Summary
この作品は、高解像度その場でハイ C ライブラリからの世代しっかり上演前原腸陥入ショウジョウバエのプロトコルをについて説明します胚。
Abstract
クロマチンの三次元のアーキテクチャを調べて遺伝子制御のメカニズムに非常に貴重な洞察力を提供しています。ここ実行するため、クロマチン構造キャプチャ テクニックその場でやあ-C のプロトコルについて述べるショウジョウバエ胚集団を上演します。結果は、単一の実験核で発生するすべてのクロマチン相互作用のマッピングを可能にするシーケンス ライブラリです。胚の選別は、蛍光実体顕微鏡と核マーカーを含むトランスジェニック フライ ラインを使用して手動で行われます。この手法により、胚集団各核分裂サイクルと定義された細胞周期の状態を使用しては非常に高純度で得られます。プロトコルは、古い胚原腸陥入を超えてを並べ替えるに適応もあります。並べ替えられた胚はその場でやあ-C の入力として使用されます。ライブラリの準備のシーケンスを含むすべての実験は、5 日間で完了できます。プロトコル低入力要件があり入力材料として 20 胚期の胚を使用して確実に動作します。最終的な結果は、次世代シーケンシングのシーケンシング ライブラリです。シーケンス処理の後データを位相ドメイン (TAD) 構造、クロマチンのループ、およびクロマチンの関連付けについての情報を得るために使用可能なツールの広い範囲を使用して分析することができるゲノム広いクロマチン間相互作用マップに処理できます。ショウジョウバエ開発中のコンパートメント。
Introduction
クロマチン構造キャプチャ (3 C) は1核クロマチンのトポロジーを研究に非常に有用な方法として浮上しています。3 C 型やあ-C は、単一の実験2では核で発生するすべてのクロマチン相互作用の接触の周波数を測定できます。やあ-C のアプリケーション検出および TADs、コンパートメント、ループ3,4,5などのクロマチン組織の多くの基本的な原則の評価で重要な役割を果たしました。
発達的変化と細胞分化のコンテキストでクロマチン アーキテクチャの研究がますますこれらプロセス6,7,8、遺伝子発現制御のメカニズムを解明するため使用 9。大きな関心のモデル有機体の 1 つは、キイロショウジョウバエ、その開発とゲノムがよく特徴付けられるです。ただし、設定されている組織培養体外外ショウジョウバエのクロマチン アーキテクチャを調査するほとんどの研究は、10、11を しました。胚の 16-18 h ポスト受精、TADs とコンパートメントの哺乳類で類似した構造を彷彿された識別された10、ショウジョウバエ胚の間に遺伝子発現制御で遊んでいる役割の質問を発生させます開発。特に、原腸陥入前に、開発の初期段階にこのような研究は技術的に挑戦的です。、原腸陥入前に、ショウジョウバエの胚は 8-60 分サイクル12,13あたりの非常に急速なペースで進む 13 同期の原子力部門を受けます。これに加えて、さまざまな段階を区別するために視覚機能の欠如は、十分な量でしっかりと段階的な胚の材料を得ることが困難。
核燃料サイクルの解像度で初期のショウジョウバエ開発におけるクロマチン アーキテクチャを勉強できるようにするプロトコルを開発するために、我々 は 2 つの既存技術を組み合わせた:その場でやあ-C、高解像度の世代全体を可能にします。ゲノム コンタクト マップ5、および胚ステージング eGFP PCNA transgene13,14を表現する遺伝子組換えショウジョウバエラインを使用します。この遺伝子は、間期核に局在して有糸分裂の胞胚全体への分散します。このプロパティを使用すると、簡単にその核密度によってさまざまな段階と GFP 信号の分散による分裂の胚を区別することが可能です。
一緒に、これらの技術は、20 のショウジョウバエの胚から高解像度でのクロマチンの三次元構造を研究するを有効にします。このプロトコルは、単一原子力部門サイクルから胚の個体数を取得する収穫・選別のショウジョウバエの胚の説明をされています。それはさらに得られた胚を使用してその場でやあ-C を実行する方法について説明します最終的な結果は、シーケンスの次世代機の配列に適した塩基配列ライブラリです。結果として得られる配列の読み取りは、詳細なクロマチン間相互作用マップ全体のショウジョウバエゲノムをカバーに処理できます。
Protocol
1ショウジョウバエ胚のコレクション。
注: 以前文書15に示すように、同等の採卵を実行できます。
- 若い eGFP PCNA ハエを転送 (< 1 週齢) 卵コレクション ケージ yeasted コレクションにプレート16 (1% エタノール, 1% 酢酸そして 4% 寒天培地)。
- 25 ° C で培養するコレクションのケージを移動します。採卵の前に 1-2 日間の培養卵収量が大幅に向上します。コレクション板に 1 日 2 回を変更します。
- 30-60 分間隔でコレクション室から胚を含むプレートを取り外します。短い間隔より少ない胚発達段階の緊密な分布があります。収集並列で複数のケージからだから、理想的に > 200 の卵が 30-60 分毎に配置されます。
- 胚が必要な年齢に達するまでは、25 ° C でプレートを格納します。胚期の胚 (核燃料サイクル 14)、約 2 時間孵化させなさい。
- 孵化の 2 h 後水道水ホヤの瓶からに追加コレクション プレート表面全体が水で覆われているので。胚を中断し、酵母の柔らかいブラシを使用します。
- 注ぎコレクション プレートからの再懸濁の胚胚コレクション バスケット (100 μ m の細孔径や自家製バスケット17仕事よく商業細胞ストレーナー)、ホヤの瓶から付加的な水道水の追加に応じて。この段階で並列で収集されたすべての板から胚を兼ね備えてください。プールされたサンプルは、1 つのバッチを表します。
