Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Standardiseret måling af Nasal membran Transepithelial potentiale forskel (NPD)

doi: 10.3791/57006 Published: September 13, 2018

Summary

Vi præsenterer her, en standardiseret protokol for at måle den nasale spændingsforskel (NPD). Cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR) og epitelial natrium kanalen (ENaC) funktion evalueres ved ændring i spændingen på tværs af den nasale epitel efter superfusion løsninger, der ændre ion-kanal aktivitet, giver en resultat foranstaltning.

Abstract

Vi beskrive et standardiseret måling af nasal spændingsforskel (NPD). I denne teknik, er cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR) og funktionen epitelial natrium kanalen (ENaC) overvåget af ændringen i spænding på tværs af den nasale epitel efter superfusion løsninger, der ændrer ion-kanal aktivitet. Denne aktiveres ved måling af potentielle forskel det subkutane rum og luftvejene epitel i næsebor, udnytter et kateter i kontakt med den ringere nasale turbinate.

Testen giver mulighed for måling af stabil basislinje spænding og successive netto spændingsændringer efter perfusion af 100 µM amilorid, en hæmmer af Na+ reabsorption i Ringers løsning; en klorid-gratis løsning indeholdende amilorid at drive chlorid sekretionen og 10 µM isoproterenol i en klorid-gratis løsning med amilorid at stimulere den cyklisk adenosin fra (cAMP)-afhængige chlorid konduktans relateret til CFTR.

Denne teknik har fordelen at demonstrere de elektrofysiologiske egenskaber af to vigtige komponenter oprettelse af hydrering af luftvejene overflade væske af respiratoriske epitel, ENaC og CFTR. Derfor er det en nyttig forskningsværktøj til fase 2 og bevis for konceptet forsøg af agenter, der er målrettet CFTR og ENaC aktivitet til behandling af cystisk fibrose (CF) lungesygdom. Det er også en vigtig opfølgningsprocedure at etablere CFTR dysfunktion, når genetiske test og sved test er tvetydige. I modsætning til sved chlorid er testen relativt mere tidskrævende og dyrt. Det kræver også operatør uddannelse og ekspertise til at gennemføre testen effektivt. Inter - og intra subject variation er blevet rapporteret i denne teknik, især i unge eller usamarbejdsvillig emner. For at hjælpe med denne bekymring, er fortolkning blevet forbedret gennem en nylig validerede algoritme.

Introduction

Det overordnede mål med denne metode er at måle den nasale spændingsforskel (NPD), som har til formål at undersøge trans-epitelial ion transport i vivo1. Denne teknik giver mulighed for måling af natrium (Na+) og chlorid (Cl-) transport. NPD er blevet brugt som et analyseværktøj siden slutningen af 1980erne og blev accepteret i 1998 som en diagnostisk procedure ved cystisk fibrose Foundation (CFF) konsensus erklæring2 og i 2017 i retningslinjerne cystisk fibrose Foundation (CFF) konsensus diagnostiske 3. ja, biologiske CFTR dysfunktion, som er årsag til CF, fremgår af en øget Na+ absorption på den apikale membran og en defekt i Cl- sekretion. Denne funktionelle test giver fordelen, at en yderligere diagnose værktøj når genetik er ikke afgørende i patienter med ubestemt mellemliggende sved test resultater3. Selvom disse oplysninger kan også fås ved tarm aktuelle måling biopsier (ICM), ICM er dog kun tilgængelige i et par Centre globalt og yderligere behov standardisering. NPD er mere tilgængelig i ca 60 globale Centre og derudover mål respiratorisk epitel, der er den vigtigste placering af sygdommen.

Givet de oplysninger, det giver på CFTR aktivitet, bruges det også i proof-of-concept undersøgelser med henblik på at vurdere funktionel genopretning af CFTR protein af modulator behandlinger4,5,6,7, 8. Faktisk, data fra undersøgelser med CFTR mRNA-genet redigering, CFTR potentiator og corrector terapier, fremhæve væsentlige ændringer i Cl- og Na+ transport med terapi6,9 og bekræfter, at NPD kan være en lydhør slutpunkt i kliniske forsøg. Da vi mangler følsomme kliniske endepunkter købedygtig opdager en subtil ændring i kliniske status for patienten på kort sigt, kan denne prækliniske biomarkør være meget oplysende. Feltet af CFTR modulator terapier udvider hurtigt og vi har hårdt brug for test i vivo , der kan hurtigt dechifrere aktive forbindelser før de går til store fase 3 forsøg10.

