Summary
这项工作描述了一个协议, 以产生高分辨率的原位高中图书馆从严格分期预肠果蝇胚胎。
Abstract
研究三维染色质体系结构对基因调控机制提供了宝贵的洞察力。在这里, 我们描述了一个协议, 执行的染色质构象捕获技术原位高 C 的分期果蝇胚胎种群。结果是一个测序库, 它允许在单个实验中对细胞核中发生的所有染色质相互作用进行映射。胚胎分类是用荧光立体显微镜和含有核标记的转基因飞线人工完成的。使用这种技术, 每个核分裂周期的胚群, 并具有明确的细胞周期状态, 可以获得非常高纯度。该议定书还可用于对肠以外的老龄胚胎进行排序。已分类的胚胎被用作原位高 C 的输入。所有的实验, 包括测序库准备, 都可以在五天内完成。该协议具有较低的输入要求, 并以20期胚盘级胚胎作为输入材料可靠地工作。最终结果是对下一代排序的排序库。在测序后, 这些数据可以被处理成全基因组的染色质相互作用图, 可以使用多种可用的工具进行分析, 以获取有关拓扑关联域 (泰德) 结构、染色质循环和染色质的信息。在果蝇发育期间的车厢。
Introduction
染色质构象捕获 (3C) 已成为一个非常有用的方法来研究染色质在细胞核1的拓扑。3C 变体高 C 允许测量在单个实验2中原子核中发生的所有染色质相互作用的接触频率。在发现和表征染色质组织的许多基本原则, 如 TADs、隔间、环路3、4、5等方面, 应用高 C 技术发挥了重要作用。
在发育过渡和细胞分化的背景下, 染色质结构的研究越来越被用来解开基因调控的机制, 在这些过程中,6,7,8, 9。果蝇是一种非常感兴趣的模型生物体, 其发育和基因组具有良好的特征。然而, 很少有研究发现,在离体组织培养环境外,果蝇的染色质结构已经进行了10,11。在胚胎 16–18 h 后受精, TADs 和隔间, 让人联想到哺乳动物的相似结构10, 这引发了他们在果蝇胚胎基因调控中扮演的角色的问题发展。特别是在肠之前的早期发展阶段, 这种研究在技术上具有挑战性。在肠之前,果蝇胚胎经历13个同步核分裂, 以极快的速度8–60每周期12,13。除此之外, 由于缺乏视觉特征来区分不同的阶段, 使得很难获得足够数量的紧密的胚胎材料。
为了制定一个协议, 允许研究早期果蝇发展的染色质结构在核周期分辨率, 我们结合了两种现有的技术:原位高 C, 这使得生成的高度分辨率整体基因组联系图5, 和胚胎分期使用转基因果蝇线表达 eGFP-PCNA 转基因13,14。这种转基因本地化在细胞间的细胞核, 在有丝分裂过程中分散在合胞期胚盘。利用这一特性, 通过 GFP 信号的分散, 可以很容易地区分不同阶段的核密度和有丝分裂胚胎。
结合起来, 这些技术使研究三维染色质结构的高分辨率从多达 20果蝇胚胎。这项议定书包括关于从单一核分裂周期获取和分类果蝇胚胎以获得胚胎种群的指示。进一步描述了所获得的胚胎如何被用来进行原位的高 C。最终结果是一个核苷酸库, 适合于排序的下一代测序机。随后的测序读数可以处理成详细的染色质相互作用图, 覆盖整个果蝇基因组。
Protocol
1.果蝇胚胎采集
注意: 可以执行类似的胚胎集合, 如前一出版物15所示。
- 转移年轻的 eGFP-PCNA (< 1 周老) 进入蛋收集笼与 yeasted 收集板16 (1% 乙醇, 1% 乙酸, 和4% 琼脂)。
- 将收集笼移动到25摄氏度的孵化器中。在采集卵子前的几天孵化能显著提高卵的产量。一天两次更换收集板。
- 在30–60分钟间隔内从收集室取出含有胚胎的板块。较小的间隔导致胚胎减少, 但发育阶段的分布更紧密。从多个笼子平行收集, 以便理想的 > 200 鸡蛋奠定每30–60分钟。
- 将盘子储存在25摄氏度, 直到胚胎达到预期的年龄。为期胚盘阶段胚胎 (核周期 14), 孵化大约2小时。
- 经过2小时的孵化, 添加自来水从一个喷瓶到收集板, 使整个表面被水覆盖。用软刷子悬浮胚胎和酵母。
- 把悬浮胚胎从收集板倒入一个胚胎收集篮 (商业细胞过滤器与100µm 孔径或自制篮子17工作良好), 添加额外的自来水从一个喷瓶, 如果需要的话。在这个阶段, 将胚胎与所有平行收集的板块结合在一起。池示例表示单个批处理。
- 在三十年代用喷水瓶冲洗篮子, 直到所有的酵母残渣被冲走, 才能把胚胎洗好。