- 30 用ホヤの瓶から水道水が付いているバスケットを洗浄によっても胚を洗う s まですべての酵母の残留で流されています。
- Dechorionate 胚 2.5% ナトリウム次亜塩素酸水溶液の水コレクション バスケットに置くことによって。渦巻く光撹拌絨毛膜の除去が容易になります。胚は、バスケットが取り外されたと再び、水没、彼らはソリューションの表面に浮くので、十分に疎水性まで続行する ~1.75–2 分を取る必要があります。
注意: 次亜塩素酸ナトリウムは腐食性です。適切な保護具を着用します。ソリューションを含む < 10% ナトリウム次亜塩素酸は通常流しに破棄できます、ホスト機関の規制をご確認ください。 - バスケットをソリューションから削除し、漂白剤の臭いが顕著なされなくなるまでホヤの瓶から水道水で完全にすすぎます。
2. 胚の固定
注: 最適な固定条件、洗剤、ホルムアルデヒドおよび固定期間の濃度では主に経験的に決定される胚の段階に合わせてする必要があります。胞胚の周りにステージ、水相中に 0.5% トリトン X-100 と 1.8% ホルムアルデヒドの最終濃度が適しています。胚の段階 9 を超えて後の段階、さらにこれらのパラメーターの最適化が必要なあります。固定および並べ替え中に使用されるすべてのソリューションは、プロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。
- コレクション バスケットを反転し、15 mL の円錐形遠心分離管の上に置きます。PBS-T を調剤パスツール ピペットを使用してチューブにバスケットから胚をフラッシュ (PBS、0.5% トリトン X-100)。
- 胚下部に解決し、PBS T で 2 mL に容量の調整をしましょう
- 水 6 mL ヘプタンのと 37% ホルムアルデヒド 100 μ L を追加します。
注意: ヘプタンおよびホルムアルデヒド吸入すると有毒であるまたは皮膚の後にお問い合わせください。適切な個人用保護具を着用し、ヒューム フードで働きます。ヘプタンまたはホルムアルデヒドを含む廃棄物がホスト機関の規則に従って個別に処分します。 - ホルムアルデヒド添加後 15 分タイマーを開始、積極的に振るチューブ上下に 1 分の手で。水溶液と有機相をフォーム シャンプーのような一貫性に結合します。
- ホルムアルデヒド添加後 10 分まで、回転ミキサーで攪拌します。
- チューブの下部に胚を収集するために部屋の温度で 1 分の 500 × gで遠心分離機します。
- 全体のシャンプーのような液体を吸引になり、胚を吸引しないように世話を破棄します。シャンプーのような上澄みの残り少量では、問題は発生しません。
- ホルムアルデヒド、添加後の 15 分は、ホルムアルデヒドをクエンチする 125 mM グリシンと PBS T の 5 mL の胚を再懸濁します。1 分の上下に揺することによって積極的にミックスします。
- 1 分間室温で 500 × gで遠心し、上清を吸引します。
- 5 mL の氷冷 PBS T にそれらを再で胚を洗う胚セトルとすべて清吸引をしましょう。
- 2.10 の手順で洗浄を 2 回繰り返します。
- 並べ替えまで氷の上の胚を保ちます。通常、並べ替えに進む前にハエの胚の 3-4 バッチを収集することをお勧めします。ただし、同じ日に胚を並べ替え 必要があります。拡張ストレージ氷や冷蔵庫の中には、変更された胚形態に します。
3. 胚の選別
注: 並べ替えは、60-80 倍の倍率で GFP フィルター搭載蛍光ステレオ顕微鏡を実行できます。
- 1,000 μ L ピペットを使用して、好ましくは暗い色の並べ替えに適して小さなガラス容器に約 100 の胚のバッチを転送、氷の上に置きます。
-
並べ替え胚核密度と細胞周期の状態 (図 1) 針や注射器の先端を使用して別の杭に望ましい胚を押すことによって。
- EGFP PCNA (図 1E) の分散、非原子力分布とすべての胚を削除します。また、部分的に非核 GFP シグナルを示す胚を削除必要があります。
- 分類の助けガイドとして図 1の画像を使用して各バッチで核燃料サイクル 12、13、および 14 を参照胚のラインアップをアセンブルしてください。彼らのステージを決定するために参照の胚のいずれかで不明な段階の胚を一致するように、このラインアップを使用します。
- 参照胚の発達段階を確認するには、胚をイメージングと距離情報を提供するイメージング ソフトウェアを使用して、2,500 μ m2の面積で胚の表面で核の数を数えることによって核密度を測定します。
注: 2,500 μ m2の領域の核数の期待値は核燃料サイクル 12、16、12 核と核燃料サイクル 131320 に 30 核。
- 適切な段階ですべての胚を分割すると、ドキュメントおよび品質管理のための胚の写真を撮る。ステレオの顕微鏡は、カメラ モジュールを装備自体ではない、GFP フィルターと落射蛍光顕微鏡が使用可能性があります。
- 氷の上の 1,000 μ L ピペット、新鮮なチューブと場所への転送を使用して目的の胚をピペットします。
- 計画された実験のため十分な胚を並べまで続行します。古い胚の第 9、ステージよりも一般的に 20 胚で十分やあ-C 実験場1 つです。核燃料サイクル 12、80 の胚は良い出発点です。以前のサイクルで胚の数はサイクル毎に約倍増する必要があります。