Den fysiologiske rationale for teknikken er baseret på måling af de potentielle forskel mellem luftvejs epitel i næsebor og det subkutane rum. Ion-kanal aktiviteter udforskes ved at måle stabil maksimal baseline potentielle forskel (PD), dets ændringer efter blokering af ENaC relateret Na+ absorption og køre Cl- sekretion via forskellige apikale Cl- transportører herunder CFTR. CFTR dysfunktion er vist af en minimal ændring i potentielle forskel ved stimulation af Cl- sekretion gennem en cAMP afhængige vej og en øget ENaC medieret Na+ absorption som påvises ved en mere negativ baseline spændingsforskel og en forbedret reaktion på amilorid. Mekanistiske grundlaget for CF versus normal PD er sammenfattet i figur 1.

Figure 1
Figur 1: sammenfattende figur af Ion-kanal aktivitet. (A) Ion aktivitet i respiratoriske epitel viser balanceret aktivitet af ENaC og CFTR hos normale forsøgspersoner og (B) tab af CFTR aktivitet resulterer i øget ENaC medieret natrium transport og reduceret CFTR afhængige chlorid transport. ENaC: epitelial natrium kanalen, Na+: natrium, CFTR: cystisk fibrose transmembrane regulator, CL-: chlorid, mV: millivolt, PD: spændingsforskel, min: minut/s Klik her for at se en større version af dette tal.

Dog, denne test viser en vis grad af variabilitet både på gentagne målinger inden for den samme patient og hos patienter med samme genotype. Dette er yderst vigtigt at lette fortolkningen af ændringerne efter modulator behandling. Derudover mangler vi stadig validerede tærskler diskriminere mellem CF og raske forsøgspersoner. Dette kan delvis skyldes forskelle mellem tilgængeligheden af kliniske faciliteter og de anvendte teknikker. Derfor er en betydelig international indsats med henblik på standardisering af testen igangværende. Både os CFF-TDN (cystisk fibrose Foundation-Therapeutics udvikling netværk) og Iværksætterkapitalfonde-CTN (europæisk cystisk fibrose samfund-kliniske forsøg netværk) lavet en NPD Standard Operating Procedure (SOP) for brug i multicenter og forskning forsøgene. Denne seneste samarbejde af CTN og TDN har resulteret i en kombineret, internationale SOP, at samle ekspertise fra CTN og TDN (2014)11. Dette paper præsenterer protokol og test teknikkerne til at ansætte NPD for CF diagnose eller investigator-initierede proof-of-concept forsøg. Hvert center implementere teknikken er ansvarlig for ansøgning til sin institutionelle menneskelige videnskabsetisk Komité for godkendelse.

Figure 2
Figur 2: skematisk af hele anbefalede NPD setup. Bemærk, at den anbefalede opsætning er vist, herunder Sekventiel perfusion pumper, og opsætningen til 4-stop-pik serien. Særlige forbindelser og eksempler på komponenter er vist i SOP. (Diagram ændres med tilladelse fra Solomon, G.M. brystet, 201013) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den generelle eksperimentelle flow er skitseret i figur 2, hvorved NPD måles mellem udforske broen placeret på epitel overflade og reference broen placeret i det subkutane rum, begge er tilsluttet elektroder og en høj-impedans voltmeter.

Dette sikres gennem 2 forskellige systemer: der er 2 acceptable reference elektrode opsætninger: (i) afbalanceret Ag/AgCl elektroder og et elektrokardiogram (EKG) fløde-fyldt bro forbundet til det subkutane rum ved let slid eller (ii) mættet kalomel Half-cells og en agar fyldt 22 - 24-gauge kanylen indføres subkutant. Kontakt til næseslimhinden er aktiveret af en dobbelt lumen kateter. En lumen er fyldt med agar eller ECG fløde og tilsluttet den måling elektrode, den anden tillader perfusion på næseslimhinden af de forskellige løsninger.

Spidsen af udforske slangen er placeret på den respiratoriske slimhinden under ringere nasale turbinate (figur 3).

Figure 3
Figur 3: placering af at udforske slanger på respiratoriske slimhinden. (A) ekstern visning viser placering. (B) Rhinoscopic Se demonstrerer placering. (C) Diagram viser den anatomiske placering for kateter placering. PD: spændingsforskel

For at studere svar af PD på flere lægemidler, anvendes de superfusion løsninger via den anden lumen af kateteret. Der er flere vigtige skridt med hensyn til forberedelse og afholdelse af NPD målinger, som er nærmere beskrevet nedenfor i protokollen, fra indledende forberedelse gennem til dataanalyse.

Efter udarbejdelsen af løsninger og elektroder, passende kvalitetstest af elektroder og katetre giver mulighed for den grundlæggende adfærd af testen. Basal målingerne foretages langs ringere turbinate, der tillader udvælgelse af de bedste sted for måling, normalt, med den mest negative måling. Derefter bestemme sekventielle perfusions Na+ (ENaC) og Cl- (CFTR-afhængige) ion flux via en ændring i spændingen over den nasale epitel.

Protocol

Den protokol, der involverer forsøgspersoner blev godkendt af alle deltagende institutter Forskningsudvalget. Hvert center implementere teknikken er ansvarlig for ansøgning til sin institutionelle menneskelige videnskabsetisk Komité for godkendelse.

1. løsning forberedelse

  1. Forberede løsninger #1, #2 og #3, som er base løsninger, i 1 L partier før proceduren og lagret på stedet (tabel 1).
    Bemærk: Amilorid er lysfølsomt og skal opbevares i mørke (Se tabel 1 for løsning sammensætning) (Se SOP for detaljerede løsning forberedelse11).
    1. Buffer alle løsninger på pH 7,4 og filter med 0,22 µm flaske-top filter.
    2. Løsning #3, først tilføje fosfat-holdige salte, tillade dem at ionisere for at forhindre krystallisering (Se tabel 2 for løsning sammensætning).
      Bemærk: Rækkefølgen af blanding er kritisk for løsning #3.
    3. Gemme disse løsninger ved 4 ° C (stabil i 3 måneder) eller ved-20 ° C (stabil i 6 måneder).
    4. Forberede løsninger #4 og #5 ved at tilføje agenter på dagen for NPD test. Isoproterenol er lys og oxidation følsomme og mister det sin aktivitet ved stuetemperatur (viser 4% forfald over 4 h på 4-8 ° C). Opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: ATP er lys og oxidation følsomme (Se tabel 3).
Sammensatte Molekylær vægt Koncentration (mM) Sammensætning (g/L)
NaCl 58 148 8.58
CaCl2 2 H2O 147 2.25 0,33
KCl 75 4.05 0,3
K2HPO4 174 2.4 0,42
KH2 PO4 136 0,4 0,05
MgCl2 6 H2O 203 1.2 0,24

Tabel 1: Løsning sammensætning.

Sammensatte Molekylær vægt Koncentration (mM) Sammensætning (g/L)
Na gluconat 218 148 33,26
Ca gluconat 430 2.25 0,97
K gluconat 234 4.05 0,95
K2 HPO4 174 2.4 0,42
KH2 PO4 136 0,4 0,05
MgSO4 7 H2O 246 1.2 0,24

Tabel 2: Løsning sammensætning.

Løsning Løsning nummer Indhold EDC Mark
Ringers injektion Løsning #1/A Bufferet ringers til injektion RINGERS
Ringers + amilorid Løsning #2/B Bufferet ringers + 100 μM amilorid AMIL
Nul Cl- + amilorid Løsning #3/C Bufferet nul Cl- + 100 μM amilorid KØRELEDNINGEN
Nul Cl- + amilorid + isoproterenol Løsning #4/D Bufferet nul Cl- + 100 μM amilorid + 10 μM isoproterenol ISO
Nul Cl-+ amilorid + isoproterenol + ATP Løsning #5/E Bufferet nul Cl- + 100 μM amilorid + 10 μM isoproterenol + 100 μM ATP ATP

Tabel 3: Løsning liste.

2. kateter

  1. Bruge en PVC, steril, enkelt brug, 2 lumen (0,7 mm indvendig Ø) kateter med en rund og glat ekstremitet (2,5 mm ydre Ø), som er specielt designet til NPD.
    1. Kontakter med slimhinde af en side hul, 2 mm fjernt at spidsen med et hul i spidsen for perfusion (Se trin 10.1).
    2. Tilsluttes en af de to Luer-lock forbindelser af kateteret måling elektrode og den anden til perfusion pumpe. Brug kanalen farves blå som måling lumen. Tag kateteret på hver 0,5 cm interval for 10 cm.
      Bemærk: Dead space er 0,3 mL. Det er at foretrække at bruge ovenstående procedure for udarbejdelse af kateteret hvis dette ikke er muligt følge de næste to trin.
    3. Skære lige (~ 76 cm) længder af PE50 og PE90 kateter slangen.
    4. Anbringe dem sammen i en 1 cm stykke silicium gummi slange. Indsæt en 25 G stump spids nål LUN i den modsatte ende af PE-90 slangen. Indsæt en 25 G sommerfugl nål LUN i den modsatte ende af PE50 slangen, og sørg for ikke at punktere slangen, da det er placeret.

Figure 4
Figur 4: kateter bruges til NPD målinger. Inset boks viser kateter tip med måling hul.

3. forberedelse af Agar hud bro (sommerfugl nål) og kateter

Bemærk: Manipulation af det smeltede agar kan forårsage forbrændinger, og dette bør gøres med forsigtighed.

