Summary
Dette arbejde beskrives en protokol for generation af høj opløsning i situ Hi-C biblioteker fra stramt iscenesat præ gastrulation Drosophila melanogaster embryoner.
Abstract
Undersøge den tre-dimensionelle arkitektur af kromatin tilbyder uvurderlig indsigt i mekanismerne af genregulering. Her, vi beskriver en protokol for at udføre kromatin kropsbygning capture teknik i situ Hi-C på iscenesat Drosophila melanogaster embryo populationer. Resultatet er en sekventering bibliotek, der giver mulighed for kortlægning af alle kromatin samspil, der opstår i kernen i et enkelt eksperiment. Embryo sortering gøres manuelt ved hjælp af en fluorescerende stereo-mikroskop og en transgene fluelinen indeholdende en nuklear markør. Ved hjælp af denne teknik, embryo befolkninger fra hver nukleare division cyklus og med definerede cellecyklus status, kan opnås med meget høj renhed. Protokollen kan også tilpasses sorterer ældre embryoner ud over gastrulation. Sorterede embryoner bruges som input for i situ Hi-C. Alle forsøgene, herunder sekventering bibliotek forberedelse, kan være afsluttet i fem dage. Protokollen har lav input krav og virker pålideligt bruge 20 blastoderm fase embryoner som input materiale. Slutresultatet er en sekventering bibliotek for næste generation sequencing. Efter sekvensering, kan dataene, der forarbejdes til genome-wide kromatin interaktion kort, der kan analyseres ved hjælp af en bred vifte af tilgængelige værktøjer til at få information om topologisk tilknytning domænestruktur (TAD), kromatin sløjfer og kromatin rum under Drosophila udvikling.
Introduction
Kromatin kropsbygning capture (3C) fremstod som en særdeles nyttig metode til at studere topologi af kromatin i nucleus1. 3C variant Hi-C giver mulighed for måling af kontakt frekvenser af alle kromatin samspil, der opstår i kernen i en enkelt eksperiment2. Anvendelse af Hi-C har spillet en vigtig rolle i opdagelsen og karakterisering af mange grundlæggende principper af kromatin organisation, som TADs, rum og sløjfer3,4,5.
Undersøgelser af kromatin arkitektur i forbindelse med udviklingsmæssige overgange og Celledifferentiering bruges i stigende grad at udrede mekanismerne af genregulering under disse processer6,7,8, 9. En af modelorganismer af stor interesse er Drosophila melanogaster, hvis udvikling og genom er godt præget. Men få studier, der undersøger kromatin arkitektur i Drosophila uden for in vitro- vævskultur indstillinger har været foretaget10,11. I embryoner blev 16 – 18 h post befrugtning, TADs og rum der minder om lignende strukturer i pattedyr identificeret10, hvilket rejser spørgsmålet om, hvilken rolle de spiller i RIBOREGULATION i Drosophila embryo udvikling. Især i de tidlige stadier af udvikling, før gastrulation, er sådanne undersøgelser teknisk udfordrende. Før gastrulation gennemgå Drosophila embryoner 13 synkron nukleare divisioner, der fortsætter i en ekstremt hurtigt tempo på 8-60 min. per cyklus12,13. Ud over dette, manglen visuelle funktioner til at skelne de forskellige faser gør det vanskeligt at opnå stramt iscenesatte embryo materiale i tilstrækkelige mængder.
For at udvikle en protokol, der giver mulighed for at studere kromatin arkitektur i tidlige Drosophila udvikling henne ved nuklear cyklus dagsorden, vi kombineret to eksisterende teknikker: i situ Hi-C, der giver mulighed for generation af høj opløsning hele genom kontakt kort5, og embryo iscenesættelse ved hjælp af en transgene Drosophila linje at udtrykke en eGFP-PCNA transgen13,14. Denne transgen lokaliserer til kernen under interphase og spreder i hele den syncytial blastoderm under mitosen. Ved hjælp af denne egenskab, kan man let skelne forskellige stadier af deres nukleare tæthed og mitotiske embryoner ved spredning af normal god landbrugspraksis signal.
Sammen, disse teknikker aktiverer studerer den tre-dimensionelle struktur af kromatin i høj opløsning fra så lidt som 20 Drosophila embryoner. Denne protokol indeholder instruktioner til høst og sortering Drosophila embryoner at opnå populationer af embryoner fra en enkelt nukleare division cyklus. Det beskrives yderligere, hvordan de opnåede embryoner bruges til at udføre i situ Hi-C. Slutresultatet er et nukleotid bibliotek egnet til sekvensering på næste generation sequencing maskiner. De resulterende sekventering læser kan derefter forarbejdes til detaljerede kromatin interaktion kort dækker hele Drosophila genomet.
Protocol
1. drosophila embryonerne blev indsamlet
Bemærk: En tilsvarende embryonopsamlingsteam kan udføres som vist i en tidligere publikation15.
- Overføre unge eGFP-PCNA fluer (< 1 uge gammel) ind i ægget samling bure med gæret samling plader16 (1% ethanol, 1% eddikesyre og 4% agar).
- Flytte samling bure til en inkubator, indstillet på 25 ° C. Inkubation i 1-2 dage før ægudtagningen forbedrer æg udbyttet væsentligt. Ændre samling plader to gange om dagen.
- Fjerne plader der indeholder embryoner fra samling kammer i 30-60 min. intervaller. Mindre intervaller resultere i færre embryoner, men strammere distribution af udviklingsstadier. Indsamle fra flere bure parallelt så der ideelt > 200 æg er lagt hver 30-60 min.
- Opbevar plader ved 25 ° C, indtil embryoner har nået den ønskede alder. For blastoderm fase embryoner (nukleare cyklus 14), inkuberes i ca 2 timer.
- Efter 2 h inkubation, tilføje postevand fra en sprøjte flaske indsamling plade så hele overfladen er dækket med vand. Suspendere embryoner og gær, ved hjælp af en blød børste.
- Hæld resuspenderet embryoner fra indsamling plade i en embryo samling basket (kommercielle celle sier med 100 µm porestørrelse eller hjemmelavet kurve17 arbejde godt), tilføje yderligere postevand fra en sprøjte flaske, hvis nødvendigt. På dette stadium, kombinere embryoner fra alle plader, der blev indsamlet i parallel. Den samlede prøve udgør et enkelt parti.
- Vaske embryoner godt ved skylning kurv med postevand fra en sprøjte flaske for 30 s indtil alle gær rester er skyllet væk.
- Dechorionate embryoner ved at placere samling kurv til 2,5% natriumhypochlorit opløsning i vand. Lys agitation af hvirvlende letter fjernelse af chorion. Fortsætte indtil embryoner er tilstrækkeligt hydrofobe, så de flyder på overfladen af løsningen når kurven er løftet ud og neddykket igen, som bør tage ~1.75–2 min.
Forsigtig: natriumhypochlorit er ætsende. Bære passende personlige værnemidler. Opløsninger indeholdende < 10% natriumhypochlorit kan normalt bortskaffes i vasken, Sørg for at tjekke reglerne i instituttets vært. - Fjern kurven fra opløsningen og skyl grundigt med postevand fra en sprøjte flaske indtil blegemiddel lugten er ikke længere synlige.
2. Foster fiksation
Bemærk: Optimale fiksering betingelser, primært koncentrationen af vaskemiddel, formaldehyd og varigheden af fiksering, skal være empirisk fast besluttet på at passe fase af embryoner. For faser omkring den syncytial blastoderm, en endelig koncentration på 0,5% Triton X-100 og 1,8% formaldehyd i den vandige fase arbejde godt. For senere stadier ud over embryo etape 9, kan yderligere optimering af disse parametre være nødvendigt. Alle løsninger anvendes under fiksering og sortering skal indeholde proteasehæmmere.
- Invertere samling kurv og Placer det over en 15 mL konisk centrifugering tube. Skyl embryoner fra kurven ind i røret ved hjælp af Pasteurs pipette udlevering PBS-T (PBS, 0,5% Triton X-100).
- Lad embryoner nøjes nederst og justere det samlede volumen til 2 mL med PBS-T.
- Tilføj 6 mL heptan og 100 µL af 37% formaldehyd i vand.
Forsigtig: Heptan og formaldehyd er giftige ved indånding eller efter hud kontakt. Bære passende personlige værnemidler og arbejde i et stinkskab. Affald indeholdende heptan eller formaldehyd må bortskaffes separat ifølge vært institute's regler. - Efter tilsætning af formaldehyd, starte en 15 min timer og ryst glasset op og ned for 1 min i hånden. Den vandige og den organiske fase vil kombinere form en shampoo-lignende konsistens.
- Agitere på en rotatorisk mixer indtil 10 min efter tilsætning af formaldehyd.
- Der centrifugeres 500 x g i 1 minut ved stuetemperatur til at indsamle embryoner i bunden af røret.
- Opsug den hele shampoo-lignende væske og kassere det, pas på ikke for at Aspirér enhver embryoner. Lille resterende mængder af shampoo-lignende supernatanten forårsager ikke problemer.
- 15 min efter tilsætning af formaldehyd, resuspend embryoner i 5 mL PBS-T med 125 mM glycin til dæmpning af formaldehyd. Bland kraftigt ved at ryste op og ned i 1 minut.
- Der centrifugeres ved 500 x g ved stuetemperatur i 1 minut og Opsug supernatanten.
- Vask embryoner af resuspending dem i 5 mL iskold PBS-T. Lad embryoner settle og aspirat alle supernatanten.
- Gentag vask i trin 2.10 to gange mere.
- Opbevare embryoner på is indtil sortering. Normalt er det en god idé at indsamle 3 – 4 partier af flyve embryoner, før du fortsætter til sortering. Embryoner skal dog sorteres samme dag. Opbevaring på is eller i køleskab fører til ændrede embryo morfologi.
3. embryo sortering
Bemærk: Sortering kan ske på enhver fluorescerende stereo-mikroskop udstyret med en normal god landbrugspraksis filter på 60 – 80 X forstørrelse.
- Ved hjælp af en 1.000 µL pipette, overføre en batch af ca. 100 embryoner til et lille glas fartøj egnet til sortering, helst af en mørk farve, og placere den på is.
-
Sorter embryoner af nukleare tæthed og cellecyklus status (figur 1) ved at skubbe ønskeligt embryoner i en separat bunke ved hjælp af en kanyle eller sprøjte tip.
- Fjerne alle embryoner med spredte, ikke-nukleare distribution af eGFP-PCNA (figur 1E). Også, embryoner, der delvist viser en ikke-nukleare normal god landbrugspraksis signal bør fjernes.
- For at støtte i den sortering, skal du samle en line-up af reference embryoner på nukleare cyklus 12, 13 og 14 i hvert parti bruger billederne i figur 1 som guide. Brug denne line-up til at matche embryoner på et ukendt tidspunkt med en af reference embryoner for at bestemme deres fase.
- Du kan kontrollere udviklingsstadiet for reference embryoner, måle nukleare tætheden af imaging fosteret og tælle antallet af kerner på overfladen af embryo i et område med 2.500 µm2 ved hjælp af billedbehandling software, der giver afstand oplysninger.
Bemærk: Det forventede antal kerner til et område med 2.500 µm2 er 12 til 16 kerner på nukleare cyklus 12 og 20 til 30 kerner på nukleare cyklus 1313.
- Når alle embryoner på det relevante tidspunkt er adskilt, tage billeder af embryoner til dokumentation og kvalitetskontrol. Hvis stereo-mikroskop ikke er selv udstyret med et kameramodul, kan enhver epifluorescensmikroskop med normal god landbrugspraksis filtre anvendes.
- Pipetteres op de ønskede embryoner ved hjælp af en 1.000 µL pipette, overførsel til en frisk rør og sted på is.
- Fortsætte indtil nok embryoner sorteres for de planlagte eksperiment. For embryoner ældre end stage 9, er generelt 20 embryoner tilstrækkelige for én i situ Hi-C eksperiment. Nukleare cyklus 12 er 80 embryoner et godt udgangspunkt. I tidligere cyklusser, bør antallet af embryoner ca fordobles for hver cyklus.
- Pool og split embryoner i 1,5 mL rør på en sådan måde, at en tube indeholder nok embryoner til en enkelt i situ Hi-C eksperimentere. Det er tilrådeligt at bruge rør med lav DNA bindende egenskaber, da det samme rør vil blive brugt til den hele protokol og adsorptionen af DNA kan føre til betydelige tab i lave koncentrationer på DNA.
- Spin rør kort på 100 x g ved stuetemperatur og Fjern supernatanten. Embryonerne skal være så tørre som muligt til nedfrysning.
- Flash fryse embryoner ved nedsænkning rør i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.
4. in Situ Hej-C
- Lysis
- Sted rør med frosne embryoner på is.
- Resuspend embryoner i 500 µL af iskold lysisbuffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, proteasehæmmere, opløst i vand). Derefter vente 1 min. at lade embryoner nøjes i bunden af røret.
- Grind embryoner ved hjælp af en metal mikro pistil, pre afkølet på is, der er designet til at passe stramt en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- For at undgå at agitere embryoner, indsætte pistil langsomt, indtil den rører bunden af røret, Tryk ned og derefter male ved at dreje pistil to gange i begge retninger.
- Løft pistil meget lidt, skubbe til bunden af glasset igen, og Gentag slibning.
- Gentag 4.1.3.2 10 gange, eller indtil embryonerne er helt mængden. Løsningen skal være homogen, og ingen tilbageværende store stykker af embryoner skal forblive.
- Inkuber homogeniseret suspension på is i 15 min. Spin på 1.000 x g, 4 ºC i 5 min, og kassér supernatanten.
- Vask pellet ved resuspending i 500 µL iskold lysisbuffer, pipettering op og ned.
- Spin igen som 4.1.4, og kassér supernatanten.
- Resuspend vasket pellet i 100 µL af 0,5% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), pipettering op og ned. Permeabilize kerner af inkubere i 10 min. ved 65 ° C i en varme blok. Dæmpning SDS ved at tilføje 50 µL af 10% Triton X-100 og 120 µL vand. Bland ved at bladre til røret.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min i varme blok.
- Begrænsning enzym fordøjelsen
- Tilsæt 25 µL af 10 x begrænsning enzym buffer og 20 U af 5 U/µL MboI. Bland ved at bladre til røret.
- Fordøje DNA ved at inkubere i 90 min ved 37 ° C i varme blok under let omrøring (750 rpm).
- Tilføje en anden 20 U af MboI og fortsætte inkubation i 90 min.
- Varme-Deaktiver MboI af inkubere ved 62 ° C i 20 min.
- Overhæng fill-in
Bemærk: Udfylde overhæng med biotinylated dATP giver mulighed for valg af specifikke sammenskrevne fragmenter. Biotin-dATP i ligatur vejkryds er beskyttet fra exonuclease aktivitet af T4 DNA Polymerase (afsnit 4.6), der henviser til, at biotin-dATP i unligated stumpe ender er effektivt fjernet. Rullegardinmenuen bruger streptavidin-belagte perler i afsnit 4.7 derfor specifikt beriger for sammenskrevne, kimære DNA fragmenter.- Tilføje 18 µL af 0,4 mM biotin-14-dATP, 2.25 µL af en umodificeret dCTP/dGTP/dTTP mix (3,3 mM) og 8 µL af 5 U/µL DNA Polymerase I Klenow Fragment.
- Bland ved at bladre til røret og inkuberes ved 37 ° C i 90 min i varme blok.
- Ligatur
- Tilføje 657 µL vand, 120 µL af 10 x T4 DNA Ligase Buffer, 100 µL af 10% Triton X-100, 6 µL af 20 mg/mL bovint serumalbumin (BSA), og blandes ved at bladre til røret. Endelig tilføje 5 µL af 5 U/µL T4 DNA Ligase og blandes ved at bladre til røret.
- Rotere rør forsigtigt (20 rpm) ved stuetemperatur i 2 timer.
- Tilføje en anden rate af 5 µL af 5 U/µL T4 DNA Ligase og fortsætte med roterende for 2 mere h.
- Spin ned kerner på 2.500 x g i 5 min og kassér supernatanten.
- DNA-ekstraktion
- Resuspend pellet i 500 µL af ekstraktionsbuffer (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 1% SDS, opløst i vand) og tilføje 20 µL af 20 mg/mL proteinase K. Mix ved at bladre til røret.
- Fordøje protein ved at inkubere ved 55 ° C i 30 min, ryster ved 1000 rpm.
- At de-bitmapgenkendelse, tilføje 130 µL af 5 M NaCl og der inkuberes natten over ved 68 ° C, ryster ved 1000 rpm.
- Pipette prøven i et nyt 2 mL tube, fortrinsvis med lav DNA bindende egenskaber.
- Tilføje 0,1 x diskenheder (63 µL) af 3 M natrium acetat pH 5,2 og 2 µL af 15 mg/mL GlycoBlue. Bland godt af invertere. Tilføje 1,6 x diskenheder (1,008 µL) af ren absolut ethanol og mix af invertere.
- Inkuber ved-80 ° C i 15 min. Centrifuge på 20.000 x g ved 4 ° C i mindst 30 min. DNA pellet er ofte meget små, næsten usynlig, og kan kun blive opdaget på grund af den blå farve af GlycoBlue.
- Fjern supernatanten meget omhyggeligt, flytte pipette spidsen ind i røret langs den modsatte væg fra hvor DNA pellet er placeret. Lille resterende dråber er ofte nemt fjernes under dette trin og de følgende vasker ved at skubbe dem ud af rørene ved hjælp en P10 tip snarere end pipettering dem ud.
- Vask pellet ved at tilføje 800 µL af 70% ethanol. Mix af invertere og centrifugeres ved 20.000 x g ved stuetemperatur i 5 min. Gentag denne vaskes mindst én gang.
- Fjerne alle spor af ethanol og forlade tube stående låg er åben for op til 5 min at lufttørre. Når ingen væske der er tilbage, tilsæt 50 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Gentagne gange afpipetteres løsningen over området på væggen i røret hvor pellet lå til solubilize DNA.
- Tilføj 1 µL af 20 mg/mL RNase A, mix af svippede røret, og der inkuberes ved 37 ° C i 15 min at fordøje RNA. Prøven kan nu opbevares i køleskabet natten over eller frosset ved-20 ° C på ubestemt tid.
- Check koncentrationen af DNA med et fluorescerende farvestof baseret assay ifølge producentens anvisninger. Den samlede mængde af DNA i stikprøven skal være mindst 10 ng, ellers for lidt materiale er tilgængeligt for forstærkning og bibliotek kompleksitet vil sandsynligvis være lav. Når dette sker, mængden af start materiale sandsynligvis ikke var tilstrækkelig, eller materiale var tabt undervejs, måske under lysis og nedbør.
- Biotin fjernelse og DNA klipning
- Tilføje sammen 12 µL af 10 x T4 DNA Polymerase buffer, 3 µL af 1 mM dATP, 3 µL af 1 mM dGTP og 46 µL vand. Bland ved at bladre til røret. Tilsæt 5 µL af 3 U/mL T4 DNA Polymerase, mix af svippede røret og inkuberes ved 20 ° C i 30 min.
- Tilføje 3 µL af 0,5 M EDTA at stoppe reaktionen, og bruge vand til at bringe prøven til et volumen på cirka 120 µL.
- Shear DNA til en størrelse på 200 – 400 bp ved hjælp af sonikering enhed ifølge producentens anvisninger. Bruger sonikator nævnt i Tabel af materialer, kan følgende program er passende: 2 cykler hver 50 s, 10% told, intensitet 5, 200 cykler/burst.
- Biotin pulldown
- Der afpipetteres 30 µL af 10 mg/mL streptavidin belagt magnetiske perler i en ny tube, adskille dem på en magnetisk stå, og kassér supernatanten.
- Resuspend perler i 1 x B & W buffer (5 mM Tris-Cl pH 7,4, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, opløst i vand) + 0,1% Triton X-100 og blanding af vortexing. Sted rør på en magnetisk stå og vente på 1-5 min. indtil perlerne er adskilt, afhængigt af mærke og model.
- Opsug og kassér supernatanten mens glidende pipette tip langs væggen overfor hvor perlerne er placeret. Resuspend perler i 120 µL af 2 x B & W buffer (10 mM Tris-Cl pH 7,4, 1 mM EDTA og 2 M NaCl). Mix af vortexing.
- Overføre afrevne DNA til en ny lav DNA bindende tube, og blandes med 120 µL af perle suspension i 2 X B & W buffer ved vortexing. Rotere perler med DNA-prøven ved 20 rpm i 15 min.
- Separat perler på en magnetisk stå og kassér supernatanten.