- 1 つの管に十分な胚 1 つ場でハイ C が含まれていることそのような方法で 1.5 mL チューブにプール、分割胚の実験します。全体のプロトコルの同じ管が使用され、DNA の吸着が低 DNA 濃度に重大な損失につながることができますので低 DNA 結合特性でチューブを使用することをお勧めします。
- 室温で 100 x gで簡単にチューブをスピンして、上清を除去します。胚を乾燥する必要があります可能な限り凍結の。
- フラッシュは、液体窒素、-80 ° C の店でチューブを水没によって胚を凍結します。
4.その場でハイ-C の
- 換散
- 凍結胚とチューブを氷を場所します。
- 冷たい換散バッファー (10 mM Tris Cl pH 8.0、10 mM の NaCl、0.2% IGEPAL CA 630、プロテアーゼ阻害剤; 水に溶解) を 500 μ l 添加の胚を再懸濁します。胚管の底で解決させる 1 分待ちます。
- 1.5 mL 遠心チューブが収まるように設計されている氷の上事前冷却金属マイクロ乳棒を用いた胚を挽きます。
- 避けるために胚を攪拌をそれが管の底に触れるまでゆっくりと、杵を挿入、プッシュ ダウン、および両方の方向で 2 回杵を回転させて挽きます。
- 非常にわずかに杵を持ち上げる、管の底に push 研削を繰り返します。
- 4.1.3.2 を繰り返して 10 回、または胚は完全に分離するまで。胚の残りの大きな部分が残っていないする必要があります、ソリューションは、均質なはずです。
- 1,000 × g、5 min のための 4 ° C で 15 分スピン氷上均質懸濁液をインキュベートし、上澄みを廃棄します。
- ペレットをピペッティング上下 500 μ L 冷たい換散バッファーに再洗い。
- 4.1.4 のように再び回転し、上澄みを廃棄します。
- ピペッティング上下 0.5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 100 μ L で洗浄のペレットを再懸濁します。暖房のブロックの 65 ° C で 10 分間インキュベートして核を permeabilize します。10% トリトン X-100 と 120 μ L 水の 50 μ L を追加することにより SDS を癒します。チューブをフリックでミックスします。
- 熱ブロックで 15 分間 37 ° C で孵化させなさい。
- 制限の酵素の消化力
- 制限酵素バッファー x 10 の 5 U/μ L mboi を検索の 20 U 25 μ L を追加します。チューブをフリックでミックスします。
- 37 ° c (750 rpm) 若干の動揺の下で熱ブロックで 90 分間インキュベートし、DNA を消化します。
- 別 20 U mboi を検索を追加し、90 分の潜伏を続けます。
- 熱-62 ° C、20 分のインキュベーションでの不活性 mboi を検索します。
- オーバー ハングのフィルイン
注: は、特定のフラグメントを結紮の選択をできます dATP をビオチン化とオーバー ハングで充填します。Unligated 鈍端にビオチン dATP を効率的に除去する一方、ビオチン-dATP を結紮交差点は exonuclease の作業の T4 DNA ポリメラーゼ (セクション 4.6) から保護されます。4.7 節したがって具体的ストレプトアビジン コーティング ビーズを用いたプルダウンを結紮、キメラの DNA 断片を富ませます。- 0.4 mM ビオチン-14-dATP の 18 μ L、未変更の dCTP/dGTP/dTTP のミックス (3.3 mM)、2.25 μ L、5 U/μ L DNA ポリメラーゼ I Klenow のフラグメントの 8 μ L を追加します。
- チューブをフリックでミックスし、熱ブロックの 90 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- 結紮
- 水の 657 μ L、100 μ L の 10% の 10 x T4 DNA リガーゼ バッファーの 120 μ L を追加トリトン X-100、20 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) のチューブをフリックでミックス 6 μ L。最後にチューブをフリックで 5 U/μ L T4 DNA リガーゼとミックスの 5 μ L を追加します。
- 回転管優しく (20 rpm) 2 時間室温で。
- 5 U/μ L T4 DNA リガーゼの 5 μ L の 2 番目の割賦を追加し、多くの h を 2 回転を続けます。
- 2,500 x gで 5 分で核を回転し、上澄みを廃棄します。
- DNA の抽出
- 抽出バッファー (50 mM Tris Cl pH 8.0、50 mM NaCl、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 %sds; 水に溶解) を 500 μ l 添加でペレットを再懸濁します、チューブをフリックで 20 mg/mL プロティナーゼ k. ミックスの 20 μ L を追加します。
- 1,000 rpm で揺れ、30 分間 55 ° c の孵化によってタンパク質を消化します。
- デ-架橋に 5 M の NaCl の 130 μ l 添加し, 一晩 1,000 rpm で揺れ、68 の ° C で。
- 低 DNA 結合特性と優先的に、新しい 2 mL チューブにピペットのサンプルです。
- 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 と 2 μ GlycoBlue 15 mg/mL の 0.1 x ボリューム (63 μ L) を追加します。反転でよく混ぜます。1.6 x 大量 (1,008 μ L) の純粋なエタノールとミックスを追加するには、反転します。