  1. Forbered 3% agar ved blanding 3 g agar med 100 mL opløsning #1 i en bred mund flaske. Smelte agar i mikroovnen indtil opløselig (gennemsigtig).
    1. Fylde 10 mL sprøjte med varm agar.
    2. Tilslut sprøjten efterfølgende til sommerfugl nål (23 G) og til den markerede lumen af kateteret. Injicere agaren, indtil det vises på spidsen.
    3. Lad det køle i mindst 10 min.
    4. Sikre, at huden broen og kateteret er fuldt fyldt og visualiseret for at være fri for luftbobler.
    5. Gemme løs hud broer i løsning #1 ved 4 ° C og må ikke anvendes efter 1 uge.

4. Hvis brug ECG fløde

  1. Fortynd ECG cremen med løsning #1 (1:1, v/v Ringer). Lad det hvile indtil fri for luftbobler.
    1. Fylde 10 mL sprøjte med fortyndet ECG fløde.
    2. Tilslutte sprøjten til den markerede lumen af kateteret og langsomt injicere ECG cremen, indtil det vises på den nederste side hul.
    3. Sikre, at kateteret er fuldt udfyldt og fri for luftbobler.

5. dataoptegningssystem

Bemærk: Den generelle opsætning af dataoptegningssystem er vist i figur 5.

Figure 5
Figur 5: etablering af dataoptegningssystem. Demonstrere forbindelser af bioamplifier og headstage til computer interface samt elektrode forbindelser til headstage11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Forbindelser
    1. Slut computeren til dataoptegningssystem (Tabel af materialer) med et USB-kabel.
    2. For at slutte dataoptegningssystem til bioamplifier, skal du slutte BNC-kablet fra kanal 1 input på dataoptegningssystem (front) til output på bioamplifier (tilbage).
    3. Tilslut bioamplifier til headstage med en brugerdefineret kabel pre tilsluttet headstage skruer ind i input del foran bioamplifier.
    4. Tilslut headstage til elektroder og jorden elektrode. Brug standard 2 mm hun-hun stik til at tilslutte forreste del af headstage til elektroderne.
      Bemærk: Porten er forsænket og passer kun én retning af 2 mm kabel: rød-måling elektrode til patient næsen (via nasale kateteret); Sort-Reference elektrode til patientens hud bro; Hvid til EKG-elektrode jordet til fagets hud.
    5. Angiv bioamplifier, som beskrevet: Offset: træk til at aktivere, henvende sig til justere, orlov i trukket holdning efter tilpasninger; Spænding: DC; 1 mV cal: neutral stilling; Magt: På for at indsamle data, ud for at oplade batteriet; Gain: Indstil til 10; Band pass: LoFreq (ydre knop): DC; Band pass: HighFreq (indre knop): 1kHz; Volumen: Off.

6. justering af hoved-fase forskydning

  1. Forbinde den bærbare computer og forstærker i rækkefølgen, som angivet i SOP11. Tænd dataoptegningssystem og derefter den bærbare computer (rækkefølgen er vigtig for software til at genkende de apparater, der anvendes til dataindsamling).
    1. Justere hoved-fase forskydning som pr SOP sekvens.

7. kompensationskøb

Bemærk: Der er flere forskydninger skal testes for at sikre stabiliteten i den elektriske målesystem. (Se figur 6)

  1. For elektrode Offset, placere referenceelektrode (negativ) og måling (positive) elektrode sammen i den fortyndede ECG fløde eller 3 M KCl. sikre, at de potentielle forskel læse mellem elektroderne er nær nul på headstage.
    1. For fastsættelse af kateter og/eller hud bro offset, placere Luer-lock slutningen af nasale kateteret eller Luer-lock slutningen af huden broen ind i badet med den måling (positive) elektrode. Placer anden enden af kateteret i ECG creme bad eller 3 M KCL, der indeholder reference (negative) elektrode at sikre, at potentielle forskellen er nær nul på headstage.
    2. Hvis du vil konfigurere et lukket kredsløb offset, sikre at kredsløbet er lukket, når du udskifter det nasale kateteret i Bad af elektroderne. Kontroller, at den lukkede kredsløb opvejet læser nær 0 mV (= 'offset'; ±2.5 mV). Justere headstage offset knop for at bringe forskydningen 0 mV.
      Bemærk: Dette bekræfter, at alle forbindelser inden for kredsløbet er intakt. Hvis dette ikke er tilfældet, det nasale kateteret kan ikke være intakt (luft bobler i agaren eller ECG fløde). Ændre agar broen eller skubbe ECG fløde i opsætningen. Forskydningen af elektrode skal udføres først, efterfulgt af det lukkede system (lukket kredsløb offset) med elektrode og broen (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Opsætning af (A) elektrode offset, (B) kateter (eller broen) offset, (C) lukkede kredsløb forskydning.