- Dechorionate 胚胎将收集篮放入水中的2.5% 次氯酸钠溶液中。旋转的光搅动方便了绒毛膜的去除。继续, 直到胚胎有足够的疏水, 使他们漂浮在解决方案的表面时, 篮子被解除和淹没, 这应该采取〜1.75–2分钟。
注意: 次氯酸钠具有腐蚀性。佩戴适当的个人防护用品。含有 < 10% 次氯酸钠的溶液通常可以放在水槽中, 一定要检查寄主机构的规章制度。 - 从溶液中取出篮子, 用水壶里的自来水彻底冲洗, 直到漂白剂的气味不再明显。
2. 胚胎固定
注: 最佳的固定条件, 主要是洗涤剂的浓度, 甲醛和固定时间, 需要经验主义地确定适合胚胎的阶段。在合胞期胚盘的各个阶段, 在水相中, 最终浓度为0.5% 海卫 X-100 和1.8% 甲醛, 工作良好。对于胚胎阶段9以外的后期阶段, 可能需要进一步优化这些参数。所有在固定和排序过程中使用的解决方案应包含蛋白酶抑制剂。
- 反转收集篮, 并将其放置在15毫升圆锥离心管。将胚胎从篮中冲洗到试管中, 使用巴斯德吸管 (pbs, 0.5% X-100)。
- 让胚胎在底部, 并调整总体积到2毫升与 PBS T。
- 在水中加入6毫升的庚烷和100µL 37% 甲醛。
注意: 在吸入或皮肤接触后, 庚烷和甲醛是有毒的。佩戴适当的个人防护设备, 并在油烟机中工作。含有庚烷或甲醛的废物必须根据主办机构的规定另行处理。 - 添加甲醛后, 启动一个15分钟定时器, 并大力摇管上下1分钟的手。水和有机相结合形成洗发水般的一致性。
- 搅拌在旋转搅拌机, 直到10分钟后添加甲醛。
- 离心机以 500 x g为1分钟, 室温下采集试管底部的胚胎。
- 吸入整个洗发水般的液体, 并丢弃它, 注意不要吸任何胚胎。剩下的少量洗发水, 如上清液不会引起问题。
- 15分钟后添加甲醛, 并用重悬的胚胎在5毫升的 PBS t 与125毫米甘氨酸, 以淬火甲醛。上下摇晃1分钟, 搅拌均匀。
- 离心机在室温下 500 x克, 1 分钟, 吸出上清。
- 用5毫升的冰冷 PBS resuspending, 将胚胎洗净。让胚胎沉淀并吸入所有上清液。
- 在步骤2.10 重复清洗两次。
- 把胚胎放在冰上直到排序。通常, 在进行排序之前收集3–4的苍蝇胚胎是一个好主意。然而, 胚胎应该在同一天进行排序。在冰上或冰箱上的扩展存储导致胚胎形态学的改变。
3. 胚胎分类
注意: 可以在任何荧光立体显微镜上进行排序, 在60–80X 放大器上装有 GFP 滤镜。
- 使用1000µL 吸管, 将一批大约100胚胎转移到适合进行排序的小玻璃容器, 最好是深色的, 然后放在冰上。
-
按核密度和细胞周期状态对胚胎进行排序 (图 1), 方法是使用针头或注射器尖端将理想的胚胎推入单独的桩中。
- 去除所有的胚胎, 分散, 非核分布的 eGFP PCNA (图 1E)。此外, 应该删除部分显示非核 GFP 信号的胚胎。
- 为了帮助排序, 在每批中使用图 1中的图片作为指南, 在核循环12、13和14中组装参考胚胎的线。使用此线来匹配一个未知阶段的胚胎与一个参考胚胎, 以确定其阶段。
- 为了验证参考胚胎的发育阶段, 用成像软件提供距离信息, 通过对胚胎进行成像和计数2500µm2的胚胎表面核的数量来测量核密度。
注: 在核循环12和20至30核的核循环 1313, 2500 µm2的区域的预期核数为12至16核。
- 一旦所有胚胎在适当的阶段被分离, 采取胚胎的图片为文献和质量控制。如果立体声显微镜本身没有配备摄像头模块, 则可以使用任何带有 GFP 过滤器的荧光显微镜。
- 用1000µL 吸管将所需的胚胎吸干, 转移到新鲜的管子上, 放在冰上。
- 继续, 直到足够的胚胎被排序的计划的实验。对于9级以上的胚胎, 一般有20个胚胎足以进行原位高 C 实验。在核循环 12, 80 胚胎是一个很好的起点。在较早的周期中, 每个周期的胚胎数量应近似加倍。
- 池和分裂胚胎成1.5 毫升管, 这样的方式, 一管含有足够的胚胎为一个单一的原位高 C 实验。最好使用低 dna 结合特性的管, 因为同一管将用于整个协议, 并且 dna 的吸附会导致低 dna 浓度的显著损失。