- 少なくとも 30 分のための 4 ° C で 20,000 × gで 15 分遠心分離機-80 ° C で孵化させなさい。DNA の餌は、しばしば非常に小さい、ほとんど目に見えないとだけ GlycoBlue の青い色のため発見することができます。
- DNA の餌がある場所から反対側の壁に沿って管にピペット チップを移動、非常に慎重に上清を除去します。小さい残りの水滴が P10 の先端を使用してチューブからそれらを押すことで削除この手順と次の洗浄時に頻繁に容易にそれらをピペットではなく。
- 70% のエタノールの 800 μ L を追加することでペレットを洗浄します。反転でミックスし、遠心分離機で 20,000 × gで 5 分間室温で少なくとも一度この洗浄を繰り返します。
- エタノールのすべてのトレースを削除し、空気乾燥するまで 5 分間蓋を開けてチューブ立ってを残します。液体がなくなり 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L を追加します。ペレットが DNA の可溶化位置していた管の壁の領域にピペット ソリューションの繰り返し。
- 20 mg/mL RNase A、チューブをフリックでミックスの 1 μ L を追加し、ダイジェスト RNA に 15 分間、37 ° C で孵化させなさい。サンプルを一晩冷蔵庫の中に格納されているまたは無期限に-20 ° C で凍って今できます。
- 製造元の指示に従って蛍光染料ベースの試金を使用して DNA の濃度を確認してください。サンプルの DNA 量必要があります少なくとも 10 ng、それ以外あまり素材は増幅とライブラリの複雑性は低いでしょう。この場合、出発材料の量は不十分だったおそらくまたは材料は溶解と沈殿物の中に途中で、おそらく失われました。
- ビオチン除去と DNA のせん断
- 一緒に 10 x T4 DNA ポリメラーゼ バッファーの 12 μ L、dATP を 1 mM の 3 μ L、1 mM dGTP の 3 μ L と 46 μ L の水を追加します。チューブをフリックでミックスします。3 U/mL T4 DNA ポリメラーゼの 5 μ L を加えてチューブをフリックでミックス 20 の ° C で 30 分間インキュベートします。
- 反応を停止する 0.5 M の EDTA の 3 μ L を追加し、約 120 μ L のボリュームに、サンプルを持参して水を使用します。
- 製造元の指示に従って超音波デバイスを使用して 200-400 bp のサイズに DNA をせん断します。材料の表に記載されている超音波発生装置を使用すると、次のプログラムは適切な: 2 サイクル 50 s、デューティ 10%、震度 5、200 サイクル/バースト。
- ビオチン プルダウン
- 新しい管に 10 mg/mL ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズの 30 μ L をピペット、マグネット スタンドに区切って、上澄みを廃棄します。
- ボルテックスでは、B & W のバッファー (5 mM Tris Cl pH 7.4 0.5 ミリメートルの EDTA、1 M 塩化ナトリウム; 水に溶解) + 0.1% トリトン X-100 とミックス × 1 でビーズを再懸濁します。マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズは、製造元やモデルによって区切られている 1-5 分間待ちます。
- 吸引し、ビーズがある場所の反対側の壁に沿ってピペット チップをスライドさせながら上澄みを廃棄します。B & W のバッファー (10 mM Tris Cl pH 7.4 では、1 mM EDTA と 2 M 塩化ナトリウム) x 2 の 120 μ L でビーズを再懸濁します。ボルテックスでミックスします。
- 新しい低 DNA 結合の管、傾斜された DNA を転送し、ボルテックスで 120 μ L 2 X B & W バッファー ビーズ懸濁液のミックスします。15 分 20 の rpm で DNA サンプルとビーズを回転させます。
- マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を捨てます。
- 再懸濁しますビーズ x B & W + 0.1 %1 600 μ L でトリトン X-100 と 55 ° C の 1,000 rpm で揺れ、2 分間インキュベートします。分離後、上清を捨てます。この洗浄をもう一度繰り返します。
- 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 600 μ L で一度ビーズを洗浄し、分離した後の上澄みを廃棄します。
- 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L でビーズを再懸濁します。
5. 配列ライブラリの準備
注: ライブラリのすべての手順が行われます商業 DNA ライブラリの準備からコンポーネントを使用してキット (材料の表を参照してください)。ただし、代替キットまたはその他の試薬を代えることが。沈殿物はフォーム ライブラリの準備エージェントの冷凍貯蔵中に傾向があります。したがって、試薬を使用する前にすべての沈殿物を溶解するかどうかを確認することが重要です。
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最後の修理