8. sprøjte Set-up

Bemærk: Følgende er de anbefalede opsætning.

  1. Tø solutions #1, #2 og #3 ca 1 time før måling.
    1. Tilslut antenneforlængeren ud til stophane tættest på kateteret.
    2. Tænd for alle pumper og skylle kateteret med løsning #1 helt skylle ud kateteret indtil stopcocks er klart af bobler.

9. placering af Reference og måling elektrode

Figure 7
Figur 7: Emne med måling elektrode og subkutane bro klar til målinger.

  1. Har undersøgelsen genstand tage en siddende stilling over for operatoren NPD. For mere komfort, placere fødderne på valgfri anti-statisk mat og hoved på orthoptic hage resten.
    1. Tilslut jorden bly elektrode til ECG pad placeret på fagets arm (figur 7).
    2. Indsætte en subkutan nål i den dorsale underarmen (agar system) eller anvende referenceelektrode til EKG creme på en tidligere minimalt slidt område på underarmen (se punkt 7 gennem til 10 nedenfor).
    3. Kontroller forbindelsen til det subkutane rum ved at måle den potentielle forskel med huden (Finger PD) og beder emne at lukke "måling hullet" ved at knibe kateter mellem spidsen af hans/hendes tommel- og pegefinger.
    4. Hvis Finger PD ikke er -30 mV eller mere negativ, skal du kontrollere indsættelse af sommerfugl nålen. Gentag slid (for ECG creme set-up) og kontrollere broer.
    5. Start løsning #1 sprøjten pumpe på 80 mL/h. Start med den højre næsebor.
    6. Måle Finger PD som en konstant negativ spænding (typisk range-40 til-80 mV).
    7. Hvis bruger EKG fløde System: Fortynd ECG fløde 1:1 og fylde kateteret efter en komplet flush ud af sonden hullet som tidligere set i agaren.
    8. Tilsluttes en 50 mL sprøjte halvt fyldt med ECG fløde at bade elektroder, tillader en kontrol af elektrode forskydning og broen ud sæt kateteret.
    9. Forbinde reference Ag/Cl elektrode til den subkutane rum ved lille tidligere minimal slitage af huden, huden vises 'pink og skinnende' når dermis er nået.
    10. Placer den måling elektrode, dækket med ECG fløde, på slidt huden. Kontrollere finger PD som tidligere vist for Agar system.

10. måling af Basal PD

  1. Indsæt det nasale kateteret ind i højre næsebor ved hjælp af en lysende rhinoscope (eller tilsvarende) for at visualisere ringere turbinate. Brug den forreste spids som et vartegn, rykke kateteret rettet mod den underlegne websted af ringere turbinate på den respiratoriske slimhinden. Alternativt, hvis placeringen er vanskeligt, sonde hul kan placeres i kontakt med gulvet i næsebor.
    Bemærk: Kateteret er stive nok til at blive guidet i næsebor af operatøren. For at lette placering, en kanal af kateteret er farvet i blå og indeholder sonde-side hul i kontakt med ringere turbinate. Dette forhindrer kateter rotation. De varemærker, der er angivet på kateter fra 1 til 10 cm giver nem referencepunkter.
    1. Måle PD på ringere turbinate. Til dette formål, sikre at kateteret måling hullet er lukket af dens placering mod slimhinden af ringere turbinate (mark ret Basal på).
    2. Måle PD på 3.0, 2.0, 1.5, 1.0 og 0,5 cm (afstand inden for den ringere meatus af ringere turbinate): markere ret Basal PDs.
    3. Opretholde hver måling på det angivne afstand for ca 5 s hver til at sikre en stabil læsning (± 1 mV) og lette præcis fortolkning af basal PD værdier.
    4. Gentag trinene ovenfor i den venstre næsebor, ved hjælp af funktionstasten til at markere venstre Basal PDs (3 cm, 2 cm, etc.) og den venstre Basal på.
    5. Ved hjælp af basal PD foranstaltninger som en guide, indsætte sonde af nasale kateteret til stedet, mest negative signal (op til 3 cm fra den forreste spids af den ringere nasale turbinate), og sikkert med et lille stykke tape på spidsen af næsen (eller tilsvarende).

11. NPD sporing sekventielle Perfusions

  1. For den højre næsebor
    1. Kontroller, at løsningen der drypper fra patientens næse. Har emnet indtage en komfortabel stilling med hovedet ned (ofte hjulpet ved at have omfattet hvile hovedet på deres hånd eller bruge en chinrest eller andre blokeret enheden). Minde om emnet til at minimere bevægelsen og undgå at berøre næse eller slangen, og at undgå at tale.
    2. Drej løsning #1 (Ringers) pumpe på (5 mL/min., eller 300 mL/h). Optage indtil der opnås en stabil værdi (< 1 mV ændring/30 s).
      Bemærk: Det tager ca. 3 min. at opnå stabilitet.
    3. Slukke perfusion med løsning #1.
    4. Start perfusion med løsning #2 (amilorid). Optage NPD for et minimum af 3 min (hvis plateau spændingen er i tvivl, fortsætte optagelsen for op til 5 min samlede).
    5. Start perfusion med løsning #3 (nul chlorid). Optage NPD for et minimum af 3 min (hvis plateau spændingen ikke er stabil, fortsætte optagelsen for op til 5 min samlede).
    6. Start perfusion med løsning #4 (Isoproterenol). Optage NPD for et minimum af 3 min [hvis plateau spændingen ikke er stabil (konstant spænding vektoriseringen til mindst 30 s < 1 mV drift), fortsætte optagelsen for op til 5 min samlede].
    7. Start perfusion med løsning #5 (ATP). Optag NPD for et minimum af 1 min, indtil en peak hyperpolarizing svar opnås.
    8. Tænd perfusion med løsning #1 (Ringers) og tillade 30 s til at skylle kateteret.
    9. Slukke løsning #1 perfusion.
    10. Gentag proceduren for den venstre næsebor.

12. slutningen af testen

  1. Recheck og registrere stabil Finger PD ("Post Finger") for 5 s.
    1. Fjerne fagets kutane bro og forbinding fra indsættelsesstedet på huden. AgCl/ECG fløde System, fjerne elektroden fra armen.
    2. Optage den "Endelige lukket Loop Offset" spænding som beskrevet til at måle forskydningen af indledende lukket kredsløb (Se trin 7.1.3).
    3. Mark endelige forskydning med funktionstasten.
    4. Stop dataopsamling (tryk på "Start"").
      Bemærk: Den nuværende SOP anbefaler brug af 100 µM ATP og aktivere den purinergic calcium afhængige Cl- sekretion, til at tjene som positiv kontrol for prøven. men dette er en valgfri test.

Representative Results

I normale luftvejene epitheler er Na+ absorption den primære ion transport aktivitet. Dette resulterer i en negativ luftvejene overflade potentielle forskel med hensyn til interstitium. Perfusion af ENaC kanal blokker amilorid fører til en mindre negativ spændingsforskel. Derefter, superfusion CL--gratis løsning skaber en kemisk gradient for Cl-, hvilket skaber en mere negativ spændingsforskel og aktiverer alle Cl- transportører, herunder CFTR. Isoproterenol, hvilket øger intracellulære cAMP, yderligere øger Cl- sekretion af specielt aktivering CFTR og øger den potentielle forskel.

Derimod i CF fag medieret fraværende eller dysfunktionelle CFTR resulterer i en øget ENaC Na+ absorption12. Som et resultat, er baseline potentielle forskel mere negative. Depolarisering observeret med anvendelse af amilorid er større, mens der er minimal eller ingen ændring i de potentielle forskel ved stimulation af Cl- sekretion gennem CFTR afhængige veje. Dette kan ses i de repræsentative tracings i figur 8viser 'sunde' vs 'CF' tracings.

Figure 8
Figur 8: repræsentative tracings af 'sund' emnet og emnet med jf. PD: spændingsforskel, ΔAmiloride: delta amilorid, 0 Cl-/Iso-: lav klorid: ændring i PD mellem afslutningen af løsning #2 og løsning #4 perfusion, S1-S4: trin 1-4, grøn linje på grafer A og B angive NPD sporing og sort pilene angiver forskellen i spændingsforskel

Discussion

In vivo, NPD giver en unik måling, der kan udføres gentagne gange på grundlag af langsgående og demonstrerer, at lignende langsgående resultater med gentagne målinger, overholdes på en group-wise og individuel basis14, 15. Der er stærke beviser at NPD har fremragende forskelsbehandling gyldighed for at skelne CF fra ikke-CF. 25 undersøgelser vist konsekvent en statistisk signifikant forskel i Cl- og Na+ ledningsevne mellem patienter med CF og raske kontrolpersoner10. Mens flere tidligere udviklet indekser demonstrere denne kapacitet, forventer vi, at nye opdateringer er nødvendige givet de seneste standardiseringer af metode7,8.

Ændringer og fejlfinding

Denne test kræver flere vigtige skridt til at sikre nøjagtige målinger. Dette omfatter forskydningen af elektroder og katetre lukket kredsløb for at sikre, at systemet udfører anbefalede standarder. Patienter skal forblive stadig og afholde sig fra at tale som dette minimerer artefakter og kateter hjemstavnsfordrivelse. Dette gør testen vanskeligt i usamarbejdsvillige patienter og teknikken er kun blevet rapporteret i en undersøgelse hos børn under 6 år alder7.