- 在室温下, 在 100 x g处简单地旋转管, 去除上清液。胚胎应尽可能干燥以冷冻。
- 通过将试管浸入液氮中, 并贮存在摄氏-80 摄氏度的情况下, 速冻胚胎。
4.原位高 C
- 溶解
- 在冰上放置冷冻胚胎的管子。
- 并用重悬胚在500µL 的冰冷裂解缓冲 (10 毫米三氯 pH 8.0, 10 毫米氯化钠, 0.2% IGEPAL CA-630, 蛋白酶抑制剂; 溶解在水中)。然后等待1分钟, 让胚胎在试管底部沉淀。
- 研磨胚胎使用金属微杵, 预冷却冰, 这是设计, 以紧密配合1.5 毫升离心管。
- 为了避免搅动胚胎, 慢慢地插入杵, 直到它接触到管子的底部, 向下推, 然后通过两个方向旋转两次杵来研磨。
- 轻轻提起杵, 再推到管子的底部, 重复研磨。
- 重复 4.1.3.2 10 次, 或者直到胚胎完全裂解。溶液应该是同质的, 没有剩余的大块的胚胎应该保持。
- 在冰上孵化匀质悬浮液15分钟, 旋转 1000 x g, 4 °c 5 分钟, 并丢弃上清。
- 用 resuspending 在500µL 冷裂解缓冲液中清洗颗粒, 吹打上下。
- 再次旋转如在 4.1.4, 并放弃上清。
- 并用重悬洗涤颗粒在100µL 月桂酸钠 (SDS), 吹打上下。Permeabilize 核通过孵化10分钟在65°c 在一个加热块。通过添加50µL 10% X-100 和120µL 水来淬火 SDS。通过弹管混合。
- 在热块中孵育37摄氏度, 15 分钟。
- 限制酶消化
- 添加25µL 10x 限制酶缓冲器和 20 u 5 u/µL MboI。通过弹管混合。
- 通过孵化90分钟在37摄氏度的热量块在轻微搅拌 (750 rpm) 消化 DNA。
- 再添加 20 U 的 MboI, 继续孵化90分钟。
- 热停 MboI 通过孵化在62°c 20 分钟。
- 悬置填充
注: 填充与生物素化 dATP 的悬置允许选择特定的结扎片段。在结扎路口的生物素-dATP 保护不受 T4 DNA 聚合酶的 exonuclease 活性 (4.6 节), 而 unligated 钝端生物素 dATP 有效去除。因此, 在4.7 节中使用链亲和素包覆的珠子, 特别丰富了结扎, 嵌合体的 DNA 片段。- 添加18µL 0.4 毫米 biotin-14-dATP, 2.25 µL 的未修改的 dCTP/dGTP/dTTP 混合 (3.3 毫米每), 8 µL 5 U/µL DNA 聚合酶 I 克莱诺片段。
- 混合通过弹管和孵化在37°c 90 分钟的热量块。
- 结扎
- 添加657µL 水, 120 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲器, 100 µL 10% 海卫一 X-100, 6 µL 20 毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA), 并通过弹管混合。最后添加5µL 5 U/µL T4 DNA 连接酶和混合通过弹管。
- 在室温下轻轻旋转管 (20 rpm), 2 小时。
- 添加第二期5µL 5 U/µL T4 DNA 连接酶, 并继续旋转2多 h。
- 在 2500 x g处旋转原子核5分钟, 并丢弃上清。
- DNA 提取
- 并用重悬颗粒在500µL 萃取缓冲器 (50 毫米三氯 pH 8.0, 50 毫米氯化钠, 1 毫米乙二胺乙酸 (EDTA), 1% SDS; 溶解在水中) 和添加20µL 的20毫克/毫升蛋白酶 k. 混合通过弹管。
- 消化蛋白通过孵化在55°c 30 分钟, 摇晃在 1000 rpm。
- 去交联, 增加130µL 5 米氯化钠和孵化隔夜在68摄氏度, 颤抖在1000转每分钟。
- 吸管样品入一个新的2毫升管子, 优先地与低脱氧核糖核酸结合的特征。
- 添加0.1x 卷 (63 µL) 3 米醋酸钠 pH 5.2 和2µL 的15毫克/毫升 GlycoBlue。通过反转混合好。添加1.6x 卷 (1008 µL) 纯绝对乙醇和混合通过反转。
- 在4摄氏度的 2万 x g处孵育-80 摄氏度, 15 分钟, 至少30分钟。DNA 颗粒通常很小, 几乎看不见, 只能被发现由于蓝色的 GlycoBlue。
- 非常小心地移除上清液, 将吸管尖端从 DNA 颗粒所在的对面的墙上移到管子里。在这个步骤中, 小的剩余水滴通常很容易被移除, 下面的洗涤方法是用 P10 尖把它们从管子里推出来, 而不是吹打出来。
- 通过添加800µL 70% 乙醇来清洗颗粒。在室温下以 2万 x g的反转和离心机混合5分钟. 重复此洗涤至少一次。
- 除去所有的乙醇的痕迹, 并保持管站与盖子打开高达5分钟的空气干燥。一旦没有液体残留, 添加50µL 10 毫米三氯 pH 8.0。反复用吸管把溶液放在管壁上的区域上, 在球团所在的地方溶解 DNA。
- 添加1µL 20 毫克/毫升 RNase A, 混合通过弹管, 并孵化37摄氏度15分钟, 以消化 RNA。该样本现在可以储存在冰箱过夜或冻结在-20 摄氏度无限期。
- 根据制造商的说明, 使用荧光染料的化验方法检查 DNA 浓度。样本中的 DNA 总量应至少为 10 ng, 否则太少的材料可用于放大, 而库的复杂性可能会很低。当这种情况发生时, 起始材料的数量可能是不够的, 或材料在途中丢失, 也许在溶解和降雨雪期间。
- 生物素去除与 DNA 剪切
- 加在一起12µL 10x T4 DNA 聚合酶缓冲器, 3 µL 1 毫米 dATP, 3 µL 1 毫米 dGTP, 46 µL 水。通过弹管混合。添加5µL 3 U/毫升 T4 DNA 聚合酶, 混合通过弹管和孵化20°c 30 分钟。
- 添加3µL 0.5 米 EDTA, 以停止反应, 并使用水使样品的体积约120µL。
- 根据制造商的说明, 使用超声波设备将 DNA 剪切到 200–400 bp 的大小。使用材料表中提到的 sonicator, 下面的程序是适当的: 2 周期每五十年代, 10% 责任, 强度 5, 200 循环/爆裂。
- 生物素下拉
- 吸管30µL 10 毫克/毫升链亲和素涂层磁性珠进入一个新的管, 分开他们在一个磁性立场, 并放弃上清。
- 并用重悬珠在 1x & W 缓冲 (5 毫米三氯 pH 7.4, 0.5 毫米 EDTA, 1 米氯化钠; 溶解在水中) + 0.1% 海卫 X-100 和混合涡流。把管子放在磁性支架上, 等待1–5分钟, 直到珠子分开, 这取决于制作和型号。
- 吸入和丢弃上清, 同时滑动的吸管尖端沿墙壁对面的珠子所在。并用重悬珠在120µL 2x B & W 缓冲 (10 毫米三氯 pH 7.4, 1 毫米 EDTA, 和2米氯化钠)。混合涡流。
- 将被剪切的 dna 转移到一个新的低 DNA 结合管, 并与120µL 的珠悬浮在 2X B & W 缓冲涡流。用 DNA 样品将珠子旋转20转15分钟。
- 在磁性的立场上单独的珠子和丢弃上清。
- 并用重悬珠在600µL 1x & W + 0.1% 海卫 X-100, 孵化55°c 2 分钟, 摇晃在 1000 rpm。分离后, 弃上清。重复一次洗一次。
- 用600µL 10 毫米三氯 pH 8.0 清洗珠, 分离后弃上清。
- 并用重悬珠在50µL 10 毫米三氯 pH 8.0。
5. 排序库准备
注意: 所有库步骤都是使用来自商业 DNA 库准备工具包 (见材料表) 的组件完成的。然而, 替代品或其他试剂可以替代。在贮藏过程中, 图书馆准备剂中的降水趋于形成。因此, 重要的是要确保所有的沉淀溶解之前, 使用试剂。
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结束修复
- 将50µL 10 毫米的珠悬浮液转移到新的 PCR 管中。
- 添加3µL 的末端准备酶混合物和7µL 的末端准备反应缓冲。吹打上下混合。
- 转移管到热循环仪和运行以下程序:20 °c 为30分钟, 65 °c 30 分钟, 并保持在4°c。
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适配器结扎
- 添加30µL 结扎主混合, 2.5 µL 1.5 µM 序适配器 (稀释到1.5 µM 从股票), 1 µL 的结扎增强剂的珠悬浮。吹打上下混合。
- 在热循环仪中孵育20摄氏度, 15 分钟。
- 添加3µL 的用户酶。吹打上下混合。
- 在热循环仪中孵育37摄氏度, 15 分钟。
- 在磁性的立场上单独的珠子和删除上清。
- 要洗珠, 并用重悬珠在100µL 1x & W 缓冲器 + 0.1% 海卫 X-100。混合涡流, 并转移到一个新的离心管。在磁性的立场上单独的珠子和删除上清。
- 使用同一缓冲区的600µL 重复此清洗一次。
- 并用重悬珠在600µL 10 毫米三氯 pH 8.0, 混合涡流, 并转移珠到一个新的管。
- 在磁性的立场上单独的珠子, 放弃上清, 和并用重悬珠在50µL 10 毫米三氯 pH 8.0。
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PCR 扩增
- 准备两个 PCR 管, 并在每个, 混合25µL 聚合酶主混合, 1.5 µL 10 µM 向前 (索引) pcr 底漆, 1.5 µL 10 µM 反向 (索引) pcr 底漆。
注: 前 (索引) PCR 底漆:
5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC 3´。
反向 (索引) PCR 底漆:
5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC 3´。* 表示硫代核苷酸键和 Ns 在索引 PCR 底漆。 - 在每管, 添加22µL 的珠悬浮和混合吹打上下。
- 使用以下程序运行 PCR:98 °c 为1分钟, (98 °c 为十五年代, 65 °c 为七十五年代, 倾斜1.5 °c/s) 重复9-12 次, 65 °c 为5分钟, 并且举行在4°c。
注: 放大周期的数量必须根据经验确定。然而, 我们发现, 需要12多个周期的库通常是低复杂度的, 并没有产生高质量的高 C 映射。另一方面, 需要少于12个周期的库不会因整个12周期的放大而受到负面影响。因此, 有可能默认为12周期的放大。 - 将两种 PCR 反应在单个离心管中, 在磁性支架上单独的珠子, 并将含有该库的上清液转移到新管上。
- 准备两个 PCR 管, 并在每个, 混合25µL 聚合酶主混合, 1.5 µL 10 µM 向前 (索引) pcr 底漆, 1.5 µL 10 µM 反向 (索引) pcr 底漆。
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大小选择
- 使 Ampure XP 珠悬浮到室温和混合良好的震动。
- 将汇集的 PCR 反应的容量给确切地200µL 与水。在 PCR 和磁分离过程中, 一些原始体积通常会丢失。通过将吸管设置为200µL 来验证体积, 并吸入整个反应量。如果空气是吸气, 需要增加更多的水。如果体积超过200µL, 调整添加在步骤5.4.3 和5.4.6 比例的珠子的体积。
注: 如果聚合 PCR 反应的总体积恰好是200µL, 则括号内的卷是有效的。 - 添加0.55x 卷 (110 µL) 的 Ampure XP 珠悬浮和混合吹打上下至少10次。
- 在室温下孵育5分钟, 在磁性支架上单独的珠子5分钟。
- 将上清移到新管上。丢弃含有珠子的管子。珠子有绑定 DNA > 700 bp, 这是太大, 无法排序。
- 到上清, 添加0.2x 卷 (40 µL, 导致在样品中总共 0.75x Ampure 缓冲区) Ampure XP 珠悬浮和混合吹打上下10次。
- 在室温下孵育5分钟, 在磁性支架上单独的珠子5分钟。
- 丢弃含有 DNA < 200 bp 的上清, 其中包括游离底漆、底漆脂肪酸和小到无法测序的碎片。
- 把管子放在磁支架上。要洗珠, 加700µL 80% 乙醇, 注意不要扰乱珠粒, 孵化三十年代。
- 放弃上清, 然后把管子从磁性的立场和并用重悬珠在100µL 10 毫米三氯 pH 8.0。混合吹打上下10次, 室温孵育1分钟。
- 添加0.8x 卷 (80 µL) 的 Ampure XP 珠悬浮。混合吹打上下10次, 室温孵育5分钟。这第二轮的下限大小选择确保最终图书馆是完全免费的底漆和底漆脂肪酸。
- 在磁性支架上单独的珠子5分钟, 并丢弃上清。
- 在三十年代, 每两次用700µL 80% 乙醇清洗珠粒, 同时将管子留在磁性支架上, 如上所述。
- 用管子仍然在磁性立场, 去除所有酒精的踪影。它有助于用 P10 吸管将乙醇的水滴从管子中推出。让残留乙醇蒸发最多5分钟。
- 在50µL 10 毫米的 pH 值8.0 中, 将磁支架和并用重悬珠管关闭。混合吹打上下10次。
- 在室温下孵育5分钟, 然后在磁性支架上分离珠。
- 将上清液转移到新鲜的管子。根据制造商的说明, 这是最终的高 C 库, 准备在下一代测序机上进行量化和排序。
Representative Results
根据《议定书》所述程序, 在核循环12、13和 14 (对应于一点半、1:45 和2:10 小时后受精、分别为12) 和 3–4 h 后受精 (hpf) 的胚胎种群进行了排序。通过对每种排序胚批的 eGFP-PCNA 信号的图片, 可以记录下下游实验使用的每个胚胎的精确阶段和细胞周期状态。图 1B-E显示了来自排序人群的胚胎的示例图片。原位高 C 协议的输出是一个核苷酸库, 可以在下一代测序机上进行排序。为此, 通常需要至少 2–4 nM 的最终库集中。使用推荐的输入材料量, 可可靠地实现此浓度(表 1)。
大小选择后 DNA 片段的预期大小分布在 300–600 bp 之间, 最大值在500左右 bp (图 2A), 具体取决于剪切和尺寸选择参数。对于测序, 我们建议对至少 75 bp 长度的配对端读取, 以最小化基因组中映射限制片段的数量。可以从4亿读取中获取具有. kb bin 大小的高分辨率地图。我们建议对每一个较低深度的1.5亿个重复的生物复制进行排序, 而不是在非常高的深度上对单个复制进行排序。这就允许对生物变异进行评估, 并导致由于 PCR 复制而丢弃的读取数量减少。对于可视表示形式, 可以组合复制。在对样本进行高深度排序之前, 我们建议使用浅测序 (每个样本数以百万计) 来运行示例, 以确定基本的库质量参数, 如图 2B所示。
对高 C 数据的分析需要大量的计算资源和生物信息学专业知识。作为粗略的概述, 配对读取独立映射到参考基因组, 结果对齐被筛选为质量和方向, 然后在给定的 bin 分辨率或片段级别上的联系人矩阵可以从筛选的路线。接触矩阵是所有进一步的下游分析探索 TADs, 循环和隔间的基础。对于测序读数的初步分析, 有几种生物信息学管道可用于在没有大量专门的生物信息学知识18、19 的情况下将原始读数处理成接触矩阵,20,21,22,23。如何进行进一步的分析取决于所研究的确切的生物学问题, 可能需要在 R 或 Python 的编程和脚本编写方面有很大的经验。然而, 几个调用 TADs 的工具和算法可用5、24、25、26、27、28以及软件来分析和在 web 浏览器中浏览高 C 数据, 并将其作为独立桌面应用程序29、30、31、32。
经过处理后, 可以使用不同的度量标准来确定库的质量 (图 2B)。首先, PCR 重复率, 这是由同一原始分子产生的序列读对的数量, 应该尽可能低, 以限制浪费序列读取的数量。然而, 即使有 > 40% PCR 复制的图书馆也可以被处理成高质量的联系人地图, 如果重复被过滤。第二, 由于其方向的筛选读取速率 (如4所述), 应始终低于10% 的对齐读对。
在12和14核周期之间的果蝇gastrular 开发期间, 核结构被大幅改建为33 (图 3)。在12核循环中, 检测到的 TADs 很少, 接触的整体分布非常平滑, 没有许多明显的特征。在核循环13和 14, 当 TADs 越来越突出, 不特异的长距离接触被耗尽时, 这一情况发生了巨大变化。
图 1: 排序期间 eGFP-PCNA 胚胎的代表性图片.(A) 在60分钟的采集和2小时孵化25摄氏度 (b E) 的情况下, eGFP-PCNA 信号来自未排序的胚胎种群, 在核循环 12 (b)、核循环 13 (C)、核循环 14 (D), 并从胚胎正在进行同步有丝分裂 (E)。刻度条 = 200 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 2:原位高 C 库质量指标示例。(A) Bioanalyzer 显示从成功的高 C 库 (库1、顶部) 和从库中显示的 DNA 片段大小的分布情况, 这些片段的顶点太大, 无法测序 (库 2, 底部)。库2已成功地进行了排序, 但更大数量的不需要的 DNA 片段可能导致排序率下降。(B) 筛选两个高 C 库的统计信息: 显示的是由于读取方向和距离 (内向、外向)4或 PCR 复制 (重复) 而被排除在进一步分析之外的对齐读对的数目。在每个条形图中, 绘制通过筛选器 (剩余) 和失败 (筛选) 的读取次数。传递筛选器的读取百分比另外显示为文本。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 来自分级胚胎的高 C 交互映射.作废交互映射的分辨率为 10 kb, 在33之前描述为平衡。显示的是一个2L 染色体区域.请点击这里查看这个数字的大版本.
| 图书馆 | 阶段 | 胚胎数量 | 剪切前的 DNA 数量 (ng) | PCR 周期 | 最后的图书馆集中 (毫微米) |
| 1 | 核循环12 | 71 | 46 | 12 | 28。2 |
| 2 | 核循环12 | 46 | 40 | 12 | 22。2 |
| 3 | 核循环12 | 60 | 13 | 13 | 12。3 |
| 4 | 核循环13 | 36 | 39 | 12 | 22。2 |
| 5 | 核循环13 | 35 | 10 | 12 | 5。0 |
| 6 | 核循环13 | 48 | 18 | 12 | 8。7 |
| 7 | 核循环14 | 33 | 30 | 12 | 39。8 |
| 8 | 核循环14 | 24 | 36 | 12 | 20。4 |
| 9 | 核循环14 | 14 | 8 | 12 | 4。2 |
| 10 | 3-4 hpf | 17 | 30 | 12 | 24。0 |
| 11 | 3-4 hpf | 18 | 42 | 11 | 19。1 |
| 12 | 3-4 hpf | 22 | 63 | 11 | 48。4 |
表 1: 代表性排序库统计的清单.对于列表中的每个库, 用于其生成的胚胎数量、生物素下拉和剪切前的总 DNA 总量、用于放大的 PCR 周期数以及序列库的最终浓度在纯化和大小选择被表明之后。
Discussion
这里提出的协议是非常有效的生成高质量的图谱结构的早期果蝇胚胎。与较早的协议34相比, 此处描述的方法使用最新的原位高 C 程序5, 从而更快地处理、更高的分辨率和较少的试剂使用。整个过程, 包括原位的高 C 协议, 预计将工作在广泛的阶段和实验系统, 除了果蝇。由于该协议的输入要求很低, 因此也可以用于孤立的细胞群。果蝇在这里所描述的范围以外的胚胎使用协议时, 某些参数, 特别是材料的固定, 可能需要调整。由于年长的胚胎发育一个高度不透水的角质层, 提高甲醛浓度和延长固定可能是适当的。为在核循环14以外的阶段采集胚胎, 步骤1.4 中25°c 的胚胎潜伏期需要调整如下: 核循环 12, 70 分钟;核循环 13, 90 分钟;3–4 hpf, 三点半 h。
在13的分裂分裂 (阶段 1-4), 原子核密度大致加倍与每个分裂。它们的明亮的 GFP 荧光可以很容易地识别细胞核。在有丝分裂过程中, eGFP-PCNA 不位于细胞核内, 其信号分散在整个胚胎中。此功能使识别正在进行同步分裂分裂的胚胎成为可能。为了研究染色质构象, 这些有丝分裂的胚胎通常是不可取的, 因为染色质的有丝分裂组织明显不同于界面组织35。这是可能的调整协议, 具体选择胚胎正在进行同步有丝分裂分裂。在这种情况下, 只有有分散的, 非核分布的 eGFP-PCNA 的胚胎应保持, 所有其他胚胎应丢弃。由于无法确定核密度, 因此必须使用在透射光显微术中观察到的以其形态学来分期胚胎的替代方法。胚胎周围的极细胞和细胞核的存在表明胚胎已经完成了至少9核循环, 而外围可见的 cellularization 表明核循环 1412。
高 C 实验可以使用多种限制酶5成功地进行。目前的方法通常使用识别4基序列 (如 MboI) 或6基识别站点 (如 HindIII) 的酶。4基刀具超过6基刀具的优点是, 它们提供了更高的潜在分辨率, 给定足够的测序深度, 并且更均匀地覆盖整个基因组的限制点。在5、23、36、37选择一个4基刀具时, 没有明显的优势。两种最常用的酶, MboI 和 DpnII, 都承认相同的 GATC 识别站点。DpnII 对中央甲基化不太敏感, 对果蝇没有任何关系。在这里提出的协议也可以成功地完成使用 DpnII 作为限制酶。在第4.2 节中。根据制造商的建议, 限制酶和缓冲器必须调整 DpnII 兼容性。
如果序列库的片段大小与图 2A所示的范围显著偏离, 则在排序过程中的簇形成可能效率较低或完全失败。在这种情况下, 应检查剪切后的尺寸分布, 并相应地调整剪切参数。非常小 (< 100 bp) 或非常大 (> 1000 bp) 大小的 DNA 片段分布的峰值表明了尺寸选择的问题, 例如, 应丢弃的珠子或上清液。通常, 这些小峰在这些不合适的大小的库, 如图所示, 仍然是成功的排序, 只有轻微降低集群效率。
应避免高速率的 PCR 复制, 因为这大大减少了可用序列读取的数量。PCR 重复率与输入材料量直接相关。因此, 使用更多的输入通常会缓解 PCR 重复的问题。
由于读取方向而过滤的读数越多(图 2B)表示消化不足, 这可能是由于使用太少的酶、过多的输入材料或胚胎的不完全同质化造成的。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由普朗克社会资助。C.B.H. 得到了来自国际普朗克研究学院--分子生物医学的奖学金。我们感谢谢尔比布莱斯和埃里克 Wieschaus 好心提供 eGFP-PCNA果蝇线。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
| MboI | New England Biolabs | R0147L | |
| DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
| GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
| Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
| Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
| Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
| 37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
| Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
| M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
| M165 FC DFC camera | Leica | ||
| Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
| RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
| Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
| BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
| EDTA 0.5 M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
| Sodium acetate 3 M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
| Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
| Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |
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