- 新しい PCR チューブに 10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L ビーズ懸濁液を転送します。
- 終了準備酵素ミックスの 3 μ L と終わり準備反応バッファーの 7 μ L を追加します。上下にピペッティングで混ぜます。
- チューブをサーマルサイクラーに転送し、次のプログラムを実行: 20 ° C、30 分、4 ° C で 30 分押しの 65 ° C
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アダプター結紮
- 結紮マスター ミックス、1.5 μ M の 2.5 μ L の 30 μ L を追加シーケンス アダプター (ストックから 1.5 μ M に希釈) と結紮エンハンサーのビーズ懸濁液に 1 μ L。上下にピペッティングで混ぜます。
- サーマルサイクラーに 15 分 20 ° C で孵化させなさい。
- ユーザー酵素の 3 μ L を追加します。上下にピペッティングで混ぜます。
- 熱 cycler で 15 分間 37 ° C で孵化させなさい。
- マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を除去します。
- ビーズを洗浄、再懸濁しますトリトン X-100 の x B & W バッファー + 0.1 %1 100 μ L のビーズします。ボルテックスと新しい微量遠心チューブへの転送でミックス。マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を除去します。
- 一度同じバッファーの 600 μ L を使用してこの洗浄を繰り返します。
- 10 mM Tris Cl pH 8.0、ボルテックス、ミックスの 600 μ L でビーズを再懸濁し、ビーズを新しいチューブに転送します。
- マグネット スタンドにビーズを分離、培養上清を破棄し、10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L でビーズを再懸濁します。
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PCR の拡大
- 2 つの PCR チューブを準備し、各ミックス ポリメラーゼ マスター ミックスの 25 μ L、10 μ M 前方 (インデックス) PCR プライマー、1.5 μ、10 μ M の逆 (インデックス) PCR プライマー 1.5 μ。
注: 転送 (インデックス) の PCR のプライマー:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T 3´。
(インデックス) PCR プライマーを逆します。
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T 3´。* インデックス付きの PCR プライマーのホスホロチオエート結合と Ns を示します。 - 各チューブの上下にピペッティングによるビーズ懸濁液とのミックスの 22 μ L を追加します。
- 次のプログラムを使用して PCR を実行: 98 ° C 1 分 (98 ° C、15 s、75 65 ° C ランプ 1.5 の ° C/s) 繰り返される 9-12 回、4 ° C で 5 分押しの 65 ° C
注: 増幅サイクル数は、経験的に定められます。しかし、我々 は発見と低演算量の概ね以上 12 サイクルに必要なライブラリですが、高品質のやあ-C にマップされませんでした。その一方で、未満 12 サイクルに必要なライブラリでは、完全の 12 のサイクルを増幅して否定的影響されなかった。したがって、増幅の 12 サイクルに既定することが可能です。 - プールの単一微量遠心チューブに 2 つの PCR の反作用、マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を新しいチューブにライブラリを含むを転送します。
- 2 つの PCR チューブを準備し、各ミックス ポリメラーゼ マスター ミックスの 25 μ L、10 μ M 前方 (インデックス) PCR プライマー、1.5 μ、10 μ M の逆 (インデックス) PCR プライマー 1.5 μ。
-
サイズの選択
- Ampure XP ビーズ懸濁液にもたらす室温とミックスを揺することによっても。
- 水で丁度 200 μ L にプールされた PCR の反作用のボリュームをもたらします。PCR と磁気分離の間に、元のボリュームのいくつかは通常失われます。ピペットを 200 μ L に設定すると、ボリュームを確認し、全体の反応量を吸引します。場合は空気を吸引するより多くの水を追加する必要があります。量は、200 μ L を超えた場合、比例して 5.4.3 と 5.4.6 の手順で追加ビーズのボリュームを調整します。
注: かっこ内のボリュームは、プールされた PCR の反作用の合計量が丁度 200 μ l 添加の場合有効です。 - Ampure XP ビーズ懸濁液の 0.55 倍ボリューム (110 μ L) を加え、ピペッティングを上下 10 回以上で混ぜます。
- 5 分、5 分、マグネット スタンドに別のビーズの室温で孵化させなさい。
- 上清を新しいチューブに移動します。ビーズを含むチューブを破棄します。ビーズは、DNA をバインドされている > 700 bp は、シーケンス処理するのには大きすぎます。
- 、上清に 0.2 x ボリューム (40 μ L、サンプルで 0.75 x Ampure バッファーの合計で) を追加 Ampure XP ビーズ懸濁液の上下に 10 回ピペッティングでミックス。