Inden inspektionen af den nasale epitel er nødvendige for at sikre, at der er ingen skorper eller slim på epitel, som kan påvirke målingerne.

Meget vigtigt, skal det påpeges, at placeringen af placeringen af kateteret er genstand for debat. SOP præsenteres her udnytter måling under ringere turbinate, (IT). Placeringen af kateter under IT er blevet standardiseret og udført i multicenter forsøg, og derfor er den anbefalede teknik. Måling under IT er udført med side-hul kateter, som kan være svært at vedligeholde i fast kontakt med næseslimhinden, samtidig med at være i kontakt med løsningerne. Andre grupper kan måle PD på de nasal gulv, som er teknisk lettere. Vigtigere, viste Vermeulen (2011), at de 2 metoder er sammenlignelige16.

Opvarmning af løsningerne er stadig et spørgsmål om forhandling mellem europæiske og amerikanske-centers17,18. Det har anbefalet at bruge løsninger ved 37 ° C i stedet for 22 ° C øger observerede samlede chlorid svar af ca 25% og isoproterenol-afhængige chlorid svar ca 95%18. Men opvarmning øger variabilitet, som vurderet af en større standardafvigelse af samlede chlorid svar17. Derfor, da opvarmning af løsninger er en yderligere faktor variation, det tilrådes ikke at varme løsningerne, medmindre det kræves på grundlag af undersøgelsen.

Vi har tidligere sammenlignet både af elektrode teknikker og fundet, at både AgCl og Calomel elektrode systemer drives på samme måde i basal og stimuleret strømninger i normale individer13.

Begrænsninger af teknikken

Denne test er underlagt betydelige inden for emnet variabilitet. Variation af scoring er især udbredt i patienter med ubestemt tracings og dette bør regnskabsføres i diagnostisk program19. Faktorer af variabilitet omfatter akut øvre luftvejsinfektion, omfattende næsepolypper, forudgående sinus kirurgi og CF-relaterede inflammation, som falde dets specificitet og sensitivitet20,10. Derudover fortolkning af tracings kan være forskellige mellem læsere, selv om ekspert læsere viser glimrende aftale af kvantitative scoring og interpretability i CF og ikke-CF tracings, kontrast med en betydelig variation i de tillid til sporing af19.

Iboende variabilitet versus betydelig tærskler

Meget vigtigere, fysiologiske variabiliteten af måling er betydelige, som illustreret i forskellige undersøgelser10, såsom CFTR gen terapi forsøg, som viste betydelig variation i ændringer i klorid samlede transport og amilorid spænder21,22. Tværsnits evaluering tyder på, at nul Cl- plus isoproterenol svar over tærsklen på -5 til -7 mV er afgrænsningen mellem CF og ikke-CF fag10.

Vi mangler ikke desto mindre klar viden om omfanget af ændringen af denne parameter repræsenterer en effektiv CFTR korrektion i fase II forsøg med Sygdomsmodificerende behandlinger. For at vurdere enkelte svar, kan gentagne forsøg overvågning svar til en intervention være nødvendigt at skelne mellem væsentlige ændringer fra iboende variabilitet. Meget vigtigere, skal fremtidige langtidsstudier med sygdomsmodificerende lægemidler vise, at forbedring af CFTR funktion korrelerer med forbedring af klinisk relevante resultater eller surrogat resultater (såsom forbedring i FEV1) af CF sygdom. Faktisk markeret en nylig fase II Ivacaftor undersøgelse viste klinisk fordel trods en lille forbedring i chlorid sekretionen23.

Disse undersøgelser vil bidrage til at etablere, hvis en cut-off værdi forbedring i trans-epitelial Cl-ledningsevne kan være en surrogat parameter for klinisk fordel. Dette ville være en vigtig parameter for at vejlede udviklingen af CFTR ændre behandlingsformer.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder: sved Test og tarm aktuelle målinger (ICM)

Hos patienter med '' tvivlsom '' cystisk fibrose, som vurderet af en mellemliggende sved Cl- koncentration mellem 30 og 60 mM, NPD composite score forudsat en yderst følsom værktøj for at diagnosticere patienter som '' CF-sandsynligvis '' og '' CF-usandsynligt ''10 . Tarm aktuelle måling (ICM), som giver en ex vivo -måling af den netto Cl- strømme på tværs af rektal epitel, giver også bestemmelse af resterende CFTR funktion med en høj følsomhed, fordi CFTR er stærkt udtrykt i denne epitel.

