Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Standardisert måling av nese membran Transepithelial potensielle forskjellen (OD)

doi: 10.3791/57006 Published: September 13, 2018

Summary

Her presenterer vi en standardisert protokoll for å måle nasal potensielle forskjellen (OD). Cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) og epithelial natrium kanal (ENaC)-funksjonen evalueres etter endringen i spenning over nasal epitel etter superfusion løsninger som endrer ion kanal aktivitet, gir en utfallet tiltaket.

Abstract

Vi beskriver en standardisert måling av nese potensielle forskjellen (OD). I denne teknikken overvåkes cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) og funksjonen epithelial natrium kanal (ENaC) av endringen i spenning over nasal epitel etter superfusion løsninger som endrer ion kanal aktivitet. Dette aktiveres ved måling av potensielle forskjellen subkutan rommet og luftveier epitel i neseboret, utnytte et kateter i kontakt med en dårligere nasal Concha.

Testen kan måling av stabil planlagte spenningen og den påfølgende netto spenning endringene etter perfusjon av 100 µM amilorid, en inhibitor av Na+ reabsorpsjon i Ringer i løsningen; et klorfritt løsning som inneholder amilorid til stasjonen klorid sekresjon og 10 µM isoproterenol i en flammehemmende løsning med amilorid å stimulere syklisk adenosin monofosfat (cAMP)-avhengige klorid konduktans knyttet til CFTR.

Denne teknikken har fordelen av å demonstrere egenskapene elektrofysiologiske to nøkkelkomponenter etablere hydrering av luftveiene overflaten væsken åndedretts epitel, ENaC og CFTR. Derfor er det en nyttig forskningsverktøy for fase 2 og bevis på konseptet studier av agenter som er rettet mot CFTR og ENaC aktivitet for behandling av cystisk fibrose (CF) lungesykdom. Det er også en nøkkel oppfølgingsprosedyre å etablere CFTR dysfunksjon når genetisk testing og svette testing er tvetydig. I motsetning til svette klorid er testen relativt mer tidkrevende og kostbare. Det krever også operatør opplæring og kompetanse for å ta testen effektivt. Inter - og intra - subject variasjon er rapportert i denne teknikken spesielt i unge eller samarbeidsvillig fag. Hjelp med denne bekymringen, er tolkning blitt bedre gjennom en nylig godkjent algoritme.

Introduction

Det overordnede målet med denne metoden er å måle den nese potensielle forskjellen (OD) som mål å undersøke trans-epitelial ion transport i vivo1. Denne teknikken tillater måling av natrium (Na+) og klor (Cl-) transport. OD brukes som et forskningsverktøy siden 1980, og ble akseptert i 1998 som en diagnostisk prosedyre av cystisk fibrose Foundation skrifter konsensus setning2 og i 2017 i cystisk fibrose Foundation skrifter konsensus diagnostiske retningslinjer 3. faktisk biologiske CFTR dysfunksjon, som er årsaken til CF, er dokumentert av en økt Na+ absorpsjon på apikale membranen og en defekt i Cl- sekret. Denne funksjonelle testen gir fordelen av en ekstra diagnose verktøy når genetikk er ikke-avgjørende i pasienter med ubestemmelig mellomliggende svette test resultater3. Selv om denne informasjonen kan også oppnås ved intestinal gjeldende måling biopsier (ICM), ICM er imidlertid bare tilgjengelig i noen sentre globalt og fremme nødvendig standardisering. OD er mer tilgjengelig i ca 60 globale sentre og mål videre åndedretts epitel som er viktigste sykdommen.

Gitt informasjonen den gir CFTR aktivitet, er det også brukt i proof-of-concept studier å vurdere funksjonelle restaurering av CFTR protein av modulator terapier4,5,6,7, 8. Faktisk data fra studier med CFTR mRNA/gen redigering, CFTR forsterker og corrector terapier, markere vesentlige endringer i Cl- og Na+ transport med terapi6,9 og bekrefter at OD kan være en forståelsesfull endepunktet i kliniske forsøk. Som vi mangler følsom klinisk endepunktene kjøpedyktig merker en subtil endring i klinisk status pasienten på kort sikt, kan det hende at denne prekliniske biomarkør svært informativ. Feltet for CFTR modulator terapier utvider raskt og vi trenger tester i vivo som kan raskt dechiffrere aktive forbindelser før du går til store fase 3 forsøk10.