- 5 分、5 分、マグネット スタンドに別のビーズの室温で孵化させなさい。
- DNA を含んだ上澄みを廃棄 < 200 bp、無料プライマー、プライマー二量体小さすぎる断片を含むシーケンスします。
- マグネット スタンドにチューブを残します。ビーズを洗浄、80% エタノールの 700 μ L を追加、ビーズ ペレットを邪魔しないように世話をしインキュベートする 30 秒。
- 上澄みを廃棄、マグネット スタンドをチューブに乗りし、100 μ L の 10 mM Tris Cl pH 8.0 でビーズを再懸濁します。上下に 10 回ピペッティングで混ぜるし、1 分間室温でインキュベートします。
- Ampure XP ビーズ懸濁液の 0.8 x ボリューム (80 μ L) を追加します。上下に 10 回ピペッティングで混ぜるし、5 分間室温でインキュベートします。下限サイズ選択のこの第二ラウンドは、最後のライブラリはプライマーおよびプライマー二量体の完全に自由を保証します。
- 5 分、マグネット スタンドにビーズを分離し、上清を捨てます。
- 30 80% エタノールの 700 μ L で 2 回ビーズ ペレットを洗う s マグネット スタンド、上記のようにチューブを残しながら、それぞれ。
- マグネット スタンドにまだチューブ、エタノールのすべてのトレースを削除します。P10 のピペットを使用してチューブからのエタノール液滴をプッシュするのに役立ちます。最大 5 分の蒸発残留エタノールができます。
- マグネット スタンドをチューブに乗り、10 mM Tris Cl pH 8.0 の 50 μ L でビーズを再懸濁します。上下に 10 回ピペッティングで混ぜます。
- 5 分後マグネット スタンドに別のビーズの室温で孵化させなさい。
- 新鮮なチューブに上清を転送します。これは、定量化し、製造元の指示に従って次世代シーケンス コンピューターでシーケンス処理する準備ができて最終的なやあ-C ライブラリです。
Representative Results
12、13、および 14 の核燃料サイクルで胚の人口を並べ替え (1:30 に対応する 1:45、および 2:10 時間受精、それぞれ12の記事) とプロトコルで説明されている手順に従って 3-4 h ポスト受精 (hpf) が得られました。並べ替えられた胚の各バッチの eGFP PCNA 信号の写真を撮り、下流の実験で使用されているすべての 1 つの胚の正確なステージと細胞周期の状態を文書化することが可能です。図 1B-Eは、並べ替えられた集団から胚の例の写真を示しています。その場でやあ-C のプロトコルの出力は、次世代シーケンス コンピューターでシーケンス処理する準備ができてのヌクレオチド ライブラリです。この目的のため、少なくとも 2-4 nM の最終的なライブラリ濃度が通常必要です。入力素材の推奨量を使用して、この濃度は確実に(表 1)を達成。
DNA のフラグメント サイズの選択は約 500 bp (2 a を図)によって正確な剪断とサイズ選択パラメーターで最大の 300-600 bp の間後の予想サイズ分布。配列、ゲノムにマップできない制限のフラグメントの数を最小限に抑えるため、少なくとも 75 bp の長さのペアエンド リードをお勧めします。1-2 kb 箱のサイズと高解像度のマップは 4 億読み取りから入手できます。非常に高い深さで単一の複製シーケンスではなく、それぞれを読み取り 1 億 5000 万のより低い深さで複数の生物学的複製をシーケンス処理をお勧めします。これは生物学的変動の評価をできるように、PCR の重複により破棄された読み取りの数を減らすにつながります。視覚的に表現、複製を結合できます。高深度でのサンプルのシーケンスにコミットする前に、図 2 bのように品質パラメーターの基本的なライブラリ確認して浅い配列 (サンプルあたり数百万ヒット) を使用してサンプルを実行するをお勧めします。
やあ-C データの分析には、重要な計算資源と生物情報学の専門知識が必要です。大まかな概要として参照ゲノムにペアの読み取りが個別にマップされます、結果の線形が画質や方向、フィルター処理し、指定された区間の解像度またはフラグメント レベルでの連絡先の行列を生成できます、フィルターから線形。コンタクト マトリックス TADs、ループ、およびコンパートメントを探索すべてさらに下流の分析のための基礎であります。配列読み取りの初期解析、バイオインフォマティクスに複数のパイプラインがあります多くバイオインフォマティクス専門知識18,19,なし連絡先行列に raw 読み取りの処理を使用することにより20,21,22,23。さらに解析を行ってどのように調査の下で正確な生物学的問題に大きく依存し、プログラミングと R または Python スクリプティングにおいて豊富な経験を必要とする可能性があります。ただし、いくつかのツールと TADs を呼び出すアルゴリズムが分析するソフトウェアと同様に、利用可能な5,24,25,26,27,28, とweb ブラウザーで、スタンドアロンのデスクトップ アプリケーション29,30,31,32やあ-C のデータを探索します。
処理ライブラリの品質は、別のメトリック (図 2 b) を使用して決定できます。まず、PCR 重複率同じ元の分子に起因読み取りのシーケンスのペアの数でありは無駄なシーケンス リードの量を制限を可能な限り低くする必要があります。ただし、さらにライブラリ > 重複するファイルをフィルター処理すると、高品質コンタクト マップに 40 %pcr 重複を処理ことができます。第二の向きによるフィルター処理された読み取り率4で説明したようする必要があります一貫して一直線に並べられた読み取りペアの 10% よりも低かった。