Overvejer ændring af CFTR funktion af CFTR modulatorer, forholdet mellem disse forskellige CFTR biomarkør ændringer er i øjeblikket uklart. Selv om de seneste arbejde baseret på besluttet Ivacaftor at NPD og sved test er korreleret4, det endnu ikke blevet etableret hvis en måling i luftvejene er en bedre indikator for respiratorisk resultatet end for eksempel, sved test24 , 25 eller ændring af ICM. Desuden kan modifier narkotika også variere i deres orgel specifikke efficacies. Med hensyn til NPD er det vigtigt at bemærke, at ændringer i basal PD og amilorid svar express Na+ transport, mens ændringer i 0 Cl- og isoproterenol svar express Cl- transport. Det er endnu at fastslås, hvilke af disse er vigtigere for sygdom forbedringsanlæg.

Fremtidig anvendelse af denne teknik

Brug af denne teknik forventes uden for feltet CF. Da denne teknik er enestående egnet til at påvise Na+ og Cl- ion-kanal, kan det anvendes til at påvise dysfunktion i luftvejene sygdomme herunder astma26, kronisk bronkitis27, ikke-CF bronchiectasis28 og tilbagevendende pankreatitis29. Desuden har ændringer af denne teknik været brugt i de nedre luftveje (LAPD) for at demonstrere lavere airways-fokuserede CFTR dysfunktion i kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) patienter med kronisk bronkitis30.

NPD giver en følsom i vivo biomarkør af CFTR funktion, som kan bruges til både diagnose og også for proof of concept undersøgelser med henblik på at korrigere CFTR og ENaC kanal aktivitet i Translationel forskning. Dette giver mulighed for langsgående vurdering af trans-epitelial funktion og holder løfte som en strategi for personlig medicin til at skræddersy den mest effektive corrector for hver patient med CF.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af arbejdsgruppen for CFTR funktion af standardisering Udvalget (kliniske forsøg netværk, europæiske cystisk fibrose samfund) og nationale ressourcer Center Working Group (Therapeutics udvikling netværk, cystisk fibrose Foundation). Yderligere støtte blev leveret fra CF Foundation (Clancy FY09 til GMS) og NIH (DK072482 til SMR og GMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) Fisher Scientific
Powerlab 4/30 AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 AD Instruments
Windows compatible PC - Minimum requirements of Windows XP or higher Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject) Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes Fisher Scientific 13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode BIOPAC Systems UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream Fisher Scientific Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device PROMED Feeling Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing Fisher Scientific 427411
Becton Dickinson PE 90 tubing Fisher Scientific 427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD Fisher Scientific 508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) 3M 1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US Marquat I0202US
1" X 10 yards silk tape 3M Durapore 1538-1
IV extension tubing (30", 50/box) International Limited IMN30
Three-way stopcock (50/box) Medex MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0.22-μm or smaller filters; or equivalent) Fisher Scientific 09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20 G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 427564
Becton Dickinson 23 G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 367283
Becton Dickinson Syringe 60 mL without needle Luer-Lok tip (40/Box) Fisher Scientific 309653
Becton Dickinson Syringe 10 mL without needle Luer-Lok tip (100/Box) Fisher Scientific 309604
Single use sterile wipes (per institutional availability) Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 L volumes acceptable) Fisher Scientific 430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23" x 36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) SureCare
23 G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) Becton Dickinson 367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional) Richmond Products, Inc 629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting  (or equivalent) Fisher Scientific No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl Spectrum Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2 •2H2O – USP Spectrum Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, KH2PO4 – USP Spectrum Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) Spectrum Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) Spectrum Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) Spectrum Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) Spectrum Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O Spectrum Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP Spectrum Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) Spectrum Formula Weight: 551; Size: 5 gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O) Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg/5 mL ampule Hospital Pharmacy Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 5 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis? Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
  2. Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
  3. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
  4. Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
  5. Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  6. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  7. Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65, (6), 539-544 (2010).
  8. Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174, (7), 787794 (2006).
  9. Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182, (7), 929-936 (2010).
  10. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint? European Respiratory Journal. 14, 38 (2013).
  11. US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). (2014).
  12. Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305, (25), 1489-1493 (1981).
  13. Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
  14. Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
  15. Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (1), 24-28 (2014).
  16. Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter? Pediatric Pulmonology. 46, (2), 145-152 (2011).
  17. Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
  18. Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124, (2), 482-489 (2003).
  19. Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16, (5), 573-578 (2017).
  20. Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
  21. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  22. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
  23. Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  24. Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190, (2), 175-184 (2014).
  25. Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2, (7), 527-538 (2014).
  26. Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (5), 641-644 (2016).
  27. Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7, (6), e39809 (2012).
  28. Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181, (10), 1078-1083 (2010).
  29. Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60, (5), 675-679 (2015).
  30. Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144, (2), 498-506 (2013).
Standardiseret måling af Nasal membran Transepithelial potentiale forskel (NPD)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).More

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter