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Medicine

Medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana Nasal (NPD)

doi: 10.3791/57006 Published: September 13, 2018

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para medir a diferença de potencial nasal (NPD). Regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e de sódio epitelial (ENaC) de canal função são avaliados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após superfusion de soluções que modificam a atividade do canal de íon, fornecendo um medida de resultado.

Abstract

Nós descrevemos uma medição padronizada da diferença de potencial nasal (NPD). Nesta técnica, regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e a função de canal (ENaC) epiteliais de sódio são monitorados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após o superfusion de soluções que modificar o canal iônico atividade. Isto é permitido a medição da diferença de potencial entre o compartimento subcutâneo e o epitélio das vias aéreas na narina, utilizando um cateter em contacto com o corneto nasal inferior.

O teste permite a medição da tensão de linha de base estável e as alterações sucessivas tensão líquida após a perfusão de 100 µM amilorida, um inibidor de reabsorção de Na+ em solução de Ringer; uma solução de cloreto livre contendo amilorida a secreção de cloreto de unidade e 10 µM isoproterenol em uma solução de cloreto livre com amilorida para estimular o adenosina monofosfato cíclica (cAMP)-condutância cloreto dependentes relacionados a CFTR.

Esta técnica tem a vantagem de demonstrar as propriedades eletrofisiológicas de dois componentes-chave que institui a hidratação do líquido das vias respiratórias superfície do epitélio respiratório, ENaC e CFTR. Portanto, é uma ferramenta útil de pesquisa para a fase 2 e comprovante de ensaios conceito agentes CFTR e ENaC atividade para o tratamento da doença de pulmão fibrose cística (CF) de destino. É também um procedimento de acompanhamento chave para estabelecer a disfunção CFTR quando genética e teste de suor são equívocos. Ao contrário de cloreto de suor, o teste é relativamente mais demorado e caro. Ele também requer treinamento do operador e expertise para realizar o teste de forma eficaz. Variabilidade intere intra - subject relatou nesta técnica, especialmente em indivíduos jovens ou não cooperativos. Para ajudar com esta preocupação, interpretação foi melhorada através de um algoritmo recentemente validado.

Introduction

O objectivo geral deste método é medir a diferença de potencial nasal (NPD) que visa investigar o transporte trans-epitelial íon na vivo1. Esta técnica permite a medição de sódio (Na+) e transporte de cloreto (Cl.). NPD tem sido utilizado como ferramenta de pesquisa desde a década de 1980 e foi aceito como um procedimento diagnóstico em 1998, pela Fundação de fibrose cística (CFF) consenso instrução2 e em 2017 nas diretrizes do diagnóstico da Fundação de fibrose cística (CFF) consenso 3. com efeito, disfunção biológica de CFTR, que é a causa da CF, é evidenciada por uma maior absorção de at+ na membrana apical e um defeito na secreção de Cl . Este teste funcional oferece a vantagem de uma ferramenta de diagnóstico adicionais quando genética é não-conclusivo em pacientes com teste de suor intermédio indeterminado resultados3. Embora essas informações podem também ser obtidas por biópsias de medição atual intestinal (ICM), o ICM é, no entanto, somente disponível em alguns centros globalmente e precisa mais padronização. NPD é mais disponível em aproximadamente 60 centros globais e, além disso, metas do epitélio respiratório que é o principal local da doença.

Tendo em conta as informações que ele fornece na atividade CFTR, também é usado em estudos de prova de conceito, com o objetivo de avaliar a recuperação funcional da proteína CFTR pelo modulador terapias4,5,6,7, 8. De facto, dados de estudos com edição de mRNA/gene CFTR, potenciador de CFTR e terapias de corrector, realçar alterações significativas na Cl e at+ transporte com terapia6,9 e confirma que o NPD pode ser um ponto de extremidade responsivo em ensaios clínicos. Como temos falta pontos finais clínicos sensíveis capazes de detectar uma sutil mudança no estado clínico do paciente, a curto prazo, este biomarcador pré-clínica pode ser altamente informativa. O campo das terapias de modulador CFTR amplia rapidamente e precisamos urgentemente de testes na vivo que são capazes de decifrar rapidamente compostos ativos antes de ir para a grande fase 3 ensaios10.

A lógica fisiológica da técnica baseia-se na medição da diferença potencial entre o epitélio das vias aéreas na narina e o compartimento subcutâneo. Atividades do canal de íon são exploradas, medindo a diferença de potencial máxima de linha de base estável (PD), suas alterações após bloquear a ENaC relacionadas a absorção at+ e secreção de Cl de condução através de diferentes transportadores apicais de Cl incluindo a CFTR. Disfunção CFTR é mostrada por uma mudança mínima na diferença de potencial sobre estimulação da secreção de Cl com um acampamento caminho dependente e um aumento ENaC mediada por absorção at+ detectadas por uma diferença de potencial mais negativa da linha de base e uma resposta reforçada para amilorida. A base mecanicista para CF versus normal PD está resumida na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: figura Resumo da actividade do canal iônico. Íon (A) atividade em demonstrar o epitélio respiratório equilibrado atividade de ENaC e CFTR em indivíduos normais e (B) perda de atividade CFTR, resultando em maior transporte de sódio ENaC mediada e reduzida dependente cloreto CFTR transporte. ENaC: canal de sódio epitelial, at+: sódio, CFTR: fibrose cística regulador transmembrana, CL: cloreto, mV: milivolts, PD: diferença de potencial, min: minuto/s , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No entanto, este teste demonstra algum grau de variabilidade tanto em medidas repetidas no mesmo paciente e entre os pacientes com o mesmo genótipo. Isto é de extrema importância para facilitar a interpretação das mudanças após o tratamento do modulador. Além disso, falta-nos ainda validados limiares discriminar entre CF e indivíduos saudáveis. Isto pode ser parcialmente devido às diferenças entre a disponibilidade de instalações clínicas e as técnicas empregadas. Portanto, um considerável esforço internacional destinado a padronização do teste está em andamento. Tanto nos CFF-TDN (rede de desenvolvimento de terapêutica-Fundação de fibrose cística) e o ECF-CTN (rede europeia de fibrose cística-sociedade clínica ensaios) criaram um procedimento operacional padrão do NPD (SOP) para o uso nos julgamentos multicêntrico e pesquisa. Este recente trabalho colaborativo pelo CTN e TDN resultou em um SOP combinada, internacional, reunindo os conhecimentos do CTN e TDN (2014)11. Este artigo apresenta as técnicas de protocolo e teste para empregar NPD para diagnóstico de CF ou para ensaios de prova de conceito iniciado pelo investigador. Cada centro de aplicação da técnica é responsável pela aplicação de sua Comissão de ética de pesquisa humana institucional para aprovação.

Figure 2
Figura 2: diagrama esquemático de todo recomendado configuração NPD. Observe que a configuração recomendada é mostrada, incluindo bombas de perfusão sequencial e a configuração de série 4-paragem-pau. Conexões específicas e exemplos de componentes são mostrados na SOP. (Diagrama modificado com permissão de Salomão, no peito, G.M. 201013) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O fluxo geral experimental é descrito na Figura 2, pelo qual o NPD é medido entre a ponte explorando posicionada sobre a ponte de superfície e referência de epitélio colocada no espaço subcutâneo, ambos conectados a eletrodos e uma alta impedância voltímetro.

Isso é assegurado por 2 sistemas diferentes: existem 2 configurações de eletrodo de referência aceitável: (i) equilibrado eletrodos de Ag/AgCl e uma ponte de creme do eletrocardiograma (ECG) ligado ao espaço subcutâneo por ligeira abrasão ou (ii) saturado de calomelano semicélulas e um ágar cheio de 22 a 24-agulha introduzida por via subcutânea. O contato com a mucosa nasal é ativado por um cateter de duplo lúmen. Um lúmen é preenchida com ágar-ágar ou creme de ECG e ligado ao eléctrodo de medição, a outra permite a perfusão na mucosa nasal das diferentes soluções.

A ponta do tubo de explorar é colocada na mucosa respiratória sob o inferior nasal corneto (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: colocação de tubos no mucosa respiratória a explorar. (A) colocação de apresentando visão externa. (B) vista rinoscópico demonstrando a colocação. (C) diagrama indicando a localização anatômica para colocação do cateter. PD: diferença de potencial

Para estudar a resposta do PD para vários medicamentos, as soluções superfusion são aplicadas através do segundo lúmen do cateter. Existem várias etapas-chave sobre a preparação e realização das medições do NPD, que são detalhadas abaixo no protocolo, desde a preparação inicial através de análise de dados.

Após a preparação de soluções e eletrodos, testes de qualidade adequada dos eletrodos e cateteres permite o comportamento básico do teste. São realizadas medições basais ao longo do corneto, inferior que permite a seleção do melhor local para a medição, geralmente que a medição mais negativo. Então perfusions sequenciais determinam at+ (ENaC) e Cl fluxo de iões (CFTR-dependente) através de uma mudança de tensão entre o epitélio nasal.

Protocol

O protocolo envolvendo seres humanos foi aprovado pelo Comitê de pesquisa dos institutos todos os participantes. Cada centro de aplicação da técnica é responsável pela aplicação de sua Comissão de ética de pesquisa humana institucional para aprovação.

1. preparação da solução

  1. Prepare soluções #1, #2 e #3, que são soluções de base, em lotes de 1 L antes do procedimento e armazenado no local (tabela 1).
    Nota: Amilorida é sensível à luz e devem ser armazenada no escuro (ver tabela 1 para a composição da solução) (consulte SOP para solução detalhada preparação11).
    1. Tampão de todas as soluções em pH 7,4 e filtrar com um filtro de garrafa-top 0,22 µm.
    2. Solução #3, adicione os sais de fosfato contendo primeiro, permitir-lhes ionizar para evitar cristalização (ver tabela 2 para composição de solução).
      Nota: A sequência da mistura é essencial para a solução #3.
    3. Guarde essas soluções a 4 ° C (estável por 3 meses) ou a-20 ° C (estável por 6 meses).
    4. Prepare soluções #4 e #5 adicionando agentes no dia do teste NPD. Isoproterenol é luz e oxidação sensível e perde sua atividade à temperatura ambiente (demonstrando deterioração 4% mais de 4 h 4 – 8 ° c). Loja a 4 ° C.
      Nota: O ATP é luz e oxidação sensível (ver quadro 3).
Composto Peso molecular Concentração (mM) Composição (g/L)
NaCl 58 148 8,58
CaCl2 2 H2O 147 2.25 0,33
KCl 75 4.05 0.3
K2HPO4 174 2.4 0.42
KH2 PO4 136 0.4 0.05
MgCl2 6 H2O 203 1.2 0,24

Tabela 1: Composição de solução.

Composto Peso molecular Concentração (mM) Composição (g/L)
Gluconato de at 218 148 33.26
Gluconato de CA 430 2.25 0,97
Gluconato de K 234 4.05 0,95
K2 HPO4 174 2.4 0.42
KH2 PO4 136 0.4 0.05
MgSO4 7 H2O 246 1.2 0,24

Tabela 2: Composição de solução.

Solução Número de solução Sumário Marca de EDC
Injeção de toques Solução #1/A Toques tamponadas para a injeção TOQUES
Toques + amilorida Solução #2/B Toques no buffer + 100 μM amilorida AMIL
Zero Cl + amilorida Solução #3/C Em buffer zero Cl + 100 μM amilorida OCL
Zero Cl + amilorida + isoproterenol Solução #4/D Em buffer zero Cl + 100 μM amilorida + 10 μM isoproterenol ISO
Zero Cl+ amilorida + isoproterenol ATP Solução #5/E Em buffer zero Cl , 100 μM amilorida + 10 μM isoproterenol + 100 μM ATP ATP

Tabela 3: Lista de solução.

2. o cateter

  1. Use um PVC, estéril de uso único, cateter 2 lúmens (0,7 mm interno Ø) com uma extremidade redonda e Lisa (2,5 mm exterior Ø), que é projetada especificamente para o NPD.
    1. Fazer contato com a mucosa por um buraco de lado, 2mm distante para a ponta com um buraco na ponta para perfusão (ver passo 10.1).
    2. Conecte uma das duas conexões Luer-lock do cateter para o eléctrodo de medição e o outro para a bomba de perfusão. Use o canal corado em azul como o lúmen de medição. Marca o cateter a cada intervalo de 0,5 cm para 10 cm.
      Nota: O espaço morto é de 0,3 mL. É preferível usar o procedimento acima para a preparação do cateter se isto não for possível seguir as duas próximas etapas.
    3. Corte igual (~ 76 cm) comprimentos de tubagem de cateter PE50 e PE90.
    4. Apor isso juntos em um pedaço de 1 cm de tubo de borracha de silicone. Inserir a extremidade oposta do tubo de PE-90, um aconchegante de agulha de ponta romba de 25 G. Inserir a extremidade oposta do tubo PE50 certificando-se não perfurar o tubo que é colocado um aconchegante de agulha 25g borboleta.

Figure 4
Figura 4: cateter utilizado para medições de NPD. Caixa de baixo-relevo demonstra a ponta do cateter com orifício de medição.

3. preparação da ponte de pele de ágar (agulha tipo borboleta) e cateter

Nota: A manipulação do ágar derretido pode causar queimaduras, e isso deve ser feito com cautela.

  1. Prepare 3% de ágar misturando 3 g de ágar com 100 mL de solução #1 em um frasco de boca larga. Derreter o ágar no microondas até solúvel (transparente).
    1. Encha a seringa de 10 mL com ágar quente.
    2. Conecte a seringa posteriormente na agulha borboleta (23 G) e para o marcado lúmen do cateter. Injete o ágar até que ele apareça na ponta.
    3. Deixe-a esfriar pelo menos 10 min.
    4. Certifique-se que a ponte de pele e o cateter são totalmente preenchidos e visualizados para ser livre de bolhas de ar.
    5. Armazenar as pontes de pele granel em solução #1 a 4 ° C e não utilizar depois de 1 semana.

4. se o creme Using ECG

  1. Dilua o creme de ECG com solução #1 (1:1, v/v Ringer). Deixe descansar até que esteja isenta de bolhas de ar.
    1. Encha a seringa de 10 mL com creme diluído de ECG.
    2. Conecte a seringa ao lúmen do cateter marcado e injecte lentamente o creme de ECG até que ele apareça no buraco lateral inferior.
    3. Certifique-se de que o cateter é totalmente preenchido e livre de bolhas de ar.

5. sistema de aquisição de dados

Nota: A configuração geral do sistema de aquisição de dados é mostrada na Figura 5.

Figure 5
Figura 5: configuração do sistema de aquisição de dados. Demonstrando conexões do bioamplifier e headstage para a interface do computador, bem como as conexões de eletrodo para a headstage11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Conexões
    1. Conecte o computador ao sistema de aquisição de dados (Tabela de materiais) com um cabo USB.
    2. Para conectar o sistema de aquisição de dados para o bioamplifier, conecte o cabo BNC do canal 1 sobre o sistema de aquisição de dados (frente) de entrada para a saída sobre o bioamplifier (costas).
    3. Conecte a bioamplifier para o headstage com um cabo personalizado Pre-ligado para os parafusos de headstage à porção entrada na frente do bioamplifier.
    4. Conecte a headstage para os eletrodos e o eléctrodo de terra. Use conectores de fêmea-fêmea padrão de 2 mm para conectar os eletrodos na frente do headstage.
      Nota: A porta é embutida e só cabe uma direção do cabo de 2 milímetros: eletrodo de medição vermelho no nariz do paciente (através de cateter nasal); Eletrodo preto-referência à ponte de pele do paciente; Branco para eletrodo ECG aterrado à pele do sujeito.
    5. Definir o bioamplifier como descrito: deslocamento: puxe para ativar, gire para ajustar, deixe na posição puxada após ajuste; Tensão: DC; 1 mV cal: posição neutra; Poder: Para coletar dados, off para carregar a bateria; Ganho: conjunto de 10; Passa faixa: LoFreq (botão exterior): DC; Passa faixa: HighFreq (botão interno): 1kHz; Volume: fora.

6. Ajuste o deslocamento de fase de cabeça

  1. Ligar o laptop e o amplificador na sequência, conforme indicado na SOP11. Ligue o sistema de aquisição de dados e, em seguida, o laptop (a sequência é importante para o software reconhecer o aparelho de aquisição de dados).
    1. Ajuste a cabeça-estágio de deslocamento conforme a sequência de SOP.

7. deslocamentos

Nota: Existem vários deslocamentos para ser testado para assegurar a estabilidade do sistema de medição elétrica. (ver Figura 6)

  1. Para o deslocamento do eletrodo, coloque o eletrodo de referência (negativo) e eletrodo (positivo) medição juntos no creme diluído de ECG ou a 3 M KCl. Assegure-se que a diferença de potencial entre os eletrodos de leitura é perto de zero sobre o headstage.
    1. Para definir o deslocamento de ponte do cateter e/ou pele, coloca o final do conector Luer-lock do cateter nasal ou o final do conector Luer-lock da ponte de pele para o banho com o eléctrodo de medição (positivo). Coloque a outra extremidade do cateter no ECG creme banho ou 3 M de KCL, que contém a referência elétrodo (negativo) garantindo que a diferença de potencial é perto de zero sobre o headstage.
    2. Para configurar um deslocamento de loop fechado, certifique-se de que o circuito está fechado quando substituindo o cateter nasal no banho dos eletrodos. Verificar que o circuito fechado deslocamento lê perto 0 mV (= 'Deslocamento'; ± 2,5 mV). Ajuste o botão de deslocamento de headstage para trazer o deslocamento para 0 mV.
      Nota: Isto confirma que todas as conexões dentro do circuito estão intactas. Se isso não for o caso, o cateter nasal pode não estar intacto (bolhas em agar ou o creme de ECG de ar). Alterar a ponte de ágar ou empurrar o creme de ECG no setup. O deslocamento do eletrodo deve ser executado primeiro, seguido pelo fechado sistema (deslocamento de loop fechado) com o eléctrodo e a ponte (Figura 6).

Figure 6
Figura 6: Deslocamento de instalação do (A) deslocamento do eletrodo, (B) cateter (ou ponte), (C) deslocamento de loop fechado.

8. seringa set-up

Nota: O seguinte é a configuração recomendada.

  1. Descongelar soluções #1, #2 e #3 aproximadamente 1h antes da medição.
    1. Conecte a linha de extensão para a torneira mais próxima ao cateter.
    2. Ligue todas as bombas e irrigue o cateter com solução #1 para expelir completamente o cateter até torneiras são claras de bolhas.

9. colocação do eletrodo de medição e da referência

Figure 7
Figura 7: Assunto com eletrodo e subcutâneo ponte pronta para medições de medição.

  1. Com o assunto de estudo tomar posição sentada de frente para o operador do NPD. Para maior conforto, coloque os pés na opcional antiestática esteira e cabeça sobre o descanso de queixo ortopédicos.
    1. Conecte o eletrodo de chumbo do chão para a almofada de ECG colocada no braço do sujeito (Figura 7).
    2. Insira a agulha subcutânea no antebraço dorsal (sistema de ágar) ou aplicar o eletrodo de referência para o ECG creme em uma área anteriormente minimamente abradado no antebraço (ver pontos 7 a 10 abaixo).
    3. Verifique a conexão ao espaço subcutâneo medindo a diferença de potencial com a pele (dedo PD) e pedindo o assunto para fechar o buraco"medição" beliscando o cateter entre a ponta do seu dedo polegar e indicador.
    4. Se o PD de dedo não é -30 mV ou mais negativo, verificar a inserção da agulha borboleta. Repita a abrasão (para ECG creme set-up) e verificar pontes.
    5. Ligue a bomba de seringa de solução #1 em 80 mL/h. iniciar com a narina direita.
    6. Medir o PD de dedo como uma constante tensão negativa (intervalo típico -40 a -80 mV).
    7. Se usando o sistema de creme de ECG: diluir o creme de ECG 1:1 e preencher o cateter após uma descarga completa fora do orifício da sonda visto como anteriormente para o ágar.
    8. Conecte o cateter a uma seringa de 50 mL, meio-cheio com o creme de ECG para banhar os eléctrodos, permitindo a verificação do deslocamento do eletrodo e a ponte fora do set.
    9. Conectar a eletrodo de Ag/Cl referência ao espaço subcutâneo por ligeira abrasão mínima anterior da pele, a pele vai aparecer 'rosa e brilhante' quando é atingido o nível da derme.
    10. Posicione o eléctrodo de medição, coberto com creme de ECG, sobre a abrasão na pele. Verifique o dedo PD como anteriormente mostrado para o sistema de ágar.

10. medição de PD Basal

  1. Insira o cateter nasal a narina direita, usando um rhinoscope iluminante (ou equivalente) para visualizar o corneto inferior. Usando a dica anterior como um marco, avance o cateter com direcionamento o site inferior do corneto na mucosa respiratória inferior. Como alternativa, se a colocação é difícil, o oríficio pode ser colocado em contacto com o chão da narina.
    Nota: O cateter é rígido o suficiente para ser guiado na narina pelo operador. Para facilitar a colocação, um canal do cateter é colorido em azul e contém o furo de sonda-lateral em contacto com o corneto inferior. Isso impede que a rotação do cateter. As marcas indicadas no cateter de 1 a 10 cm fornecem pontos de referência fácil.
    1. Medir o PD no corneto inferior. Para este efeito, certifique-se de que o orifício de medição do cateter é fechado pelo seu posicionamento contra a mucosa do corneto inferior (marca Basal no direito).
    2. Medir o PD no 3.0, 2.0, 1.0, 1.5 e 0,5 cm (distância dentro do meato inferior do corneto inferior): marcar direito Basal PDs.
    3. Manter cada medição à distância especificada por aproximadamente 5 s cada para garantir uma leitura constante (± 1 mV) e para facilitar a interpretação exata dos valores basais de PD.
    4. Repita as etapas acima na narina esquerda, usando a tecla de função para marcar o PDs Basal de esquerda (3 cm, 2cm, etc.) e a esquerda Basal em.
    5. Utilizando medidas de PD basais como guia, inserir a sonda do cateter nasal para o site do sinal mais negativo (até 3 cm da ponta anterior do corneto nasal inferior) e seguro com um pequeno pedaço de fita na ponta do nariz (ou equivalente).

11. NPD rastreamento sequenciais Perfusions

  1. Para a narina direita
    1. Verifique se que a solução está escorrendo do nariz do paciente. Com o assunto assumir uma posição confortável com sua cabeça para baixo (muitas vezes ajudado por ter o assunto descanse sua cabeça em sua mão ou usar um chinrest ou outro dispositivo de imobilização). Lembre o assunto para minimizar o movimento e evite tocar o nariz ou a tubulação e para evitar falar.
    2. Transformar a solução #1 bomba (toques) em (5 mL/min ou 300 mL/h). Gravar até à obtenção de um valor estável (< 1 mV mudança/30 s).
      Nota: Isto leva cerca de 3 min para alcançar a estabilidade.
    3. Desligue a perfusão com solução #1.
    4. Inicie a perfusão com solução #2 (amilorida). Gravar o NPD para um mínimo de 3 min (se a tensão do planalto está em dúvida, continuar a gravação para até 5 min. total).
    5. Inicie a perfusão com solução #3 (cloreto de Zero). Gravar o NPD para um mínimo de 3 min (se a tensão do planalto não é estável, continuar a gravação para até 5 min. total).
    6. Inicie a perfusão com solução #4 (Isoproterenol). Gravar o NPD para um mínimo de 3 min [se a tensão do planalto não é estável (um rastreamento de tensão constante pelo menos 30 s de < 1 mV deriva), continuar a gravação para até 5 min total].
    7. Inicie a perfusão com solução #5 (ATP). NPD recorde para um mínimo de 1 min, até à obtenção de um pico de resposta de hiperpolarização.
    8. A perfusão com a solução #1 (toques) e deixe de 30 s para lavar o cateter.
    9. Desligue a perfusão de solução #1.
    10. Repita o procedimento para a narina esquerda.

12. fim do ensaio

  1. Verifique novamente e gravar estável dedo PD ("dedo do Post") para 5 s.
    1. Remova ponte cutânea do sujeito e a bandagem no local da inserção na pele. Para o sistema de creme AgCl/ECG, retire o eletrodo do braço.
    2. Gravar a tensão de "Final fechado Loop Offset", conforme descrito para o deslocamento inicial de circuito fechado de medição (ver passo 7.1.3).
    3. Deslocamento final de Mark com a tecla de função.
    4. Pare de aquisição de dados (pressione "começar a'').
      Nota: O atual SOP recomenda o uso de 100 µM ATP para ativar a purinérgicos cálcio dependente Cl secreção, para servir como um controle positivo para o teste; no entanto, este é um teste opcional.

Representative Results

No epitélio normal das vias respiratórias, absorção at+ é a actividade de transporte de íon primário. Isso resulta em uma diferença de potencial negativa das vias respiratórias superfície no que se refere o interstício. Perfusão da amilorida de bloqueador de canal de ENaC leva a uma diferença de potencial menos negativa. Em seguida, superfusion de Cl-solução livre cria um gradiente químico para Cl-, que cria uma diferença de potencial mais negativa e ativa todos os transportadores de Cl , incluindo CFTR. Isoproterenol, o que aumenta o cAMP intracelular, mais aumenta a secreção de Cl ativando especificamente CFTR e aumenta a diferença de potencial.

Por outro lado, nos indivíduos CF, ausente ou disfuncional CFTR resulta em um aumento ENaC mediada at+ absorção12. Como resultado, a diferença de potencial de base é mais negativa. A despolarização observada com aplicação de amilorida é maior, Considerando que há mínima ou nenhuma mudança na diferença potencial sobre a estimulação da secreção de Cl , através de vias dependentes de CFTR. Isto pode ser visto em traçados representativos na Figura 8, mostrando 'saudáveis' vs traçados 'CF'.

Figure 8
Figura 8: traçados representativos da matéria 'saudável' e o assunto com CF PD: diferença de potencial, ΔAmiloride: delta amilorida, /Iso Cl 0: cloreto de baixa: a mudança em PD entre e perfusão de solução #4, S1-S4 desta solução #2: linha verde de estágios 1-4, em gráficos A e B indicam o rastreamento NPD e preto as setas indicam a diferença na diferença de potencial

Discussion

In vivo, NPD fornece uma única medição que pode ser executada repetidamente em uma base longitudinal e demonstra que, com medidas repetidas, resultados longitudinais semelhantes são observados em uma base individual e armazenando14, 15. Há fortes evidências que o NPD tem validade excelente discriminação para distinguir CF do não-CF. 25 estudos consistentemente demonstraram uma diferença estatisticamente significativa na Cl e condutância at+ entre pacientes com FC e controles saudáveis10. Enquanto vários índices previamente desenvolvidos demonstram essa capacidade, prevemos que novas atualizações são necessárias dada a recentes padronizações de metodologia7,8.

Modificações e solução de problemas

Este teste requer várias etapas-chave para assegurar medições precisas. Isso inclui o deslocamento de loop fechado de eletrodos e cateteres para garantir que o sistema está executando aos padrões recomendados. Os pacientes devem ainda permanecem e abster-se de falar como isso minimiza artefatos e desalojamento de cateter. Isto dificulta o teste em pacientes não-cooperativos e a técnica só tem sido relatada em um estudo em crianças abaixo de 6 anos de idade7.

Inspecção preliminar do epitélio nasal é necessária garantir que não existem crostas ou muco no epitélio, que pode afetar as medidas.

Muito importante, deve-se salientar que o local de colocação do cateter é objecto de debate. O SOP aqui apresentada utiliza medição sob corneto inferior (IT). A colocação do cateter sob o que foi padronizada e realizada em ensaios multicêntricos e, portanto, esta é a técnica recomendada. Medição sob o IT é executada com o cateter de lado-buraco, que pode ser difícil de manter em contato firme com a mucosa nasal, enquanto estar em contato com as soluções. Outros grupos podem medir o PD no chão nasal, que é tecnicamente mais fácil. Importante, Vermeulen (2011) demonstrou que os 2 métodos são comparáveis16.

O aquecimento das soluções, é uma questão de debate entre europeus e centro-norte-americano de17,18. Tem sido advogava que usar soluções a 37 ° C, em vez de 22 ° C aumenta a resposta de cloreto total observado por cerca de 25% e a resposta de isoproterenol dependentes cloreto por aproximadamente 95%18. No entanto, o aquecimento aumenta variabilidade, avaliada pelo maior desvio padrão do cloreto total resposta17. Portanto, como o aquecimento das soluções é um factor adicional de variabilidade, é aconselhável não aquecer as soluções, a menos que exigido em uma base de estudo.

Temos anteriormente em relação a ambas as técnicas de eletrodo e encontrado que o AgCl e o calomelano sistemas de eletrodo operavam da mesma forma nas correntes basais e estimuladas em indivíduos normais,13.

Limitações da técnica

Este teste está sujeito a significativa dentro de variabilidade. A variabilidade de marcar um gol é especialmente prevalente em pacientes com traçados indeterminados e este deve ser contabilizado no aplicativo de diagnóstico19. Fatores de variabilidade incluem infecção aguda do trato respiratório superior, extensa polipose nasal, cirurgia prévia do seio e CF-relacionados a inflamação, que diminuem a sua especificidade e sensibilidade20,10. Além disso, interpretação de traçados pode ser diferente entre os leitores, embora leitores especialistas demonstram excelente acordo de Pontuação quantitativa e interpretabilidade em CF e traçados não-CF, contrastando com uma variabilidade significativa na confiança dos rastreamento19.

Variabilidade intrínseca contra limiares significativos

Muito importante, a variabilidade fisiológica da medição é considerável, como ilustrado em diferentes estudos10, tais como os testes de terapia do gene CFTR que demonstrou variabilidade considerável em mudanças no transporte total de cloreto e amilorida variam de21,22. Avaliação transversal sugere que zero Cl além disso isoproterenol resposta acima do limiar de -5 a -7 mV é o limite entre CF e assuntos não-CF10.

No entanto, carecemos de conhecimento claro sobre a magnitude da mudança desse parâmetro, que representa uma correção de CFTR eficaz em ensaios de fase II com doença modificando terapias. Para avaliar a resposta individual, repetidos testes de monitoramento da resposta a uma intervenção podem ser necessária para distinguir alterações significativas da variabilidade intrínseca. Muito importante, futuros estudos de longo prazo com doença modificando drogas precisam demonstrar que melhora da função CFTR correlaciona-se com melhoria nos resultados clinicamente relevantes ou substituto resultados (tais como a melhoria no VEF1) da CF doença. Com efeito, uma recente fase II Ivacaftor estudo demonstrou marcada benefício clínico, apesar de uma pequena melhoria da secreção de cloreto23.

Esses estudos irão ajudar a estabelecer-se um valor de corte de melhoria na condutância de Cltrans-epitelial pode ser um parâmetro substituto para benefício clínico. Isto seria um parâmetro importante para orientar o desenvolvimento de CFTR modificando terapias.

Importância no que diz respeito a métodos existentes: teste de suor e medições atual Intestinal (ICM)

Em pacientes com ' questionável ' fibrose cística, como avaliado por um intermediário suor Cl concentração entre 30 e 60 mM, golo de NPD composto fornecido uma ferramenta altamente sensível para diagnosticar pacientes como 'CF-provável ' e ' CF-improvável '10 . Medição atual intestinal (ICM), que fornece uma medição ex vivo do líquido Cl fluxos através do epitélio retal, também permite determinação da função CFTR residual com uma alta sensibilidade porque CFTR é altamente expresso em Este epitélio.

Considerando a modificação da função CFTR por moduladores CFTR, a relação entre estes diferentes alterações de biomarcador CFTR é actualmente pouco claras. Apesar de recente trabalho baseado em Ivacaftor determinou que teste NPD e suor são correlacionados4, não ainda estabeleceu-se uma medição no tracto respiratório é melhor preditor de resultado respiratório do que, por exemplo, o suor teste24 , 25 ou mudança na ICM. Além disso, drogas de modificador também podem diferir em suas eficácias específicas do órgão. Em relação a NPD, é importante notar que as alterações em resposta basal de PD e amilorida expressam transporte at+ , enquanto mudanças no Cl 0 e o isoproterenol resposta expressam transporte Cl . É ainda necessário estabelecer qual delas é mais importante para a melhoria da doença.

Futura aplicação desta técnica

O uso desta técnica é esperado fora do campo de CF. Uma vez que esta técnica é excepcionalmente adequada para demonstrar at+ e Cl canal iônico, que pode ser aplicado para demonstrar a disfunção em doenças de vias respiratórias, incluindo asma26, bronquite crônica,27, não-CF Bronquiectasia28 e pancreatite recorrente29. Além disso, modificações desta técnica tem sido usadas nas vias aéreas inferiores (LAPD) para demonstrar a disfunção centrada em vias aéreas inferior CFTR em portadores de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) bronquite crônica30.

NPD fornece um biomarcador sensível na vivo da função CFTR, o que pode ser usado tanto no diagnóstico e, também, para estudos de prova de conceito, com o objetivo de corrigir CFTR e ENaC canal atividade em pesquisa translacional. Isto permite a avaliação longitudinal da função trans-epitelial e é uma promessa como estratégia de medicina personalizada costurar o corrector mais eficiente para cada paciente com FC.

Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo grupo de trabalho para a função de CFTR do Comitê de padronização (rede de ensaios clínicos, da sociedade europeia de fibrose cística) e o grupo nacional de recursos centro trabalhando (rede de desenvolvimento de terapêuticas, fibrose cística Fundação). Apoio adicional foi fornecido pela Fundação CF (Clancy FY09 para GMS) e NIH (DK072482 para ARM e GMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) Fisher Scientific
Powerlab 4/30 AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 AD Instruments
Windows compatible PC - Minimum requirements of Windows XP or higher Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject) Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes Fisher Scientific 13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode BIOPAC Systems UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream Fisher Scientific Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device PROMED Feeling Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing Fisher Scientific 427411
Becton Dickinson PE 90 tubing Fisher Scientific 427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD Fisher Scientific 508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) 3M 1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US Marquat I0202US
1" X 10 yards silk tape 3M Durapore 1538-1
IV extension tubing (30", 50/box) International Limited IMN30
Three-way stopcock (50/box) Medex MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0.22-μm or smaller filters; or equivalent) Fisher Scientific 09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20 G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 427564
Becton Dickinson 23 G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 367283
Becton Dickinson Syringe 60 mL without needle Luer-Lok tip (40/Box) Fisher Scientific 309653
Becton Dickinson Syringe 10 mL without needle Luer-Lok tip (100/Box) Fisher Scientific 309604
Single use sterile wipes (per institutional availability) Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 L volumes acceptable) Fisher Scientific 430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23" x 36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) SureCare
23 G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) Becton Dickinson 367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional) Richmond Products, Inc 629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting  (or equivalent) Fisher Scientific No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl Spectrum Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2 •2H2O – USP Spectrum Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, KH2PO4 – USP Spectrum Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) Spectrum Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) Spectrum Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) Spectrum Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) Spectrum Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O Spectrum Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP Spectrum Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) Spectrum Formula Weight: 551; Size: 5 gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O) Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg/5 mL ampule Hospital Pharmacy Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 5 L

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References

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Medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana Nasal (NPD)
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Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).More

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).

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