核燃料サイクル 12 と 14 の間ショウジョウバエの事前 gastrular 開発時に核のアーキテクチャは大幅に改造された33 (図 3) です。核燃料サイクル 12、いくつか TADs が検出されたと連絡先の全体的な配分は多くの認識機能せず非常に滑らか。これは劇的に変更核燃料サイクルで 13、14、TADs はますます顕著と不特定の長距離接触が枯渇しています。
図 1: 並べ替え中に eGFP PCNA 胚の代表的な写真です。(A) eGFP PCNA 信号サイクル 13 (C) 核燃料サイクル 14 (60 分コレクションと核燃料サイクル 12 (B)、核で並べ替えられた集団から胚の 25 ° C (B E) 例を 2 時間培養後胚の並べ替えられていない人口からD) と (E) 同期有糸分裂を経る胚から。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:その場でハイ C ライブラリの品質の指標の例です。(A) バイオアナライザー トレース DNA フラグメント サイズが大きすぎて (ライブラリ 2、下) の配列のためのフラグメントのピークを表示するライブラリから成功したやあ-C ライブラリ (ライブラリ 1、トップ) の分布を示します。ライブラリ 2 は正常に配列されたが、望ましくない DNA のフラグメントのさらに大きな金額が減少シーケンス収率につながる可能性があります。(B) 2 つのやあ-C ライブラリの統計情報をフィルタ リング: 読み取り方向と距離 (内側・外側)4または PCR 重複 (重複) による詳細な分析から除外される一直線に並べられた読み取りペアの数が表示されます。各バー (残りの) フィルターを渡す読み取りと失敗 (フィルタ リング) の番号がプロットされています。フィルターを渡す読み取りの比率がさらにテキストとして表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 段階の胚からハイ-C の相互作用マップします。ハイ-C の相互作用マップは 10 kb の解像度でのビニング、33の前に、の前述のバランスします。2 番染色体上の領域は、示されている l.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ライブラリ | ステージ | 胚の数 | (Ng) を刈り前に、DNA 量 | PCR のサイクル | 最後のライブラリ濃度 (nM) |
| 1 | 核燃料サイクル 12 | 71 | 46 | 12 | 28.2 |
| 2 | 核燃料サイクル 12 | 46 | 40 | 12 | 22.2 |
| 3 | 核燃料サイクル 12 | 60 | 13 | 13 | 12.3 |
| 4 | 核燃料サイクル 13 | 36 | 39 | 12 | 22.2 |
| 5 | 核燃料サイクル 13 | 35 | 10 | 12 | 5.0 |
| 6 | 核燃料サイクル 13 | 48 | 18 | 12 | 8.7 |
| 7 | 核燃料サイクル 14 | 33 | 30 | 12 | 39.8 |
| 8 | 核燃料サイクル 14 | 24 | 36 | 12 | 20.4 |
| 9 | 核燃料サイクル 14 | 14 | 8 | 12 | 4.2 |
| 10 | 3-4 hpf | 17 | 30 | 12 | 24.0 |
| 11 | 3-4 hpf | 18 | 42 | 11 | 19.1 |
| 12 | 3-4 hpf | 22 | 63 | 11 | 48.4 |
表 1: 代表的なシーケンス図書館統計の一覧。ビオチン プルダウンと量子ビットを用いてせん断前に総 DNA の量は、その生成のために使用された胚の数の一覧で各ライブラリの PCR の数サイクルの増幅、およびシーケンシング ライブラリの最終的な集中に使用浄化とサイズを選択した後表示されます。
Discussion
ここで提示されたプロトコルはショウジョウバエの初期胚クロマチンのアーキテクチャの高品質なマップを生成するに非常に効果的です。以前のプロトコル34に比べると、説明している方法はここで、最新はその場でやあ-C の手順5、迅速処理、高解像度で、試薬の使用量が減少、その結果を使用します。その場でやあ-C のプロトコルを含む全体の手順は、ステージとショウジョウバエ以外の実験システムの広い範囲で動作する予定です。プロトコルは低入力要件があるので、隔離された細胞集団にも使用できます。ショウジョウバエ範囲外胚のプロトコルを使用していくつかのパラメーターで説明ここでは、特に材料の固定必要があります調整します。以来、古い胚は、遮水性の高いキューティクルを開発し、ホルムアルデヒドの濃度を上げると固定の延長は適切かもしれません。次のように調整する必要があります核燃料サイクル 14 以外の段階で胚のコレクション、1.4 の手順で 25 の ° c の胚のインキュベーション時間: 核燃料サイクル 12、70 分;核燃料サイクル 13、90 分。3-4 hpf、3:30 h。
13 の分裂 (ステージ 1-4) 中、核密度約各部門に倍になります。核は、その明るい GFP 蛍光で簡単に識別できます。有糸分裂の間、eGFP PCNA 核であるし、その信号が胚に分散しています。この機能は、可能な同期切断部門を受けている特定胚をなります。クロマチン構造を勉強するためこれらの分裂の胚は通常望ましくない、クロマチンの分裂組織がき相組織35よりも大幅に異なっているので。具体的には同期の分裂を受けている胚を選択するプロトコルに適応することが可能です。この場合、eGFP PCNA の分散、非原子力分布を持つ唯一の胚を保持する必要がありますと他のすべての胚は破棄しなければなりません。核の密度が決定できないので透過光顕微鏡で見るその形態によって段階の胚の代替手段を用いなければなりません。極細胞と胚周囲核の存在は、周縁部に表示されている cellularization を示す核燃料サイクル 1412に対し胚が少なくとも核燃料サイクル、9 を完了したことを示します。
ハイ-C の実験は、様々 な制限酵素5を使用して正常に実行できます。現在のアプローチは、通常 mboi を検索、HindIII などの 6 塩基認識サイトなどいずれかの 4 塩基配列を認識する酵素を使用します。6 ベース カッター 4 ベース カッターの優位は、遺伝子配列に十分な深さ、および制限のサイトのよりもカバレッジを与え高の潜在的な解像度を提供することです。別の5,23,36,37上の 1 つの 4 ベース カッターの選択の明確な利点はありません。Mboi を検索し、DpnII の 2 つの最も一般的に使用される酵素、両方は同じ GATC 認識サイトを認識します。DpnII はショウジョウバエの心配のである CpG のメチル化に敏感であります。ここで提示されたプロトコルことができますも正常に完了する制限酵素として DpnII を使用しています。セクション 4.2。制限の酵素とバッファーは、メーカーの推奨事項に従って DpnII 互換性のため調整が必要。
配列ライブラリのフラグメントのサイズは、図 2に示した範囲から大きく外れている、シーケンス処理中にクラスター形成が効率や完全に失敗します。この場合、毛刈り後のサイズ分布をチェックする必要があります、せん断パラメーター調整。非常に小さい DNA のフラグメントの分布のピーク (< 100 bp) または非常に大規模な (> 1,000 bp) サイズ ビーズまたは破棄することになっている清の上サイズ選択、キャリーなどの問題を示します。多くの場合 1 つの図のようにはまだなど、これらの望ましくないサイズで小さなピークを持つこれらのライブラリは効率をクラスタ リングのマイナーな減少だけで正常にシーケンスです。
PCR の重複率が高い利用可能なシーケンスの読み込み回数を大幅に短縮するため避けるべきであります。PCR の重複率は入力材料の量に直結します。多くの入力を使用してしたがって通常軽減 PCR 重複の問題。
読み取り読み取り方向(図 2 b)ため、フィルターの高い数値は、不十分な消化、酵素、あまり入力材料または胚の不完全な均質化が小さすぎるを使用しての結果をすることができますを示します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、マックス ・ プランク協会によって賄われていた。C.B.H. は分子生物医学国際マックス プランク研究学校-奨学金によって支えられました。EGFP PCNAショウジョウバエキイロショウジョウバエ ラインを提供する親切、シェルビー ブライスとエリック Wieschaus に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
| MboI | New England Biolabs | R0147L | |
| DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
| GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
| Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
| Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
| Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
| 37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
| Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
| M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
| M165 FC DFC camera | Leica | ||
| Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
| RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
| Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
| BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
| EDTA 0.5 M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
| Sodium acetate 3 M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
| Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
| Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |
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