- Resuspend perler i 600 µL 1 x B & W + 0,1% Triton X-100, og der inkuberes ved 55 ° C i 2 min., ryster ved 1000 rpm. Efter adskillelse, Fjern supernatanten. Gentag denne vask en gang.
- Vaske perlerne engang med 600 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0, og kassér supernatanten efter adskillelse.
- Resuspend perler i 50 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0.
5. sekventering bibliotek forberedelse
Bemærk: Alle bibliotek trin er udført ved hjælp af komponenter fra en kommerciel DNA bibliotek forberedelse kit (Se Tabel af materialer). Men alternative kits eller andre reagenser kan erstattes. Nedbør har tendens til at form i præparationer bibliotek under fryseren opbevaring. Det er derfor vigtigt at sikre, at alle nedbør er opløst før ved hjælp af reagenserne.
-
Ende reparation
- Overføre perle suspension i 50 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8.0 til en ny PCR rør.
- Tilføje 3 µL af slutningen Prep enzym Mix og 7 µL af slutningen Prep reaktion Buffer. Mix af pipettering op og ned.
- Overføre rør til en termisk cycler og køre følgende program: 20 ° C i 30 min, 65 ° C i 30 min, og hold på 4 ° C.
-
Adapter ligatur
- Tilføj 30 µL af ligatur Master Mix, 2,5 µL af 1,5 µM sekventering adapter (fortyndes til 1,5 µM fra lager), og 1 µL af ligatur forstærker til perle suspension. Mix af pipettering op og ned.
- Der inkuberes ved 20 ° C i 15 min i en termisk cycler.
- Tilføje 3 µL af brugeren enzym. Mix af pipettering op og ned.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min i en termisk cycler.
- Separat perler på en magnetisk stå og Fjern supernatanten.
- At vaske perlerne, resuspend perler i 100 µL 1 x B & W buffer + 0,1% Triton X-100. Blanding af vortexing og overførsel til en ny microcentrifuge tube. Separat perler på en magnetisk stå og Fjern supernatanten.
- Gentag denne vask, én gang med 600 µL af den samme buffer.
- Resuspend perler i 600 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0, blanding af vortexing, og overføre perler til en ny tube.
- Adskille perler på en magnetisk stå og kassér supernatanten resuspend perler i 50 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0.
-
PCR-amplifikation
- Forbered to PCR rør og i hver, blandes 25 µL af Polymerase Master Mix, 1,5 µL af 10 µM fremad (ikke-indekserede) PCR primer og 1,5 µL af 10 µM omvendt (indekserede) PCR primer.
Bemærk: Fremad (ikke-indekserede) PCR primer:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.
Reverse (indekserede) PCR primer:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * Angiver phosphorothioate obligationer og Ns i den indekserede PCR primer. - Tilføj 22 µL af perle suspension og mix af pipettering op og ned i hver tube.
- Køre PCR ved hjælp af følgende program: 98 ° C i 1 min, (98 ° C i 15 s, 65 ° C i 75 s, ramping 1,5 ° C/s) gentog 9 - 12 gange, 65 ° C i 5 min, og hold på 4 ° C.
Bemærk: Antallet af forstærkning cykler har fastsættes empirisk. Dog fandt vi at biblioteker, der kræves mere end 12 cykler var generelt af lav kompleksitet og resulterede ikke i høj kvalitet Hi-C kort. På den anden side var biblioteker, der kræves mindre end 12 cykler ikke negativt påvirket ved at forstærke for en fuld 12 cyklusser. Det er derfor muligt at standard til 12 cyklusser af forstærkning. - Pool to PCR reaktioner i en enkelt microcentrifuge rør, adskille perler på en magnetisk stå og overføre supernatanten indeholdende bibliotek til en ny tube.
- Forbered to PCR rør og i hver, blandes 25 µL af Polymerase Master Mix, 1,5 µL af 10 µM fremad (ikke-indekserede) PCR primer og 1,5 µL af 10 µM omvendt (indekserede) PCR primer.
-
Valg af størrelse
- Bringe Ampure XP perle suspension til stuetemperatur og bland godt ved omrystning.
- Bringe mængden af poolede PCR reaktion ved præcis 200 µL med vand. Under PCR og magnetisk separation, nogle af den originale lydstyrke er normalt tabt. Kontrollere lydstyrken ved at angive pipetten til 200 µL og Opsug den hele mængde af reaktionen. Hvis luften er indsugning, mere vand skal tilføjes. Hvis den overstiger 200 µL, justere lydstyrken på perler tilføjede i trin 5.4.3 og 5.4.6 proportionalt.
Bemærk: Bind i parentes er gyldig, hvis den samlede mængde af de poolede PCR reaktioner er præcis 200 µL. - Tilføje 0,55 x diskenheder (110 µL) af Ampure XP perle suspension og mix af pipettering op og ned på mindst 10 gange.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 min, separat perler på en magnetisk stå i 5 min.
- Flytte supernatanten til en ny tube. Kassér rør indeholdende perlerne. Perlerne har bundet DNA > 700 bp, som er for store til at blive sekventeret.
- Supernatanten, tilføje 0,2 x diskenheder (40 µL, hvilket resulterer i alt 0,75 x Ampure buffer i prøven) af Ampure XP perle suspension og mix af pipettering op og ned 10 gange.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 min, separat perler på en magnetisk stå i 5 min.
- Kassér supernatanten, som indeholder DNA < 200 bp, som omfatter gratis primere, primer dimere og fragmenter for små til at blive sekventeret.
- Forlade røret på den magnetiske stand. At vaske perlerne, tilføje 700 µL 80% ethanol, tager sig ikke at forstyrre perle pellet, og Inkuber i 30 s.
- Kassér supernatanten, derefter tage tube fra magnetiske standeren og resuspend perler i 100 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Mix af pipettering op og ned 10 gange, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 minut.
- Tilføje 0,8 x diskenheder (80 µL) af Ampure XP perle suspension. Mix af pipettering op og ned 10 gange og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Denne anden runde af nedre grænse størrelse udvalg sikrer, at den endelige bibliotek er helt fri af primere og primer dimerer.
- Separat perler på en magnetisk stå i 5 min og kassér supernatanten.
- Vaske perle pellet to gange med 700 µL 80% ethanol til 30 s hver, mens de forlader røret på magnetisk standen, som ovenfor.
- Med rør stadig på den magnetiske stå, fjerne alle spor af ethanol. Det hjælper til at skubbe dråber af ethanol fra røret ved hjælp af en P10 pipette. Lad resterende ethanol inddampes til et maksimum på 5 min.
- Tage tube fra magnetiske standeren og resuspend perler i 50 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Mix af pipettering op og ned 10 gange.
- Inkuber ved stuetemperatur til 5 min og derefter separat perler på en magnetisk stand.
- Overføre supernatanten til en frisk tube. Dette er den endelige Hi-C library, klar til at være kvantificeret og sekventeret på næste generation sequencing maskiner, ifølge producentens anvisninger.
Representative Results
Sorteret embryo befolkninger på nukleare cyklus 12, 13 og 14 (svarende til 1:30, 1:45, og 2:10 timer sende befrugtning, henholdsvis12) og 3-4 h post befrugtning (hpf) blev opnået efter procedurerne i protokollen. Ved at tage billeder af eGFP-PCNA signal af hvert sorteret embryo parti, er det muligt at dokumentere præcise fase og cellecyklus status for hver enkelt embryon, der er brugt i downstream eksperimenter. Eksempel billeder af embryoner fra sorterede populationer er vist i figur 1B-E. Produktionen af i situ Hi-C protokollen er et nukleotid bibliotek klar til at blive sekventeret på næste generation sequencing maskiner. Til dette formål er en endelige bibliotek koncentration af mindst 2 – 4 nM normalt kræves. Ved hjælp af de anbefalede mængder af råmateriale, denne koncentration er pålideligt opnåede (tabel 1).
Den forventede størrelse fordeling af DNA fragmenter efter størrelse udvælgelse er mellem 300-600 bp, med et maksimum på omkring 500 bp (figur 2A), afhængigt af den nøjagtige klipning og størrelse udvælgelse parametre. Til sekvensering anbefaler vi parret ende læser i mindst 75 bp længde til at minimere antallet af tilknyttes begrænsning fragmenter i genomet. Høj opløsning kort med 1 – 2 kb bin størrelse kan fås fra 400 millioner læser. Vi anbefaler sekventering flere biologiske replikater på en lavere dybde af ~ 150 millioner læser hver, i stedet for sekventering en enkelt replikat på stor dybde. Dette giver mulighed for vurdering af den biologiske variation og fører til et lavere antal kasserede læser på grund af PCR dobbeltarbejde. For visuel repræsentation, kan replikater kombineres. Før der indgås sekventering en stikprøve på stor dybde, anbefaler vi kører prøver ved hjælp af lavvandede sekventering (et par millioner læsninger pr. sample) til at bestemme grundlæggende bibliotek kvalitetsparametre som i figur 2B.
Analyse af data, Hi-C kræver betydelige beregningsmæssige ressourcer og bioinformatik ekspertise. Som et groft overblik, de parrede læser selvstændigt er tilknyttet reference genomet, de deraf følgende tilpasninger er filtreret for kvalitet og orientering, så en matrix af kontaktpersoner på en given beslutning eller fragment placeringsniveau kan genereres fra den filtrerede linjeføringer. Kontakt matrix er grundlaget for alle videre downstream analyse at udforske TADs, loops og rum. Flere Bioinformatik rørledninger findes til den indledende analyse af sekventering læsninger, der aktiverer forarbejdning af rå læsninger til kontakt matricer uden meget specialiserede Bioinformatik viden18,19, 20,21,22,23. Hvordan er foretaget yderligere analyse ud i vid udstrækning afhænger af den nøjagtige biologiske spørgsmål under undersøgelsen og kan kræve betydelig erfaring i programmering og scripting i R eller Python. Men flere værktøjer og algoritmer til at kalde TADs er tilgængelige5,24,25,26,27,28, samt software til at analysere og udforske Hi-C data i webbrowseren og som stand-alone skrivebordsprogrammer29,30,31,32.
Når behandlet, kan kvaliteten af biblioteket bestemmes ved hjælp af forskellige målinger (figur 2B). Første bør sats af PCR dubletter, som er antallet af sekventeret Læs par udspringer af samme molekyle, være så lavt som muligt for at begrænse mængden af spildt sekvens læser. Men selv biblioteker med > 40% PCR dobbeltarbejde kan forarbejdes til høj kvalitet kontakt maps, hvis dubletter, som er filtreret. Andet bør sats af filtrerede læser på grund af deres orientering, som beskrevet i4, konsekvent være lavere end 10% af justeret Læs par.
Under pre gastrular udvikling af Drosophila mellem nuklear cyklus 12 og 14 er den nukleare arkitektur drastisk remodeled33 (figur 3). Nukleare cyklus 12, par TADs er fundet, og den samlede fordeling af kontakter er meget glat uden mange mærkbare funktioner. Dette er dramatisk ændret på nukleare cyklus, 13 og 14, når TADs er stadig mere fremtrædende og uspecifik langtrækkende kontakter er forarmet.
Figur 1: repræsentative billeder af eGFP-PCNA embryoner under sortering. (A) eGFP-PCNA signal fra en usorteret befolkning af embryoner efter 60 min samling og 2 h inkubation ved 25 ° C (B-E) eksempler på embryoner fra sorterede befolkninger på nukleare cyklus 12 (B), nukleare cyklus 13 (C), 14 () nukleare cyklus D), og fra embryoner gennemgår synkron mitosen (E). Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempler på i situ Hi-C bibliotek quality metrics. (A) Bioanalyzer spor viser fordelingen af DNA fragment størrelser fra en vellykket Hi-C library (bibliotek 1, top) og et bibliotek, der viser en top af fragmenter, der er for store til sekventering (bibliotek 2, nederst). Biblioteket 2 var med held sekventeret, men endnu større mængder uønskede DNA fragmenter kan føre til nedsat sekventering udbytter. (B) filtrering statistik af to Hi-C biblioteker: vises er antallet af justeret Læs par, der er udelukket fra yderligere analyse på grund af Læs retning og afstand (indad, udad)4 eller PCR overlapning (dubletter). I hver søjle afbildes antallet læsninger passerer filteret (resterende) og svigtende (filtreret). Procentdelen af læser passerer filteret er desuden vist som tekst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hej-C interaktion kort fra iscenesatte embryoner. Hej-C interaktion kortene er arkiveret lodret med 10 kb opløsning og afbalanceret som beskrevet før33. Vist er et område på kromosom 2 L. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Bibliotek | Fase | Antallet af embryoner | Mængde DNA før klipning (ng) | PCR cyklus | Endelige bibliotek koncentration (nM) |
| 1 | nukleare cyklus 12 | 71 | 46 | 12 | 28.2 |
| 2 | nukleare cyklus 12 | 46 | 40 | 12 | 22,2 |
| 3 | nukleare cyklus 12 | 60 | 13 | 13 | 12.3 |
| 4 | nukleare cyklus 13 | 36 | 39 | 12 | 22,2 |
| 5 | nukleare cyklus 13 | 35 | 10 | 12 | 5.0 |
| 6 | nukleare cyklus 13 | 48 | 18 | 12 | 8.7 |
| 7 | nukleare cyklus 14 | 33 | 30 | 12 | 39,8 |
| 8 | nukleare cyklus 14 | 24 | 36 | 12 | 20.4 |
| 9 | nukleare cyklus 14 | 14 | 8 | 12 | 4.2 |
| 10 | 3-4 hpf | 17 | 30 | 12 | 24,0 |
| 11 | 3-4 hpf | 18 | 42 | 11 | 19.1 |
| 12 | 3-4 hpf | 22 | 63 | 11 | 48.4 |
Tabel 1: liste over repræsentative sekventering bibliotek statistik. For hvert bibliotek på listen, antallet af embryoner, der er anvendt til sin generation, mængden af samlede DNA før biotin pulldown og klipning, målt ved Qubit, antallet af PCR-cykler anvendes til forstærkning, og den endelige koncentration af biblioteket sekventering efter rensning og størrelse udvælgelse er angivet.
Discussion
Protokollen præsenteres her er meget effektiv til at skabe høj kvalitet kort af kromatin arkitektur i tidlige Drosophila embryoner. Sammenlignet med en tidligere protokollen34, bruger fremgangsmåden her en up-to-date i situ Hi-C procedure5, resulterer i hurtigere behandling, højere opløsning, og mindre brug af reagens. Den generelle procedure herunder i situ Hi-C protokollen forventes at arbejde på en lang række faser og eksperimentelle systemer udover Drosophila. Da protokollen har en lav input krav, kan den også bruges på isolerede cellepopulationer. I Drosophila, når ved hjælp af protokollen for embryoner uden for intervallet beskrevet her, nogle parametre, navnlig fiksering af materialet, skal måske justeres. Da ældre embryoner udvikler et stærkt vandtætte kutikula, kan at hæve koncentrationen af formaldehyd og forlænge fiksering være passende. Til samling af embryoner i faser end nuklear cyklus 14, inkuberingstider af embryoner ved 25 ° C i trin 1.4 skal justeres som følger: nukleare cyklus 12, 70 min.; nukleare cyklus 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 3:30 h.
I løbet af 13 kavalergang divisionerne (fase 1-4), fordobler kerner massefylde ca med hver division. Kerner kan let identificeres ved deres lyse normal god landbrugspraksis fluorescens. Under mitosen, eGFP-PCNA er ikke placeret i kernen, og signalet er spredt over hele fosteret. Denne funktion gør at identificere embryoner, der befinder sig i en synkron kavalergang division muligt. For at studere kromatin kropsbygning, er disse mitotiske embryoner normalt ikke ønskeligt, da den mitotiske organisationen af kromatin er drastisk anderledes end interphase organisation35. Det er muligt at tilpasse protokollen du specifikt vælger embryoner undergår en synkron mitotiske division. I dette tilfælde kun embryoner med spredte, ikke-nukleare distribution af eGFP-PCNA skal holdes, og alle andre embryoner skal kasseres. Da den nukleare tæthed ikke kan bestemmes, skal alternative metoder til fase embryoner ved deres morfologi, set i overførte lysmikroskopi være ansat. Tilstedeværelsen af stangen celler og cellekerner i embryo periferien indikere, at fosteret har afsluttet mindst nukleare cyklus 9, synlige cellularization i periferien viser nukleare cyklus 1412.
Hej-C eksperimenter kan udføres korrekt, ved hjælp af et bredt udvalg af restriktionsenzymer5. Nuværende metoder bruger typisk enzymer, der genkender enten en 4-base sekvens, såsom MboI, eller en 6-base genkendelsessekvens, såsom HindIII. Fordelen ved 4-base kuttere over 6-base kuttere er, at de tilbyder højere potentielle opløsning, givet nok sekventering dybde, og en mere jævn dækning af begrænsning websteder på tværs af genomet. Der er ingen klar fordel i at vælge en 4-base fræser over en anden5,23,36,37. De to mest almindeligt anvendte enzymer, MboI og DpnII, genkende begge den samme GATC'EN anerkendelse websted. DpnII er mindre følsomme over for CpG methylering, der er ikke noget problem i Drosophila. Protokollen præsenteres her kan også være fuldført ved hjælp af DpnII som en begrænsning enzym. I afsnit 4.2. begrænsning enzym og buffer har tilpasses DpnII kompatibilitet, efter producentens anvisninger.
Hvis biblioteket sekventering fragment størrelse afviger betydeligt fra det område, vist i figur 2A, kan klynge dannelse under sekventering være mindre effektive eller mislykkes helt. I dette tilfælde den størrelse fordeling efter klipning bør kontrolleres og klipning parametre justeret i overensstemmelse hermed. Toppe i fordelingen af DNA fragmenter af meget små (< 100 bp) eller meget store (> 1.000 bp) størrelser angiver problemer med størrelse udvælgelse, som bære perler eller supernatanten, som formodes at blive kasseret. Ofte disse biblioteker med små toppe på disse uønskede størrelser, såsom en afbilledet, er stadig sekventeret held med kun et mindre fald i klynger effektivitet.
Høje priser af PCR dobbeltarbejde bør undgås, fordi det drastisk reducerer antallet af anvendelige sekvens læser. Sats af PCR dubletter er direkte relateret til mængden af tilført materiale. Ved hjælp af flere input derfor afbøder normalt problemer med PCR dobbeltarbejde.
Højere antal læsninger filtreret på grund af Læs orientering ()figur 2B) angiver utilstrækkelig fordøjelse, som kan være resultatet af bruger for lidt enzym, for meget input materiale eller ufuldstændig homogenisering af embryoner.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Max Planck Society. C.B.H. blev støttet af et stipendium fra internationale Max Planck Research School – molekylær biomedicin. Vi takker Shelby Blythe og Eric Wieschaus venligst give eGFP-PCNA Drosophila melanogaster linje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
| MboI | New England Biolabs | R0147L | |
| DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
| GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
| Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
| Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
| Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
| 37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
| Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
| M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
| M165 FC DFC camera | Leica | ||
| Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
| RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
| Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
| BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
| EDTA 0.5 M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
| Sodium acetate 3 M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
| Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
| Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Jin, F., et al. A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells. Nature. , (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Darbellay, F., Duboule, D. Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci. Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).
- Beagan, J. A., et al. Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming. Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).
- Andrey, G., et al. Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding. Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).
- Krijger, P. H. L., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Ghavi-Helm, Y., et al. Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase. Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).
- Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).
- Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition. Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).
- Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis. eLife. 5, e20148 (2016).
- JoVE Science Education Database. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , JoVE, Cambridge, MA. (2017).
- Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos. Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).
- Shermoen, A. W. Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).
- Ay, F., Noble, W. S. Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome. Genome biology. 16 (1), 183 (2015).
- Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking. BMC Genomics. 18 (1), (2017).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing. Genome Biology. 16 (1), (2015).
- Durand, N. C., et al. Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments. Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).
- Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Shin, H., et al. TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes. Nucleic Acids Res. 44 (7), e70 (2016).
- Kruse, K., Hug, C. B., Hernández-Rodríguez, B., Vaquerizas, J. M. TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms. Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).
- Lévy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data. Bioinformatics. 30 (17), Oxford, England. i386-i392 (2014).
- Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. Identification of alternative topological domains in chromatin. Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14 (2014).
- Crane, E., et al. Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation. Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).
- Durand, N. C., et al. Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom. Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).
- Zhou, X., et al. Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser. Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. bioRxiv. , 115063 (2017).
- Kerpedjiev, P., et al. HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps. bioRxiv. , 121889 (2017).
- Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription. Cell. 169 (2), (2017).
- Berkum, N. L., et al. Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).
- Naumova, N., et al. Organization of the mitotic chromosome. Science. 342 (6161), 948-953 (2013).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).
