund, muskeldystrofi Canada, Canada Foundation for innovasjon (CFI), Alberta avansert utdanning og teknologi (EEO), canadisk Institutes of Health Research (CIHR), Jesse reise - grunnlaget for Gene og cellen terapi, kvinner og barns helse Research Institute (WCHRI), og Alberta fornyer Health Solutions (AIHS ).
Vi vil gjerne takke Dr. Steven Laval for å forsyne oss med full lengde dysferlin plasmider. Vi vil også gjerne takke Dr. Katsuya Miyake for tekniske råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
