Summary
Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.
Abstract
Il reclutamento dei leucociti su lesioni o infiammazione ai siti di lesione o danno tissutale è stato studiato durante gli ultimi decenni ed ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita. Tuttavia, l'esatti meccanismi molecolari coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati ancora completamente identificati. Dal momento che il reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell'infezione, infiammazione e (auto-) ricerca immune, presentiamo un semplice test a flusso laminare per studiare meccanismi di fondo dell'aderenza, de-adesione, e trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. L'analisi in vitro può essere usata per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulare in diversi modelli di infiammazione vascolare. Questo protocollo descrive un'analisi basata su flusso laminare usando una camera di flusso parallelo ed un microscopio invertito di contrasto di fase collegato ad una macchina fotografica per studiare le interazioni dei leucociti e cellule endoteliali o piastrine, che possono essere visualizzate e registrate poi analizzati non in linea. Le cellule endoteliali, piastrine o dei leucociti possono essere pretrattati con inibitori o anticorpi per determinare il ruolo di specifiche molecole durante questo processo. Condizioni di taglio, cioè arteriosi o venosi shear stress, possono essere facilmente adattate dalla viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l'altezza del canale.
Introduction
Alla ferita, infiammazione o infezione, il leucociti rispondono rapidamente all'agente patogeno o danni associata - molecolare modelli (PAMPs, DAMPs), cambiare in uno stato di attivazione e spostare fuori dal flusso di sangue ai siti di infiammazione e danno tissutale. La capacità dei leucociti per interagire con l'ambiente cellulare e molecolare è essenziale per la loro corretta funzione come cellule immuni, come evidenziato da malattie genetiche come l'adesione del leucocita carenza1. L'adesione del leucocita è stato oggetto di intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni e ciò ha provocato il concetto della cascata di adesione del leucocita nei primi anni 19902,3. L'adesione del leucocita è iniziata dalla cattura selectina-mediata dei leucociti all'endotelio, causando le cellule a rotolare sopra la superficie vascolare. Questo rotolamento permette di leucociti cercare spunti migratori endotelio associato, ad esempio, chemochine, che inducono l'attivazione delle integrine. Successivamente, le integrine attivate mediano l'associazione da ligandi endoteliali, con conseguente arresto del leucocita ferma. Leucociti successivamente possono preparare a MPEG strisciando e diffondendo, prima di penetrare il monostrato endoteliale e trasmigra in tessuto di fondo. Il concetto alla base della cascata del canonico del leucocita ha è rimasto pressoché invariato sin dalla sua introduzione, con alcuni passaggi intermedi aggiunto4. Tuttavia, i meccanismi molecolari esatti e i ruoli dei molti giocatori coinvolti nel reclutamento leucocitario non sono stati chiariti finora, e reclutamento leucocitario rimane un tema importante nel campo dell'infezione, infiammazione e (auto-) immuni ricerca.
Ad esempio, nel corso di malattie infiammatorie vascolari come l'aterosclerosi, aumentato reclutamento leucocitario nello sviluppo della placca vaso muro unità. Le placche aterosclerotiche instabili potrebbero rompersi, che conducono alla massiccia attivazione delle piastrine e del sistema di coagulazione e successivamente all'occlusione del vaso5. Ciò potrebbe comportare gravi esiti cardiovascolari come infarto miocardico o ictus. In più, per esempio dopo stenting di un'arteria coronaria, decumulazione endoteliali come esso si verifica clinicamente, conduce ad una moltitudine di interazioni dei leucociti e delle piastrine all'interno del muro vaso esposto (per esempio, componenti della matrice e liscio le cellule del muscolo) e dei leucociti con le piastrine che copre il danno vascolare. Queste interazioni sono importanti per l'ulteriore sviluppo della malattia come monociti e piastrine potrebbero guidare neointima formazione6,7. Inoltre, interazioni della piastrina-leucocitarie mediata da integrine leucocitarie Mac-1 (αMβ2) e della piastrina GPIbα sono state recentemente identificate come romanzo driver di trombosi in topi8.
Data l'ampia disponibilità di sangue umano e degli animale come fonte di leucociti e piastrine per la ricerca e l'ampio spettro di molecole di matrice isolato e linee cellulari immortalizzate di origine vascolare e del leucocita, è fattibile per simulare del leucocita interazioni in flusso in un laboratorio di impostazione, utilizzando appositamente progettato camere di aspersione di flusso. Molte varianti sono state progettate negli ultimi decenni, che vanno dal vuoto-driven agli alloggiamenti di aspersione autoadesiva. Tutte le varianti hanno in comune che la parte immobile (ad es., cellule vascolari coltivate o proteine della matrice) viene assemblata in una camera più grande di tenuta dotata di un pre-definito canale consentendo la perfusione di liquidi sopra la parte immobile. Inoltre, gli avanzamenti nella tecnologia di stampaggio permesso lo sviluppo di soluzioni su misura basate su silice polimeri9. La viscosità e la portata dei fluidi irrorati e l'altezza del canale principalmente di determinare le caratteristiche di sollecitazione di taglio del flusso perfusione periferica10. In questo articolo, presentiamo un metodo in vitro per lo studio dei meccanismi sottostanti dell'aderenza, de-adesione e la trasmigrazione dei leucociti sotto i regimi di flusso venoso e arterioso. Il vantaggio dei metodi presentati qui è che può essere eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza lecamera comune e non richiedono un sperimentatori di possedere alta competenza tecnica. Il saggio in vitro può essere manipolato in vari modi (ad esempio, l'aggiunta di inibitori o bloccando gli anticorpi) e così è applicabile a diversi modelli di infiammazione vascolare e permette l'indagine su adesione le funzioni della proteina o la valutazione di specifici composti.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dai medici etici e animale etico tavole dell'Università di Maastricht.
1. flow-Based Assay con le cellule umane
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Isolamento delle piastrine da sangue umano
- Prelievo di sangue venoso in anticoagulante citrato (3,2%).
- Aggiungere 15/1 volume di acido citrato destrosio (ACD: citrato trisodico 80 mM, 52 mM acido citrico e 183 mM glucosio) nel sangue.
- Centrifugare a 350 x g senza freno per 15 min ottenere plasma ricco di piastrine (PRP).
- Trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 mL e aggiungere volume 1/20 di ACD.
- Centrifugare a 1.110 g senza freno per 15 min ottenere plasma povero di piastrine (PPP).
- Scartare il surnatante. Tagliare l'estremità della punta della pipetta (P 1000), rendendolo grande alesaggio, che aiuta nella prevenzione dell'attivazione della piastrina e attentamente sospendere il pellet della piastrina nello stesso volume come PRP in tampone a pH della piastrina 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl2, albumina di siero bovino 0,1% e 0,1% di glucosio). Aggiungere volume 1/20 del ACD e mescolare delicatamente.
- A pellet le piastrine a 1.110 g senza freno per 15 min.
- Scartare il surnatante e attentamente sospendere le piastrine come sopra in 1 mL di tampone di piastrine (pH 7.5).
- Misurare la concentrazione di piastrine in una diluizione di 1: 10 con un analizzatore automatizzato di ematologia.
- Regolare il volume con tampone della piastrina (pH 7.5) per ottenere un conteggio di 2 x 107/ml.
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Isolamento di cellule polimorfonucleari da sangue umano (adattato da Brinkmann et al. 11 )
- Disegnare 24 mL di sangue in eparina (10 U/mL) come anticoagulante.
- Aggiungere 6 mL di 1,077 g/mL liquido di densità polysucrose-sodium diatrizoate (Vedi Tabella materiali) a una provetta conica da 15 mL e attentamente livello 5-6 mL di sangue intero in cima.
- Centrifugare per 20 min 800 x g senza freno.
- Aspirare e scartare lo strato superiore giallastro limpida e trasferire la fase inferiore rossastra contenente granulociti in fresche provette coniche da 15 mL. Lavare le cellule con l'aggiunta di PBS contenente 2 mM EDTA ad un volume finale di 14 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 x g senza freno.
- Nel frattempo, preparare un mezzo del gradiente di densità (ad es., percoll, Vedi Tabella materiali) soluzione di lavoro mescolando 18 mL liquido gradienti di densità con 2 mL 10 x soluzione PBS. Diluire la soluzione di lavoro con PBS (1x) ottenere 4,25 mL ciascuna di 85%, 80%, 75%, 70% e 65% soluzioni di media pendenza.
- Preparare 2 provette coniche con il gradiente di densità di stratificazione 2 mL di ogni percentuale medio in cima a vicenda. Iniziare con la più alta concentrazione e continuare in ordine decrescente. Contrassegnare gli strati sul tubo con un pennarello resistente all'acqua.
- Strato attentamente 2 mL di sospensioni di cellule su ciascuno dei due gradienti preparati.
- Centrifugare per 20 min 800 x g senza freno in una centrifuga accuratamente equilibrata.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere lo strato superiore e la maggior parte del 65% (primo anello) di strato con PBMCs e raccogliere in nuovi tubi il bianco restanti le interfasi fino al livello 85% (secondo anello, PMN).
- Lavare le cellule da riempire i tubi con PBS 2 mM EDTA e centrifugare per 10 minuti a 300 x g senza freno.
- Rimuovere il supernatante e sospendere le cellule sedimentate (≥ 95% sono in genere PMN) in 1 mL di tampone di Hank (pH 7,45), contenente 10 mM Hepes e 0,2% di albumina umana (tampone del saggio).
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e sospendere le cellule a 1 x 106/ml.
- Continuare con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3).
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Preparazione di aderente della piastrina e monostrati di cellule vascolari
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Preparazione del piatto cultura delle cellule (cellule coltivate)
- Pre-cappotto i piatti di cultura cellulare 35 mm con 1 mL diluito collagene coda di ratto (30 µ g/mL diluito in PBS filtrato sopra un filtro da 0,2 µm).
- Incubare a 37 ° C per 30 minuti, eliminare la soluzione di collagene e lavare il piatto una volta con PBS.
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Cultura delle cellule vascolari in piastre di coltura
- Staccare il primario (ad es., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) o cellule immortalizzate vascolare (ad es., EA. Hy926, SVEC) cresciuta alla confluenza in una boccetta di T75 con 1,5 mL soluzione di distacco delle cellule (per esempio, accutase). Aggiungere 4,5 mL di terreno di coltura appropriato per neutralizzare la soluzione di distacco delle cellule e determinare la concentrazione di cellule con una cella camera di conteggio. Sospendere le cellule a 0,5 x 105 cellule/mL nel terreno di coltura appropriato (ad es., mezzo di sviluppo completo delle cellule endoteliali).
- Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare ad ogni piatto di 35 mm. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 fino alla confluenza (assunzione di 24 – 48 h, a seconda del tipo di cellula).
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Preparazione di vetro vetrino coprioggetti (aderente piastrine)
- Immergere il vetrino coprioggetti una volta in HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
- Sciacquare il vetrino coprioggetto 2 volte in acqua ultrapura.
- Asciugare il vetrino coprioggetto N.2.
- Pre-cappotto il vetrino coprioggetti con 100 µ l, in conformità della posizione del canale della camera aspersione collagene coda di ratto diluito di tipo I (30 µ g/mL diluito in PBS filtrato sopra un filtro da 0,2 µm).
- Incubare per 30 min a RT, scartare la soluzione di collagene e lavare il vetrino coprioggetto 3 x con PBS.
- Bloccare il coprioggetto di collagene rivestito con 1% BSA in HEPES per 0,5 h a TA.
- Lavare e asciugare il vetrino coprioggetto e montarlo nella camera di aspersione. Isolare le piastrine da umano o sangue del topo come illustrato nel passaggio 1.1 o 2.1, rispettivamente.
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Immobilizzazione delle piastrine
- Aggiungere 70 µ l di una sospensione di piastrine/ml72 x 10 per canale e incubare per 1,5 h a 37 ° C e 5% CO2.
- Sostituire con attenzione le piastrine non aderente con soluzione bloccante (5% BSA in HEPES) per almeno 30 min a RT. Continue con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3).
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Stimolazione del monostrato cellulare vascolare
- Stimolare le cellule vascolari sostituendo i media freschi fluidi contenenti 10 ng/mL fattore di necrosi tumorale α (TNFα) per 4 h a 37 ° C e 5% CO2.
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Preparazione del piatto cultura delle cellule (cellule coltivate)
2. flow-based test con cellule Murine
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Isolamento delle piastrine da sangue del topo
- Disegnare sangue dalla puntura cardiaca utilizzando un ago 21 G (~ 1 mL) da anestetizzati (ketamina 80 mg/kg e medetomidina 0,3 mg/kg) 6 – 8 settimana-vecchi topi (C57Bl/6) in citrato (3,2%) come anticoagulante.
- Aggiungere volume 1/6 di ACD.
- Centrifuga a 220 x g, freno medio per 5 min ottenere plasma ricco di piastrine (PRP).
- Trasferire il surnatante (~ 600 µ l) più 1/3 dei globuli rossi ad un nuovo tubo
- Centrifugare a 95 x g senza freno per 6 min.
- Trasferire il surnatante (PRP) e misurare la concentrazione di piastrine in una diluizione di 1: 10 nel buffer di Tyrode (buffer di TH: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, albumina di siero bovino 0,1% e 0,1% glucosio) con un analizzatore automatizzato di ematologia.
- Lavare le piastrine aggiungendo volume 1/25 di ACD + 0,1 apyrase U/mL e centrifugare a 2.870 g, freno medio per 2 min.
- Scartare il surnatante e aggiungere 600 µ l di tampone di TH, 1/10 di volume di ACD e 0.1 apyrase U/mL. Tagliare la punta di dispensare (P 1000), rendendolo ampio foro, che aiuta nella prevenzione dell'attivazione della piastrina e delicatamente sospendere il pellet.
- Centrifugare a 2.870 g, freno medio per 2 min
- Scartare il surnatante e delicatamente sospendere le piastrine nel buffer di TH.
- Regolare il volume con buffer di TH per ottenere un conteggio di 2 x 107/ml.
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Preparazione di monostrati aderente della piastrina
- Preparare il vetrino coprioggetti (aderente piastrine) secondo 1.3.3.
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Immobilizzazione delle piastrine
- Aggiungere 100 µ l di una sospensione di piastrine/ml72 x 10 per canale e incubare per 1,5 h a 37 ° C e 5% CO2.
- Sostituire con attenzione le piastrine non aderente con soluzione bloccante (5% BSA in HEPES) per almeno 30 min a RT. Continue con Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (punto 3.3)
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Stimolazione di monostrato di piastrine del mouse
- Prima di aspersione dei leucociti (punto 3.3), stimolare le piastrine di aspersione della trombina (0,5 nM) nel buffer di HHHSA per 3 min a 37 ° C.
3. Contrassegno fluorescente e l'aspersione dei leucociti (PMN o THP-1 per umani e RAW 264.7 o monociti del Mouse primario per l'analisi di flusso-base murino)
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Contrassegno fluorescente
- Etichettare i leucociti (1 x 106/mL) con la macchia di acido nucleico cellulare-permeante fluorescente verde (1 µM). Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.
- Lavare le cellule con PBS per centrifugazione a 300 x g per 5 min e sospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL (5 mL ogni condizione di test, a seconda della portata) nel tampone.
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Preparazione di analisi di flusso camera
- Per l'adesione del leucocita su un monostrato di cellule, scartare il mezzo di coltura cellulare dal piatto e assemblarlo in camera di flusso. Collegare la siringa. Per l'adesione del leucocita sulle piastrine immobilizzate, collegare la micro diapositiva alla siringa. Pre-riscaldare a bagnomaria a 37 ° C.
- Prendere una siringa di aspersione (50 mL), installare siringa sul titolare di siringa, set ritirare la pompa su e modalità. Impostare il volume di pompa a 0 mL e impostare il diametro a 26,70 mm per la siringa da 50 mL.
- Collegare un connettore luer a gomito a un'estremità del tubo. Posizionare un accoppiatore di blocco luer della siringa e collegare il tubo con il connettore luer a gomito per l'accoppiatore di luer lock. Collegare l'estremità libera della tubazione alla camera di flusso.
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Adesione e l'aspersione del leucocita
- Per l'adesione del leucocita su un monostrato di cellule, scartare il mezzo di coltura cellulare dal piatto e assemblarlo in camera di flusso. Collegare la siringa. Per l'adesione del leucocita sulle piastrine immobilizzate, collegare la micro diapositiva alla siringa.
- Per aspersione del leucocita e adesione sopra un vascolare- o monostrato di piastrine, posizionare il secondo tubo in una provetta conica 50 mL contenente tampone di dosaggio e riempimento della tubazione con pipetta da 1 mL, poi spremere il tubo e collegarlo a una camera di flusso.
- Prima dell'aspersione del leucocita, aggiungere 3 mM CaCl2 e 2 mM MgCl2 alla sospensione cellulare e incubare per 5 min a 37 ° C.
- Irrorare il tampone prima dell'aspersione delle cellule per rimuovere l'aria possibile dall'aula e tubazione.
- Chiudere le estremità del tubo stringendo loro stretto e passare tubi da tampone del saggio di sospensione cellulare, impedendo che le bolle d'aria intrappolata. Irrorare le cellule con flusso appropriato tasso/sollecitazione di taglio fino a quando arrivano le prime cellule.
- Irrorare le cellule con flusso appropriato tasso/shear stress per 2 min e catturare almeno 6 immagini tra 2 – 6 min di rotolamento e aderente cellule con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es., EVOS-FL) con 100 ingrandimenti collegato fotocamera digitale CCD o CMOS.
Nota: Flusso tasso/sollecitazione di taglio dipende da dimensioni camera di flusso e viscosità di perfusato. Per aspersione camera utilizzata qui (Vedi Tabella materiali):
Τ =η* 97.1*Φ
Τ: sollecitazione di taglio (1 dine/cm2)
Η: viscosità (0,015 dyn * s/cm2)
Φ: portata (0,67 mL/min)
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De-adesione del leucocita
- Per de-adhesion, passare la tubazione dalla sospensione cellulare a tampone schiacciando il tubo, impedendo la diventando intrappolate bolle d'aria.
- Staccare le cellule mediante perfusione con tampone del saggio con un'appropriato flusso tasso/sollecitazione di taglio (Vedi 3.3.7 Nota).
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Trasmigrazione leucocitaria
- Per trasmigrazione leucocitaria, irrorare leucociti (passaggio 3) fino a una quantità adeguata di leucociti aderiscono (~ 50 cellule/vista campo).
- Sostituire sospensione del leucocita con tampone del saggio.
- Registrare le cellule trasmigra da lasso di tempo ogni 10 – 15 s per 30 – 60 min a 37 ° C.
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Representative Results
Per studiare l'adesione del leucocita endoteliale, cellule THP-1 fluorescente identificate sono state irrorate sopra un monostrato endoteliale TNFα o non stimolato per 2 min a 3 dyne/cm2. Il numero totale delle cellule monocytic aderenti era risoluto dopo 2 min di aspersione catturando 6 campi indipendenti per un periodo di 2-6 min. Le celle aderenti sono state quantificate in almeno 6 immagini catturate con un microscopio a contrasto/fluorescenza invertito fase (ad es., EVOS-FL) con 10 ingrandimenti collegato a una fotocamera digitale CCD o CMOS e la media è stata espressa come cellule aderenti / mm2. Dopo stimolazione endoteliale con TNFα, THP-1 arresto significativamente aumentato rispetto ad endotelio non stimolata. Micrografie rappresentativi e la quantificazione di saldamente aderente THP-1 alla non - o TNFα-cellule endoteliali stimolate è presentato nella Figura 1. L'adesione della piastrina-del leucocita è stata valutata mediante perfusione dei neutrofili fluorescente contrassegnati sopra un monostrato di piastrine TRAP-6 o non stimolato per 2 minuti a 1 dyne/cm2. Come accennato in precedenza, sono stati quantificati neutrofili aderenti. TRAPPOLA-6 stimolazione ha aumentato significativamente l'adesione dei neutrofili rispetto piastrine non stimolate. Video rappresentativo e la quantificazione dei neutrofili saldamente aderente al non - o trappola-6-stimolata monostrato di piastrine è presentato nella Figura 1B.
Figura 1 : Adesione leucocitaria endoteliale e piastrinica in condizioni di flusso. Micrografie quantificazione e rappresentante di adesione delle cellule monocytic umane (THP-1) alle cellule endoteliali (HUVEC) seminate su piastre di coltura rivestite con collagene in condizioni di flusso, con o senza attivazione TNFα (10 ng/mL) (A). Micrografie quantificazione e rappresentante di adesione dei neutrofili umani di piastrine umane immobilizzate sulle lastre di vetro rivestite con collagene in condizioni di flusso, senza o con attivazione trappola-6 (50 µM) (B). Valori di P sono stati calcolati dal spaiato t-test (n = 3; media ± DS). Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Inoltre, questo test può essere implementato per studiare il ruolo delle molecole di adesione, come molecola di adesione giunzionale della piastrina (JAM-A). L'adesione di RAW 264.7 del mouse del monocito/macrofago di un monostrato di piastrine da JAM-A (trJAM-A+ +) e topi carenti JAM-A (trJAM-A- / -) è stata valutata nel nostro precedente studio7. Come osservato in esso, della piastrina carenza JAM-A ha aumentato l'adesione dei monociti del mouse per il monostrato di piastrine rispetto ai topi wild type (Figura 2A-B). In alternativa, i neutrofili primario del mouse possono essere isolati da topi come descritto12.
Per lo studio dei meccanismi sottostanti, quali molecole di adesione coinvolte nelle interazioni della piastrina-leucocita, specifici recettori di superficie possono essere bloccati. Nel suddetto studio, blocco della piastrina GPIbα e del leucocita αMβ2 significativamente diminuito l'adesione del monocito, identificando un ruolo per l'asse di2 β GPIbα-αMnel reclutamento del monocito aumentata a JAM-A- / - piastrine (Figura 2A-B). Inoltre, esperimenti di distacco delle cellule possono essere eseguiti per studiare la dipendenza di sollecitazione di taglio della piastrina-interazioni leucocitarie. Per la misura di flusso-dipendente distacco dei monociti, sollecitazione di taglio in modo incrementale è stata aumentata da 0 a 20 dynes/cm2. In questo studio, l'adesione delle cellule RAW 264.7 sulle piastrine JAM-A- / - era più resistente a shear stress rispetto alla marmellata-A+ + piastrine (Figura 2C).
Figura 2 : Carenza-JAM-A promuove l'adesione cellulare monocytic flusso-resistente. Adesione del mouse monociti/macrofagi RAW 264.7 celle alle piastrine da JAM-A+ + e marmellata-A- / - topi immobilizzati sulle lastre di vetro rivestite con collagene in condizioni di flusso, con o senza l'attivazione della trombina (IIa, 0.5 nM) in presenza di inibitori indicati (A). Micrografie rappresentativi del mouse monociti/macrofagi RAW 264.7 cellule aderenti alla marmellata-A+ + e marmellata-A- / - piastrine dopo il trattamento con isotipo degli anticorpi di controllo o anti-GPIbα (B). Delle cellule adesione espressa come percentuale di cellule inizialmente aderenti sotto sollecitazione di taglio in modo incrementale aumentato (dyne/cm2) sulle piastrine immobilizzate dopo l'attivazione della trombina (IIa, 0,5 nM). Valori di P sono stati calcolati mediante ANOVA con post-test di Tukey (n = 3-5; media ± SEM). Barra della scala = 100 µm. Questa figura è stata modificata da Zhao et al. 7 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il tempo di registrazione prolungato (30 – 60 minuti) di singoli campi seguendo l'aspersione del leucocita e adesione permette lo studio del leucocita strisciando e diffondendo il comportamento e trasmigrazione finale attraverso lo strato endoteliale. All'interno di questo studio, abbiamo analizzato la trasmigrazione dei monociti umani primari (isolato con il kit di isolamento del monocito, secondo le istruzioni del produttore come descritto13) attraverso un strato endoteliale. Come presentato nella Figura 3, arresto seguente ferma all'endotelio, monociti si preparano a MPEG strisciando e diffondendo fino a raggiunta il sito preferito per trasmigrazione. Successivamente, monociti penetrano la barriera endoteliale delle cellule mediante migrazione para - o transcellular. Trasmigra le cellule sono state definite come cellule che sparsi su cellule endoteliali, estendendo loro pseudopodi e passando attraverso la barriera endoteliale, diminuendo in tal modo la loro luminosità.
Figura 3: In vitro trasmigrazione dei monociti primari attraverso un monostrato endoteliale. Trasmigrazione di striscianti e spalmare e finale del monocito attraverso l'endotelio è stato registrato ogni 15 s per 30 min. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Questo test in vitro è un semplice metodo per indagare i meccanismi di reclutamento leucocitario durante l'infiammazione vascolare, ma ci sono alcuni punti critici deve essere notato. Il primo requisito per eseguire correttamente questo dosaggio è la perfusione dei leucociti sopra un intatto e confluenti vascolari o monostrato di piastrine. Questo può essere ottenuto previo rivestimento delle superfici con collagene di tipo I. In generale, quando si lavora con cellule primarie vascolari, è importante staccare delicatamente celle utilizzando la soluzione consigliata contenente collagenasi di distacco (Vedi la Tabella materiali), che è meno rigorosa, ma efficace come tripsina. Per strati monomolecolari della piastrina, è importante lavare delicatamente le piastrine durante l'isolamento per impedire l'aggregazione e l'attivazione piastrinica.
Un'altra considerazione importante è mantenere la continuità della pompa disturbato modalità di ritiro usato per l'aspersione, poiché una discontinuità conduce a condizioni di tasso e di taglio di flusso. Così, il risultato inesattezza della sollecitazione di taglio effettivo e, successivamente, all'interpretazione errata dei processi fisiologicamente shear-dipendenti. Ciò può essere evitato da una regolare manutenzione della pompa. Inoltre, fondamentale per la continuità durante l'aspersione è l'uso di una siringa fresca per ogni esperimento. Poiché la trama della gomma all'interno le modifiche di siringa con l'aumento dell'uso e tempo tra esperimenti, impedisce un prelievo continuo.
Un ulteriore passo fondamentale è la prevenzione dell'aria diventando intrappolato durante la perfusione dei leucociti, poiché aria verrà successivamente strappare le cellule dalla superficie e alterare le condizioni di taglio. Ciò può essere evitato da risciacquo tutti i tubi prima di utilizzarlo con acqua ultra-pura e poi con tampone del saggio. Inoltre, quando ci si connette, tubazione da tampone del saggio di sospensione cellulare, o da uno stato a altro, è importante mantenere interfacce liquide durante la connessione. Ciò sarà possibile mediante spremitura della tubazione o di non alterare i livelli di liquidi all'interno della tubazione. Ulteriormente, il volume del liquido del perfusato dovrebbe sempre essere sufficiente per evitare che il livello che cade sotto l'estremità della tubazione e, così, aria essere ripreso nel sistema.
Una possibile limitazione di questo test potrebbe essere l'uso di cellule coltivate che sono mantenuti in un ambiente artificiale, cioè coltivate su una superficie di plastica circondata da un mezzo che non modella accuratamente lo stato in vivo . Anche se il chimico-fisico e l'ambiente fisiologico può essere controllati con precisione, cellule coltivate hanno un tasso di crescita rapida, che aumenta la variabilità genetica e quindi l'eterogeneità delle cellule all'interno di una popolazione. Inoltre, il vascolare- o monostrato di piastrine è costituito da un singola cella tipo solo. In particolare, l'istruttoria delle interazioni leucocita-endoteliali, cioè, la trasmigrazione dei leucociti attraverso la barriera endoteliale delle cellule, il ruolo fisiologicamente rilevante della sottostante membrana basale di cellule endoteliali e periciti non può essere preso in considerazione. In alternativa, potrebbe essere interessante creare un ambiente multicellulare implementando tecniche di coltura 3D-cell con questo test.
Per riassumere, tenendo conto di questi punti, l'analisi di flusso laminare-basata può essere efficacemente applicato in diversi modelli di infiammazione vascolare. In particolare, può essere facilmente modificato per rispondere alle ricerche specifiche domande, vale a dire l'adeguamento dello sforzo di taglio variando la portata di perfusato, viscosità del fluido, o l'altezza del canale e la larghezza. In particolare, quest'ultimo è di importanza poiché cambiamenti nelle dimensioni della camera di flusso riducono il volume del liquido o cellule necessarie. Più ulteriormente, diversa fluorescenza etichettatura dei leucociti, o di specifiche molecole di vascolare o strati monomolecolari della piastrina possono essere utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la d. ssa Martin M. Schmitt e linea Fraemohs. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Paesi Bassi per la ricerca scientifica (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Fondazione per la ricerca di trasfusione di sangue (LSBR Nr. 1638) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) assegnato a r.r.k.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
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