Fysiologiske begrunnelsen av teknikken er basert på måling av potensielle forskjellen airway epitel i neseboret og underhud batterirommet. Ion kanal aktiviteter blir utforsket ved å måle den stabile maksimale planlagte potensielle forskjellen (PD), sine endringer etter blokkerer ENaC relaterte Na+ absorpsjon og kjøre Cl- sekresjon forskjellige apikale Cl- transportører inkludert CFTR. CFTR dysfunksjon vises av en minimal endring i potensielle forskjellen ved stimulering av Cl- sekresjon gjennom en leir avhengige sti og en økt ENaC mediert Na+ absorpsjon som oppdages av en mer negativ planlagte potensiell forskjell og en forbedret respons på amilorid. Mekanistisk grunnlaget for CF kontra vanlig PD summeres i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Sammendrag figur Ion kanal aktivitet. (A) Ion aktivitet i luftveiene epitel demonstrere balansert ENaC og CFTR i vanlig fag og (B) tap av CFTR aktivitet som resulterer i økt ENaC mediert natrium transport og redusert CFTR avhengige komponenter transport. ENaC: epithelial natrium kanal, Na+: natrium, CFTR: cystisk fibrose transmembrane regulator, CL-: klorid, mV: millivolt, PD: potensielle forskjell, min: minutt/s Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Denne testen viser imidlertid en viss grad av variasjon både gjentatte målinger i samme pasient og hos pasienter med samme genotype. Dette er av største betydning for å lette tolkingen av endringer etter modulator behandling. Dessuten mangler vi fortsatt validert terskler forskjellsbehandle CF og friske. Dette kan være delvis på grunn av forskjellene mellom tilgjengeligheten av klinisk fasiliteter og teknikker ansatt. Derfor pågår en betydelig internasjonal innsats rettet mot standardisering av testen. Både av oss CFF-TDN (cystisk fibrose Foundation-Therapeutics utvikling nettverk) og ECFS-CTN (europeisk cystisk fibrose samfunnet-kliniske forsøk nettverk) opprettet en OD Standard prosedyre (SOP) for bruk i multisenter og forskning forsøk. Dette siste samarbeidet av CTN og TDN har resultert i en kombinert, internasjonale SOP, bringe sammen kompetanse CTN og TDN (2014)11. Dette dokumentet presenterer protokollen og test teknikker for å ansette OD CF diagnose eller etterforsker startet proof-of-concept prøvelser. Hver center implementere teknikken er ansvarlig for søknaden til sin institusjonelle menneskelige forskning etikk for godkjenning.

Figure 2
Figur 2: skjematisk av hele anbefalt OD oppsett. Merk at anbefalte oppsettet vises, inkludert sekvensiell perfusjon pumper og 4-stopp-kuk-serien oppsettet. Bestemte tilkoblinger og eksempler på komponenter vises i SOP. (Diagrammet endret med tillatelse fra Solomon, G.M. brystet, 201013) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Generell eksperimentell flyten er skissert i figur 2, der OD måles mellom utforske broen på epitel overflate og referanse broen plassert i subcutaneous plass, begge koblet til elektroder og en høy impedans voltmeter.

Dette er sikret av 2 forskjellige systemer: det er 2 akseptabel referanse elektrode oppsett: (i) balansert Ag/AgCl elektroder og et elektrokardiogram (ECG) krem-fylt bro koblet til subkutan plassen med liten slitasje eller (ii) mettet calomel Half-Cells og en agar fylt 22 - til 24-gauge nål introdusert subcutaneously. Kontakten til nasal mucosa aktiveres som en dobbel lumen kateter. En lumen er fylt med agar eller ECG fløte og koblet til måle elektroden, den andre lar perfusjon på nese mucosa av de ulike løsningene.

Spissen av utforske slangen plasseres på luftveiene mucosa under den underlegne nasal Concha (Figur 3).

Figure 3
Figur 3: plassering av utforske rør på luftveiene mucosa. (A) ekstern visning viser plassering. (B) Rhinoscopic Vis demonstrere plassering. (C) Diagram som viser anatomiske plasseringen for kateter plassering. PD: potensielle forskjellen

For å studere svaret av PD flere legemidler, brukes superfusion løsninger via den andre lumen av kateter. Det er flere viktige skritt om forberedelse og gjennomføring av OD målinger, som er beskrevet nedenfor i protokollen, fra innledende forberedelse gjennom til dataanalyse.

Etter forberedelse av løsninger og elektroder gir tilstrekkelig kvalitet testing av elektroder og katetre grunnleggende gjennomføringen av testen. Basal målingene gjøres langs underlegen Concha, hvilke innrømmer utvalg av de beste stedet for måling, vanligvis at med mest negative målingen. Deretter bestemme sekvensiell perfusions Na+ (ENaC) og Cl- (CFTR-avhengige) ion flux via en endring i spenningen over nasal epitel.

Protocol

Protokollen som involverer mennesker ble godkjent av alle deltakende institutter Research Committee. Hver center implementere teknikken er ansvarlig for søknaden til sin institusjonelle menneskelige forskning etikk for godkjenning.

1. løsning forberedelse

  1. Utarbeide løsninger #1, #2 og #3, som er basen løsninger, 1 L satsvis før prosedyren og lagret på stedet (tabell 1).
    Merk: Amilorid er følsomt for lys og lagres i mørket (se tabell 1 for løsning sammensetning) (se SOP for detaljert løsning forberedelse11).
    1. Bufre alle løsninger på pH 7.4 og filter med et 0.22 µm plastflaske-top filter.
    2. Løsning #3 først legge fosfat inneholder salter, la dem ionisere for å forhindre krystallisering (se tabell 2 for løsning sammensetning).
      Merk: Sekvensen av miksing er avgjørende for løsning #3.
    3. Lagre disse løsningene på 4 ° C (stabile for 3 måneder) eller på 20 ° C (stabile i 6 måneder).
    4. Forberede løsninger #4 og #5 ved å legge til agenter ved OD testen. Isoproterenol er lys og oksidasjon følsom og mister sin virksomhet ved romtemperatur (demonstrere 4% forfall over 4 h på 4-8 ° C). Butikken på 4 ° C.
      Merk: ATP er lys og oksidasjon sensitive (se tabell 3).
Sammensatte Molekylvekt Konsentrasjon (mM) Komposisjon (finans)
NaCl 58 148 8.58
CaCl2 2t2O 147 2,25 0,33
KCl 75 4.05 0,3
K2HPO4 174 2.4 0.42
KH2 PO4 136 0,4 0,05
MgCl2 6t2O 203 1.2 0.24

Tabell 1: Løsning komposisjon.

Sammensatte Molekylvekt Konsentrasjon (mM) Komposisjon (finans)
Na Gluconate 218 148 33.26
Ca Gluconate 430 2,25 0,97
K Gluconate 63° 4.05 0,95
K2 HPO4 174 2.4 0.42
KH2 PO4 136 0,4 0,05
MgSO4 7T2O 246 1.2 0.24

Tabell 2: Løsning komposisjon.

Løsning Løsningen nummer Innholdet EDC merke
Ringesignaler injeksjon Løsning #1/A Bufrede ringesignaler for injeksjon RINGESIGNALER
Ringe + amilorid Løsning #2/B Bufrede ringesignaler + 100 μM amilorid AMIL
Null Cl- + amilorid Løsning #3/C Bufret null Cl- + 100 μM amilorid OCL
Null Cl- + amilorid + isoproterenol Løsning #4/D Bufret null Cl- + 100 μM amilorid + 10 μM isoproterenol ISO
Null Cl-+ amilorid + isoproterenol + ATP Løsning #5/E Bufret null Cl- + 100 μM amilorid + 10 μM isoproterenol + 100 μM ATP ATP

Tabell 3: Løsning liste.

2. kateter

  1. Bruk en PVC, sterile, enkelt å bruke, 2 lumen (0,7 mm indre Ø) kateter med en runde og jevne ekstremitetene (2,5 mm ytre Ø), som er spesielt utformet for OD.
    1. Gjør kontakter med mucosa ved siden hull, 2 mm langt til spissen med et hull i spissen for perfusjon (se trinn 10.1).
    2. Koble én av to Luer-lock forbindelsen med kateter å måle elektroden og den andre på perfusjon pumpen. Bruk kanalen farget i blått som måler lumen. Tag kateter ved hvert 0,5 cm intervall i 10 cm.
      Merk: Dead space er 0,3 mL. Det anbefales å bruke det over fremgangsmåten for utarbeidelsen av kateter Hvis denne ikke er mulig følger de neste to trinnene.
    3. Kuttet lik (~ 76 cm) lengde på PE50 og PE90 kateter rør.
    4. Feste disse sammen i et 1 cm stykke silikon gummi tubing. Sett inn en 25 G butt tupp nål snuggly i den motsatte enden av PE-90 slangen. Sett inn en 25 G sommerfugl nål snuggly i den motsatte enden av PE50 slangen og pass på ikke å punktering av rør som er plassert.

Figure 4
Figur 4: kateter brukes for OD målinger. Rammemarg for viser catheter spissen med måling hull.

3. forberedelse Agar huden Bridge (Butterfly p) og kateter

Merk: Manipulering av smeltet agar kan forårsake brannskader, og dette bør gjøres med varsomhet.

  1. Forberede 3% agar ved å blande 3 g av agar med 100 mL #1 i en bred munn flaske. Smelte agar i mikrobølgeovn til løselig (gjennomsiktig).
    1. Fyll 10 mL sprøyte med varm agar.
    2. Koble sprøyten senere sommerfugl nålen (23 G) og den merkede lumen av kateter. Injisere agar til det vises på spissen.
    3. La det avkjøles i minst 10 min.
    4. Sikre at huden broen og kateter er fullt fylt og visualisert for å være fri for luftbobler.
    5. Lagre bulk huden broene i løsning #1 på 4 ° C, og bruker ikke etter 1 uke.

4. Hvis bruke ECG krem

  1. Fortynne ECG kremen med løsning #1 (1:1, v/v Ringer). La det hvile før gratis luftbobler.
    1. Fyll 10 mL sprøyte med fortynnet ECG krem.
    2. Koble sprøyten til den merkede lumen av kateter og sakte injisere ECG kremen til det vises på nedre side hullet.
    3. Kontroller at kateter er fullt fylt og fri for luftbobler.

5. data oppkjøpet System

Merk: Det generelle oppsettet for oppkjøpet datasystemet er vist i figur 5.

Figure 5
Figur 5: oppsett av oppkjøpet datasystemet. Demonstrere tilkoblinger av bioamplifier og headstage til datamaskinen grensesnittet og elektroden forbindelser til headstage11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Tilkoblinger
    1. Koble datamaskinen til data oppkjøpet systemet (Tabell for materiale) med en USB-kabel.
    2. For å koble oppkjøpet datasystemet til bioamplifier, koble BNC-kabelen fra kanal 1 inngang på oppkjøp datasystemet (front) til utgangen på bioamplifier (tilbake).
    3. Koble til bioamplifier til headstage med en tilpasset kabel pre koblet til headstage skruene i delen inngang foran bioamplifier.
    4. Koble til headstage til elektrodene og bakken elektroden. Bruk standard 2 mm kvinne-hunn-kontakter for å koble foran headstage til elektrodene.
      Merk: Porten er innfelt og bare passer én retning av 2 mm kabelen: Red-måle elektroden til pasienten nesen (via nasal kateter); Black-referanse elektrode til pasientens hud bridge. Hvit til ECG elektrode jordet fagets huden.
    5. Angi bioamplifier som beskrevet: Offset: trekk å aktivere, aktivere justere, la i trakk posisjon etter justering; Spenning: DC; 1 mV cal: nøytral posisjon; Strøm: På å samle inn data, av for å lade batteriet. Gevinst: satt til 10; Bandet pass: LoFreq (ytre knob): DC; Bandet pass: HighFreq (indre knob): 1kHz; Volum: av.

6. justere hodet-trinns forskyvningen

  1. Koble den bærbare datamaskinen og forsterkeren i sekvens som angitt i SOP11. Slå på oppkjøp datasystemet og laptop (rekkefølgen er viktig for at programvaren gjenkjenner apparater for datainnsamling).
    1. Justere hodet fase Offset som SOP sekvensen.

7. forskyvninger

Merk: Det finnes flere forskyvninger skal testes for å sikre stabilitet i det elektriske måle systemet. (se figur 6)

  1. For elektrode forskyvning, plasser referanse (negativ) elektroden og måling (positive) elektroden sammen i utvannet ECG kremen eller 3 M KCl. sikre det potensielle forskjellen lese mellom elektrodene er nær null på headstage.
    1. For å sette kateter og/eller huden bro forskyvningen, plassere Luer-lock slutten av nese kateter eller Luer-lock slutten av huden broen i badekaret med måling (positive) elektroden. Plass den andre enden av kateter i ECG krem bad eller 3 M KCL som inneholder referanse (negativ) elektroden sikrer at potensielle forskjellen er nær null på headstage.
    2. Sette opp en lukket sløyfe forskyvning, sikre at kretsen er lukket når du erstatter den nese kateter i badekaret av elektrodene. Sjekk som lukket loopen forskyves leser nær 0 mV (= 'offset', ±2.5 mV). Justere headstage offset bryteren til å bringe forskyvningen 0 mV.
      Merk: Dette bekrefter at alle tilkoblingene på krets er intakte. Hvis dette ikke er tilfelle, nasal kateter kan ikke være intakt (luftbobler i agar eller ECG krem). Endre agar broen eller presse ECG kremen i oppsettet. Elektroden forskyvningen må utføres først, etterfulgt av lukket system (lukket sløyfe forskyvning) med elektroden og bridge (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Oppsett av (A) elektroden forskyvning, (B) kateter (eller bridge) forskyvning, (C) lukket sløyfe forskyvning.

8. sprøyte oppsett

Merk: Følgende er det anbefalte oppsettet.

  1. Tine løsninger #1, #2 og #3 ca 1 time før måling.
    1. Koble forlengelsesslangen til stopcock nærmest kateter.
    2. Slå på alle pumper, og tømme kateter løsning #1 å helt skylle av kateter til stopcocks er klar av bobler.

9. plassering av referanse og måling elektrode

Figure 7
Figur 7: Emne med måle elektroden og underhud bro klar for målinger.

  1. Har studere emnet ta sittende stilling overfor operatoren OD. For mer komfort, plasser føttene på valgfri anti-statisk matte og hodet på orthoptic haken resten.
    1. Koble bakken bly elektroden til ECG pad plassert på emnet arm (figur 7).
    2. Subkutan nålen inn dorsal underarmen (agar system) eller referanse elektroden gjelder EKG krem på et tidligere minimal abraded område på underarmen (se punkt 7 til 10 nedenfor).
    3. Kontroller tilkoblingen til subkutan plass ved å måle den potensielle forskjellen med huden (Finger PD) og be om emnet lukke "måling hullet" ved pinching kateter mellom spissen av sin tommelen og pekefingeren.
    4. Hvis Finger PD ikke -30 mV eller flere negative, sjekk innsetting av sommerfugl nålen. Gjenta slitasje (for ECG krem oppsett) og sjekk broer.
    5. Start løsning #1 sprøytepumpen på 80 mL/h. Start med det høyre neseboret.
    6. Måle Finger PD som en jevn negativ spenning (rekkevidde 40--80 mV).
    7. Hvis bruker EKG krem System: fortynne ECG krem 1:1 og fylle kateter etter en fullstendig flush av ut av sonden hullet som tidligere sett for Agar.
    8. Koble kateter til en 50 mL sprøyte halv fylt med ECG kremen å bade elektrodene, slik at en sjekk av elektroden forskyvningen og broen av settet.
    9. Koble referansen Ag/Cl elektrode til subkutan plass ved liten tidligere minimal slitasje av huden, huden vises "rosa og skinnende" når nivået av dermis er nådd.
    10. Plasser måle elektroden, dekket med ECG krem, på abraded hud. Sjekk fingeren PD som tidligere vist for Agar systemet.

10. måling av basale PD

  1. Den nese kateter inn høyre nesebor bruker en belyst rhinoscope (eller tilsvarende) for å visualisere underlegen Concha. Bruke fremre spissen som et landemerke, forhånd kateter målretting dårligere stedet for dårlig Concha på luftveiene mucosa. Hvis plasseringen er vanskelig, kan eventuelt sonde hullet plasseres i kontakt med gulvet i neseboret.
    Merk: Kateter er stiv nok til å bli veiledet i neseboret av operatøren. For å lette plasseringen, en kanal av kateter er farget i blått og inneholder probe-side hullet i kontakt med underlegen Concha. Dette hindrer kateter rotasjon. Merkene vises på kateter fra 1 til 10 cm gir enkel referanse poeng.
    1. Måle PD på underlegen Concha. For dette formålet, kan du sikre at måling hullet av kateter er stengt av sin plassering mot mucosa underlegen Concha (merke høyre basale på).
    2. Måle PD på 3.0, 2.0, 1.5, 1.0 og 0,5 cm (avstand i den underlegne kjøtt fra underlegen Concha): merke høyre basale PDs.
    3. Opprettholde hver måling på den angitte avstanden for ca 5 s å sikre en jevn lesing (± 1 mV) og å lette nøyaktig tolkning av basale PD verdier.
    4. Gjenta trinnene ovenfor i det venstre neseboret, ved hjelp av funksjonstasten for å markere venstre basale PDs (3 cm, 2 cm, etc.) og det venstre basale på.
    5. Bruker basal PD tiltak som en guide, sette sonden av nese kateter til området av mest negative signalet (opp til 3 cm fra fremre spissen av en mindreverdig nasal Concha), og sørger for et lite stykke tape på spissen av nesen (eller tilsvarende).

11. OD sporing sekvensiell Perfusions

  1. For det høyre neseboret
    1. Kontroller at løsningen er dryppende fra pasientens nesen. Har emnet antar en behagelig stilling med hodet ned (ofte hjulpet av har emnet hvile hodet på sin hånd eller bruke en chinrest eller andre immobilizing enhet). Minne gjenstand å minimere bevegelse og unngå å berøre nesen eller slangen, og unngå snakker.
    2. Slå løsning #1 (Ringers) pumpen på (5 mL/min eller 300 mL/t). Ta opp til en stabil verdi er oppnådd (< 1 mV endring/30 s).
      Merk: Dette tar omtrent 3 minutter å oppnå stabilitet.
    3. Slå av perfusjon løsning #1.
    4. Start perfusjonen med løsning #2 (amilorid). Registrere OD i minst 3 min (hvis platå spenningen er i tvil, fortsette opptaket i opptil 5 min totale).
    5. Start perfusjonen med løsning #3 (null klorid). Registrere OD i minst 3 min (hvis platå spenningen ikke er stabil, fortsette opptaket i opptil 5 min totale).
    6. Start perfusjonen med løsning #4 (Isoproterenol). Registrere OD i minst 3 min [Hvis platå spenningen ikke er stabil (en jevn spenning sporing for minst 30 s < 1 mV drift), fortsette opptaket i opptil 5 min totale].
    7. Start perfusjonen med løsning #5 (ATP). Registrere OD minimum 1 min, til en topp hyperpolarizing responsen er oppnådd.
    8. Slå på perfusjon med løsning #1 (Ringers) og tillate 30 å tømme kateter.
    9. Slå av løsning #1 perfusjon.
    10. Gjenta dette for det venstre neseboret.

12. etter testen

  1. Kontroller og registrere stabil Finger PD ("Post Finger") for 5 s.
    1. Fjern emnet kutan bridge og bandasjen fra innsetting site på huden. For AgCl/ECG krem systemet, fjerne elektroden fra armen.
    2. Registrere "Siste lukket Loop Offset" spenningen som måler første lukket sløyfe forskyvningen (se trinn 7.1.3).
    3. Merke siste forskyvning med funksjonstasten.
    4. Stoppe datainnsamling (trykk "Start").
      Merk: Gjeldende SOP anbefaler bruk av 100 µM ATP aktivere purinergic kalsium avhengige Cl- utskillelsen, som en positiv kontroll for test; men er dette en valgfri test.

Representative Results

I normal airway epithelia er Na+ absorpsjon primære ion transport aktiviteten. Dette resulterer i en negativ airway overflaten potensiell forskjell med hensyn til interstitium. Perfusjon av ENaC kanal blokkering amilorid fører til en mindre negative potensielle forskjellen. Deretter superfusion av Cl--gratis løsning skaper en kjemisk gradering for Cl-, som skaper negative potensielle forskjeller og aktiverer alle Cl- transportører, inkludert CFTR. Isoproterenol, som øker intracellulær leiren, ytterligere øker Cl- sekresjon av spesielt CFTR og øker den potensielle forskjellen.

Derimot i CF fag mediert fraværende eller dysfunksjonelle CFTR resulterer i en økt ENaC Na+ absorpsjon12. Som et resultat, er planlagte potensielle forskjellen negative. Depolarization observert med anvendelse av amilorid er større, mens det er minimal eller ingen endring i den potensielle forskjellen ved stimulering av Cl- sekresjon gjennom CFTR avhengige baner. Dette kan sees i de representant tracings i Figur 8viser "sunn" vs 'CF' tracings.

Figure 8
Figur 8: Representative tracings "sunn" emnet og gjenstand med jf PD: potensiell forskjell, ΔAmiloride: delta amilorid, 0 Cl-/Iso-: lav klorid: endring i PD mellom fullføringen av løsning #2 og løsning #4 perfusjon, S1-S4: trinn 1-4, grønn linje på grafer A og B Angir OD sporing og svart pilene angir forskjellen i potensielle forskjellen

Discussion

I vivo, OD gir en unik måling som kan utføres flere ganger på langsgående basis og viser at med gjentatte målinger, lignende langsgående resultater er observert på et group-wise og personlige14, 15. Det er sterke bevis for at OD har utmerket diskriminering gyldigheten for å skille CF fra ikke-CF. 25 studier vist en statistisk signifikant forskjell i Cl- og Na+ ledningsevne mellom pasienter med CF og sunn kontroller10. Mens flere tidligere utviklet indekser demonstrere denne kapasiteten, forventer vi at nye oppdateringer er nødvendig gitt siste standardizations av metode7,8.

Endringer og feilsøking

Denne testen krever flere viktige trinn å sikre nøyaktige målinger. Dette inkluderer elektroder og katetre lukket sløyfe forskyvningen for å sikre at systemet utfører anbefalte standarder. Pasienter må forbli fremdeles og avholde seg fra fra snakker som dette reduserer gjenstander og kateter dislodgement. Dette gjør testen vanskelig i ikke-samarbeidende pasienter og teknikken er bare rapportert i en studie i barn under 6 års alder7.

Inspisert av nese epitel er nødvendig for å sikre at det er ingen skorper eller Slim på epitel, noe som kan påvirke målingene.

Veldig viktig, må det påpekes at plasseringen av plasseringen av kateter er gjenstand for debatt. SOP presenteres her benytter måling under underlegen Concha (det). Plassering av kateter under IT har blitt standardisert og utført i multicenter studier og derfor er dette anbefalte teknikken. Måling under IT utføres med side-hulls kateter, som kan være vanskelig å opprettholde i fast kontakt med nasal mucosa, mens kontakt med løsningene. Andre grupper kan måle PD på nese gulvet, teknisk enklere. Viktigere, vist Vermeulen (2011) at det 2 metoder er sammenlignbare16.

Oppvarmingen av løsningene er fortsatt en del debatt mellom europeiske og amerikanske centers17,18. Det har blitt forfektet at løsninger på 37 ° C i stedet for 22 ° C øker observert totale klorid svaret av ca 25% og isoproterenol-avhengige klorid svaret av ca 95%18. Men øker oppvarming variasjon, som vurdert av de totale klorid svar17større standardavvik. Derfor oppvarming løsninger er en tilleggsfaktor på variasjon, er det anbefales ikke å varme løsninger med mindre nødvendig på studiet basis.

Vi har tidligere sammenlignet begge elektrode teknikker og fant at både AgCl og Calomel elektrode systemer drives tilsvarende på basale og stimulert strømninger i vanlig fag13.

Begrensninger av teknikken

Denne testen er underlagt betydelig innenfor emnet variasjon. Dette skal regnskapsføres i minnediagnostiseringsprogrammet19variasjon av scoring er særlig utbredt i pasienter med ubestemmelig tracings. Faktorer av variasjon er akutt øvre luftveisinfeksjon, omfattende nasal polypper, tidligere sinus kirurgi og CF-relaterte betennelse, som reduserer dens spesifisitet og følsomhet20,10. I tillegg tolkning av tracings kan være forskjellig mellom leserne, men ekspert lesere vise utmerket avtale av kvantitative scoring og interpretability CF og ikke-CF tracings, kontrast med en betydelig variasjon i de tillit av sporing19.

Iboende variasjon versus betydelig terskler

Veldig viktig, fysiologiske variasjon av målingen er betydelig, som illustrert i forskjellige studier10, som CFTR gene terapi prøvelser som vist betydelig variasjon i endringer i klorid totale transport og amilorid varierer21,22. Tverrsnittsstudier evaluering antyder at null Cl- pluss isoproterenol svar over terskelen av-5 -7 mV er cut-off mellom CF og ikke-CF fag10.

Likevel mangler vi klart kunnskap om omfanget av endring av denne parameteren representerer en effektiv CFTR korreksjon i fase II forsøk med sykdom endre terapier. For å vurdere individuell respons, kan gjentatte tester overvåking responsen på en intervensjon være nødvendig å skille betydelige endringer fra iboende variasjon. Veldig viktig, må fremtidige langsiktige studier med sykdom endre narkotika vise at forbedring i CFTR-funksjonen samsvarer med forbedring i klinisk relevante resultater eller surrogat resultater (som forbedring i FEV1) av CF sykdom. Faktisk merket en fersk fase II Ivacaftor studie vist klinisk fordel til tross for en liten forbedring i klorid sekresjon23.

Slike studier vil bidra til å etablere hvis cut-off verdien forbedring i trans-epitelial Cl-konduktans kan være en surrogat parameter for klinisk fordel. Dette er en viktig parameter for guiding utviklingen av CFTR å endre terapier.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder: svette Test og Intestinal gjeldende målinger (ICM)

Hos pasienter med '' tvilsom '' cystisk fibrose, som vurdert av en mellomliggende svette Cl- konsentrasjon mellom 30 og 60 mM, OD sammensatt score følger en svært følsom å diagnostisere pasienter '' CF-sannsynlig '' og '' CF-usannsynlig ''10 . Intestinal gjeldende måling (ICM), som gir en ex vivo måling av netto Cl- flukser over endetarms epitel, tillater også fastsettelse av gjenværende CFTR funksjonen med en høy følsomhet, fordi CFTR er svært uttrykt i Denne epitel.

Vurderer modifikasjon av CFTR funksjonen ved CFTR modulatorer, forholdet mellom disse ulike CFTR biomarkør endringene er i dag uklart. Selv om nyere arbeid basert på fastslått Ivacaftor at OD og svette test er korrelert4, det ennå ikke har opprettet hvis en måling i luftveiene er en bedre prediktor for åndedretts resultat enn for eksempel, svette test24 , 25 eller endring i ICM. Videre kan modifikator narkotika også varierer i deres orgel bestemte efficacies. I forhold til OD er det viktig å merke seg at endringer i basale PD og amilorid respons uttrykke Na+ transport, mens endringer i 0 Cl- og isoproterenol svar express Cl- transport. Det er ennå å bli etablert som disse er viktigere for sykdom forbedring.

Fremtidig bruk av denne teknikken

Bruk av denne teknikken er ventet utenfor feltet CF. Siden denne teknikken er unikt egnet for å demonstrere Na+ og Cl- ion kanalen, kan det brukes for å demonstrere dysfunksjon i airways sykdommer som astma26, kronisk bronkitt27, ikke-CF bronkiektasier28 og tilbakevendende pankreatitt29. I tillegg har endringer av denne teknikken vært brukt i lavere luftveiene (LAPD) for å demonstrere nedre luftveier-fokusert CFTR dysfunksjon i kroniske hindrende lunge sykdom (COPD) pasienter med kronisk bronkitt30.

OD gir en følsom i vivo biomarkør av CFTR-funksjonen, som kan brukes for både diagnostisering, og også for proof-of-concept studier å rette CFTR og ENaC stasjon aktivitet i translasjonsforskning. Dette gjør langsgående vurdering av trans-epitelial funksjon og holder løftet som en strategi for personlig medisin skreddersy mest effektive corrector for hver pasient med CF.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av arbeidsgruppen for CFTR funksjonen standardisering leder (kliniske forsøk nettverk, europeiske cystisk fibrose samfunn) og den nasjonale ressurser Center Working Group (Therapeutics Development Network, cystisk fibrose Foundation). Ytterligere støtte ble gitt av CF Foundation (Clancy FY09 til GMS) og NIH (DK072482 SMR og GMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) Fisher Scientific
Powerlab 4/30 AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 AD Instruments
Windows compatible PC - Minimum requirements of Windows XP or higher Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject) Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes Fisher Scientific 13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode BIOPAC Systems UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream Fisher Scientific Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device PROMED Feeling Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing Fisher Scientific 427411
Becton Dickinson PE 90 tubing Fisher Scientific 427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD Fisher Scientific 508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) 3M 1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US Marquat I0202US
1" X 10 yards silk tape 3M Durapore 1538-1
IV extension tubing (30", 50/box) International Limited IMN30
Three-way stopcock (50/box) Medex MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0.22-μm or smaller filters; or equivalent) Fisher Scientific 09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20 G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 427564
Becton Dickinson 23 G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 367283
Becton Dickinson Syringe 60 mL without needle Luer-Lok tip (40/Box) Fisher Scientific 309653
Becton Dickinson Syringe 10 mL without needle Luer-Lok tip (100/Box) Fisher Scientific 309604
Single use sterile wipes (per institutional availability) Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 L volumes acceptable) Fisher Scientific 430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23" x 36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) SureCare
23 G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) Becton Dickinson 367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional) Richmond Products, Inc 629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting  (or equivalent) Fisher Scientific No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl Spectrum Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2 •2H2O – USP Spectrum Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, KH2PO4 – USP Spectrum Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) Spectrum Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) Spectrum Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) Spectrum Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) Spectrum Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O Spectrum Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP Spectrum Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) Spectrum Formula Weight: 551; Size: 5 gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O) Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg/5 mL ampule Hospital Pharmacy Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 5 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis? Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
  2. Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
  3. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
  4. Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
  5. Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  6. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  7. Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65, (6), 539-544 (2010).
  8. Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174, (7), 787794 (2006).
  9. Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182, (7), 929-936 (2010).
  10. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint? European Respiratory Journal. 14, 38 (2013).
  11. US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). (2014).
  12. Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305, (25), 1489-1493 (1981).
  13. Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
  14. Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
  15. Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (1), 24-28 (2014).
  16. Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter? Pediatric Pulmonology. 46, (2), 145-152 (2011).
  17. Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
  18. Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124, (2), 482-489 (2003).
  19. Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16, (5), 573-578 (2017).
  20. Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
  21. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  22. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
  23. Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  24. Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190, (2), 175-184 (2014).
  25. Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2, (7), 527-538 (2014).
  26. Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (5), 641-644 (2016).
  27. Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7, (6), e39809 (2012).
  28. Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181, (10), 1078-1083 (2010).
  29. Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60, (5), 675-679 (2015).
  30. Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144, (2), 498-506 (2013).
Standardisert måling av nese membran Transepithelial potensielle forskjellen (OD)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).More

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter