Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

doi: 10.3791/56999 Published: January 2, 2018

Summary

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

Abstract

Çok sayıda patofizyolojik hakaret hücre zarlarında zarar verebilir ve hücre zarının onarım veya bütünlüğü, doğuştan gelen kusurlar ile birleştiğinde hastalığı neden olabilir. Hücre zarı tamir çevreleyen temel moleküler mekanizmaları anlama, bu nedenle, işlevsel olmayan hücre zarı dynamics ile ilişkili hastalıklar için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir amacın var. Hücre zarının çeşitli hastalık bağlamlarda yeniden mühürlemeden anlama amaçlayan birçok içinde in vitro ve in vivo çalışmada İki fotonlu lazer ablasyon fonksiyonel sonuçlar deneysel tedavileri takip belirlemek için standart olarak kullanmaktadır. Bu tahlil, hücre zarlarında hücre membran rüptürü ve hücre sızmaya floresan boya için neden bir iki fotonlu lazer ile yaralama için tabi tutulmaktadır. Hücre içinde floresan yoğunluğu sonra kendisini yeniden mühürlemek için hücrenin yeteneği ölçmek için takip edilebilir. Hücre zarının yanıt yaralanma, yaklaşım kendini yaralama İki fotonlu lazer büyük varyasyon olarak değerlendirmek için birkaç farklı yöntemi var, bu nedenle, hücre yaralama bir tek, birleştirilmiş model beneficially azaltmak için hizmet verecek Bu metodolojileri arasında varyasyon. Bu makalede, basit bir iki fotonlu lazer hücre zarı tamir vitro hem de sağlıklı ve dysferlinopathy hastanın fibroblast hücreleri veya bir tam uzunlukta dysferlin plazmid olmadan transfected değerlendirilmesi için protokol yaralama anahat.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir çift-hücre içi/hücre dışı ortam tanımlar ve hücresel homeostazı ve hücre yaşam bakımı için önemlidir tabaka-in protein çivili fosfolipitler, ökaryotik hücre hücre zarı oluşur. Hücre zarının yaralanmaları mekanik veya kimyasal hakaret kaynaklanan çeşitli memeli hücre türleri sıradan, dahil iskelet ve kalp kası, mide ve akciğer hücreleri1,2,3,4. Yaralanmalar için günlük fizyolojik fonksiyon sonucu ek olarak, hücre zarlarında Ayrıca çevre hakaret, bakteriyel toksinler ve iskemik reperfüzyon5tarafından zarar görebilir. Hücre membran yırtığı yeniden mühürlemek için başarısızlık ekstraselüler Ca2 +- diğer potansiyel olarak toksik ekstraselüler bileşenleri - ile birlikte bir düzensiz akını hücre içine hızlı bir şekilde hücre neden olabilir aşağı akım sinyal cascades tetikleme yol açar Ölüm1,4,5,6.

Bugüne kadar hücrelerde membran onarım için birkaç önerilen modelleri olmuştur. Farklı onarım mekanizmaları boyutuna ve membran rüptürü niteliğine bağlı olarak etkinleştirilebilir. Örneğin, bu hücre zarlarında yanal akışı veya küçük aksamalar onarmak için tıkanma protein yararlanmak olabilir önerilmektedir (< 1 nm). Membran yırtığı hızla yanal alımı dysferlin içeren tamir lateral füzyon modeli öneriyor küçük delikler protein toplamalardan tamir modeli tıkanma protein öneriyor iken membran7, (çoğunlukla annexins) 8. diğer taraftan, daha büyük membran lezyonlar Ca2 +tetik-bağımlı, dysferlin-aracılı vezikül fusion ve onarım yama oluşumu. Onarım yama modelinde, hücre içine hızlı bir Ca2 + akın bir kompleks veya "yama", bir füzyon ile birlikte hücre içi veziküller formu birden fazla protein (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ve EDH proteinler) alımı tetikler veya organellerin membran sitesinde4,9,10,11,12zarar. Bu modeller mutlaka birbirini dışlamaz ve membran onarım kolaylaştırmak için konserde işe yaramayabilir unutmamak gerekir. Düzgün hücre zarının hasar yeniden mühürlemek için başarısızlık Muskuler Distrofi (dysferlinopathy - Miyoshi myopathy, bacak-korse Muskuler Distrofi Tip IIb ve anterior tibial başlangıçlı ile distal myopathy gibi) da dahil olmak üzere birden çok hastalık durumlarında ile ilişkilidir 13, kardiyomiyopati14ve Chediak-Higashi Sendromu (CHS)15.

O uygun hücre zarının bütünlüğü ve oyun yeniden mühürlemeden verilen Sağlık ve hastalığında, önemli bir rol hücre zarı tamir temel moleküler mekanizmaları daha derin bir anlayış roman tedavi stratejileri için arama yararlı olacaktır. Bu, bu nedenle, Kinetik izlemek ve hücre zarının Onarım yeteneğini değerlendirmek için uygun deneysel teknikleri sahip olmak gereklidir. Birkaç vitro yöntemi membran onarım modelleme için tasarlanmıştır. Bir strateji bir pipet/cerrahi bıçaklı/tıraş bıçağı ile veya cam boncuk hücreleri16üzerinde çalışırken tarafından hücre kazıma kolaylaştırılabilir mekanik yaralanma içerir. Ancak, bu tür mekanik yaralanma daha büyük lezyonlar oluşturur ve hücre yaralanmalarında, içinde ve kültürler arası değişim yüksek derecede oluşturur.

Membran yaralar üreten başka bir lazer ablasyon İki fotonlu mikroskobu tarafından yöntemdir. Tek foton uyarma kullanan geleneksel lazer confocal mikroskobu aksine, İki fotonlu lazer aynı anda bir yüksek enerjili elektron17uyarma kolaylaştırmak için iki uzun dalga boyu, düşük enerjili fotonlar kullanır. Uyarma sadece odak düzlemi içinde ve tüm ışık yolunu17 (şekil 1) boyunca doğrusal olmayan bu işlem sonuçlanır. Bu uyarma birim yardımcı olur duyarlilik canlı hücreleri18,19görüntüleme en alt düzeyde tutmak için azaltılmış. Araştırmacılar bu nedenle hücre zarı ve monitör membran gerçek zamanlı olarak floresan boyalar kullanarak ve floresan yoğunluğu hücre membran yırtığı ve reseals olarak değişiklikler gözlemleyerek yeniden mühürlemeden kesin lezyonlar elde edebilecektir.

Bu yaklaşımı art arda içinde in vitro ve in vivo yaralama membran eğitim için kullanılan ve birden çok hücreye20,21türleri. Örneğin, membran fibroblastlar ve hastaların bu tekniği22,23kullanarak değerlendirildi dysferlinopathy türetilen myotubes hatalarını onarın. Ayrıca, tek kas lifleri fareler izole onarım yama oluşumu13,24,25izlemek için kullanılmıştır. Hareket fluorescently tagged proteinlerin tek kas lifleri9membran onarım sırasında da görülebilir. Ayrıca, Zebra balığı embriyo İki fotonlu lazer yaralama takip sarcolemmal onarım süreci içinde gerçek-zaman içinde vivo26görülebilmektedir.

Bu makalede, biz her ne kadar bu metodoloji plazma zarı yeteneği yeniden mühürlemeden miktarının amacıyla çeşitli hücre tiplerinin uygulanabilir hücre zarı tamir dinamiklerini kullanarak iki fotonlu lazer yaralama, fibroblastlar değerlendirmek için bir metodoloji anahat vitro. Bu yöntemde, hücreleri FM4-64 ile inkübe, olumsuz bağlanır gibi hızlı bir şekilde fluoresces lipofilik, hücre geçirimsiz boya fosfolipitler sitoplazma hücre membran lezyon üzerinden girdikten sonra içinde tahsil (Şekil 2& 3). boya Floresans membran lezyon komşu miktar sağlar kendisini yeniden mühürlemek hücre zarı için geçen süre izlemek için. Bu yöntemin yarar örneklemek için biz tam uzunlukta dysferlin (DYSF) GFP Birleşik Plasmid'ler ile transfected dysferlinopathy hastanın fibroblast hücre zarı tamir kurtarma değerlendirmek için kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmada kullanılan insan fibroblast hücre Tıp Fakültesi ve diş hekimliği University of Alberta adlı insan Etik Komitesi onay ile kullanılmıştır.

1. transfection tam uzunlukta DYSF plazmid içeren hücrelerin

  1. Kültür fibroblast hücrelerinde büyüme medya - 36 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS) 4 mL ve penisilin/streptomisin (P/S) - CO2 kuluçka 37 ° C'de 20 µL 40 mL içeren bir T225 şişesi
    Not: Hücreleri yaklaşık % 70-80 confluency kültürlü olmalı ve tamamen Konfluent olmak için izin verilmemelidir.
  2. Hücreleri tohum için hazırlamak için iki kez fosfat tamponlu tuz (PBS) 40 mL hücrelerle durulama sonra hücreleri ayırmak için % 0.05 tripsin 5 mL ekleyin. Hücreleri 37 ° C CO2 kuluçka dönün ve 5 min için hücreleri kuluçkaya.
    1. Hücreleri tamamen müstakil tripsin reaksiyonu durdurmak için büyüme ortamının 40 mL ekleyin.
    2. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri veya başka bir hücreye aygıt sayma saymak.
  3. 2 mL 1 x 105 hücre/mL, hücrelerin 35 mm kolajen kaplı cam-alt yemekleri tohum. CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya
    Not: Hücreleri yaklaşık % 50-60 birleşmesi ertesi gün olmalıdır.
  4. Büyüme ortamını çıkarın ve 2 mL serum yoksun medya (büyüme medya FBS olmadan) ile değiştirin.
  5. Hücreleri lipotransfection kullanarak tam uzunlukta dysferlin plazmid ile transfect.
    1. 150 µL serum yoksun medya 1,5 mL tüp (transfected her yemek için bir tüp) hazırlayın.
    2. Transfection reaktif 3 µL serum yoksun ortamı içeren her 1,5 mL tüp ekleyin. Oda sıcaklığında en az 5 dk kuluçkaya.
    3. Bir ayrı 1,5 mL tüp, 175 µL serum yoksun medya ve plazmid DNA 3,5 µg ekleyin.
      Not: transfected ek her yemek için yukarıdaki tutarları çarpmak.
    4. Plazmid DNA içine bir tüp ile 150 µL serum yoksun medya ve transfection reaktif içeren medya 150 µL birleştirin. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
    5. Plazmid ve transfection reaktif ile medya 300 µL çanak arasında dağıtabilmenizi. Bulaşıkları CO2 kuluçka 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya
  6. Ortamı serum içeren taze büyüme medya ile değiştirin ve bir ek 24 h 37 ° C'de CO2 kuluçka için kuluçkaya

2. İki fotonlu yaralama tahlil için hücreleri hazırlanması

  1. Pipetting tarafından medyayı çıkarın ve bir kez 1 mL Tyrode'nın çözeltisi içeren hücreleri durulama sonra taze Tyrode'nın çözüm 2.5 mm FM 1 µL içeren 1 mL ekleyin 4-64 boya.
    Not: Son FM 4-64 boya 2.5 µM bölgedir.
  2. Membran onarım kalsiyum tükenmiş bir ortamda değerlendirmesini isterseniz, PBS 1 mL hücrelerle durulayın ve 1 mL 1 mM EGTA içeren PBS ekleyin.
    Not: PBS zaman içinde ayırmak hücreleri neden olur gibi yaralama tahlil mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır.

3. İki fotonlu lazer yaralama tahlil

  1. Bir ters confocal mikroskop ve ilişkili program yazılım kullanarak, 0.2 µm x 2 µm hedef oluşturabilir ve böylece hedef satırı ile çakışıyor ve hücre zarının (Şekil 2) yönünü dikey yatıyor hücre zarı arasındaki sınırda yer.
  2. 543-nm Helene lazer FM boya sinyal heyecanlandırmak ve 600-760 nm için algılama aralığı ayarlamak için kullanın. 488-nm Argon lazer GFP sinyal (şekil 4) heyecanlandırmak ve 500-550 nm için algılama aralığı ayarlamak için kullanın.
    1. Her 5 sıralı görüntü taramaları, hücreleri görüntüleme 5 dk zaman serisi oluşturmak s.
    2. Membran lezyon üretmek için çamaşır suyu hücrelerin 820-nm için % 15 kullanarak, ayarla İki fotonlu lazer kullanarak güç 10 yinelemeler ile lazer ve hücreleri 25 s zaman serisinin başında sonra çamaşır suyu.
  3. 4-64 boya Floresans FM ölçmek için 6 µm x 6 µm bölge (ROI) ilgi çekmek ve yer bitişik yaralama konumuna ve hücre (şekil 3) içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın.
    Not: yazılım - bu uygulamada "Aralığı göstergesi" işlevini kullanarak piksel oversaturation örnekleme alanlarının önlemek için kırmızı piksel doygun piksel temsil eder. İstatistiksel analiz için bir elektronik tablo içine çiğ Floresans değerleri vermek.
  4. Arka plan (membran yaralama önce timepoints ortalama Floresans değeri) çıkararak her zaman noktası göreli Floresans değerlerini hesaplamak ve net artış tarafından Floresans bölen değer t = 0 (şekil 5, 6) .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sağlıklı insan fibroblast, dysferlinopathy olmayan tedavi hasta fibroblastlar ve hasta fibroblastlar tam uzunlukta dysferlin sıra tabi yeteneği yeniden mühürlemeden membran değerlendirmek için iki fotonlu lazer yaralama için içeren bir plazmid transfected gerçek zamanlı olarak. Sağlıklı insan fibroblast hücreleri görüntülenen lazer yaralama takip FM 4-64 Floresans etkinleştirme düzeyi düşük ve sigara tedavi hasta fibroblastlar sergilenen yaralanma takip göreli floresan yoğunluğu yüksek derecede (şekil 5& 6 ). 4-64 floresan yoğunluğu olmayan tedavi hasta denetimleri ile karşılaştırıldığında ve sağlıklı kontrol (şekil gözlenen Floresans değerlerle karşılaştırılabilir azaltılmış göreli FM tam uzunlukta dysferlin plazmid ile transfected hasta hücreleri gösterdi 5& 6).

Figure 1
Resim 1 . Bir-foton İki fotonlu mikroskobu karşı. Geleneksel bir fotonlu mikroskop sisteminde, bir tek yüksek enerji foton (UV veya görünür tayf) bir fluorophore (A) heyecanlandırmak için kullanılır. İki fotonlu sisteminde, iki alt-enerji fotonlar (yakın kızılötesi) bir fluorophore (B) heyecanlandırmak için kullanılır. Silindir içinde tasvir nasıl iki fotonlu lazer sistemi uyarma odaklanabilirsiniz gösteren odak düzlem oluşturulan Floresans sinyal odak uçaklar (A) bir özel bölge (B) ve dışlama ışık içinde için hafiftir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Bir hedef hücre zarının yerleştirerek. Yazılımı kullanarak, 0.2 µm x 2 µm hedef çizilir ve üst üste gelen ve dikey hücre zarı için yerleştirilir. Ok hedefi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . FM boya olarak sinyalini Floresans infiltratlar hücre membran rüptürü ile. Hücre membran yırtığı olarak lipofilik FM 4-64 boya hücre infiltratlar ve olumsuz ücret fosfolipitler sitoplazma içinde bağlar gibi fluoresces. Yazılımı kullanarak, bir bölge (ROI) ilgi çizilmiş (beyaz kutu) olabilir ve floresan değerleri kutusunun içindeki hücre içinde göreli Floresans değişiklikleri hesaplamak için kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . GFP Birleşik tam uzunlukta DYSF plazmid sinyalini Floresans. Plazmid transfection hastanın fibroblast hücreleri tam uzunlukta DYSF protein hızlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Floresans zamanla miktar. ROI içinde bilgisayar yazılımı tarafından hesaplanan Floresans değerlerini her tedavi grubu için zaman içinde göreli Floresans değişir belirlemek için kullanılabilir. Oku lazer ablasyon süresini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . Zaman içinde göreli Floresans değişikliği. Göreli floresan (RF) değerler her zaman için (membran yaralama önce timepoints floresan değerleri ortalaması hesaplanır) arka plan Floresans verilen Floresans değerleri (sinyal çıkararak hesaplanır Yoğunluk - arka plan ΔF =) ve net bölen t Floresans değeriyle (ΔF) artırmak = 0 (F0). Bu nedenle, RF ΔF/F0 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İki fotonlu lazer hücre membran yaralama içinde vitroyeniden mühürlemeden membran dinamikleri değerlendirmek için hassas ve çok yönlü bir tekniktir. Bu makalede, hücre zarının dysferlinopathy hasta hücrelerin tahlil yaralama İki fotonlu lazer kullanarak yeteneği yeniden mühürlemeden belirlemek için bir iletişim kuralı açıklanan. Dysferlinopathy hasta hücrelerin hücre zarının yeniden mühürleme, arızalı diğer araştırmacılar tarafından bulguları ile uyumlu olduğu ve hangi daha fazla hücre zarı dynamics kas arasında yeniden mühürlemeden çarpıcı benzerlikler vurgular bizim sonuçları göster ve 3,11,15,22-kas hücre türleri. Biz de hasta hücrelerin tam uzunlukta dysferlin sıra içeren bir plazmid ile transfected--dan onların kusurlu membran fenotip, yeniden mühürlemeden kurtarıldı o tam uzunlukta dysferlin plazmid fenotip kas-kurtarmak gösteren gözlenen hücre tipleri de olduğu gibi kas27.

Birlikte, ölçüm bir altın standart hücre olarak membran yeniden mühürlemeden yetenek içinde vitrosonuçlarımız fizibilite ve güvenilirlik-in iki fotonlu membran yaralama tahlil güçlendirmek. Ancak, maliyet ve iki fotonlu mikroskobu ile ilişkili durumu tahlil yaralama İki fotonlu membran yararlanmak isteyen bazı araştırma grupları faktörü sınırlama bir potansiyel olabilir. Ayrıca, bizim kurulum içinde vitro çalışma için uygundur ama vivo içinde görüntüleme için daha az uygun olabilir bir ters confocal mikroskobu, kullanır.

İki fotonlu lazer hizalama duyarlığını teknik başarısı için kritik olduğunu unutmamak gerekir. Deneyim, lazer hizalama sorunlarını giderme karşılaşılan en yaygın sorun oldu. Lazer yaralama sırasında sanatçının başarılı hitlerinin Puan edinildi yeteneğini etkileyebilecek diğer konular cam alt fincan sahne yanı sıra çözüm hücrelerde yönünü tesviye yer alıyor.

Tahlil hangi hücre zarının bütünlüğü veya yeniden mühürlemeden tedirgin hastalık durumlarında soruşturma mevcut ve gelecekteki çalışmaları ve terapiler, gen tedavisi ve antianlamlı Oligonükleotid tabanlı terapisi yararlanacak gibi etkinliği için geçerlidir --dan having böylece roman tedavi olanakları olabilir membran dynamics karakterize için etkili bir tahlil28,29araştırdı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser yenilik (CFI) tıp ve diş hekimliği, arkadaş, Garrett Cumming araştırma sandalye Fonu, HM Toupin nörolojik bilim araştırma sandalye Fonu, kas distrofisi Kanada, Kanada Vakfı Alberta Üniversitesi Fakültesi tarafından desteklenmiştir, Alberta ileri eğitim ve Teknoloji (AET), Kanadalı Sağlık Araştırma (CIHR), Jesse'nin yolculuk - gen ve hücre tedavisi, kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI), temeli enstitüleri ve Alberta Sağlık Çözümleri (AIHS yeniliklerin ).

Dr. Steven Laval tam uzunlukta dysferlin plazmid ile bize sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Katsuya Miyake teknik tavsiye için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312, (3), L371-L391 (2017).
  2. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
  3. McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96, (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
  4. McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (6), 499-505 (2005).
  5. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95, (4), 1205-1240 (2015).
  6. Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261, (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
  7. McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28, (8), 3660-3670 (2014).
  8. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, (Unit 4), 11-24 (2013).
  9. Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213, (6), 705-718 (2016).
  10. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140, (5), 1097-1109 (1992).
  11. Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137, (1), 93-104 (1997).
  12. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, (2), 157-169 (2001).
  13. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, (6936), 168-172 (2003).
  14. Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117, (7), 1805-1813 (2007).
  15. Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (48), 16795-16800 (2004).
  16. Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
  17. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  18. Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3, (3), 231-237 (2000).
  19. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, (5), 1808-1817 (2003).
  20. McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4592-4597 (2003).
  21. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
  22. Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
  23. Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
  24. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, (1), 56-64 (2009).
  25. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (16), 6004-6009 (2014).
  26. Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22, (3), 515-529 (2012).
  27. Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287, (33), 27629-27636 (2012).
  28. Lee, J., Yokota, T. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Springer Japan. 87-102 (2016).
  29. Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17, (9-10), 875-882 (2011).
İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).More

Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter